EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE LÍPIDOS TERPENICOS CAROTENOS

MANCILLA, C. G. E.; ROSAS, T. M; PÉREZ, S. L. J; CASTREJÓN, C. R. y BLANCO, E. Z.

Q.F.B.; V Semestre: Universidad del Valle de México, Campus Chapultepec

(Av. Constituyentes No. 151 Col. San Miguel Chapultepec. C.P. 11850 México, DF.)

RESUMEN:

En esta práctica se podrá encontrar la definición de los lípidos, su composición, tipos y estructuras, además de algunos de los métodos más utilizados para analizar y separarlos.

También se podrá encontrar la definición y tipos de terpenos que se encuentran en la naturaleza y que en esta práctica son objeto de estudio así mismo de los carotenos que son un tipo de tetraterpenos que constituyen tanto la coloración de las zanahorias (que son los vegetales utilizados para esta práctica) como su fuente nutrimental de aporte en vitaminas.

Para la extracción y separación de los carotenos de la zanahoria, se utilizaron 10 gramos de zanahoria las cuales se picaron y se les extrajeron los pigmentos vegetales por medio de alcohol al 95% hasta dejar la zanahoria incolora. Después para separar los carotenos de las xantofilas se utilizó un embudo de separación en el cual se lavó la solución y en la fase acuosa quedaron las xantofilas y en la orgánica los carotenos.

Después a los carotenos se les realizó una separación para obtener sus 3 tipos de componentes, es decir los alfa, beta y gama carotenos.

1

Resumen………………………………………………………………..….1Introducción……………………………………………………………..…2I.- Lípidos…………………..……………………………………………….….…2II.-Separación y análisis de glúcidos………………………………….…….…5III. Terpenos……..………………..……………………………………………...6IV. Carotenos……………………………..………………………………………7

Objetivos………….……………………………………….……………..…10Hipótesis………...……………………………………………….……..…..10

Material………………...……………………………………….………...…11 Metodología…………….………………………………………….……..….11 Resultados………………………..…………………………………………..11

Discusión de Resultados………………………………….………… ……….13 Conclusiones…………………………………………….……………………13

Referencias……………………………………………….……………...…….13

INTRODUCCIÓN

LÍPIDOS

Los lípidos biológicos constituyen un grupo químicamente diverso de compuestos cuyas características común y definitoria es su insolubilidad en agua. Sus funciones son diversas. [1]

Lípidos de almacenamiento

Las grasas y aceites [ácidos carboxílicos con cadenas hidrocarbonadas de 4-36 carbonos (en algunos completamente saturada sin dobles enlaces y sin ramificar y otros con uno o varios dobles enlaces); unos cuantos contienen anillos de 3 carbonos o grupos hidroxilo] son derivados de los ácidos grasos y sirven de almacenamiento de energía. La oxidación completa de los ácidos grasos a CO2 y H2O en las células es muy exergónica.

Las propiedades físicas de los ácidos grasos y de los compuestos que los contienen vienen determinadas en gran parte por la longitud y grado de insaturación de la cadena hidrocarbonada. La cadena hidrocarbonada apolar explica la poca solubilidad de ácidos grasos en agua. Cuanto más larga sea la cadena acíclica grasa y el menor número de dobles enlaces, menor es la solubilidad del agua. El grupo ácido carboxílico es polar (y ioniza a pH neutro) y justifica la ligera solubilidad en agua de los ácidos grasos de cadena corta. [1, 2]

Los lípidos más sencillos obtenidos a partir de los ácidos grasos son los triacilgliceroles (triglicéridos, grasas o grasas neutras) compuestos de 3 ácidos grasos en enlace éster con un solo glicerol.

Triacilgliceroles simples: Mismo tipo de ácido graso en las 3 posiciones y se denominan según el ácido graso que contienen. Ej. Triestearina 16:0 y trioleína 18:1.

Triacilgliceroles mixtos: 2 o más ácidos grasos diferentes. Se especifica el nombre y posición de cada ácido graso.

La mayoría de las grasas naturales como los aceites vegetales, productos lácteos y grasas animales son mezclas complejas de triacilgliceroles sencillos y mixtos. Estos últimos contienen diversos ácidos grasos que difieren en la longitud de cadena y grado de saturación. Los aceites vegetales (ej. Oliva) están compuestos mayoritariamente de triacilgliceroles con ácidos grasos insaturados, por lo que son líquidos a temperatura ambiente; se convierten industrialmente en grasas sólidas por hidrogenación catalítica que reduce

algunos de sus dobles enlaces a sencillos. Los triacilgliceroles que solo contienen ácidos grasos saturados son sólidos blancos y grasos a temperatura ambiente.

Las ceras biológicas son ésteres de ácidos grasos e insaturados (14-36 átomos de carbono) con alcoholes de cadena larga (16-30 átomos de carbono). Sus puntos de fusión (60-100ºC) son generalmente más elevados que los de los triacilgliceroles. Las ceras también realizan diversas funciones en la naturaleza que están relacionadas con sus propiedades repelentes del agua y con su consistencia firme. Tienen diversas aplicaciones en las industrias farmacéutica y cosmética.[1,3]

Lípidos estructurales de las membranas

La característica arquitectónica central de las membranas biológicas es una doble capa lipídica que constituye una barrera al paso de moléculas polares e iones. Los lípidos de las membranas son antipáticos; la orientación de sus regiones hidrofóbicas e hidrofílicas dirige su empaquetamiento hacia la formación de bicapas membranosas. Tipos generales de lípidos de las membranas:

Glicerofosfolípidos: Regiones hidrofóbicas compuestas por 2 ácidos grasos unidos al glicerol.

Esfingolípidos: Se une un solo ácido graso a una amina grasa, la esfingosina.

Esteroles: Sistema rígido de 4 anillos hidrocarbonados fusionados.

Los glicerofosfolípidos, esfingolípidos y esteroles son virtualmente insolubles en agua ya que cunado se mezclan con ella, estos compuestos antipáticos forman agregados lipídicos microscópicos en una fase separada de su entorno acuoso. Las moléculas lipídicas se agrupan con sus porciones hidrofóbicas en contacto entre sí y sus grupos hidrofílicos interaccionando con el agua circundante. El agrupamiento de los lípidos reduce la cantidad de superficie hidrofóbica expuesta al agua, con lo que se minimiza el número de moléculas en la capa de agua ordenada en la interfase lípido-agua, lo que se traduce en un aumento de entropía. Las interacciones hidrofóbicas entre las moléculas lipídicas proporcionan la fuerza termodinámica motriz para la formación y mantenimiento de estas estructuras.[1,4]]

Según sean las condiciones precisas y la naturaleza de los lípidos utilizados, se pueden formar 3 tipos de agregados cuando se mezclan lípidos alinfáticos con el agua. Las micelas son estructuras esféricas relativamente pequeñas en las que intervienen desde

2

unas cuantas decenas a unos millares de moléculas ordenadas de modo que sus regiones hidrofóbicas se agregan en el interior excluyendo al agua, y los grupos de cabeza hidrofílicos están en la superficie en contacto con el agua. La formación de micelas está favorecida cuando el área de la sección transversal del grupo de cabeza es mayor que la de las cadenas laterales acilo, tal como sucede con los ácidos grasos libres, lisofosfolípidos (a los que les falta un ácido graso) y el detergente SDS.

Un segundo tipo de agregado lipídico en agua es la bicapa, en la que se combinan 2 monocapas lipídicas formando una hoja bidimensional. La formación de bicapas se da fácilmente cuando las áreas transversales del grupo cabeza y las cadenas laterales son similares, tal como sucede con los glicerofosfolípidos y esfingolípidos. Las porciones hidrofóbicas de cada monocapa interaccionan excluyendo el agua. Los grupos de cabeza hidrofílicos interaccionan con las 2 superficies de la bicapa.

El tercer tipo de agregado lipídico se forma cuando una bicapa lipídica se dobla sobre sí misma formando una esfera hueca denominada liposoma o vesícula. Al formar vesículas las hojas de bicapa pierden sus regiones hidrofóbicas de los extremos, con lo que consiguen la máxima estabilidad en su ambiente acuoso. Estas vesículas de bicapa contienen agua, por lo que se crea un compartimiento acuoso separado. [1,5]

Lípidos con actividades biológicas específicas

Los lípidos de membrana representan del 5-10% de la masa seca de muchas células y los de almacenamiento más del 50% de la masa de un adiposito. Estos lípidos juegan un papel pasivo en la célula; enzimas oxidativas actúan sobre los combustibles y las membranas lipídicas forman barreras impermeables que separan los compartimientos celulares. Hay otro grupo de lípidos componentes celulares relativamente minoritarios en cuanto a masa con actividades biológicas específicas y esenciales. Entre ellos se encuentran los esteroides, compuestos que comparten el núcleo esteroide de 4 anillos pero son más polares que el colesterol, y gran número de isoprenoides que se sintetizan a partir de precursores de 5 carbonos relacionados con el isopreno.

Dentro de los isoprenoides se encuentran las vitaminas A, D, E y K (materiales graso esenciales para el crecimiento normal de los animales y numerosos pigmentos biológicos). Otros lípidos “activos” son cofactores esenciales de enzimas, transportadores electrónicos o señales intracelulares.

Los principales grupos de hormonas esteroides son las hormonas sexuales masculinas y femeninas y las hormonas de la corteza suprarrenal, el cortisol y la aldosterona. Todas estas hormonas contienen un núcleo esteroide intacto. Se producen en un tejido y se transportan por el torrente circulatorio a tejidos diana donde se fijan a receptores proteicos muy específicos desencadenado cambios en la expresión genética y en el metabolismo. Dada la elevada afinidad de los receptores hacia la hormona, son suficientes concentraciones muy bajas de hormona (hasta 10-9M) para producir el efecto sobre los tejidos diana.

El fosfatidilinositol y sus derivados fosforilados son componentes de las membranas plasmáticas de todas las células eucarióticas. Actúan como depósito de moléculas mensajeras que se liberan en el interior de la célula cuando ciertas señales extracelulares interaccionan con receptores específicos de la membrana plasmática (Ej. Cuando la vasopresina se fija a moléculas receptoras de las membranas plasmáticas renales y de vasos sanguíneos, se activa una fosfolipasa que rompe el enlace entre el glicerol y el fosfato en el fosfatidilinositol-4,5-bifosfato liberando inositol-1,4,5-trifosfato y diacilglicerol.) El inositol-1,4,5-trifosfato produce la liberación de Ca2+

secuestrando en los compartimientos celulares limitados por membrana, desencadenando la activación de diversas enzimas dependientes de Ca2+ y respuestas hormonales. El diacilglierol se fija a una enzima, la proteína quinasa C, activándola, lo que conduce a la transferencia de grupos fosfato del ATP a varias proteínas citosólicas alterando de este modo sus actividades enzimáticas.[1, 6]

Los icosanoides son derivados de ácidos grasos con una diversidad de acciones del tipo hormonal extremadamente potentes sobre varios tejidos de vertebrados. Actúan sobre el tejido en el que se producen. Algunas de sus funciones son que intervienen en la función reproductiva, inflamación, fiebre y dolor asociados a lesiones o enfermedades, etc.

Todos los icosanoides provienen del ácido araquidónico [ácido graso poliinsaturado de 20carbonos, 20:4 (5,8,11,14)] del que toman su nombre general (del griego eikosi, “veinte”). Hay 3 clases de icosanoides: prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos. Se producen en distintos tipos celulares mediante rutas sintéticas diferentes y tienen diferentes células diana y acciones biológicas.

Todas las prostaglandinas (PG) contienen un anillo de 5 átomos de carbono que originalmente formaba parte de la cadena de ácido araquidónico. Su nombre

3

proviene del tejido en el que se identificaron (la glándula prostática). Originalmente se definieron 2 grupos: PGE, soluble en éter y PGF soluble en tampón fosfato. Cada uno contiene numerosos subtipos denominados PGE1, PGE2, etc. Actúan en muchos tejidos regulando la síntesis de la molécula mensajera intracelular AMP 3´,5´-cíclico (cAMP). Debido a que el cAMP media la acción de muchas hormonas, las prostaglandinas afectan a una amplia gama de funciones celulares y titulares. Algunas prostaglandinas estimulan la contracción del músculo liso del útero durante el parto o la menstruación. Otras afectan al flujo sanguíneo a órganos específicos, al ciclo sueño-vigilia y a la capacidad de respuesta de ciertos tejidos a hormonas como la adrenalina y el glucagón. Prostaglandinas de un tercer grupo elevan la temperatura corporal (dando lugar a fiebre) y produciendo inflamación con el dolor consiguiente.

Los tromboxanos se aislaron por primera vez de las plaquetas sanguíneas (trombocitos) y tienen un anillo de 6 átomos que contienen una función éter. Son producidos por las plaquetas y actúan en la formación de coágulos sanguíneos y en la reducción del flujo sanguíneo hacia el sitio de un coagulo.

Los leucotrienos, encontrados por primera vez en los leucocitos, contienen 3 dobles enlaces conjugados. Son señales biológicas poderosas (ej. Inducen la contracción del músculo que recubre las vías aéreas del pulmón. La sobreproducción de leucotrienos produce ataques asmáticos. La fuerte contracción de los músculos lisos del pulmón que tiene lugar en el shock anafiláctico es parte de la reacción alérgica potencialmente fatal, en individuos hipersensibles a las picadas de abeja, penicilina y otros agentes.[1,7]

Las vitaminas son compuestos esenciales para la salud del hombre y otros vertebrados que no pueden ser sintetizados por estos animales por lo que deben ser obtenidos en la dieta. Tipos:

Liposolubles: Solubles en disolventes orgánicos apolares (Ej. Vitaminas A, D, E y K son isoprenoides y se sintetizan por condensación de unidades de isopreno).

Hidrosolubles: Solubles en disolventes acuosos

Vitamina A (Retinol): Pigmento esencial para la visión. No se presenta en los vegetales, pero muchas plantas contienen carotenoides, pigmentos que absorben la luz y se pueden convertir enzimáticamente en vitamina A (por rotura del -caroteno) por la mayoría de los animales. La deficiencia de vitamina A produce piel reseca, xeroftalmia, membranas mucosas secas, desarrollo y

crecimiento retardados, esterilidad en animales machos y ceguera nocturna.

Vitamina D: Derivado del colesterol y precursor de una hormona esencial en el metabolismo de calcio y fosfato en vertebrados. La vitamina D3

(colecalciferol), se forma en piel mediante una reacción fotoquímica accionada por el componente ultravioleta de la luz solar. Abunda en aceites de hígado de pescado y se añade a la leche comercial como suplemento nutritivo. Por si misma no es biológicamente activa pero es precursor del 1,25-dihidroxicolecalciferol. Su deficiencia conduce a la formación defectuosa de huesos (raquitismo).

Vitamina E (tocoferoles): Contienen un anillo aromático sustituido y una cadena lateral hidrocarbonada larga. Se encuentran en los huevos de gallina, aceites vegetales y germen de trigo. Su deficiencia produce piel escamosa, debilidad muscular y esterilidad. Los tocoferoles pueden experimentar reacciones de óxido-reducción del anillo aromático. Previenen la destrucción oxidativa de lípidos de las membranas celulares al reaccionar con las formas más reactivas del oxígeno destruyéndolas y protegiendo a los ácidos grasos insaturados de la oxidación.

Vitamina K: Cofactor lipídico necesario para la coagulación normal de la sangre. La vitamina K1

(filoquinona) se encuentra en las hojas de las plantas verdes mientras que la K2 (menaquinona) es sintetizada por las bacterias que residen en el intestino de los animales. La vitamina actúa en la formación de protombina, que es una proteína en el plasma sanguíneo esencial para la formación del coagulo de sangre. La protombina es una enzima proteolítica que rompe enlaces peptídicos específicos de la proteína sanguínea fibrinógeno, convirtiéndola en fibrina, la proteína fibrosa insoluble que mantiene unidos los coágulos de sangre. La deficiencia en vitamina K da lugar a una coagulación de la sangre más lenta que puede ser fatal a un animal herido.

La warfarina es un análogo sintético de la vitamina K que actúa como inhibidor competitivo de la formación de protombina. Funciona como anticoagulante.

La uboquinona y plastoquinona (derivados isoprenoides) funcionan como transportadores de electrones en la producción de ATP en la mitocondria y en los cloroplastos. En la mayoría de los tejidos de mamíferos, la uboquinona (coenzima Q) tiene 10 unidades de isopreno. La plastoquinona es equivalente en plantas a la uboquinona. Su papel como

4

transportadores de electrones pueden aceptar bien uno o 2 electrones así como 1 o 2 protones reduciéndose a la forma hidroquinona.

Durante la formación de los glúcidos complejos de las paredes celulares bacterianas así como la adición de unidades polisacáridas a las glucoproteínas en eucariotas, las unidades glucídicas que se han de adicionar están activadas químicamente mediante la unión a los dolicoles, pertenecientes al grupo de isoproenoides. Los dolicoles de animales tienen entre 17-21 unidades isopreno (85-105 átomos de carbono), los dolicoles bacterianos tienen 11 unidades y plantas y hongos tienen entre 14-24 unidades isopreno. Estos compuestos altamente hidrofóbicos tienen interacciones hidrofóbicas fuertes con los lípidos de membrana, anclando los glúcidos unidos a la membrana, donde participam en reacciones de transferencia de glúcidos.[1,8]

SEPARACIÓN Y ANÁLISIS DE GLÚCIDOS

Debido a que los lípidos son insolubles en agua, su extracción de los tejidos y posterior fraccionamiento requieren la utilización de disolventes orgánicos y algunas técnicas poco usadas en la purificación de moléculas hidrosolubles como las proteínas y glúcidos. En general las mezclas complejas de lípidos se separan por diferencia en su polaridad o solubilidad en disolventes apolares. Los lípidos que contienen ácidos grasos en enlace éster o amida se pueden hidrolizar (saponificar) tratándolos con ácido o álcali para analizar sus componentes.

Los lípidos neutros (triacilgliceroles, ceras, pigmentos, etc.) se extraen fácilmente de los tejidos con éter etílico, cloroformo, benceno, disolventes en los que no se produce la agregación de lípidos promovida por las interacciones hidrofóbicas. Los lípidos de membrana se extraen mejor con disolventes orgánicos más polares como etanol o metanol, que reducen las interacciones hidrofóbicas entre las moléculas de lípidos pero que también debilitan los puentes de hidrógeno y las interacciones hidrostáticas que unen los lípidos de membrana a las proteínas de membrana. Una solución extractiva muy utilizada es una mezcla de cloroformo, metanol y agua, inicialmente en proporciones inmiscibles produciendo una sola fase (1:2:0,8, v/v/v). Después de homogenizar el tejido en este disolvente para extraer todos los lípidos, se añade más agua al extracto resultante que se separa en 2 fases, metanol/agua (fase superior) y cloroformo (fase inferior). Los lípidos permanecen en el cloroformo y las moléculas más polares (proteínas, glúcidos) se sitúan en la fase polar de metanol/agua.

La mezcla compleja de lípidos tisulares aún se puede fraccionar más mediante procedimientos cromatográficos basados en la diferente polaridad de cada clase de lípido. En la cromatografía de adsorción se empaqueta un material polar insoluble, como el gel de sílice (una forma de ácido silícico, Si(OH)4) en la columna de vidrio delgada y larga aplicándose la mezcla de lípidos (en solución clorofórmica) en la parte superior de la columna. Los lípidos polares se fijan fuertemente al ácido silícico polar mientras que los neutros pasan directamente a través de la columna y emergen en el primer lavado con cloroformo. A continuación se eluyen los lípidos polares, en orden de polaridad creciente, lavando la columna con disolventes de polaridad progresivamente más elevada. Los lípidos polares sin carga (ej. Cerebrosidos) se eluyen con acetona y los lípidos muy polares o cargados (ej. Glicerofosfolípidos) se eluyen con metanol.

La cromatografía en capa fina sobre ácido silícico utiliza el mismo principio. Se distribuye una fina capa de gel de sílice sobre una placa de vidrio a la que se adhiere. Se aplica una pequeña muestra de lípidos disueltos en cloroformo cerca del borde de la placa, la cual se sumerge en un recipiente poco profundo con disolvente orgánico contenido dentro de una cámara cerrada saturada con vapor del disolvente. A medida que el disolvente asciende sobre la placa por acción de la capilaridad, arrastra consigo los lípidos. Después de su separación se pueden detectar los lípidos pulverizando la placa con un colorante (rodamina) que presenta fluorescencia cuando se asocia con los lípidos, o bien exponiendo la placa a los vapores de yodo. El yodo reacciona con los dobles enlaces de los ácidos grasos confiriendo a los lípidos que los contenga un color amarillo o marrón. Para el análisis posterior se pueden rascar de la placa las regiones que contienen los lípidos separados recuperándolos por extracción con un disolvente orgánico.

La cromatografía gas-líquido separa los componentes volátiles de una muestra según sus tendencias relativas a disolverse en el material inerte empaquetado en la columna cromatográfica y a volatilizarse desplazándose a través d la columna arrastrados por una corriente de un gas inerte como el helio. Algunos lípidos son de naturaleza volátil pero la mayoría han de modificarse previamente para aumentar su volatilidad (disminuyendo su punto de ebullición). Para el análisis de los ácidos grasos presentes en una muestra de fosfolípidos, se calientan primeramente los lípidos en una mezcla metanol/HCl o metanol/NaOH, que convierte los ácidos grasos que eterificaban al glicerol en su ésteres metílicos (tranesterificación). Se cargan a continuación estos ésteres metílicos de los acilos grasos

5

en una columna de cromatografía gas-líquido y se calienta para volatilizar los compuestos. Aquellos ésteres de acilo graso mayoritariamente solubles en el material de la columna se disuelven en el; los menos solubles son arrastrados por la columna de helio y emergen en primer lugar de la columna. El orden de elución depende de la naturaleza del adsorbente sólido de la columna. El orden de elución depende de la naturaleza del adsorbente sólido de la columna y del punto de ebullición de los componentes de la mezcla lipídica. Con la utilización de estas técnicas se pueden separar completamente mezclas de ácidos grasos con diferentes longitudes de cadena y diversos grados de insaturación.

Ciertas clases de lípidos son susceptibles de degradación en condiciones específicas. Por ejemplo, todos los ácidos grasos unidos por enlace éster en triacilgliceroles, fosfolípidos y ésteres esteriolo se liberan mediante tratamiento ácido o alcalino suave mientras que un tratamiento algo más fuerte libera los ácidos grasos unidos por un enlace amida de los esfingolípidos. Las enzimas que hidrolizan específicamente ciertos lípidos también son útiles en la determinación de la estructura lipídica. Las fosfolipasas A, C y D hidrolizan enlaces específicos en los fosfolípidos dando productos de solubilidad y comportamiento cromatográfico característicos. La fosfolipasa C, por ejemplo, libera un fosforil alcohol hidrosoluble (fosfocolina en la fosfatidilcolina) y un diacilglicerol soluble en cloroformo, cada uno de los cuales puede caracterizarse separadamente para determinar la estructura del lípido intacto. La combinación de hidrólisis específica por caracterización de los productos por cromatografía en capa fina o cromatografía gas-líquido permite a menudo la determinación de estructura de un lípido. Para establecer sin ambigüedades la longitud de 1 cadena hidrocarbonada, o la posición de los dobles enlaces, es de gran valor el análisis por espectrometría de masas de los lípidos o sus derivados volátiles.[1,9]

TERPENOS

Se denominan así a cada uno de los hidrocarburos saturados o insaturados que se consideran constituidos formalmente por unidades sucesivas de isopreno (C5H8), y que se hallan muy difundidos en los reinos animal y vegetal, sobre todo en forma de derivados oxigenados (alcoholes, aldehídos, cetonas, ácidos carboxílicos y ésteres), denominados también terpenoides. Las unidades pueden arreglarse

linealmente (como en el escualeno) o cíclicamente (como en la limonina). Dentro de los terpenos se clasifica a los carotenoides que son tetraterpenos muy importantes en los mamíferos, especialmente el -caroteno que es precursor de la vitamina A (11-cis-retinal). También las vitaminas liposolubles D (colecalciferol) y K son consideradas como terpenos.

Los terpenos de bajo peso molecular se encuentran sobre todo como componentes de los aceites esenciales, los que se obtienen de las flores, hojas o frutos, mediante destilación con vapor de agua; mientras que los de peso molecular medio o alto, constituyen el esqueleto de los esteroides, los carotenoides y el caucho. [10]

Tomando como unidad terpeno la de diez átomos de carbono, se ha desarrollado la siguiente clasificación:

Monoterpenos: formados por dos unidades de isopreno (diez átomos de carbono). Por ej. el geraniol, el limoneno, el mentol y el alcanfor.

Sesquiterpenos: formados por tres unidades de isopreno (quince átomos de carbono). Por ej. el guayacol y el farnesol.Diterpenos: formados por cuatro unidades de isopreno (veinte átomos de carbono). Por ej. el fitol. Un diterpeno conocido es la vitamina A1 (C20H30O), contenida en la leche y en el aceite de hígado de bacalao.Triterpenos: formados por seis unidades de isopreno (treinta átomos de carbono). Por ej. el escualeno y los esteroides.

Tetraterpenos: formados por ocho unidades de isopreno (cuarenta átomos de carbono). Por ej. los carotenoides y el licopeno. En este grupo son abundantes las xantofilas y carotenos, pigmentos vegetales amarillo y anaranjado respectivamente. Dan color a los frutos, raíces (zanahoria) flores etc.En la fotosíntesis desempeñan un papel clave absorbiendo energía luminosa de longitudes de onda distinta a las que capta la clorofila. El caroteno es precursor de la vitamina A.

El ß-caroteno (C40H56O) tiene una estructura similar a la de la vitamina A1; este tetraterpeno es un sólido rojo, que se puede obtener a partir de las zanahorias y se emplea como colorante en la industria alimentaria .

Politerpenos: formados por más de ocho unidades de isopreno (más de cuarenta átomos de carbono). Por ej. el caucho y la gutapercha. [11]

6

CAROTENOS

Los carotenoides son los responsables de la gran mayoría de los colores amarillos, anaranjados o rojos presentes en los alimentos vegetales, y también de los colores anaranjados de varios alimentos animales. Desde el punto de vista químico, pertenecen a la familia de los terpenos, es decir están formados por unidades de isopreno (ocho unidades, es decir, cuarenta átomos de carbono), y su biosíntesis se produce a partir de isopentenil pirofosfato. Esto produce sus rasgos estructurales más evidentes, la presencia de muchos dobles enlaces conjugados y de un buen número de ramificaciones de grupos metilo, situados en posiciones constantes. Se conocen alrededor de 600 compuestos de esta familia, que se dividen en dos tipos básicos: los carotenos, que son hidrocarburos, y las xantofilas, sus derivados oxigenados. A estos tipos hay que unir los apocarotenoides, de tamaño menor, formados por ruptura de los carotenoides típicos.

En los vegetales verdes se encuentran en los cloroplastos, formando parte del sistema de biosíntesis a partir de la energía de la luz, pero son mucho más abundantes, y visibles, coloreando algunas raíces, frutas y flores. Dada su ubicuidad en el reino vegetal, la biosíntesis total anual de carotenoides se ha estimado en unos 100 millones de toneladas. Los animales no pueden sintetizar sustancias de este tipo, pero si pueden transformar una en otra, aunque con bastantes limitaciones.[12] De los carotenoides conocidos, solamente alrededor del 10% tienen valor como vitamina A. Además del caroteno, los más importantes entre ellos son el a

caroteno y la b criptoxantina. La condición fundamental para que tengan actividad vitamínica es que tengan cerrado y sin oxidar al menos uno de los anillos de los extremos de la estructura. Consecuentemente, varios de los carotenoides más comunes, como el licopeno, zeaxantina y luteína no tienen valor como vitamina A, aunque son muy importantes como pigmentos, y pueden tener también actividad como antioxidantes. En general, las xantofilas producen color amarillo, mientras que los carotenoides son anaranjados o rojizos.

Los carotenoides pueden desempeñar un papel como antioxidantes en la protección del organismo frente a los radicales libres, aunque esta cuestión está todavía en discusión. Sí parece claro que la presencia en la dieta de alimentos con contenidos elevados de carotenoides tiene efectos preventivos frente a ciertas enfermedades, aunque los experimentos en los que se han utilizado suplementos han dado resultados contradictorios, en algunos casos incluso evidenciando efectos perjudiciales.

La presencia de gran número de dobles enlaces hace a a los carotenoides muy sensibles a la oxidación, especialmente en reacciones de fotooxidación con el oxígeno singlete. También se oxidan en presencia de lipoxigenasas, pero no de forma directa, sino por reacción con los hidroperóxidos. Las reacciones de oxidación dan lugar en todos los casos a la perdida de color. Generalmente, existe una gran dependencia entre la velocidad de oxidación y el ambiente en el que se encuentran. Dentro de los alimentos, los carotenoides son mucho más resistentes a la oxidación que en materiales pulverizados y secos, o en extractos.

7

También pueden alterarse por isomerización. Salvo excepciones, como en algunas algas, los carotenoides naturales se encuentran siempre con todos los dobles enlaces en forma trans. Aunque en principio la configuración trans de los dobles sería la más estable, las repulsiones que inducen los grupos metilos laterales hacen que algunos de los dobles enlaces puedan pasar a la configuración cis. Esta isomerización puede producirse por calentamiento, exposición a la luz o de forma espontánea en ciertos disolventes o en presencia de superficies activas.[13]

-caroteno

El -caroteno fue el primer carotenoide purificado. En 1831, Wackenroder lo aisló en forma cristalina a partir de la zanahoria, dándole el nombre que lleva, derivado de la denominación latina de este vegetal (Daucus carota).

Aunque su valor vitamínico es solamente de alrededor de un sexto del valor del retinol (la “vitamina A” en su forma metabólicamente activa), su abundancia en los vegetales y también en algunos alimentos animales, como la leche, hace de él una fuente fundamental de vitamina A para muchísimas personas. Incluso en dietas relativamente pobres en productos vegetales, como es la estadounidense, los carotenoides representan alrededor del 30% de la ingesta total de vitamina A. Son ricas en b caroteno la zanahoria, que contiene entre 70 y 140 mg/kg, los vegetales verdes como la espinaca y algunas frutas. En los vegetales verdes el b caroteno se encuentra en los cloroplastos, junto con xantofilas, y suele ser el carotenoide mayoritario. En las frutas, en cambio, el carotenoide mayoritario depende de la especie. El -caroteno lo es en el mango y en el caki.

El -caroteno se emplea mucho como colorante alimentario. Al ser insoluble en agua, no es fácil de utilizar, por ejemplo para colorear bebidas refrescantes,

una de sus principales aplicaciones. En este caso, se utiliza en forma de polvo extremadamente fino, en partículas de alrededor de 0.4 micras de diámetro, que se puede dispersar en el agua, con la ayuda de un polisacárido como la goma arábiga. Se obtiene actualmente por síntesis química, o bien por cultivo de Dunaliella salina, un alga microscópica que prolifera en aguas con concentraciones muy elevadas de sal.

El caroteno, como todos los carotenoides, puede sufrir isomerizaciones en condiciones de procesado drásticas, como en el caso del enlatado. Dependiendo del producto y de las condiciones concretas, puede llegar a isomerizarse entre el 30% y el 40% del todo- trans caroteno presente, fórmándose sobre todo los isómeros 9-cis y 13-cis.

La isomerización reduce el valor como vitamina A del -caroteno. La forma 13-cis tiene aproximadamente la mitad de valor como vitamina A que a forma todo trans, mientras que la forma 9-cis tiene un valor vitamínico del orden del 40% de la todo trans. Sin embargo, esta pérdida se ve compensada en general muy sobradamente por la mucha mayor biodisponibilidad del -caroteno, al desnaturalizarse en este proceso las proteínas a las que se encuentra unido en muchos alimentos, especialmente en los vegetales. [14]

El alfa caroteno es 38% más potente como antioxidante que el beta caroteno y 10 veces más efectivo inhibiendo el cáncer de hígado, piel y pulmón (siendo potenciado este efecto cuando se consume combinado junto con vitamina E y selenio). Pero presenta menos actividad provitamínica a su vez. Lo encontramos en la zanahoria y la calabaza.

El gamma caroteno posee actividad de vitamina A, aunque inferior a la de los carotenos alfa y beta. Los estudios preliminares demuestran una actividad antioxidante del gamma caroteno, aunque menor que los demás carotenos. Se obtiene de las algas.[15]

Licopeno

El licopeno es el carotenoide más abundante en el tomate. Aunque el contenido depende mucho del grado de maduración (aumenta con ella), exposición a la luz (también aumenta), tipo de suelo, y de la variedad, puede considerarse representativa la cifra de 40 mg de licopeno por cada 100 gramos.

Una diferencia fundamental entre la estructura del licopeno y la del -caroteno es que los anillos de los extremos se encuentran abiertos. De hecho, el licopeno es el precursor biosintético del -caroteno en el tomate.

8

El licopeno no tiene actividad como vitamina A, pero es un antioxidante muy eficiente frente al oxigeno singlete, el que más de todos los carotenoides comunes.

Cantaxantina

La cantaxantina se encuentra en la seta Cantharellus cinnabarinus , de donde se extrajo por primera vez, y de cuyo nombre latino procede el del carotenoide. También aparece la cantaxantina, generalmente asociada a otros carotenoides, como pigmento en los crustáceos y en la carne de salmón.

La cantaxantina se utiliza extensamente como aditivo en los piensos destinados a los salmónidos, para dar color a su carne, y en el destinado a las gallinas y pollos, para dar color a la yema del huevo, a la piel y carne. El color se obtiene por depósito directo o por transformación de la cantaxantina en otros carotenoides.

La cantaxantina se utiliza como “bronceador químico”, dado que se deposita en la piel y permine obtener un tono dorado sin necesidad de sol. Ahora bien, las dosis elevadas utilizadas (algunos fabricantes recomiendan más de 100 miligramos al día, y algunas consumidoras tomaban incluso más). Dado que en su utilización como bronceador aparecieron en los usuarios problemas de salud asociados con la deposición del pigmento en la retina, su utilización está limitada, tanto en alimentos para uso humano como en piensos con efecto “colorante”. La ADI para humanos fijada actualmente es de 0,03 mg/kg de peso. En Internet se venden actualmente “suplementos bronceadores” con dosis que cantaxantina superan con mucho el límite de seguridad, y que pueden resultar peligrosos.

Astaxantina

La astaxantina es el carotenoide más común en los animales. Es el principal pigmento responsable del color rosa de la carne del salmón o de la trucha, y también de las huevas de algunos peces. El músculo del salmón del Atlántico contiene entre 4 y 10 mg de astaxantina por kilogramo, mientras que el salmón del pacífico, más intensamente coloreado, contienen entre 14 y 40 mg/ kg. Junto con la astaxantina se encuentran cantidades menores de cantaxantina y de astaceno.

Como los demás animales, estos peces no pueden sintetizar los carotenoides “de novo”, por lo que dependen de los contenidos en la dieta, que si pueden transformar unos en otros, con ciertas limitaciones. Esto es importante en acuacultura, ya que si se quiere obtener el color habitual en los animales salvajes,

deben incluirse carotenoides precursores en los piensos.

La astaxantina es también la causa del color rojo de la mayoría de los crustáceos. En los crustáceos muchas veces el color de la cantaxantina está enmascarado, dado que se encuentra unida muy fuertemente a proteínas, hasta el extremo de que esta unión modifica sus propiedades ópticas. En el caso del bogavante, por ejemplo, la cantaxantina está formando parte de un complejo multimérico llamado crustacianina, que es de color azulado. La desnaturalización de la proteína, por calentamiento, hace que aparezca el color del carotenoide sin modificaciones en su espectro.

Beta-criptoxantina

La -criptoxantina es el carotenoide predominante en las naranjas. También se encuentra presente en otras frutas de color amarillo o anaranjado, como la papaya o el melocotón, en el boniato y, acompañando a la zeaxantina, en algunas variedades de maíz.

CapsantinaLa capsantina es el principal carotenoide del pimiento común (Capsicum annuum), en el que representa hasta el 60% del total de los carotenoides presentes. Tambiés es el más abundante en otras especies del mismo género y, naturalmente también en el pimentón, utilizado extensamente en España (y en Hungría, con el nombre de paprika) como especia, por su color y aroma.

La capsantina es un carotenoide bastante raro, entendiendo como tal en primer lugar que prácticamente no se encuentra en otros vegetales. Además su estructura tiene la particularidad de que el anillo de uno de sus extremos es solamente de cinco eslabones Su biosíntesis se produce a partir de la zeaxantina, que se transforma en anteraxantina (un epóxido), y después en capsantina.

En el pimiento y en sus extractos (polvo, oleorresina) aparecen otros muchos carotenoides, del orden de 50, una buena parte de los cuales no se conoce con detalle. El segundo más importante es la capsorrubina. Tanto ésta como la capsantina están mayoritariamente en forma esterificada. También contiene cantidades significativas de -caroteno

Zeaxantina

La zeaxantina se encuentra bastante distribuida entre los vegetales, acompañando a otros carotenoides. Es el carotenoide típico del maíz, y de ahí procede su nombre. También se encuentra en muchas bacterias.

9

Luteína

La luteína se encuentra en muchos vegetales, como las judías verdes, las espinacas o el broculi, aunque su color está enmascarado por el de la clorofila. Junto con la zeaxantina, es el carotenoide responsable del color de la yema de huevo. Se utiliza precisamente para añadirla al pienso de pollos y gallinas, para colorear la piel, carne y huevos.

La luteína tienen dos grupos hidroxilo, pero en los alimentos (como los indicados anteriormente) se encuentra generalmente en forma no esterificada. En los pétalos de algunas flores, como el llamado “clavelón de la India”, Tagetes erecta (oriundo de Méjico, a pesar del nombre), en los que es muy abundante, se encuentra como mono o di ésteres de los ácidos palmítico o mirístico. Esta flor es interesante porque precisamente de ella se extrae gran parte de la luteína comercializada (generalmente como oleorresina) como suplemento para piensos, y también la utilizada en el mercado de los mal llamados “suplementos dietéticos” para humanos.

Aunque no tienen actividad como vitamina A, la luteína y la zeaxantina se encuentran presentes en la retina humana, donde absorben la luz de la zona azul del espectro. Aunque se ha indicado que podrían proteger de la enfermedad conocida como degeneración macular, y se venden extensamente como “suplementos dietéticos” con este fin, no existe ninguna prueba de que ese supuesto efecto protector sea cierto.

Pigmentos del azafrán

Tanto los pigmentos del azafrán como los principales componentes del aroma y del sabor se forman por la oxidación biológica de la zeaxantina. A partir de la zona central con dobles enlaces conjugados se forma la crocetina. Este tipo de estructuras derivadas se conocen como “apocarotenoides”. Primeramente se produce una oxidación a dialdehido, y luego a diácido. Una vez producida, la crocetina se une de forma sucesiva a unidades de glucosa, dos en cada extremo (el disacárido gentobiosa) formando la crocina, que es el principal pigmento del azafrán. Debido a la presencia de los grupos de azúcar en los extremos de la cadena, la crocina es soluble en agua.

A partir de los extremos de la estructura de la zeaxantina se forma primeramente el hidroxi--

ciclocitral. Esta sustancia se une por una reacción enzimática a una unidad de glucosa, mediante un enlace glicosídico, dando lugar a la picrocrocina. La picrocrocina es la responsable del sabor ligeramente amargo del azafrán. A partir de la picrocrocina se forma, durante el secado de la especia, el safranal, uno de los componentes fundamentales del aroma del azafrán.

Pigmentos de la bija

La bija o achiote Bixa orellana, es un árbol de tamaño pequeño que crece en Sudamérica, De la pulpa que envuelve sus semillas se extrae un colorante, la bija, utilizado para colorear alimentos y también en otras industrias. Las sustancias presentes en este pigmentos son principalmente dos apocarotenoides, la bixina y la nor-bixina.

La bixina se encuentra en forma cis, pero se transforma en la forma trans con los tratamientos térmicos utilizados habitualmente en la extracción del pigmento, con aceite caliente. También puede extraerse con disolventes como al acetona. La nor-bixina tiene una estructura semejante, pero con los dos grupos ácidos libres. La nor-bixina es soluble solamente en medio alcalino, y se utiliza como sal sódica, de modo que al mezclar el colorante con los alimentos, que tienen pH ácido, precipita la forma no ionizada. Esto tiene la ventaja de que el alimento queda coloreado, pero no “destiñe”.[16]

OBJETIVOS

Extraer por medio de disolventes orgánicos los pigmentos naturales de la zanahoria.

Separar los carotenos de las xantofilas que se encuentran en las zanahorias.

Por medio de la técnica de cromatografía separar los 3 tipos de carotenos que existen e identificarlos.

HIPÓTESIS

Si a una zanahoria se le extraen sus pigmentos naturales que le dan coloración por medio de disolventes orgánicos y después al obtener estos se realiza una separación de los pigmentos constituyentes por medio de lavados, entonces se podrán extraer los carotenos de la zanahoria y después a estos por medio de cromatografía de adsorción en columna se podrán separar en sus tres tipos de terpenos.

MATERIAL Bisturí Probeta 10, 50ml

10

3 matraces erlenmeyer 250ml 1 agitador de vidrio 1 espátula Pinzas de 3 dedos Soporte universal Columna para cromatografía Vidrio de reloj Pipeta volumétrica 10ml 3 vasos de precipitados de 150ml Embudo de separación Pipeta pasteur Vial ámbar

REACTIVOS

Etanol Agua destilada Éter de petróleo Alúmina Acetona

MATERIAL BIOLÓGICO

10g de zanahoria

EQUIPO

Parrilla de calentamiento Rotavapor

METODOLOGÍA

A) EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE CAROTENOS

1. Picar 10 gramos de zanahoria perfectamente, extraer los pigmentos con 25 ml de alcohol al 95%, caliente en un matraz de 250 ml (la muestra debe quedar incolora).

2. Re extraer con otros 25 ml de alcohol y reunir los extractos.

3. Calentar la solución amarilla y diluir aproximadamente al 85% de alcohol con H2O, enfriar a temperatura ambiente (agregar 9 ml de H2O).

4. Agitar la solución en un embudo de separación con 25 ml de éter de petróleo, permitir reposo para que se separe en 2 capas, la superior de éter que lleva los carotenos y la inferior las xantofilas.

5. Separar y guardar la capa superior.6. Volver la capa inferior al embudo y lavar con 2

porciones sucesivas de 10 ml c/u de éter de petróleo.7. Combinar los extractos de éter de petróleo y lavados

con 10 ml de alcohol al 85% para quitar las xantofilas.

8. Evaporar el éter de petróleo calentando a menos de 40° C usando al vacío (manipule con cuidado).

9. Disolver el residuo en 2 ml de éter de petróleo antes de pasar a columna.

B) SEPARACIÓN DE CAROTENOS

Disolver 20g de alúmina en metanol hasta cubrirla Introducirla en la columna para cromatografía Introducir la muestra por medio de una pipeta

pasteur Utilizar como eluyente éter de petróleo – acetona

(95:5)

RESULTADOS

A) Extracción y separación de carotenos

Zanahorias casi incoloras después de extraer en alcohol

Extractos de la zanahoria

Separación de carotenos y xantófilas

11

Capa superior: carotenosCapa inferior: xantófilas

Carotenos

Evaporación del éter de petróleo en el rotavapor

B) Separación de los carotenos

Preparación de la columna

Tubos con los 3 carotenos extraídos

-caroteno (4.6ml)

-caroteno (2.7ml)

-caroteno (6.4ml)

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

12

Se picaron las zanahorias para extraer los pigmentos en alcohol al 95%; esto debido a que estos pigmentos son insolubles en agua. Esto se realizó hasta que las zanahorias quedaron prácticamente incoloras.

La solución que se obtuvo fue de un color amarillo-naranja debido a la presencia de xantofilas y carotenos que son los pigmentos naturales de la zanahoria.

Para separar estos pigmentos se utilizó un embudo de separación; en la fase orgánica se separaron los carotenos por medio de lavados y en la acuosa a las xantofilas que después se desecharon debido a que el producto de interés eran los carotenos.

Se evaporo en el rotavapor el éter para obtener los carotenos y después estos se introdujeron en la columna de cromatografía por el método de adsorción.

Al realizar la separación de los carotenos por el método de cromatografía en columna, se lograron obtener los 3 tipos de carotenos que existen: -caroteno (4.6ml), -caroteno (2.7ml) y -caroteno (6.4ml); de cada uno se obtuvieron cantidades distintas habiendo más del gama caroteno, seguido del alfa y por último el beta caroteno, que poseía una coloración más intensa.

CONCLUSIONES

Por medio de esta práctica, logramos extraer de la zanahoria, los carotenos; estos junto con las xantofilas son los que le proporcionan el color naranja a las zanahorias ya que son los pigmentos vegetales que las constituyen; sin embargo para la finalidad de esta práctica se separaron las xantofilas de los carotenos para después por medio de cromatografía separar y determinar cualitativamente los 3 tipos de carotenos que existen: , y . Y como estos se contienen en diferentes proporciones.

El más conocido de los carotenos es el ß-caroteno (C40H56O), el cuál es un tetraterpeno (hidrocarburos saturados o insaturados que se consideran constituidos formalmente por unidades sucesivas de isopreno (C5H8)), que se suele utilizar como colorante en la industria alimenticia.

REFERENCIAS

[1] Lehninger, A. L. Lípidos En Principios de bioquímica. Barcelona: Ed. Omega, 2ª ed., 1993. 240-264[2] Ascon-Bieto. Y Talon. “Fisiología y Bioquímica vegetal”. Interamericana de MacGraw Hill. 1996. [3] Bilbao. M. Del R. “Análisis Fitoquímico preliminar” Universidad del Quindio. Armenia. 1997[4] Lambert. J.B.; H.F. Shurvert.; D.A. Lightner, R. Graham. “Organic Structural Spectroscopy”. Prentice Hall. 1998. [5] Silverstein R.M. y F.X Webster. “Spectrometric Identification of Organic Compounds”. Six Edition. Ed. John Wiley and Sons, N.Y. 1998. [6] Acherson.R.M. “An Introduction to the Chemistry of heterocyclic compounds. 3ª Edi. J. Wiley and Sons. N. Y. 1985. [7] García, Barriga. “Flora Medicinal de Colombia”. Ed. Limusa, 1990[8] Dominguez. X.A. “Métodos de Investigación Fitoquímica”. Edit. Limusa, Mexico, 1974 [9] Irease G. and Ewvans W. “Tratado de Farmacología” 12ª. Edición.México.1986 [10] Pasto D.J. y C.R. Jhonson. “Determinación de Estructuras Orgánicas”. Ed. Reverté, 1974[11] http://milksci.unizar.es/bioquimica/temas/pigmentos/carotenoides.html[12] Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Mayes, Rodwell, "Bioquímica de Harper", Ed. Manual Moderno, 701-704, 1993.[13] Maria Luz P. M. de Portela, "Vitaminas y Minerales en Nutrición", Ed. Lopez, 10;19, 1994[14] A. Streitwieser, C.H. Heathcock, "Química Orgánica", Ed. Mac Graw Hill, 1191;1227, 1989.[15] Garcia Closas R, Serra Majem L, Pastor Ferrer C, Olmos Castellvell M, Roman B, Ribas Barbay Vinas L et al. Distribución de la concentración sérica de beta-caroteno y alfa-tocoferol en una muestra representativa de la población adulta de Cataluña. Med Clin (Barc) 2002 Mar 2;118(7):256-61. 2003.[16] MÍNGUEZ, M., J. FERNÁNDEZ y J. PEREDA. 1984. Pimiento pimentonero (Capsicum annuun L.). Relación entre los pigmentos carotenoides rojos y amarillos. Grasas y Aceites 3 5(1):4- 1 0.

13