Antranoidi

Analiza antranoidaz Antranoidi su sekundarni metaboliti biljaka, derivati 1,8-

dihidroksiantracena, koji ispoljavaju laksantno delovanje (prisustvo hidroksilnih grupa u poloaju C-1 i C-8 je uslov za delovanje).

z Na osnovu hemijske strukture, antranoidi su podeljeni u vie klasa. Razlikuju se:

z antrahinoniz antroni i antranoli (predstavljaju keto-enolne tautomere). U

kiseloj sredini prisutan je antronski, a u baznoj antranolni oblik. Antroni oksidacijom prelaze u antrahinone.

z diantroni (biantroni): nastaju C10 C10' kondenzacijom 2 molekula antrona.

Osnovne klase antranoida, njihova biogenetska povezanost

i tip supstitucije

OOH OH

R1R2

OOH OH

R1R210

10,

OOH OH

H HR1R2

9

10

8 1

OHOH OH

R1R2

9

10

8 1

31

68

O

O

OHOH

R1R2

9

10

[]

X 2

HOH3CO

COOH

CH2OHCH3

OH-

H+

ANTRANOL(ENOLNI OBLIK)

ANTRON(KETO OBLIK)

ANTRAHINONDIANTRON

z IDENTIFIKACIJA ANTRANOIDA (KVALITATIVNA ANALIZA)

z Dokazivanje antranoida vri se:z HEMIJSKIM REAKCIJAMAz HROMATOGRAFSKI: TLC.

z DOKAZIVANJE HEMIJSKIM REAKCIJAMA

z A. BORNTRGER-OVA REAKCIJA: antrahinoni (uti, liposolubilni) grade sa bazama (KOH, NaOH, NH3), crvene, hidrosolubilne fenolate, koji su mezomerno stabilizovani.

O OHOH

R1R2O

O OO

R1R2O

H

OH

ANTRAHINON(UT, LIPOSOLUBILAN)

FENOLAT(CRVEN, HIDROSOLUBILAN)

z Antroni i diantroni (napr. senozidi), koji su uti i liposolubilni, grade sa bazama ute, hidrosolubilne fenolate, koji su mezomerno stabilizovani. Pozitivnu Borntrger-ova reakciju daju tek posle oksidacije do antrahinona (npr. stajanjem u prisustvu kiseonika iz vazduha ili zagrevanjem)!

z Reakcijom se, zavisno od propisa, dokazuju:z -slobodni aglikoniz -aglikoni osloboeni kiselom ili baznom hidrolizomz -aglikoni izolovani mikrosublimacijom na 200-220C.

O OHOH

R1R2H H

O OO

R1R2

H

H H

OH

ANTRON(UT, LIPOSOLUBILAN)

FENOLAT(UT, HIDROSOLUBILAN)

z Prema savremenim farmakopejama, dokazivanje antranoidnih droga (osim u Aloe capensis i Aloe barbadensis), vri se Borntrger-ovom reakcijom (najznaajnija reakcija).

z Primeri:z -dokazivanje Frangulae cortex, Rhamni

purshiani(ae) cortex, Rhei radix, Sennae folium, Sennae fructus acutifoliae i Sennae fructus angustifoliae prema Ph.Eur. 6.0 i Ph. Jug. V.

z Dokazivanje hidroksiantracenskih derivata u kori kruine, Frangulae cortex (Ph. Jug. IV)

z Princip: zagrevanjem antrahinonski heterozidi hidrolizuju, osloboeni 1,8-dihidroksiantrahinoni sublimuju i dokazuje se Borntrger-ovom reakcijom. Napomena: antroni se pod ovim uslovima oksiduju do antrahinona koji sublimuju.

z Dokazivanje hidroksiantracenskih derivata u kori kruine, Frangulae cortex i korenu rabarbare, Rhei radix (Ph. Eur. 6.0; Ph. Jug. V)

z Princip: antrahinonski heterozidi podvrgnu se kiseloj hidrolizi (zagrevanjem sa hlorovodoninom kiselinom). Osloboeni liposolubilni aglikoni preuzmu se etrom (etarski sloj je uto obojen). Etarski ekstrakt izmuka se rastvorom amonijum-hidroksida. Vodeni sloj oboji se crvenoljubiasto od nagraenih hidrosolubilnih crvenih fenolata (Borntrger-ova reakcija).

z Dokazivanje hidroksiantracenskih derivata listu sene, Sennae folium, plodu tinevelijske sene, Sennae angustifoliae fructus i plodu aleksandrijske sene, Sennae acutifoliae fructus (Ph. Eur. 6.0; Ph. Jug. V)

z Princip: diantronski heterozidi ekstrahuju se iz droge vodom i podvrgnu kiseloj hidrolizi. Osloboeni antronski aglikoni preuzmu se etrom. Sa rastvorom amonijaka razvija se uta ili narandasta boja (fenolati antrona). Posle zagrevanja na vodenom kupatilu (oksidacija antrona do antrahinona), boja prelazi u crvenoljubiastu od fenolata antrahinona (Borntrger-ova reakcija).

z B. MODIFIKOVANA BORNTRGER-OVA REAKCIJA: antrahinoni (uti) grade sa magnezijum-acetatom crvene, hidrosolubilne, estolane helate, koji su mezomerno stabilizovani. Crveni Mg-helati stabilniji su od crvenih fenolata!

z Antroni i diantroni (uti) grade sa magnezijum-acetatom ute helate.

O OHOH

R1R2O

O OOH

R1R2O

Mg

Mg(CH3COO)2

ANTRAHINON(UT, LIPOSOLUBILAN)

HELAT(CRVEN, HIDROSOLUBILAN)

z C. SHOUTETEN-OVA REAKCIJA: antroni u prisustvu natrijum-tetraborata (slabo bazna sredina), prelaze u antranole, koji fluoresciraju ukastozeleno.

z Primer: dokazivanje Aloe capensis (izvor A. ferox) i Aloe barbadensis (izvor A. barbadensis) prema Ph. Eur. 6.0 i Ph. Jug. V.

OHOH OH

R1R2

OOH OH

H HR1R2

ANTRONANTRANOL

(FLUORESKUJE UTOZELENO)

Na2B4O6

Aloe barbadensisAloe ferox

z D. REAKCIJA SA BROMNOM VODOM: antranoidi grade sa bromnom vodom smeeut talog.

z Primer: dokazivanje Aloe capensis i Aloe barbadensis prema Ph. Eur. 6.0 i Ph. Jug. V. Reakcija istovremeno slui i za njihovo meusobno razlikovanje: u sluaju Aloe barbadensis supernatant je ljubiast (7-hidroksialoin).

z Dokazivanje antrona u Aloe capensis (Kap aloja) i Aloe barbadensis (Barbados aloja) i meusobno razlikovanje droga

z Priprema ispitivanog rastvora: izmuka se 1 g spraene droge sa 100 ml kljuale vode R. Ohladi se, doda 1 g talka R i filtrira.

z Dokazivanje antrona: Shouteten-ova reakcijaz Princip: antroni u baznoj sredini (natrijum-tetraborat) prelaze u antranole,

koji fluoreskuju ukastozeleno.

z Razlikovanje droga: reakcija sa bromnom vodom (Ph. Eur. 6.0; Ph. Jug. V)

z Princip: sa bromnom vodom antranoidi grade smeeut talog. U sluaju Aloe barbadensis suprenatant se boji ljubiasto od 7-hidroksialoina. Boja izostaje u sluaju Aloe capensis, koji sadri 5-hidroksialoin.

z E. DOKAZIVANJE ANTRONA SA C-10 NESUPSTITUISANOM METILENSKOM GRUPOM: sa nitrotetrazolium plavim grade ljubiasto ili sivoplavo obojene proizvode.

z HROMATOGRAFSKO DOKAZIVANJE: TLCz Savremene farmakopeje propisuju za identifikaciju svih oficinalnih

antranoidnih droga hromatografiju na tankom sloju (TLC). z Antranoidni heterozidi ekstrahuju se etanolom ili metanolom i razdvajaju

na tankom sloju silikagela. Kao poredbene supstance koriste se istiantranoidi (npr. aloin, emodin) ili autentini ekstrakti (npr. sena ekstraktHRS).

z Posthromatografska derivatizacija vri se pomou kalijum-hidroksida -Borntrger-ova reakcija.

z Hromatogram se posmatra na dnevnoj svetlosti (boja zona) i pod UV svetlou na 365 nm (fluorescencija zona), posle ili pre i poslederivatizacije. Nekada se hromatogram zagreva na 100-105 C, pri emu se antroni oksiduju do antrahinona.

z Tabela. Boja i fluorescencija zona antranoida pre i posle derivatizacije bazom (KOH)

Pre prskanja KOHAntranoid

Dnevna svetlost UV (365 nm) Dnevna svetlost UV (365 nm)

Antrahinon utonarandasta narandasta crvenoljubiasta crvenoljubiasta

Antron uta crvena uta uta

z Dokazivanje hidroksiantracenskih derivata u kori kruine,Frangulae cortex (Ph. Eur. 6.0; Ph. Jug. V)

z Princip: antrahinonski heterozidi ekstrahuju se iz droge etanolom i razdvajaju na tankom sloju silikagela. Dokazivanje se vri pomou rastvora kalijum-hidroksida (Borntrger-ova reakcija). Hromatogram se posmatra na dnevnoj svetlosti. Zone antrahinona obojene su crvenosmee.

z Dokazivanje hidroksiantracenskih derivata u listu sene, Sennae folium (Ph. Eur. 6.0; Ph. Jug. V)

z Princip: hidroksiantracenski heterozidi ekstrahuju se iz droge etanolom i razdvajaju na tankom sloju silikagela. Kao poredbena supstanca koristi se autentini ekstrakt sene (ne koriste se isti senozidi, jer ih je teko izolovati!). Zatim se, na tankom sloju, izvri hidroliza heterozida i oksidacija antrona do antrahinona pomou azotne kiseline uz zagrevanje. Dokazivanje se vri pomou rastvora kalijum-hidroksida (Borntrger-ova reakcija). Hromatogram se posmatra na dnevnoj svetlosti. Zone antrahinona obojene su crveno.

z Napomena: s obzirom da je list sene bogatiji u senozidu C i D u odnosu na plod obe sene, zone senozida C i D na hromatogramu lista su jasno uoljive, dok su na hromatogramu plodova samo slabo vidljive (razlikovanje lista od plodova sene!).

z ODREIVANJE ANTRANOIDA (KVANTITATIVNA ANALIZA)z Odreivanje antranoida moe da se vri:z SPEKTROFOTOMETRIJSKI (prema farmakopejama)z HROMATOGRAFSKI: HPLC.

z SPEKTROFOTOMETRIJSKO ODREIVANJEz Za kvantitativnu analizu antranoidnih droga farmakopeje propisuju

spektrofotometrijski postupak. S obzirom da droge sadre sloene smee antranoidnih sastojaka (razlikuju se po stepenu oksidacije i nainu glikozilovanja), rezultati ovih odreivanja odstupaju od realnih vrednosti, koje se mogu dobiti HPLC metodom. Meutim, tanost spektrofotometrijske metode zadovoljava potrebe prakse, zbog ega ga propisuju i najsavremenije farmakopeje.

z Cilj farmakopejskih metoda jeste da se utvrdi sadraj glikozidno vezanih antranoida. Slobodni antranoidi se ne odreuju, jer nisu bitni za delovanje.

z Princip: hidroksiantracenski heterozidi ekstrahuju se iz droge metanolom ili vodom. Slobodni aglikoni se uklone organskim rastvaraem (npr. petroletrom, hloroformom ili smeom etra i heksana).

z Zatim se izvri oksidacija antronskih heterozida do antrahinonskih pomou gvoe(III)-hlorida. Antrahinonski heterozidi (nativni i nastali oksidacijom antronskih), podvrgnu se kiseloj hidrolizi (zagrevanje sa HCl). Osloboeni antrahinonski aglikoni preuzmu se organskim rastvaraem (etrom ili smeom etra i heksana). Viak gvoe(III)-jona ukloni se izmukavanjem organskog rastvaraa vodom. Odreivanje se vri spektrofotometrijskim postupkom.

z Starije farmakopeje, npr, Ph. Jug. IV, propisivale su odreivanje zasnovano na Borntrger-ovoj reakciji, , tj. na graenja crvenih fenolata sa bazama.

z Prema savremenim farmakopejama (Ph. Eur. 6.0; Ph. Jug. V) spektrofotometrijsko odreivanje zasniva se na modifikovanoj Borntrger-ovoj reakciji (graenje crvenih helata sa magnezijum-acetatom). Metoda je modifikovana jer su crveni Mg-helati stabilniji od crvenih fenolata!

z Primeri:z -odreivanje antranoida u Frangulae

cortex, Rhei radix, Sennae folium, Sennae fructus acutifoliae i Sennae fructus angustifoliae prema Ph. Eur. 6.0 i Ph. Jug. V.

EKSTRAKCIJA DROGE (H2O ILI MeOH)

ANTRAHINONSKI HETEROZIDI

ANTRAHINONSKI AGLIKONI

PREUZIMANJE AGLIKONA ETROM

SPEKTROFOTOMETRIJSKO ODREIVANJE (NA 515 nm)

OKSIDACIJA POMOU FeCl3

KISELA HIDROLIZA (HCl, T)

VIAK FeCl3 UKLONI SE VODOM

NEPOLARNA FAZA SA AGLIKONIMA SE ODBACUJE !

RASPODELA HETEROZIDA I AGLIKONA IZMEU POLARNE I

NEPOLARNE FAZE

RASTVOR HETEROZIDA

Slika . Shema ekstrakcije antracenskih derivata prilikom spektrofotometrijskog odreivanja

HROMATOGRAFSKO ODREIVANJE: HPLC

z U savremenoj strunoj literaturi za odreivanje antranoida u drogama navodi se HPLC metoda.

z Ona omoguava razdvajanje sloene smee antranoida i odreivanje pojedinanih sastojaka.

z Meutim, kao to je ve reeno, farmakopeje propisuju spektrofotometrijski postupak, ija tanost zadovoljava potrebe prakse.

Veba VDokazivanje i odreivanje antrahinona

z 1a. Dokazivanje hidroksiantracenskih derivata (Ph. Jug. V i Ph. Eur. 6.0)

z Oko 50 mg spraene droge (180) prelije se sa 25 ml razblaene hlorovodonine kiseline (7,3%) i zagreva oko 15 minuta na vodenom kupatilu. Posle hlaenja izmuka se sa 20 ml etra i vodeni sloj odbaci. Etarski ekstrakt izmuka se sa 10 ml amonijaka (10%). Vodeni sloj oboji se crvenoljubiasto (Borntregerova reakcija).

z Droge: Frangulae cortex, Rhei radix.

z 1b. Dokazivanje hidroksiantracenskih derivata mikrosublimacijom (Ph. Jug. IV)

z Frakcionom mikrosublimacijom pri 200-220 C nastaju narandaste iglice, koje se u amonijum-hidroksidu ili rastvoru alkalnih hidroksida rastvore tamnocrvenom bojom (Borntregerova reakcija).

Droga T (C) Mikrosublimat Reaktiv Boja

Frangulae cortex 200-220ukaste kapljice ili iglice

(1,8-dihidroksiantrahinoni: frangula-emodin)

tamnocrvena(Borntregerova

reakcija)

Gentianae radix 200-210 ukaste kapljice ili iglice(gentizin)

alkoholni rastvor KOH

uta

z 2. TLC analiza ekstrakta antrahinonskih drogaz a. TLC analiza ekstrakta kore kruine, Frangulae cortexz (Ph. Eur. 6.0)z Priprema ekstrakta:z 0,50 g spraene droge (180) ekstrahuje se sa 5 ml etanola (70%) zagrevanjem

uz povratni hladnjak na vodenom kupatilu do kljuanja. Supernatant se odlije i odmah nanosi na TLC plou.

z Rastvor za poreenje:z 20 mg barbaloina ratvori se u 10 ml etanola (70%).z Stacionarna faza:z Gotove aluminijumske ploe sa tankim slojem silikagela i fluorescentnim

indikatorom (Silica gel 60 F254).z Mobilna faza:z Etilacetat metanol - voda (100: 17: 13).z Nanosi se 10 l rastvora, u obliku trake.z Front rastvaraa: 10 cm.z Detekcija:z A. Ploe se sue na vazduhu 5 minuta i prskaju rastvorom KOH (50 g/l) u

etanolu (50%) i zagrevaju 15 minuta na 100-105 C. z Rezultat:z Pod UV svetlom (365 nm) se u srednjem delu hromatogramu uoava

smeeuta zona koja odgovara barbaloinu. Na hromatogramu ispitivanog rastvora se ne uoava nijedna intenzivno uto obojena zona, kao niti zona narandaste ili crvenkaste fluorescencije na Rf vrednosti slinoj Rf vrednosti barbaloina.

z B. Ploe se odmah prskaju rastvorom nitrotetrazolijum-plavog u metanolu (5 g/l) i posmatraju na dnevnom svetlu.

z Rezultat:z Na hromatogramu ispitivanog rastvora ne pojavljuju se ljubiaste ili sivkastoplave zone.

3. Odreivanje sadraja antrahinonskih heterozida u kori kruine, Frangulae cortex (Ph. Eur. 6.0)

z Odmeriti 0,25 g droge u praku (180) u tarirani balon okruglog dna. Dodati 25 ml metanola (70%), izmeriti ukupnu masu i zagrevati 15 minuta na vodenoj pari uz povratni hladnjak. Kada se ohladi, dopuniti do prvobitne mase metanolom (70%) i filtrirati.

z 5 ml filtrata pomea se u levku za odvajanje sa 50 ml destilovane vode i 0,1 ml (2 kapi) koncentrovane hlorovodonine kiseline i pet puta izmuka sa po 20 ml petroletra. Vodeni sloj se prenese u odmernu tikvicu od 100 ml. Spojene petroletarske frakcije se ispiraju dva puta sa po 15 ml destilovane vodom i vodene frakcije prebace u odmernu tikvicu. U odmernu tikvicu dodati 5 ml rastvora natrijum-karbonata (50 g/l) i dopuniti vodom do 100 ml.

z 40 ml ovog rastvora se prebaci u balon okruglog dna od 200 ml, doda 20 ml rastvora gvoe(III)-hlorida (200 g/l) i zagreva 20 minuta uz povratni hladnjak i ee mukanje u kljualom vodenom kupatilu.

z Zatim se doda 2 ml koncentrovane hlorovodonine kiseline i ponovo zagreva 20 minuta uz ee mukanje, da se nastali talog rastvori.

z Kada se ohladi, smesa se izmuka u levku za odvajanje 3 puta sa po 25 ml etra.z Sjedinjeni etarski ekstrakti se ispiraju 2 puta sa po 15 ml destilovane vode,

profiltriraju preko suvog filter papira i bezvodnog natrijum sulfata i etarski sloj prebaci u suvu odmernu tikvicu od 100 ml i dopuni etrom do oznake.

z 20 ml etarskog ekstrakta se paljivo upari do suva, ostatak rastvori u 10 ml rastvora magnezijum-acetata u metanolu (5 g/l) (ispitivani rastvor).

z Apsorbancija rastvora se meri na 515 nm uz metanol kao slepu probu.

z Sadraj antrahinona se izraava kao sadraj (%) glukofrangulina A, ija je specifina apsorbancija A 1%/1cm= 204, prema formuli:

z % antrahinona =

z A = apsorbancija ispitivanog rastvoraz m = masa droge u gramima

mA 06,3

AntranoidiAnaliza antranoidaOsnovne klase antranoida, njihova biogenetska povezanost i tip supstitucijeHROMATOGRAFSKO ODREIVANJE: HPLCVeba VDokazivanje i odreivanje antrahinona