天然蟛蜞菊内酯提取与精制

报 告 人：唐桂文指导教师：丁辉 副教授报告日期： 2012.11.25

目录

研究背景与意义

实验进展

研究内容与工作计划

参考文献

蟛蜞菊内脂文献综述

研究背景与意义

研究背景乌髭发，益肾阴。

—— 《本草纲目》

入肾补阴而生长毛发，又能入血，为凉血止血之品。 —— 《本草正义》

蟛蜞菊内酯 (Wedelolactone ) 是菊科植物墨旱莲中的主要活性成分，现代医学发现蟛蜞菊内酯具有促进毛发细胞、肝细胞生长、免疫调节和抗肿瘤、抗衰老作用。

这些是关于墨旱莲的记载，古代的许多医药典籍上还有很多类似记载。这不仅意味墨旱莲有着美容的功效，在根本上来说是增强细胞活力和抗衰老问题。

研究对象 蟛蜞菊内酯（ Wedelolactone ）

分子式： C16H10O7

CAS 号： 524-12-9

性状： 蟛蜞菊内脂为灰黄色粉末， mp315℃ ，不溶于水，溶于有机 溶剂，在 DMSO 中的溶解度为 14mg/ml 。紫外灯下，蓝色荧光。 作用：抗肿瘤、保肝、抗蛇毒、酶抑制等，具有重要的药用价值。

研究定位

蟛蜞菊内酯

化学合成法：苯基香豆素类化合物的去甲基修饰法、 4- 羟基香豆素化合物环合法、酶催化制备香豆酮法、 由芳香醛合成 4- 羟基香豆素、环化等系列反应。

从天然产物中提取分离纯化制得。

※ 现存问题

反应合成蟛蜞菊内酯，需投入大量的资金，且操作工序复杂，合成产品 蟛蜞菊内酯较天然产物提取生物活性低，功效差。 现有天然产物提取纯化制备工艺尚不成熟，只适用于小剂量制备，为毫 克级。

研究定位

从墨旱莲中提取蟛蜞菊内酯工艺研究。从墨旱莲中提取蟛蜞菊内酯工艺研究。

研究 2

研究 1

将粗提物分离纯化得到高纯度，大剂量的蟛蜞菊内酯的工艺探索。将粗提物分离纯化得到高纯度，大剂量的蟛蜞菊内酯的工艺探索。

研究意义

可实现低投入高产出

对新药的研发具有重要的促进作用

墨旱莲作为提取蟛蜞菊内酯的天然产物，分布广泛，价格低廉。

ContentTitle

天然产物的研究与应用，符合人类回归大自然和追求健康的大趋势，是国际上各国争相竞争的热门领域之一。从天然产物中分离有效成分及寻找先导化合物 (lead compound) 是药物开发和生命保健领域的重要内容。

蟛蜞菊内酯价格昂贵

文献综述 - 提取 天然蟛蜞菊内酯的提取方法

中药提取新技术

传统的提取方法煎煮法、浸渍法、渗滤法、回流法、逆流浸出法等。这些方法普遍存在着有效成分提取不高 , 杂质清除率低 , 能耗高 , 溶剂用量大，后处理工序工作量大、生产周期长等缺点。

超临界流体萃取技术（ SFE ）超声波提取半仿生提取法（ SBE ）酶工程技术微波辅助萃取技术（ ME ）双水相萃取技术（ ATPE ）

微波萃取法：具有萃取时间短 , 溶剂用量少 , 提取率高 , 溶剂回收率高 , 所得 产品品质好 , 成本低 , 投资少等诸多优点。其已成为提取天然 产物的有效方法之一。

文献综述 - 提取

微波提取技术天然化合物及生物活性成分的提取中的应用

Ganzler 等运用微波辅助提取对植物原料、食物及土壤中多种类型的化合 物（天然脂肪、蚕豆嘧啶葡糖苷、棉子酚、鹰爪豆碱及其代谢物）进行 了研究，微波辅助提取产物的产率与传统的索式提取或机械振荡提取相 当，但微波辅助提取明显快于传统方法。

Wang Junlong 等研究了蕨麻多糖的提取，通过微波辅助萃取法和常规提 取法的比较，得出微波辅助萃取具有提取速率快，节省劳力和能量等特点。 Yang Zhendong 等研究了微波辅助萃取紫色玉米棒中的花青素，并运用 响应面法优化了提取工艺条件，如萃取时间、固液比、微波功率等，结 果显示微波辅助萃取具有提取效率高，提取时间少等优点。

微波萃取法在天然产物中应用的报道还有很多，但是微波辅助提取墨旱莲中 有效成分鲜有报道。

※ 本课题采用微波萃取法提取天然蟛蜞菊内酯，并通过响应面法对其提取工艺 进行优化。

文献综述 - 纯化※ 天然产物粗提物成分复杂，需要进一步的分离纯化才能得到目标产物， 目前主要用的分离纯化方法主要有大孔树脂吸附法，柱层析法，高速 逆流色谱法，膜分离技术法，高效液相色谱法。

纯化方法 优点 缺点大孔树脂

吸附法具有选择性好、吸附容量大、吸附效率高、解析容易、再生处理方便、

吸附剂种类多等

分离结果目标产物的纯度不高

柱层析法 设备简单，分离效果较好，重复性高可有效分离目标产物

流动阻力与分离效率之间的矛盾，缺乏完善的过程模拟计算

方法，不利于工程化膜分离技术 - 超滤

不发生相变、节能、有效成分理化性质稳定、可重复使用

膜的污染和劣化

高速逆流色谱分离纯化技术

连续高效、样品易于回收、便于操作、节省溶剂、处理量大

溶剂系统的选择，其次分离机理研究尚不成熟，仪器放大技

术有待解决。高效液相

色谱法制备量大、产率和纯度高、分离速

度快操作条件难找，填料筛选困难

文献综述 - 纯化

※ 现有文献关于从墨旱莲的提取液中分离蟛蜞菊内酯，就是将提取液减 压浓缩成浸膏，以不同极性有机溶剂萃取出各部位，在中弱极性部位 （乙醚部位，乙酸乙酯、乙醚 - 甲醇 4:1部位，正丁醇部位）色谱法分离 提纯得蟛蜞菊内酯单体。

M. Kobor 等利用 Toyopearl HW40凝胶填料纯化乙酸乙酯部位得到 99.7% 纯度的蟛蜞菊内酯。 Wagner 等就从 E.albaL 中提取分离蟛蜞菊内酯的方法申请德国专利， 该技术为提取液浓缩得浸膏，乙酸萃取乙酯部位经 C18 反相 HPLC梯 度洗脱分离得蟛蜞菊内酯。 Kokai 等利用 SephadexLH-20柱色谱分离蟛蜞菊内酯获得日本专利。

文献综述 - 纯化

钟显科将提取液经过粗分、精制纯化得到蟛蜞菊内酯。具体工艺流程如下：

墨旱莲提取液减压浓缩

浓缩浸膏大孔树脂

粗分含蟛蜞菊内酯洗脱液

硅胶柱层析

粗分含蟛蜞菊内脂洗脱液

葡萄糖凝胶蟛蜞菊内酯 精制

该工艺繁琐，操作复杂，生产周期长，且制备量小。

※ 结论：寻求一种即经济又操作简单的适合于工业生产的分离纯化工艺是 必要的。

※ 本课题拟选用大孔树脂对墨旱莲的粗提取液粗分，然后分别选用重结晶法 和高效液相色谱法精制。

实验进展 - 提取

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微波辅助提取天然蟛蜞菊内酯

1. 电源开关 ; 2.电源指示 ; 3.微波指示 ; 4.时间设定 ; 微波功率显示 ; 6.温度 ; 7.微波开关 ; 8.微博调节 ; 9.循环水 ; 10.E-面弯波导 ; 11. 反应釜 ; 12.玻璃反应器 ; 13,搅拌器 14.红外测温

实验进展 - 提取

各因素对蟛蜞菊内酯收率影响图※ 最优提取条件：微波功率 208w ；乙醇纯度 90% （ v/v ）；提取时间 26.5min ； 固液比 33:1mL/g 。※ 蟛蜞菊内酯的收率：实验值 82.67±0.16% ；模拟值 82.89% 。

实验进展 - 提取

提取方法 提取时间 蟛蜞菊内酯收率 /%

室温常规方法提取 24h 67.79±2.59

超声提取 26.5min 63.16±0.10

加热回流提取 5h 62.93±0.82

微波辅助提取 26.5min 82.67 ±0.16

微波辅助提取与其他方法比较

提取条件： 90% (v/v) 乙醇 ; 墨旱莲处理量 , 5 g; 固液比 , 33:1 mL /g微波功率 , 208 W; 超生功率 , 208 W ; 室温 : 25.6 ; ℃ 加热回流温度 78 .℃

实验进展 - 纯化（参考文献）

数值型号

树脂极性

树脂外观

粒度 /mm 比表面 /(m2/g)

平均孔径/nm

孔容 /(mL/g)

AB-8 弱极性 乳白色不透明球状颗粒

0.3-1.25 480-520 13.0-14.3 0.73-0.77

X-5 非极性 0.3-1.25 500-600 29.0-30.0 1.20-1.24

NAK-2 极性 0.3-1.0 160-200 14.5-15.5 0.62-0.66

HPD-300 非极性 0.3-1.2 800-870 50.0-55.0 —

D101 非极性 0.3-1.25 480-520 25.0-28.0 1.18-1.24

树脂预处理：称取一定量树脂以乙醇湿法装柱； 2BV体积的乙醇浸泡 8h； 然后用乙醇冲洗树脂至洗脱液中加入水后无乳白色浑浊出 现；用大量蒸馏水冲洗至无醇味。

研究内容 - 纯化（参考文献）

大孔树脂筛选大孔树脂筛选

Add Your Text吸附率 蟛蜞菊内酯

纯度解析率 洗脱剂用量

静态吸附

筛选出合适的大孔树脂，用于粗分蟛蜞菊内酯。

研究内容

大孔树脂动态吸附（粗分）

初步考察上柱流速，大孔树脂用量，吸附温度等因素做正交试验，期望蟛蜞菊内脂在树脂上达到最大吸附量。

用不同浓度的洗脱剂进行洗脱，将含有蟛蜞菊内酯的洗脱液合并，用于下一步精制。

根据实验数据做出吸附动力学曲线和穿透曲线。 试着建立大孔树脂吸附蟛蜞菊内脂的传质模型。

研究内容

蟛蜞菊内酯（精制）

重结晶精制蟛蜞菊内酯。 高效液相色谱法精制蟛蜞菊内脂。

研究内容 蟛蜞菊内酯物性参数缺乏

结晶方法的选取

带来的问题

高相液相色谱柱调料的选取

※ 解决办法

拟采用化工模拟软件和相关文献报道的物性估算方法对蟛蜞菊内酯的物性参数进行估算。

缺点：存在误差

研究内容

重结晶（精制）

选择适宜的结晶溶剂，初步考察甲醇、乙醇和乙酸乙酯作为溶剂的结晶情况，专利中提到使用甲醇作为结晶溶液，但甲醇药物残留对人体有一定影响，而蟛蜞菊内酯溶于乙醇，因而下一步工作中寻找优化乙醇结晶工艺。

确定合适的结晶方法，尝试冷却结晶技术进行结晶分离，从而达到精致纯化的目的。

尝试溶析结晶方法，以水作为反溶剂对蟛蜞菊内酯饱和溶液进行滴加从而降低过饱和度达到溶析精致的目的。

研究内容

高效液相色谱法（精制）

检测波长的选择，通过对粗提样品的紫外全光谱扫描，来确定蟛蜞菊内酯的最大吸收波长。

流动相体系及配比的选择，选 0.5%醋酸 - 甲醇体系作为流动相（检测条件），体积比为 45:55.

流动相流速的选择，根据出峰情况和溶剂用量确定流速。

柱温及进样量的选择，使用制备用的色谱柱时，半制备液相不能控温，因此柱温为室温。进样量由柱子的分离性能确定

研究内容

样品复杂样品复杂

经验方法费时

经验方法费时

分离条件难找

分离条件难找

高效液相色谱法

※ 初步打算运用人工神经网络(Artificial neural network ， ANN ）对高效液相色谱中保留值模拟、预测以及分离条件的优化。

※ 色谱柱填料：拟打算由模拟估算出的物性参数，自己设计出一种填料，来分离纯化蟛蜞菊内酯。

工作计划 2012.11——2012.01 筛选大孔树脂，选出吸附量大，解析率高的大孔

树脂，运用正交试验方法获得最佳上柱条件，梯度洗脱，完成粗分工艺。

2013.02——2013.03 建立大孔树脂吸附蟛蜞菊内酯的传质模型。

2013.04——2013.07 考察重结晶法精制蟛蜞菊内脂。

2013.11——2014.04 运用高效液相色谱法精制蟛蜞菊内脂。

2014.04——2014.06 总结实验，撰写论文

参考文献1. 徐汝明，陆阳 . 蟛蜞菊内脂的研究进展 [J]. 中国科技论文在线 ,2011.2. 廖华军 . 中药提取新技术研究进展 [J]. 福建分析测试 ,2008,17(1),25-

30.3. Ganzler K, Salgo A, Valko K. Microwave extraction: a novel sample

preparation method for chromatograph [J]. Journal of Chromatography, 1986, 371: 299-306.

4. Chee K K, Wong M K, Lee H K. Microwave-assisted solvent elutiontechnique for the extraction of organic pollutants in water [J].Analytica Chimica Act, 1996, 330: 217-227.

5. Tomoki Yoshida, Shuntaro Tsubaki, Yoshikuni Teramoto, Jun-ichi Azuma. Optimization of microwave-assisted extraction of carbohydrates from industrial waste of corn starch production using response surface methodology[J]. Bioresource Technology 101 (2010) 7820–7826.

6. Junlong Wang, Ji Zhang, Baotang Zhao, Xiaofang Wang, Yiqian Wu, Jian Yao. A comparison study on microwave-assisted extraction of Potentilla anserinaL. polysaccharides with conventional method: Molecule weight and antioxidant activities evaluation[J]. Carbohydrate Polymers 80 (2010) 84–93.

参考文献7. Zhendong Yang, Weiwei Zhai. Optimization of microwave-assisted extraction of anthocyanins from purple corn (Zea mays L.) cob and identification with HPLC–MS[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies 11 (2010) 470–476.8. M Kobori, Z Yang, D Gong et al. Wedelolactone suppresses LPS-induced caspase-11 expression by directly inhibiting the IKK Complex[J]. Cell Death and Differentiation (2004) 11, 123–130.9. 钟显科 .墨旱莲中化学成分的抗肿瘤活性及总皂苷工艺优化研究 .华南理工 大学， 2011.10. 张力 . 微波辅助提取天然产物有效成分及丹参酮Ⅱ A 分离纯化工艺研究 .浙 江大学 .2008.11. 吴红 , 梁恒 , 吴道澄 ,袁忠海 . 大孔吸附树脂法分离纯化山茱萸总皂苷 [J]. 第 四军医大学学报 ,2003,24(8),689-692.12. 李淑珍 ,李进 , 杨志江 , 原惠 . 黑果枸杞类黄酮的提取和精制工艺研究 [J]. 食 品研究与开发 ,2008,29(8),82-87.