Upload
nda-azza
View
501
Download
28
Embed Size (px)
Citation preview
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
1/50
KROMATOGRAFI KOLOM
Tresna Lestari, M.Si., Apt
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
2/50
PENGERTIAN
Kromatografi kolom adalah kromatografi
yang menggunakan kolom sebagai alat
untuk memisahkan komponen-komponen
dalam campuran.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
3/50
KROMATOGRAFI KOLOM
Merupakan kelanjutan dari KLT
Prinsip sama dengan kromatografi lapis tipis
Digunakan untuk memurnikan senyawa ataumemisahkan campuran
Dilaksanakan dalam suatu kolom yang diisi
dengan fase diam Fase diam : Padat, cair
Fase gerak : Cair, gas
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
4/50
PEMBAGIAN KROMATOGRAFI KOLOM
Fase Diam Fase
Gerak
Jenis
Kromatografi
Padat
Cair KK, KCV, KCKT
Gas KG
CairCair KCKT
Gas KG
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
5/50
MAKANISME PEMISAHAN
KROMATOGRAFI KOLOM
Kromatografi Adsorbsi, komponen yang dipisahkan secaraselektif teradsorbsi pada permukaan adsorben.
Kromatografi Partisi, analit mengalami partisi antara
lapisan cairan fase diam (stasioner) & eluen sebagai fasegerak (mobile).
Kromatografi Pertukaran Ion, komponen berbentuk ionyang terikat pada penukar ion sebagai fase stasioner secaraselektif akan terlepas/terelusi oleh fase mobile.
Kromatografi Filtrasi Gel, fase diam berupa gel permeabel,pemisahan berlangsung spt proses pengayakan ygdidasarkan pd ukuran molekul dr komponen yg dipisahkan.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
6/50
KROMATOGRAFI ADSORBSI
Zat padat sebagai adsorben / fase stasioner
Alumina & silika gel paling populer
Urutan dari kemampuan adsorbsi besar ke kecil :
Alumina
Charcoal
Silika gel
Magnesium
Kalium karbonat Sukrosa
Starch
Selulosa
POLAR
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
7/50
Zat cair sebagai fase gerak/mobile
Elusi terlalu cepat tidak mampu memisahkan campuran
dengan baikElusi terlalu lambat menyebabkan waktu retensi terlalu
lama
Golongan pelarut yang diurutkan berdasarkan kenaikan
adsorbilitasnya pd kolom alumina : Perfluorokarbon
Hidrokarbon jenuh
Hidrokarbon tak jenuh
Halida & eter Aldehid & keton
Alkohol & thiol
Asam & basa
POLAR
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
8/50
KROMATOGRAFI KOLOM KLASIK
Didasarkan pada adsorbsi komponen campurandengan afinitas berbeda terhadap permukaan fasediam.
Adsorben bertindak sebagai fase diam dan fasegeraknya adalah cairan yang mengalir membawakomponen campuran sepanjang kolom.
Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadapadsorben akan secara selektif tertahan danafinitasnya paling kecil akan mengikuti aliran pelarut.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
9/50
Cara Penggunaan
Kromatografi Kolom
1. Sampel dikeringkan menggunakan fase diam
2. Sampel dituangkan melalui atas kolom
3. Masukkan pelarut ke dalam kolom
4. Komponen dalam sampel teradsorbsi oleh bahan
penyerap berupa pita sempit pada permukaan
kolom.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
10/50
5. Dengan penambahan pelarut secara terus menerus,masing-masing komponen akan bergerak turun
melalui kolom dan akan terbentuk pita yang setiap
zona berisi satu macam komponen.
6. Setiap zona yang keluar kolom dapat ditampung
dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar
kolom.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
11/50
Gambar kromatogafi kolom
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
12/50
HIGH PERFORMANCE LIQUID
CHROMATOGRAPHY
Fase stasioner berupa cairan dan padatan
Fase diam cair : Pelarut lebih polar (kromatografi fase normal)
Pelarut non polar (krom fase terbalik)
Fase diam padat : Pellicular beads
Bagian dalam padat tidak berpori
Terbuat dari silika
Microporous particle
Ukurannya kecil 3-10mm sehingga luas permukaan besar
Effisiensi tinggi karena jumlah plat teoritik 10.000 dalam kolom
25 cm.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
13/50
HPLC FASE NORMAL
a. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang150 sampai 250 mm.
b. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan
fase gerak non polar misalnya heksan.
c. Senyawa-senyawa polar dalam campuran akan melekatlebih lama pada silika yang polar dibanding dengansenyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawayang non polar akan lebih cepat melewati kolom.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
14/50
HPLC FASE TERBALIKa. Ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi
non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon
panjang pada permukaannya secara sederhana baik
berupa atom karbon 8 atau 18.
b. Fase gerak yang digunakan pelarut polar berupa
campuran air dan alkohol seperti metanol.
c. Senyawa-senyawa non polar akan terikat lebih lama di
dalam kolom sehingga memiliki waktu retensi yanglebih lama.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
15/50
Rangkaian Dasar Kolom HPLC
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
16/50
1. Eluen, berfungsi sebagai fase gerak yang akan
membawa sampel masuk ke dalam kolompemisah.
2. Pompa, berfungsi untuk mendorong eluen dan
sampel masuk ke dalam kolom. Kecepatan alirdapat dikontrol dan perbedaan kecepatan bisa
mengakibatkan perbedaan hasil.
3. Injektor, tempat memasukkan sampel danselanjutnya sampel dapat didistribusikan
masuk ke dalam kolom.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
17/50
4. Kolom pemisah, untuk memisahkan
komponen yang ada dalam sampel.5. Detektor, berfungsi membaca komponen
yang lewat ke dalam detektor.
6. Rekorder data, berfungsi merekam dan
mengolah data yang masuk
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
18/50
KOLOM
Dari bahan stainless steel. Panjang 10-25 cmdan diameter 4,5-5,0 mm yg diisi dg fase
stationer berukuran rata-rata 5-10mm.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
19/50
DETEKTOR
Mempunyai sensitivitas yang tinggi
Bersifat linear untuk jangka konsentrasi
tertentu
Dapat mendeteksi eluen tanpa mempengaruhi
resolusi kromatogam
Tidak terlalu peka terhadap perubahan
berbagai parameter terutama suhu & tekanan
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
20/50
MACAM DETEKTOR Detektor UV
Untuk senyawa yang mempunyai serapan khusus di daerah UV
& sinar tampak.
Pengukuran secara kuantitatif berdasar Hk Lambert-Beer yangmenghubungkan besaran absorbansi dengan konsentrasi solut.
Terdapat daerah deteksi UV (200-400nm) dan sinar tampak(400-700 nm) sehingga dapat mendeteksi hampir semua
senyawa organik.
Detektor Fluoresensi Untuk senyawa yang dapat berfluoresensi seperti aflatoksin,
seny aromatik berinti banyak, vitamin tertentu & derivat asamamino.
Sangat peka & dapat mendeteksi kadar senyawa yang sangatkecil
Kepekaan terhadap senyawa asing sebagai kontaminan dalameluen dapat mengganggu kuantifikasi senyawa yg diukur.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
21/50
Detektor Konduktivitas Untuk mengukur senyawa yang bersifat ionik
Perlu dihindari penggunaan buffer ion karena mempunyaikonduktivitas yang tinggi
Detektor Indeks Refraksi Prinsip kerja perubahan nilai indeks refraksi dari suatu cairan
yang mengalir
Untuk analisis gula dan lemak
Detektor FID (Flame Ionization Detector) Senyawa pelarut dihilangkan dahulu
Eluen dr kolom dialirkan ke evaporator kemudian ke alat pirolisisdan ke FID
Yang dianalisa hanya senyawa target
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
22/50
Interaksi Antara Fase Diam dan Analit
(Adsorbsi Isotermik)
a. Tipe konkap, terjadi bila mula-mula linaruttidak kuat interaksinya. tetapi kemudianmenjadi lebih kuat sehingga terikat lamapada fase diam. berarti K < 1
b. Tipe normal (linier), ikatan yang terjadi padasetiap saat panggah atau tetap. Sehinggaberupa garis lurus dan K = 1.
c. Tipe konvek, adsorpsi mula-mula terikatdengan kuat oleh fese diam, tetapi makinlama makin lemah sehingga bentuk kurvanyamenjadi konvek atau harga K>1
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
23/50
Contoh Gambar Adsorbsi Isotermik
23
Gambar:
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
24/50
Retensi (Tambat)
Sifat retensi suatu linarut menggambarkan
jenis distribusi linarut diantara fase gerak dan
fase diam
Retensi diukur berdasarkan waktu dimana
sampel diinjeksikan sampai sampel
menunjukkan ketinggian puncak yang
maksimum dari senyawa itu.
Retensi ini dinyatakan sebagai VR (volume
tambat) atau tR
(waktu tambat)
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
25/50
Volumefase gerak yang diperlukan untuk
membawa linarut dari kolom sampai ke
detektor dinamakan volume retensi (VR)
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa untuk
bergerak melalui kolom menuju detektor
disebut waktu retensi (tR)
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
26/50
Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan
sangat bervariasi dan bergantung pada:
Tekanan yang digunakan (karena itu akan
berpengaruh pada laju alir dari pelarut)
Kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuatdari material apa, tetapi juga pada ukuran
partikel)
Komposisi yang tepat dari pelarut
Temperatur pada kolom
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
27/50
27
Tambat Relatif
Tambat relatif () merupakan rasio tambat antara dualinarut yang berbeda setelah dielusi
Makin besar harga akan makin besar selisih waktutambat linarut 2 - waktu tambat linarut 1.
Berarti kedua puncak linarut tersebut dapat terpisah
dengan baik. Keadaan tersebut menggambarkan kemampuan fase
membedakan linarut 1 dan linarut 2.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
28/50
Campuran sebelum elusi
Puncak dan Bercak
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
29/50
Keterangan
29
Puncak pada KCKTp-dihidroksi benzen palinglama tertahan dalam kolom dengan fase diam
silika gel. Karena iktannya paling kuat.
Bercak pada KLTp-dihidroksi benzin paling
pendek migrasinya, karena ikatan dengan fasediam silika paling kuat.
Makin dekat gugus hidroksil, ialah meta dihidroksi
dan o dihidroksi benzen paling mudah terelusi
oleh pelarut karena ikatan adsorbsinya dengan
silika makin lemah.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
30/50
KROMATOGRAFI GAS
Adalah teknik untuk memisahkansenyawa atsiri dalam fase gas melalui fasediam
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
31/50
Macam Kromatografi Gas
Kromatografi gas - padat : fase diam adalah
butiran-butiran adsorben dan fase gerak
adalah gas
Kromatografi gas - cair : fase diam adalah
cairan yang disalutkan pada permukaan tipis
butiran padat dan fase gerak adalah gas
http://www.catatankimia.com
http://www.catatankimia.com/http://www.catatankimia.com/7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
32/50
RANGKAIAN DASAR ALAT
KROMATOGRAFI GAS
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
33/50
Bagian dasar kromatografi gas :
1. Sistem gas pembawa
2. Sistem pemasukan cuplikan
3. Sistem pemanasan kolom
4. Kolom
5. Sistem deteksi
6. Sistem pengolah data
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
34/50
Syarat Sampel
Harus memiliki keatsirian yang cukup(Volatil)
Stabil terhadap panas
Tidak terdekomposisi pada suhuoperasional KG (< 450oC)
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
35/50
1. Lembam
2. Koefisien difusi gas rendah
3. Kemurnian tinggi
4. Mudah didapat dan murah
5. Cocok dengan detektor yang dipakai
Contoh gas pembawa : N2, He, H2, Ar, dll
Syarat Gas Pembawa
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
36/50
PRINSIP KERJA KROMATOGRAFI GAS
Injektor merupakan tempat masuknya sampel kedalam sistem KG
Injektor dipanaskan antara 150 ~ 250oC gunamenguapkan sampel dan pelarutnya.
Linarut-linarut yang berfase uap ini akandigerakkan ke kolom oleh gas pembawa.
Kolom berada dalam oven yang terkontrol
suhunya. Laju migrasi komponen sampel dalam kolom
ditentukan oleh : sifat-sifat fisikokimianya,suhu dan komposisi kolom.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
37/50
Dalam kolom, komponen sampel mengalir dengan
kecepatan yang berbeda-beda. Komponen yang bergerak tercepat akan keluar dari
kolom paling awal dan diikuti dengan sisanya.
Komponen yang terpisah menuju detektor akanmenghasilkan sinyal listrik yang besarnya
proporsional.
Sinyal listrik tersebut akan diperkuat oleh amplifier.
Kromatogram akan dicatat oleh rekorder berupa
puncak.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
38/50
GAS DAN DETEKTOR
Detektor GasPembawa
GasPembakar
GasPendukung
1. TCD He/Ar/N2/H2 __ _____
2. FID He/N2 H2 Udara
3. FTD He/N2 H2 Udara
4. FPD He/N2 H2 Udara
5. ECD N2 __ _____
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
39/50
GAS DAN TEKANAN
Tipe Gas Tekanan Gas yang dibutuhkan
1. Gas Pembawa 7 kg/cm2 atau lebih tinggi
2. Gas Pembakar 2 kg/cm2 atau lebih tinggi
3. Gas Pendukung 2 kg/cm2 atau lebih tinggi
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
40/50
SISTEM DETEKSI
( DETEKTOR)Detektor Senyawa yang
terdeteksiJumlahminimum
TCD Semua senyawa kecuali gaspembawa
10 ppm (10 ng)
FID Senyawa organik 0,1 ppm (0,1 ng)
ECD Senyawa halogen/logamorganik
0,1 ppb (0,1 pg)
FTD Senyawa nitrogen/fosfor
organik
1 ppb (1 pg)/
0,1 ppb (0,1 pg)
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
41/50
THERMAL CONDUCTIVITY DETECTOR (TCD)
Mendeteksi semuasenyawa yangmemiliki perbedaan
konduktivitas dengangas pembawa.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
42/50
FLAME IONIZATION DETECTOR (FID)
Sensitif terhadapsenyawa-senyawaorganik padaumumnya.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
43/50
ELECTRON CAPTURE DETECTOR (ECD)
Sensitif terhadapsenyawa-senyawa
halogen dan logamorganik.
Biasanya untuk analisispestisida organoklorin
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
44/50
FLAME THERMIONIC DETECTOR (FTD
/NPD)
Sensitif terhadap senyawafosfor organik dannitrogen organik.
Biasanya untuk analisispestisida dan produkmedikal.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
45/50
FLAME PHOTOMETRIC DETECTOR (FPD)
Sensitif terhadapsenyawa-senyawafosfor organik,
sulfur organik dantimah organik.
Biasanya untukanalisis pestisidadan flavour.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
46/50
SISTEM PENGOLAH DATA
Sinyal yang didapat dari detektor akan direkamdalam bentuk kromatogram dan diolah.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
47/50
KROMATOGRAM
Kromatogram ideal mempunyai deretanpuncak yang rapat namun tidakbertumpukkan.
Ukuran puncak hasil analisis berhubunganbanyaknya senyawa dalam cuplikan.
Bila konsentrasi sebuah senyawabertambah maka ukuran puncakpunmembesar.
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
48/50
Contoh Kromatogram
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
49/50
Contoh Kromatogram
7/29/2019 5. KROMATOGRAFI KOLOM
50/50
TERIMAKASIH