LAPORAN PRAKTIKUM TOKSIKOLOGI UJI KETOKSIKAN SUBKRONIS
Di susun oleh : Natalia Noveli Hardita (088114130) Octo Rahadian
Pius (088114149) Yohana Tika Ameliawati (088114159) Lilia C. Y.
Rogan (088114167) Meiske Munda (088114177) Agnes Afriana Fajarwati
(088114194)
LABORATORIUM TOKSIKOLOGI FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA
DHARMA YOGYAKARTA 2010
UJI KETOKSIKAN SUBKRONISI. Latar Belakang Setiap obat baik obat
sintesis maupun obat tradisional yang diproduksi oleh pabrik
industri harus diuji terlebih dahulu. Salah satu parameter yang
digunakan adalah uji ketoksikan. Uji ketoksikan dibagi menjadi dua
bagian yaitu uji ketoksikan khas dan uji ketoksikan tak khas.
Pengujian ketoksikan dari suatu produk sediaan farmasi atau obat
tradisional merupakan salah satu pengujian yang penting atau wajib
dilakukan oleh pabrik atau produsen produk tersebut, hal ini
dikarenakan uji ketoksikan menunjukkan tingkat keamanan pengunaan
dari produk yang bersangkutan, karena hal ini berkaitan langsung
dengan keamanan terutama untuk pengguna produk tersebut. Penelitian
mengenai obat tradisional tanaman obat, terus berlangsung bahkan
meningkat jumlahnya akhir-akhir ini. Meskipun demikian, dalam
kenyataannya hingga saat ini baru beberapa penelitian obat
tradisional ataupun tanaman obat yang digunakan dalam fasilitas
pelayanan kesehatan. Obat yang digunakan pada fasilitas pelayanan
kesehatan harus memenuhi persyaratan aman, bermanfaat dan sudah
terstandarisasi. Bukti yang diperlukan harus didasarkan pada data
yang sahih. II. Permasalahan 1. Seberapa besar spektrum efek toksik
sediaan uji terhadap organ (hepar, ginjal, lien, lambung, usus,
jantung, paru-paru, organ kelamin) yang dinilai dari histopatologi
masing-masing organ tersebut? 2. Bagaimana hubungan kekerabatan
antara dosis senyawa uji dengan efek toksisitas subkronis pada
organ (hepar, ginjal, lien, lambung, usus, jantung, paru-paru,
organ kelamin) hewan uji? 3. Bagaimana keterbalikan
(reversibilitas) spektrum efek toksik yang terjadi?
III. Manfaat 1. Manfaat teoritis Percobaan ini diharapkan dapat
bermanfaat bagi pengembangan ilmu kefarmasian, ilmu kedokteran dan
pengetahuan tentang uji ketoksikan subkronis 2. Manfaat praktis
Percobaan ini dapat memberikan informasi kepada masyarakat tentang
wujud efek toksik subkronis pada organ (hepar, ginjal, lien,
lambung, usus, jantung, paru-paru, organ kelamin) akibat pemberian
senyawa uji IV. Tujuan 1. Tujuan umum Mengetahui wujud efek toksik
sub kronis pada organ (hepar, ginjal,lien, lambung, usus, jantung,
paru-paru, organ kelamin) akibat pemberian senyawa uji 2. Tujuan
khusus Mengetahui spektrum efek toksik sediaan uji pada organ
(hepar, ginjal, lien, lambung, usus, jantung, paru-paru, organ
kelamin) dinilai dari histopatologi organ tersebut Mengetahui
kekerabatan antara dosis dengan spektrum efek toksik Mengevaluasi
keterbalikan (reversibilitas) spektrum efek toksik yang terjadi. V.
Penelaahan Pustaka Toksikologi mempelajari sifat-sifat racun zat
kimia terhadap makhluk hidup dan lingkungan. Sedikitnya 50.000 zat
kimia kini digunakan oleh manusia dank arena tidak dapat
dihindarkan, maka kita harus sadar tentang bahayanya (Darmansjah,
1999). Toksikologi berkenaan dengan sifat dan mekanisme luka toksik
dan evaluasi kualitatif maupun kuantitatif spektrum perubahan
biologis, yang ditimbulkan oleh pemejanan yang disengaja atau tak
disengaja dari zat toksik racun (Donatus, 2001). Uji ketoksikan
subkronis termasuk golongan uji ketoksikan tak khas yaitu uji
toksikologi yang dirancang untuk mengevaluasi keseluruhan atau
spektrum efek toksik suatu senyawa pada aneka ragam jenis hewan uji
(Loomis, 1978 cit Donatus 2001).
Uji toksisitas subkronis adalah uji ketoksikan suatu senyawa
yang diberikan dengan dosis berulang pada hewan uji tertentu,
selama kurang dari tiga bulan. Uji ini ditujukan untuk
mengungkapkan spectrum efek toksik senyawa uji serta untuk
memperlihatkan apakah spectrum efek toksik itu berkaitan dengan
takaran dosis (Donatus, 2001). Meskipun demikian, beberapa peneliti
mengggunakan jangka waktu yang lebih pendek, misalnya pemberian zat
selama 14 dan 28 hari (Lu, 1995). Dalam melakukan uji ini segala
perubahan berupa akumulasi, toleransi, metabolisme dan kelainan
khusus di oorgan atau system organ tertentu harus diperhatikan.
Pada waktu tertentu sebagian hewan uji perlu dibunuh untuk
mengevaluasi pengaruh bertahap obat terhadap organ. Sebagian lain
digunakan untuk eksperimen pemulihan guna mempelajari
reversibilitas dari kelainan yang terjadi. Pemerikasaan kimia
darah, urin, dan tinja perlu diusahakan agar dapat diikuti kelainan
yang timbul (Darmansjah, 1999). Pengamatan dan pemeriksaan yang
dilakukan dari uji ketoksikan subkronis meliputi : 1. 2. 3. 4. 5.
6. 7. Perubahan berat badan yang diperiksa paling tidak tujuh hari
sekali Masukan makanan untuk masing-masing hewan atau kelompok
hewan yang diukur paling tidak tujuh hari sekali Gejala kronis umum
yang diamati setiap hari Pemeriksaan hematologi paling tidak
diperiksa dua kali pada awal dan akhir uji coba Pemeriksaan kimia
darah paling tidak dua kali pada awal dan akhir uji coba Analisis
urin paling tidak sekali Pemeriksaan histopatologi organ pada akhir
uji coba (Loomis, 1978). Hasil uji ketoksikan subkronis akan
memberikan informasi tentang efek utama senyawa uji dan organ
sasaran yang dipengaruhinya serta perkembangan efek toksik yang
lambat berkaitan dengan takaran yang tidak teramati pada uji
ketoksikan akut (Donatus, 2001). Tujuan utama dari uji ini adalah
untuk mengungkapkan dosis tertinggi yang diberikan tanpa memberikan
efek merugikan serta untuk mengetahui pengaruh senyawa kimia
terhadap badan dalam pemberian berulang (Eatau dan Klaassen,
2001).
Tata cara pelaksanaannya adalah: 1. Pemilihan hewan uji, dapat
digunakan roden (tikus) dan nirroden (anjing), sebaiknya dipilih
hewan uji yang peka dan memiliki pola metabolisme terhadap senyawa
uji yang semirip mungkin dengan manusia. Disarankan paling tidak
satu jenis hewan uji dewasa, sehat, baik jantan maupun betina.
Jumlah yang digunakan paling tidak 10 ekor untuk masing-masing
jenis kelamin dalam setiap kelompok takaran dosis yang diberikan.
2. Pengelompokan, minimal ada empat kelompok uji yaitu 3 kelompok
dosis dan 1 kelompok kontrol negatif. Hal ini disebabkan karena
untuk regresi minimal digunakan 3 data sehingga dapat dianalisis
hubungan dosis dengan efek. 3. Takaran dosis, bergerak dari dosis
yang sama sekali tida menimbulkan efek toksis sampai dengan dosis
yang betul-betul menimbulkan efek toksik yang nyata. Minimal
digunakan 3 peringkat dosis degan syarat dosis yang tetinggi sebisa
mungkin tidak mematikan hewan uji tetapi memberi wujud efek toksik
yang jelas (nyata). Sedangkan dosis terendah yang digunakan
setingkat dengan ED50-nya. 4. Pengamatan, berupa wujud efek toksik
atau spektrumnya, semua jenis perubahan harus diamati (Loomis 1978
cit Donatus, 2001). Spektrum efek toksik dapat dibagi dua yaitu
efek lokal dan efek sistemik. Efek lokal dapat diakibatkan oelh
senyawa kaustik, misalnya pada saluran percernaan, bahan korosif
pada kulit dan iritasi gas atau uap pada saluran nafas. Efek lokal
seperti ini menggambarkan perusakan umum pada sel-sel hidup. Efek
sistemik terjadi hanya setelah toksikan diserap dan tersebar ke
bagian lain tubuh. Umumnya toksikan hanya memepengaruhi satu atau
beberapa organ saja. Organ seperti itu dinamakan organ sasaran.
Kadar toksikan dalam organ sasaran tidak selalu yang paling tinggi.
Sebagi contoh, organ sasaran metil merkuri adalah system saraf
pusat, tetapi kadarnya di hati dan ginjal jauh lebih tinggi (Lu,
1995). Penilaian toksisitas tidak langsung menilai keamanan tetapi
hanya satu-satunya variable yang dipertimbangkan dalam
memperkirakan bagaimana keamanan suatu zat nantinya selama
penggunaannya mudah dilaksanakan. Toksisitas suatu zat pada
hakekatnya tidak dapat diubah Karena ini adalah sifat dasar zat
tersebut. Hal ini memungkinkan untuk mengurangi keamanan zat toksik
dengan cara mengurangi resiko praktis kedapatan (Stine dan Brown,
1996).
VII. Metodologi Penelitian 1. 2. Jenis penelitian :
eksperimental murni Variabel : dosis senyawa uji : kerusakan
struktur anatomi organ hewan uji yang
a. Variabel bebas b. Variabel terikat c. Variabel pengganggu
dilihat dari gambaran histopatologinya. Variabel yang bisa
dikendalikan: - Jenis alat injeksi yang digunakan - Bobot badan
tikus yang digunakan - Umur Variabel yang tidak bisa dikendalikan:
- jumlah makanan yang dikonsumsi oleh tikus. - Kondisi patologis
tikus 3. Alat dan Bahan: Alat: Spuit injeksi dan jarum oral
Timbangan analitik Seperangkat alat gelas (gelas beker, gelas ukur,
pipet, labu takar) Seperangkat alat bedah (gunting, pinset)
Stopwatch mikroskop Mencit putih galur swiss masing-masing kelompok
5 ekor, umur 2Aquadest Formalin p.a. 10% Senyawa uji Eosin alkohol
Xilol paraffin
Bahan 2,5 bulan, berat badan 200-300 gram
-
Paraffin cair
VIII. Tatacara penelitian (Di modifikasi dari Sinarmata, 2004)
1. Penyiapan hewan uji Hewan uji yang digunakan 25 ekor,
ditempatkan dalam kandang khusus (satu kandang berisi satu mencit),
sedangkan sisanya ditempatkan dalam kandang biasa (satu kandang
berisi tiga mencit). Satu kelompok mendapatkan 5 ekor mencit, dan 5
ekor mencit sisanya sebagai cadangan 2. Pengumpulan bahan Senyawa
uji didapat dari laboratorium Toksikologi-Farmakologi, Fakultas
Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta. 3. Prosedur
pelaksanaan Dua puluh lima ekor mencit dibagi secara acak dalam 5
kelompok dosis. Kelompok I yaitu kelompok kontrol negatif diberi
aquadest sebanyak 0,5 mL, kelompok II-IV diberi senyawa uji ..
secara per oral dengan peringkat dosis berturut-turut. Pada hari
ke-15, 5 mencit dari masing-masing kelompok diambil secara acak,
kemudian hewan uji dikorbankan untuk diambil organnya Amati
penampakkan makroskopisnya dan ditimbang beratnya, lalu dimasukkan
ke dalam larutan formalin 10% untuk dibuat preparat hispatologi
menurut tatacara pengecatan hematoksilin eosin. Sementara anggota
kelompok yang masih hidup tetap dipelihara tanpa perlakuan
apapun.
Pada hari ke-15, semua hewan uji dikorbankan, diambil heparnya,
diamati penampakan makroskopis yang terjadi, ditimbang beratnya dan
dibuat preparat hispatologi. 4. Pengamatan Pengamatan gejala-gejala
fisik dilakukan setiap hari, asupan makanan dan jumlah urin
dihitung dan diukur seminggu sekali. 5. Pembuatan preparat
hispatologi Organ mencit dipotong-potong dengan mikrotom setebal 3
mm, kemudian difiksasi. Preparat dimasukan kedalam larutan etanol
secara bertingkat berturut-turut etanol 50% selama 30 menit, etanol
90% selama 30 menit, etanol mutlak selama 30 menit, masing-masing
2x perlakuan. Preparat kemudian dimasukan ke dalam xilol paraffin,
masukan kedalam oven selama 1,5 jam dalam suhu 60C. Pindahkan
preparat ke dalam paraffin cair selama 1,5 jam dalam blok preparat.
Setelah dicetak, preparat dipotong setebal 5 mikron, masukkan ke
dalam xilol murni selama 5-10 menit. Cuci preparat dengan air,
kemudian dimasukkan ke dalam larutan eosin alcohol selama 1-2
menit. Selanjutnya, preparat dikeringkan pada suhu kamar dan
ditutup dengan kanada balsam serta objek gelas. 6. Pemerikasaan
hispatologi sel hati Pemeriksaan sel hati mencit hasil pengecatan
hematosilin eosin dilakukan dibawah mikroskop dengan perbesaran
100x dan 400x.
Hasil pemerikasaan dibuat fotomikroskopi sebagai data
kualitatif, kemudian hasilnya diberi score menurut tingkat
kerusakannya. 7. Analisis hasil Pemeriksaan preparat histopatologi
dilakukan secara kualitatif desktriptif dengan membandingkan antara
kelompok kontrol dengan kelompok perlakuan untuk mengetahui
spektrum efek toksik sediaan uji terhadap organ hewan uji yang
terkena, dan juga untuk mengetahui hubungan kekerabatan antara
dosis dan spektrum efek toksik. Data diberi scoring lalu dianalisis
statistik secara Kruskal-Wallis dengan taraf kepercayaan 95%.
Perbedaan masing-masing kelompok perlakuan dinyatakan bermakna
apabila nilai p
