A DEPRESSZIÓ ÉS A DIABÉTESZ MELLITUSZ

MOLEKULÁRIS VONATKOZÁSAI

Doktori értekezés

Abdul Rahman Omár

Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Nemoda Zsófia, egyetemi adjunktus, Ph.D.

Hivatalos bírálók: Dr. Igaz Péter, egyetemi adjunktus, Ph.D.

Dr. Bálint Bálint László, egyetemi adjunktus, Ph.D.

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Enyedi Péter, egyetemi tanár, D.Sc.

Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Nyitray László, egyetemi docens, D.Sc.

Dr. Speer Gábor, egyetemi adjunktus, Ph.D.

Budapest

2013

1

TARTALOMJEGYZÉK

Tartalomjegyzék ............................................................................................................... 1

Táblázatjegyzék ................................................................................................................ 3

Ábrajegyzék ...................................................................................................................... 5

Rövidítésjegyzék .............................................................................................................. 6

1 Bevezetés ................................................................................................................... 14

2 Irodalmi áttekintés...................................................................................................... 16

2.1 A diabétesz mellitusz és a komorbid depresszió epidemiológiája és háttere ..... 16

2.1.1 A diabétesz mellitusz és a depresszió néhány kandidáns génje ............... 21

2.1.2 Kapcsoltsági analízisek és teljes genomi asszociáció vizsgálatok ........... 24

2.1.3 A P2X7 receptor variánsok szerepe depresszió kialakulásában .............. 26

2.2 A mikroRNS és polimorfizmusai ....................................................................... 28

2.2.1 A mikroRNS szerepe a transzláció szabályozásában ............................... 28

2.2.2 A miRNS-kötőhelyek polimorfizmusai ................................................... 31 2.3 Teljes genomi expressziós vizsgálatok diabétesz mellituszban ......................... 32

2.3.1 Génexpressziós változások a zsírszövetben ............................................. 33

2.3.2 Génexpressziós változások az izomszövetben ......................................... 34

2.3.3 Génexpressziós változások a májban ....................................................... 35

2.4 Idegrendszeri változások diabétesz mellituszban, a 3-as típusú diabétesz koncepciója ................................................................................................................ 36

2.4.1 Az inzulin hatása az agyra ....................................................................... 36

2.4.2 A demencia és a diabétesz mellitusz kapcsolata ...................................... 38

2.4.3 Alzheimer-kórra jellemző génexpressziós változások ............................. 40 2.4.4 3-as típusú diabétesz ................................................................................ 43

3 Célkitűzések ............................................................................................................... 45

4 Módszerek .................................................................................................................. 46

4.1 A P2RX7 gén polimorfizmusának vizsgálata ..................................................... 46

4.1.1 A genetikai asszociáció analízisben résztvevő személyek ....................... 46

4.1.2 A depresszió súlyosságának mérése ........................................................ 46

4.1.3 Mintavétel és DNS-izolálás ..................................................................... 46

4.1.4 Genotipizálás RFLP-vel ........................................................................... 47

4.1.4.1 Restrikciós fragmentum hosszúság-polimorfizmus (RFLP) ..... 47 4.1.4.2 A PCR-elegy összetétele ........................................................... 47

4.1.4.3 Restrikciós emésztés ................................................................. 48

4.1.4.4 Fragmentanalízis ....................................................................... 48

4.1.4.5 Statisztikai analízis .................................................................... 49

4.2 Patkány diabétesz mellitusz modellek agyi expresszióváltozásának vizsgálata 49

4.2.1 Kísérleti állatok ........................................................................................ 49 4.2.2 Az 1-es típusú diabétesz mellitusz kísérletes modellje ............................ 50

4.2.3 A 2-es típusú diabétesz mellitusz kísérletes modellje .............................. 50

4.2.4 Agyi disszekció és RNS-izolálás ............................................................. 50

4.2.5 Génexpressziós microarray mérés ........................................................... 51

2

4.2.6 A microarray adatok bioinformatikai értékelése ...................................... 51

4.2.7 Validálás valós idejű PCR-módszerrel .................................................... 53 5 Eredmények ............................................................................................................... 55

5.1 A P2RX7 gén mikroRNS-kötőhelyének polimorfizmusa .................................. 55 5.1.1 A feltételezett mikroRNS-kötőhelyek in silico vizsgálata ....................... 55

5.1.2 Az rs1653625 SNP genotipizálására kifejlesztett módszer..................... 56

5.1.3 A P2RX7 mikroRNS-kötőhely SNP és a depresszió súlyosságának asszociáció analízise ................................................................................ 60

5.2 Agyi expressziós változások diabétesz patkánymodellekben ............................ 62

5.2.1 Kísérleti elrendezés .................................................................................. 62

5.2.2 A normalizálás koncepciója ..................................................................... 63

5.2.2.1 „Per chip” normalizálás ............................................................. 63

5.2.2.2 „Per gén” normalizálás .............................................................. 65

5.2.3 Technikai adatszűrés ................................................................................ 67

5.2.4 Statisztikai adatszűrés .............................................................................. 67

5.2.5 Utószűrés .................................................................................................. 69

5.2.6 Végső adatszűrés az útvonal-analízis és az RT-PCR validálás alapján ... 70 6 Megbeszélés ............................................................................................................... 76

6.1 A P2RX7 gén polimorfizmusai és kapcsolatuk a depresszióval ........................ 76

6.2 Agyi expressziós változások a 2-es típusú diabétesz patkánymodelljében ........ 78

6.2.1 A hippocampus validált expressziós változásai 2-es típusú diabétesz-modellben ................................................................................................. 80

6.2.2 A prefrontális kéreg validált expressziós változásai 2-es típusú diabétesz modellben ................................................................................................. 84

6.2.3 3-as típusú diabétesz ................................................................................ 86

6.2.4 A galanin és receptorai ............................................................................. 88

7 Következtetések ......................................................................................................... 92

8 Összefoglalás ............................................................................................................. 94

9 Summary .................................................................................................................... 96

10 Irodalomjegyzék......................................................................................................... 98

11 Saját közlemények jegyzéke .................................................................................... 119

12 Köszönetnyilvánítás ................................................................................................. 120

13 Függelék ................................................................................................................... 121

3

TÁBLÁZATJEGYZÉK

1. táblázat: A kísérleti állatok testsúly, kor és vércukorszint értékei a feldolgozás

időpontjában. ......................................................................................................... 49

2. táblázat: P2RX7 rs1653625 genotípusok és a hozzájuk tartozó HADS depresszió

és szorongás skálaértékei depressziós, diabéteszes és kontroll csoportokban. ..... 60

3. táblázat: P2RX7 Gln460Arg (rs2230912) genotípusok és a hozzájuk tartozó

HADS depresszió és szorongás skálaértékei depressziós, diabéteszes és kontroll

csoportokban. ........................................................................................................ 61

4. táblázat: Az agyterület-specifikus génlisták alakulása a kiértékelés során ........... 69

5. táblázat: A Gene Ontology, a KEGG és a GenMapp adatbázisok útvonalaiban

dúsulást mutató gének száma ................................................................................ 71

6. táblázat: Validált gének listája a hippocampusban ............................................... 72

7. táblázat: Validált gének listája a prefrontális kéregben ........................................ 73

8. táblázat: Az útvonal-analízissel kiválasztott majd validált gének száma az egyes

régiókban. .............................................................................................................. 74

9. táblázat. Nem útvonal-analízissel kiválasztott gének expressziója a validálás

eredményeként. ..................................................................................................... 74

10. táblázat: Validált gének által érintett biokémiai útvonalak a hippocampusban .... 83

11. táblázat: Validált gének által érintett biokémiai útvonalak a prefrontális kéregben

............................................................................................................................... 86

12. táblázat: A HADS (Hospital Anxiety and Depression Scale) kérdőív ................ 121

13. táblázat: Hippocampus-specifikus változást mutató gének a kontrollhoz képest

mért változás („Expressziós változás”) csökkenő sorrendjében. ........................ 122

14. táblázat: Prefrontális kéreg-specifikus változást mutató gének a kontrollhoz képest

mért változás („Expressziós változás”) csökkenő sorrendjében. ........................ 126

15. táblázat: Hippocampusban és prefrontális kéregben egyaránt változást mutató

gének a kontrollhoz képest mért változás hippocampusban mért („Expressziós

változás a hippocampusban”) csökkenő sorrendjében. ....................................... 127

16. táblázat: Hippocampusban, prefrontális kéregben és striatumban egyaránt

változást mutató gének a kontrollhoz képest mért változás hippocampusban mért

(„Expressziós változás a hippocampusban”) csökkenő sorrendjében. ................ 129

4

17. táblázat: A GO Molecular function, a KEGG és a GenMapp adatbázisok aktivitást

mutató útvonalai és a hozzájuk tartozó gének 2-es tipusú diabétesz modell

hippocampusában. ............................................................................................... 130

18. táblázat: A GO Molecular function, a KEGG és a GenMapp adatbázisok aktivitást

mutató útvonalai és a hozzájuk tartozó gének 2-es tipusú diabétesz modell

prefrontális kérgében. .......................................................................................... 131

19. táblázat: Validált, de az in silico kiértékeléssel ellentétes génexpressziós

specificitást mutató gének. .................................................................................. 132

5

ÁBRAJEGYZÉK

1. ábra: Egymásnak ellenható anabolikus és katabolikus folyamatok a glükóz

homeosztázisban. .................................................................................................. 19

2. ábra: A P2X7 receptor alegységének struktúrája és polimorf pontjai .................. 27

3. ábra: A miRNS és a siRNS érése és a poszt-transzkripciós szupresszió általános

folyamata (76). ...................................................................................................... 30

4. ábra: Diabétesszel összefüggésbe hozható patológiás mechanizmusok feltételezett

hatása az Alzheimer-kór kialakulásában. .............................................................. 40

5. ábra: A P2RX7 mRNS feltételezett polimorf mikroRNS kötőhelyei. .................. 55

6. ábra. A P2RX7 3’ UTR A/C SNP (rs1653625) genotipizálása. ........................... 57

7. ábra. Néhány reprezentatív elektroferogram a P2RX7 3’ UTR A/C SNP

(rs1653625) genotipizálásában. ............................................................................ 58

8. ábra. A P2RX7 3’ UTR A/C SNP (rs1653625) genotípusainak reprezentatív

elektroferogramjai és szekvenálási eredményei. ................................................... 59

9. ábra. A kísérleti elrendezés ................................................................................... 62

10. ábra. A kiértékelés csoportosítási elve .................................................................. 63

11. ábra. Chip szintű normalizálás eredménye dobozdiagram ábrázolással ............... 64

12. ábra. Génszintű normalizálás eredménye dobozdiagram ábrázolással ................. 65

13. ábra: Normalizált expresszió változások (adatszűrés nélkül) ............................... 66

14. ábra. Statisztikai adatszűrés – Volcano plot. ......................................................... 68

15. ábra: 2-es típusú diabétesz modellben változást mutató gének eloszlása az egyes

agyterületek közt ................................................................................................... 70

16. ábra: Validált gének eloszlása génontológiai kategóriákban a hippocampus

területéről .............................................................................................................. 81

17. ábra. Validált gének eloszlása génontológiai kategóriákban a prefrontális kéreg

területén ................................................................................................................. 84

18. ábra A cukorbetegség összefüggése az agyi inzulin és galanin aktivitással. ....... 90

6

RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK

3'UTR 3' untranslated region, 3' végi nem transzlálódó régió

AADAT aminoadipát-aminotranszferáz

ABCA1 ABC-transzporter A1

ABCC8 ABC-transzporter C8

ABCG5 ABC-transzporter G5

ACAA2 acetil-KoA-aciltranszferáz 2

ACOX3 acil-KoA-oxidáz 3

ADAM1A a disintegrin and metallopeptidase domain 1a fehérje

ADH1B alkohol-dehidrogenáz 1B

ADP adenozin-difoszfát

AGE advanced glycation endproduct (végglikációs termékek)

AGRP agouti-related protein homolog

AGTR1 angiotenzin-II receptor, 1-es típus

AKAP3 A kinase (PKA) anchor protein 3

ALB albumin

ALDH1A1 aldehyde dehydrogenase 1 family, member A1 (acetaldehid-

dehidrogenáz 1)

AMPA (2-amino-3-(5-metil-3-oxo-1,2- oxazol-4-il)propánsav

ANK3 ankirin 3

APOE apolipoprotein E

APP amyloid prekurzor protein

AQP1 aquaporin 1

ATP adenozin-trifoszfát

BDNF brain-derived neurotrophic factor (agyi neurotróf faktor)

BHLHE40 basic helix-loop-helix family, member e40

bp bázispár

BST2 csontvelő stróma sejt antigén 2

BTBD9 BTB (POZ) domain containing 9

BZRAP1 periferiális benzodiazepin-receptor asszociált fehérje 1

CACNA1C L-típusú feszültségfüggő kalciumcsatorna alfa-1C alegység

7

CAMKK2 kalcium/kalmodulin-dependens protein-kináz-kináz 2 béta

CAST calpastatin

CCDC42 coiled-coil domain containing 42

CDK5 ciklin-dependens kináz 5

CDKAL1 CDK5 regulatory subunit associated protein 1-like 1

CDKN2A ciklin-dependens kináz inhibitor 2A

CES1 karboxilészteráz 1

CHI3L1 chitinase 3-like 1, cartilage glycoprotein-39

CIDEA sejthalál indukáló effektor protein A

CILP cartilage intermediate layer protein, nucleotide

pyrophosphohydrolase

CLEC10A C-típusú lektin domén 10A

CNTN3 kontaktin 3

COLQ collagen-like tail subunit (single strand of homotrimer) of

asymmetric acetylcholinesterase (acetilkolin-észteráz Q

alegysége)

CR16 corticosteroids and regional expression protein 16 homolog

CREB cAMP response element-binding protein

CTLA4 citotoxikus T-limfocita asszociált protein 4

CXCL4 chemokine (C-X-C motif) ligand 4

Cy3 cianin fluoreszcens festék (sárga-zöld)

D' linkage disequilibrium normalizált értéke, valószínűségi változó a

genetikai kapcsoltság kifejezésére

DAPK2 death-associated protein kinase 2

dATP dezoxiadenozin-trifoszfát

dCTP dezoxicitidin-trifoszfát

dGTP dezoxiguanozin-trifoszfát

DHDDS dehydrodolichyl diphosphate synthase

DICER III-as típusú endoribonukleáz

DM diabétesz mellitusz

DM1 1-es típusú diabétesz mellitusz

8

DM2 2-es típusú diabétesz mellitusz

DNAJB13 DnaJ (Hsp40) homológ B13

dNTP a négy különböző dezoxiribonukleozid-trifoszfát 1:1:1:1 arányú

keveréke

DROSHA III-as típusú endoribonukleáz

DSM-IV Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth

Edition

dTTP dezoxitimidin-trifoszfát

EDNRB endotelin receptor B-típus

EID1 EP300 differenciáció inhibitor 1

EP300 E1A binding protein p300

ETT-TUKEB Egészségügyi Tudományos Tanács, Tudományos és Kutatásetikai

Bizottság

FGD4 FYVE, RhoGEF and PH domain containing 4

fMRI funkcionális mágneses rezonancia képalkotás

FTCD formimino-transzferáz ciklodezamináz

GABAA receptor ƴ-amino-vajsav receptor A

GABRA4 GABA A receptor alfa 4 alegység

GAL galanin

GALNT2 UDP-N-acetyl-alpha-D-galactosamine:polypeptide N-

acetylgalactosaminyltransferase 2

GALR2 galanin receptor 2

GenMapp Gene Map Annotator and Pathway Profiler

GK Goto-Kakizaki patkánytörzs

GLUT glukóz transzporter

GM2A GM2 gangliozid aktivátor

GO Gene Ontology

GOLPH2 Golgi foszfoprotein 2

GR glükokortikoid receptor

GRM2 metabotróp glutamát receptor 2

GWAS genome wide association study (genomszintű asszociációanalízis)

9

HADS Hospital Anxiety and Depression Scale

HHEX hematopoietically expressed homeobox

HIC1 hypermethylated in cancer 1

HLA humán leukocita antigén

HLA-DQB1 humán leukocita antigén II. osztály DQ beta 1

HLA-DRB1 humán leukocita antigén II. osztály DR beta 1

HNF1β hepatocita nukleáris faktor-1-beta

HPA-tengely hipotalamusz - agyalapi mirigy - mellékvese tengely

HSP27 27 kDa hősokk fehérje

IGF inzulinszerű növekedési faktor

IGF2R inzulinszerű növekedési faktor 2 receptor

IGFBP2 insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 2

IGKC kappa konstans immunoglobulin

IGKV1D-13 kappa variábilis 1D-13 immunoglobulin

IHPK2 inozitol hexafoszfát kináz 2

IL-1 interleukin-1

IL22RA2 interleukin-22 receptor alfa 2

IL2RA interleukin 2 receptor alfa

IL6 interleukin-6

Ilf3 interleukin enhancer binding factor 3, 90kDa

IRS-1 inzulin receptor szubsztrát-1

ISG15 Isg15 ubiquitin-szerű módosító

ITGAM integrin alfa M

JUND jub D protoonkogén

KCNJ11 potassium inwardly-rectifying channel, subfamily J, member 11

Kcnq3 feszültségfüggő kálium csatorna Q3

Kctd6 potassium channel tetramerisation domain containing 6

KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

KLF7 Krupper-szerű faktor 7

KRT7 keratin 7

LARS leucil-tRNS-szintetáz

10

LDLR low-density lipoprotein (LDL) receptor

LGALS3BP lektin, galaktozid-kötő szolubilis fehérje 3

LIN7A lin-7 homolog A (C. elegans)

LOD logarithm of odds (esélyértékek logaritmusa a genetikai

kapcsoltság kifejezésére)

LSP1 limfocita-specifikus protein 2

LTD long-term depression (hosszú távú gátlás)

MAG myelin-asszociált glikoprotein

MAWBP phenazine biosynthesis-like protein domain containing

MGLL monoglicerid-lipáz

MHC major histocompatibility complex

miR mikro-RNS

miRISC microRNA-induced silencing complex

miRNS mikro-RNS

MMSE Mini Mental State Examination

MOBP mielin-asszociált oligodendrocita bázikus protein

MODY maturity onset diabetes of the young (felnőtt diabétesz, mely

fiataloknál jelentkezik)

MT2A methallothionein 2A

MTAP2 mikrotubulus-asszociált fehérje 2

MX2 myxovírus (influenza vírus) rezisztencia 2

MYOM2 miomezin2

N esetszám

NAA35 N-alfa-aciltranszferáz 35

NADPH redukált nikotinamid-adenin-dinukleotid-foszfát

NCOA3 nuclear receptor coactivator 3

NFT neurofibrillary tangle (neurofibrilláris köteg)

NPTX2 neuronális pentraxin II

NR4A3 magreceptor 4A3

NUDCD1 NudC domain containing 1

OAS1 2'-5'-oligoadenilát-szintáz 1

11

OLR821 olfaktorikus receptor 821

ORAI2 ORAI calcium release-activated calcium modulator 2

p p-érték (adott esemény valószínűsége)

P2RX7 purinerg receptor P2X, ligand-gated ion channel, 7

PCR polimeráz-láncreakció

PDE10A foszfodiészteráz 10A

PKM2 piruvát-kináz M2

PML promyelocytic leukemia protein

PPA2 inorganikus pirofoszfatáz 2

PPARBP PPARG binding protein

PPARƴ peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor-gamma

PRIM1 DNS primáz p49 alegység

pri-miRNS primer mikroRNS

PRKCG protein-kináz C gamma

PRKR eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 2

PTER foszfodiészteráz-szerű fehérje

PTNP1 nem-receptor típusú protein tirozin-foszfatáz 1

PTPN22 nem-receptor típusú protein tirozin-foszfatáz 22

PTPRVP protein tirozin-foszfatáz-receptor, V-ös típus; pszeudogén

PXMP4 peroxiszómális membrán protein 4

R purin bázisok (A vagy G) egybetűs kódja

r2 korrelációs koefficiens

RAB11FIP4 RAB11 family interacting protein 4 (class II)

RAB2B RAB2B, member RAS oncogene family

RAGE Receptor for Advanced Glycation End-products (végglikációs

termékek receptorai)

RBAK retinoblastoma-associated KRAB repressor

RBBP1 retinoblastoma binding protein 1

RBMS2 RNS-kötő motívum egyszálú interakciós fehérje 2

RET ret protoonkogén (receptor tirozin-kináz)

RETSAT Retinol-szaturáz

12

RFLP Restrikciós fragmentum hosszúság-polimorfizmus

RLN1 Relaxin 1

RNF182 ring finger protein 182

RORC RAR-related orphan receptor C (reténsav kötő receptor γ)

RPS7 riboszómális fehérje S7

rRNS riboszómális RNS

rs# reference SNP cluster

RT1-AW2 RT1 class Ib, locus EC2 (Ib osztályú MHC gén)

RTP4 kemoszenzoros receptor transzporter 4

RXRB retinoid X receptor, beta

SAT1 spermidin/spermin N1-acetiltranszferáz 1

SDS sodium dodecyl sulfate (nátrium-lauril-szulfát)

SENP5 SUMO1/sentrin specific peptidase 5

SEZ6L2 seizure related 6 homolog (mouse)-like 2

SIK1 salt-inducible kinase 1

siRNS small interfering RNA, kis interferáló RNS

SLC17A6 solute carrier family 17 member 6 (Na-dependens inorganikus

foszfát kotranszporter)

SLC30A8 solute carrier family 30 (zinc transporter), member 8

SLC35C2 solute carrier family 35, member C2

SLCO2B1 solute carrier organic anion transporter family, member 2B1

SLITRK1 SLIT and NTRK-like family, member 1

SNCG gamma-szinuklein

snoRNS small nucleoar RNA, kis nukleóéusz RNS

SNP single nucleotid polymorphism, egypontos nukleotid variáció

SNRI Selective Noradrenaline Reuptake Inhibitor (szelektiv

noradrenalin visszavétel gátló)

snRNS small nuclear RNA, kis sejtmagi RNS

SSRI Selective Serotonin Reuptake Inhibitor (szelektív szerotonin

visszavétel gátló)

ST5 suppression of tumorigenicity 5

13

STARD4 StAR-related lipid transfer (START) domain containing 4

STAT3 signal transducer and activator of transcription 3 (acute-phase

response factor)

STZ streptozotocin

TAE Tris-acetát-EDTA pufferoldat

TAF13 TAF13 RNA polymerase II, TATA box binding protein (TBP)-

associated factor, 18kDa

TBX3 T-box 3

TFF1 trefoil factor 1

TLDA TaqMan Low Density Array

TNFRSF1B tumor nekrózis faktor receptor szupercsalád 1b

TNFα tumor nekrózis faktor-alfa

TRIM45 tripartite motif containing 45

tRNS transzfer-RNS

TRPV6 transient receptor potential cation channel, subfamily V, member

6

Uba7 ubiquitin-szerű módosító aktiváló enzim 7

UCP2 kettes típusú szétkapcsoló fehérje

VPS13A vacuolar protein sorting 13 homolog A (S. cerevisiae)

VPS52 vacuolar protein sorting 52 homolog (S. cerevisiae)

WDR66 WD repeat domain 66

WFS1 Wolfram syndrome 1 (wolframin)

Y pirimidin bázisok (C vagy T) egybetűs kódja

YWHAZ tirozin-3-monooxigenáz/triptofán-5-monooxigenáz aktivációs

fehérjéje, zéta-polipeptid

14

1 BEVEZETÉS

Mind a diabétesz mellitusz, mind a depresszió komplex, multifaktoriális betegség.

Kialakulásukat több száz gén összehangolt működésében bekövetkező zavar okozhatja.

Emellett azonban az egyénre ható környezeti tényezők is fontos szerepet játszanak.

Mindkét betegség a modern, iparilag fejlett társadalmakban gyakori, amelyeket

mozgásszegény életmód, helytelen táplálkozás és stressz-, illetve ingergazdag környezet

jellemez. Egy összefoglaló epidemiológiai vizsgálat támasztotta alá először tényszerűen,

hogy létezhet kapcsolat a két kórkép között. Megfigyelték, hogy cukorbetegek között a

depresszió előfordulásának valószínűsége közel kétszerese az egészséges populációban

tapasztalthoz képest. Ezek alapján a két betegség együttes genetikai és molekuláris

biológiai vizsgálata megalapozottnak tekinthető. A depresszió és a diabétesz mellitusz

genetikai hátterét külön-külön és együttes előfordulásban is vizsgálták különböző

módszerekkel.

A depresszió genom szintű kapcsoltsági vizsgálata eredményeként került előtérbe a

P2RX7 génje, amely egy, az agyban is előforduló purinerg kation csatornát kódol. A

fehérje karboxil végén lévő, aminosav cserét okozó Gln460Arg polimorfizmusának

asszociációját a depresszió súlyosságával cukorbetegek csoportjában is megfigyeltük.

Felmerült, hogy esetlegesen nem is a vizsgált polimorfizmus, hanem a közelében lévő, a

gén 3’ nem transzlálódó régiójában található polimorfizmus felelős a kimutatott

hatásért. In silico vizsgálataink miRNS kötőhelyet valószínűsítettek arra a régióra, ahol

a nukleotidsorrend megváltozása befolyásolhatja a kötődést. A jelen dolgozat egyik

célja egy genotipizáló módszer fejlesztése volt a P2RX7 gén nem kódoló régiójában

található, miRNS kötőhelyet befolyásoló polimorfizmus kimutatására és ennek

felhasználása a korábban leírt genetikai asszociáció ellenőrzésére.

A dolgozat másik célkitűzése a diabétesz mellitusznak az agy génexpressziós

mintázatára, többek között a depresszióval összefüggő gének kifejeződésére gyakorolt

hatásának kimutatása volt. A cukorbetegek körében megfigyelt relatíve gyakori

depresszió molekuláris hátterének felderítése a kérdés összetettsége és bonyolultsága

miatt szinte lehetetlen. Általánosabb kérdésfeltevéssel azonban sikerült olyan modellt

találnunk, amelynek vizsgálatával új információkhoz juthatunk. A cukorbetegség

állatmodelljeként szolgáló patkányok agyrégióinak teljes genomi szintű expressziós

15

mintázatát vetettük össze egészséges állatokéval. Az így kapott gének listáját

hasonlítottuk össze az irodalomban eddig leírt, depresszióhoz kapcsolt génekkel.

16

2 IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2.1 A diabétesz mellitusz és a komorbid depresszió epidemiológiája és háttere

A diabétesz mellitusz egy krónikus és erősen heterogén anyagcsere-betegség, mely

elsősorban a szénhidrát-anyagcserét érinti, de zavart szenved a fehérje- és a

zsíranyagcsere is. Alapvetően az inzulin abszolút vagy relatív hiánya jellemzi. Előbbi

fennállása jellemzi az 1-es típusú diabétesz mellituszt (DM1), melynek hátterében az

inzulintermelő pankreász béta-sejtek szelektív pusztulása áll, ami autoimmun

folyamatok következtében fellépő szigetsejt-gyulladás eredményeként következik be. A

diabéteszes esetek legnagyobb részét (kb. 90%) a 2-es típusú diabétesz mellitusz (DM2)

teszi ki. Ebben az esetben egyszerre beszélhetünk az inzulinhatás zavaráról

(inzulinrezisztencia) és az inzulin-elválasztás problémájáról, amelyek leggyakrabban 35

éves életkor felett, klasszikus tünetek nélkül, elhízással társulva jelennek meg. Mind a

DM1, mind a DM2 manifesztálódásában bizonyítottan szerepet játszanak örökölhető

faktorok, például jellegzetes HLA-antigének, melyek jelentőségét család- és

ikervizsgálatokkal támasztották alá. A DM1 gyakorisága az elsőfokú rokonok körében

5-10%, ami az átlagpopulációhoz képest (0,1-0,4%) 12-100-szoros különbséget jelent

(1). Az ikervizsgálatok eredményei szerint egypetéjű ikrek konkordanciája 21-70%

között mozog, míg kétpetéjű ikreknél ez az érték jelentősen alacsonyabb, 0-13% között

van (2). DM1 örökölhetősége egy finn populáción végzett genetikai vizsgálat szerint

0,88 (3). DM2 esetében a genetikai meghatározottság alacsonyabb, de itt is hatszoros

kockázatot jelent a betegség kialakulása szempontjából a családi anamnézis, mivel a

DM2 gyakorisága elsőfokú rokonoknál 30-40% közötti értékű, míg nem rokon

személyek esetén ez 7%. DM2 esetén 63%-os konkordanciát mértek egypetéjű ikreknél,

mely érték kétpetéjű ikreknél 43% (2), így az örökölhetőség csupán 0,3 körüli (4).

A depresszió az egyik leggyakoribb hangulatzavar, melyet a DSM-IV (Diagnostic and

Statistical Manual of Mental Disorders, 4. kiadás) (5) szerint napokig tartó levert,

kedvetlen hangulat, az érdeklődés és az öröm csökkenése jellemez. Gyakran társul

jelentős súlycsökkenéssel vagy növekedéssel, insomniával vagy hipersomniával,

fáradtsággal, erőtlenséggel, érzéketlenséggel, csökkent összpontosítási képességgel és a

halál gondolatával való gyakori foglalkozással. Ha depressziós és mániás (túlzott

jókedv) szakaszok váltakoznak a kedélybetegség lefolyása alatt, akkor bipoláris

17

depresszióról beszélünk, ennek hiányában unipoláris (major) a depresszió. A kiváltó

októl függően endogén és exogén formáját ismerik. Az endogén depresszió feltehetően

az agyi neurotranszmitterek zavaraira vezethető vissza, míg az exogén depressziót jól

beazonosítható külső okok (például személyes tragédia vagy kudarc, egy szeretett

ember halála, társadalmi kirekesztettség, diszkrimináció) idézik elő, de nyilvánvalóan

éles határvonalat nem lehet húzni közöttük. A depresszió öröklődő komponenseinek

meglétét család- és ikervizsgálatok támasztják alá mind az unipoláris, mind a bipoláris

depresszív kórképekben. A bipoláris depresszió halmozódásának gyakorisága az

elsőfokú rokonok körében átlagosan 7%, ha ezt összehasonlítjuk az átlagpopuláció 1%-

os prevalenciájával, akkor a közvetlen családtagok rizikója hétszeresére nő. Négy

ikervizsgálat eredményeit együttesen elemezve bipoláris zavarok esetén az egypetéjű

ikrek konkordanciája közel 70%-os, míg kétpetéjű ikrek esetében ez 30% körüli (6),

ezért az örökölhetőségét 0,8 körüli értékre becsülik (7). Major depresszióban az

örökölhető faktoroknak kisebb a hatása. A családi halmozottságot megfigyelő

vizsgálatok közel háromszoros kockázati arányról számolnak be és az öt ikervizsgálatot

összefoglaló meta-analízis szerint a major depresszió örökölhetősége 0,4 körüli (8).

Mind a diabétesz mellitusz (DM), mind a major depresszió komoly népegészségügyi

probléma, melyek gyakorisága folyamatos emelkedést mutat világszerte, és együttes

megjelenésük is figyelemre méltóan nagy gyakoriságú. A major depresszió

prevalenciája cukorbetegek között kétszer nagyobb az átlag populációhoz képest, és a

betegek mintegy 20%-át érinti (9). A depressziós epizódok negatívan befolyásolhatják

az antidiabetikus kezelés helyes követését, mely komoly problémákat okozhat a DM

kezelésében. A tartósan rossz glikémiás kontroll megnöveli a mikrovaszkuláris és

makrovaszkuláris szövődmények valószínűségét, mely rossz életminőséghez és magas

morbiditáshoz, illetve mortalitáshoz vezet a diabéteszes betegek körében (10). Habár a

DM és a depresszió közti kapcsolatot sokan sokféle nézőpontból vizsgálták már, az

együttes előfordulást megmagyarázni még nem sikerült. Egy hipotézis szerint a rossz

glikémiás kontroll negatívan befolyásolja a hangulati életet. Egy korai vizsgálatban

ugyanis kimutatták, hogy a hiperglikémia szorongásos tüneteket idézhet elő (11), illetve

egy másik csoport azt találta, hogy a depressziós tünetek enyhíthetők a metabolikus

kontroll javításával 2-es típusú cukorbetegek körében (12). Egy 5 éves követéses

vizsgálatban Lustman és munkatársai azt tapasztalták, hogy a kórosan magas glikált

18

hemoglobin (HbA1c) szint előre jelzi az antidepresszáns kezelés csökkent hatékonyságát

és súlyosbítja a depresszió lefolyását (13). Mivel a hiperglikémia felelős a mikro- és

makrovaszkuláris szövődményekért, a rossz glikémiás kontroll lehet az egyik kiváltó

környezeti tényező depresszió kialakulásában diabéteszes betegek körében. A

depresszió és a DM kapcsolatának megértéséhez fontos megemlíteni az egyén

társadalmi, gazdasági státuszának hozzájárulását a betegség kialakulásához. Azok a

cukorbetegek, akiknek magasabb a rizikófaktora depresszió kialakulására,

kimutathatóan alacsonyabban iskolázottak, nem élnek házasságban vagy családjuktól

kevesebb támogatást kapnak és életükben többször érte már őket krónikus negatív

stresszor (14). Létezik nemi különbség is, mely kölcsönhatásban állhat a fent leírtakkal.

Diabéteszes nők között kétszer akkora az esélye, hogy bizonyos életszituációkat negatív

pszichés élményként éljenek meg és ezekre feloldhatatlan stresszel reagáljanak(15).

Arról sem feledkezhetünk meg, hogy a cukorbetegséggel együtt járó életminőség-

romlás, a szigorú étrendi szabályok, a gyógyszerektől való függőség mennyire negatív

hatással van a betegek pszichés állapotára.

Másrészről, a depressziós tünetek vagy major depresszió megléte nagymértékben

hajlamosíthat 2-es típusú cukorbetegségre. Azoknál az embereknél, akik valamilyen

pszichiátriai zavarban szenvednek, általában sokszorosan nagyobb a rizikója a DM2

kialakulásának, nem utolsó sorban a fizikai inaktivitás és az elhízás következtében.

Azonban, még ha a potenciális befolyásoló tényezőket, mint a kor, az etnikai

hovatartozás, a nem, a társadalmi státusz, anyagi helyzet, iskolázottság, egészségügyi

ellátottság, egyéb pszichiátriai zavar és testsúly figyelembe vesszük, még akkor is a

depresszió marad a legszignifikánsabb rizikófaktor a cukorbetegség kialakulására (16).

A depresszió számos fontos patofiziológiai változással hozható összefüggésbe, mely

magyarázhatja, hogy miért olyan nagy az együttes előfordulása diabétesszel. Habár a

háttérmechanizmusok az intenzív kutatások ellenére kevésbé ismertek, a depresszió

összefüggésbe hozható a stresszválasz abnormális működésével. Stressz-szituáció során

egyes hormonok elválasztása, mint például kortizol, katekolaminok, növekedési hormon

és glukagon, indul meg. Ezeknek a hormonoknak a metabolikus hatása antagonizálja az

inzulin és más inzulinszerű növekedési faktorok hatásait, amelyben kritikus változó az

aktuális vércukorszint (1. ábra) (17). A vércukorszintnek nem szabad egy bizonyos

szint alá süllyednie, hogy az agy normális működését elláthassa illetve, hogy akut

energia igény esetén gyorsan elérhesse a kívánt szintet. A major depresszió az egyik

hipotézis szerint nem más, mint egy kudarcba fulladt stresszválasz, ahol az

inzulinhatásnak ellenható hormonok rendszerében zavar keletkezik: er

szimpato-adrenerg aktiváció, valamint a hipotalamusz

hipotalamusz-növekedési hormon tengely aktivációja

abnormális működése hozzájárulhat az inzulin rezisztencia kialakulásához és/vagy a

pankreász β–sejtek diszfunkciójához.

1. ábra: Egymásnak ellenható anabolikus és katabolikus folyamatok a glükóz homeosztázisban. Az inzulin, mint anabolikkeresztül fejtve ki hatását növeli a glükóz felhasználást, segítve ezáltal a fehérje, triglicerid és glikogén szintézist. Ennek ellenhatva a kortizol, az adrenalin és a noradrenalin, a növekedési hormon glükóz termelést a proteolízisen, a lipolízisen, a glikolízisen és glükoneogenezisen keresztül. Az agynak a stresszre adott egyik válaszreakciója pedig ezen ellenhormonok elválasztásának stimulálása.

A glükóz az emlős sejt nélkülözhetetlen metabolitja, mely a glükóz transzporterek

(GLUT) segítségével jut be a sejtekbe. A GLUT1 mediálja az endotél sejtekbe és az

asztrocitákba való bejutást, míg a GLUT3 a neuronok transzportere. Az agy glükóz

felhasználása a neuronális aktivitás indikátora, amelyet pozitron emissziós

19

energia igény esetén gyorsan elérhesse a kívánt szintet. A major depresszió az egyik

hipotézis szerint nem más, mint egy kudarcba fulladt stresszválasz, ahol az

inzulinhatásnak ellenható hormonok rendszerében zavar keletkezik: er

adrenerg aktiváció, valamint a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese tengely és a

növekedési hormon tengely aktivációja (18). Ezeknek a folyamatoknak az

ködése hozzájárulhat az inzulin rezisztencia kialakulásához és/vagy a

sejtek diszfunkciójához.

ábra: Egymásnak ellenható anabolikus és katabolikus folyamatok a glükóz

Az inzulin, mint anabolikus hormon a májon, a zsírszöveten és az izomszöveten keresztül fejtve ki hatását növeli a glükóz felhasználást, segítve ezáltal a fehérje, triglicerid és glikogén szintézist. Ennek ellenhatva a kortizol, az adrenalin és a noradrenalin, a növekedési hormon és a glükagon mint katabolikus hormonok növelik a glükóz termelést a proteolízisen, a lipolízisen, a glikolízisen és glükoneogenezisen keresztül. Az agynak a stresszre adott egyik válaszreakciója pedig ezen ellenhormonok elválasztásának stimulálása.

ős sejt nélkülözhetetlen metabolitja, mely a glükóz transzporterek

(GLUT) segítségével jut be a sejtekbe. A GLUT1 mediálja az endotél sejtekbe és az

asztrocitákba való bejutást, míg a GLUT3 a neuronok transzportere. Az agy glükóz

neuronális aktivitás indikátora, amelyet pozitron emissziós

energia igény esetén gyorsan elérhesse a kívánt szintet. A major depresszió az egyik

hipotézis szerint nem más, mint egy kudarcba fulladt stresszválasz, ahol az

inzulinhatásnak ellenható hormonok rendszerében zavar keletkezik: erőteljesebb a

mellékvese tengely és a

a folyamatoknak az

ködése hozzájárulhat az inzulin rezisztencia kialakulásához és/vagy a

ábra: Egymásnak ellenható anabolikus és katabolikus folyamatok a glükóz

us hormon a májon, a zsírszöveten és az izomszöveten keresztül fejtve ki hatását növeli a glükóz felhasználást, segítve ezáltal a fehérje, triglicerid és glikogén szintézist. Ennek ellenhatva a kortizol, az adrenalin és a

és a glükagon mint katabolikus hormonok növelik a glükóz termelést a proteolízisen, a lipolízisen, a glikolízisen és glükoneogenezisen keresztül. Az agynak a stresszre adott egyik válaszreakciója pedig ezen ellenhormonok

s sejt nélkülözhetetlen metabolitja, mely a glükóz transzporterek

(GLUT) segítségével jut be a sejtekbe. A GLUT1 mediálja az endotél sejtekbe és az

asztrocitákba való bejutást, míg a GLUT3 a neuronok transzportere. Az agy glükóz

neuronális aktivitás indikátora, amelyet pozitron emissziós

20

tomográfiával (PET) és funkcionális mágneses rezonancia vizsgálattal (fMRI) lehet

kvantitatíve vizsgálni. PET-nél 18F-fluorodeozxiglükóz lehet a radioaktív nyomjelző

molekula, mely GLUT1 és GLUT3 segítségével jut át a vér-agy gáton. Depressziós

betegeknél csökkent glükóz felhasználást figyeltek meg a baloldali laterális prefrontális

kéreg területén kontroll személyekhez képest. Ezen kívül korrelációt is találtak a

glükózmetabolizmus helyi lecsökkenése és a depressziós tünetek súlyossága között. Az

antidepresszáns kezelésre adott tüneti válasz és a megnövekedett glükóz felhasználás

között asszociációt figyeltek meg a cinguláris kéregben, a prefrontális kéregben és a

bazális ganglionokban (19). Az a kérdés, hogy a neurális aktivitás regionális csökkenése

összefüggésben állhat-e a GLUT-ek funkcionális vagy struktúrabeli eltéréseivel, még

bizonyításra vár. Mindenestre Huntington-kórban (20) valamint Alzheimer-kórban (21)

a nucleus caudatus és az agykéreg területén már dokumentáltak expressziós eltéréseket

GLUT izoformák esetében.

A depresszió és a diabétesz közti kapcsolat megértését megközelíthetjük a gyulladásos

folyamatok és a hatásukra aktivált sejtek által szekretált proinflammatórikus citokinek

irányából is. A gyulladást közvetítő citokineknek (IL-1, IL-6, TNFα) számos hatásuk

mellett ún. „betegségviselkedést” is előidézhetnek. Ez alatt olyan nem specifikus

tünetek csoportját értjük, mint a láz, letargia, fáradékonyság, megnövekedett alvásigény,

fogyás, gyengeség, pszichomotoros aktivitás csökkenése, szociális interakcióktól való

visszavonulás (22). Ezek nagy része átfed a major depresszió tüneteivel. Nem meglepő

módon az IL-6 emelkedett szintjét mutatták ki major depresszióban szenvedő

betegekben (23). Számos cukorbetegnél is megfigyelhető a proinflammatórikus

citokinek szintjének megemelkedése, mely származhat a zsírszövetekből (24) vagy az

életkor előrehaladtával monociták és makrofágok szekréciójából (25). A túlsúlyos

egyéneknél észlelt TNFα-túlprodukció a zsír- és izomszövetben nemcsak az

inzulinhatást akadályozhatja meg (26), hanem akár fokozhatja is az egyéni hajlamot a

betegségviselkedés vagy depressziós tünetek kialakulására.

A fentiek alapján levonható a következetés, hogy a depressziós tünetek kifejlődése

diabéteszben a metabolikus hálózat kényes egyensúlyának megbomlására vezethető

vissza. Azonban nem egyedül ez az egyetlen faktor az, amelyik felelőssé tehető a

tünetek kialakulásáért. Mind a DM, mind a depresszió kialakulásában mai tudásunk

szerint a genetikai hajlam is fontos. Feltehetően a genetikai hajlam és a környezeti

21

faktorok interakciója lehet az, mely a felszínre hozhatja a betegséget. A következő

fejezetben azt szeretném összefoglalni, amit a DM és a depresszió genetikai hátteréről –

a jelenlegi szakirodalmi adatok alapján – érdemes tudni.

2.1.1 A diabétesz mellitusz és a depresszió néhány kandidáns génje

A komplex genetikai háttérrel rendelkező betegségek genetikai faktorainak

azonosítására a legelterjedtebb módszer még mindig a kandidáns gének asszociáció

vizsgálata, de a modern, nagy áteresztőképességű metodikák rohamos terjedése

következtében egyre több a teljes genomot vizsgáló asszociációanalízis (GWAS:

genome-wide association study). Az eset-kontroll típusú vizsgálatok során a kiválasztott

(kandidáns) gén(ek) vagy a teljes genomra kiterjedő markerek polimorf változatainak

előfordulási gyakoriságát hasonlítják össze bizonyos fenotípusos jegyekkel rendelkező

(az eset populációba tartozó) és nem rendelkező (a kontroll populációba tartozó)

csoportokban. Amennyiben statisztikai analízissel a két populáció között szignifikáns

eltérés mutatható ki egyes génvariánsok gyakoriság értékeiben, akkor az az allél az

adott betegség vagy jelleg kialakulásának genetikai rizikófaktorának tekinthető. A

kandidáns gén kiválasztásának alapja, hogy az adott gén terméke szerepet játszhat a

vizsgált betegség patomechanizmusában. A génben lévő változatok, polimorfizmusok

esetlegesen megváltoztatják a fehérje funkcióját vagy expresszióját. A pszichiátriai

genetika témakörében a kandidáns gének leggyakrabban a neurotranszmitterek

képződésében, lebontásában illetve a receptor hatásában közreműködő fehérjék génjei

közül kerülnek ki. A kandidáns gén asszociáció vizsgálatának előnye az érzékenység,

ezzel a módszerrel kis hatású gének is kimutathatók. Ugyanakkor ez az érzékenység

téves pozitív eredményekhez is vezethet, elsősorban akkor, ha az összehasonlított

populációk genetikailag heterogének (populáció-stratifikáció jelensége).

A depresszió kandidáns génjeit leginkább a monoamin hipotézis alapján választották ki,

mely a hatvanas években, Schildkraut munkássága nyomán fogalmazódott meg először.

A hipotézis értelmében, a depresszió kialakulásában a szerotonin, a noradrenalin és a

dopamin metabolizmusában fellépő regulációs zavarok játszanak döntő szerepet (27,

28). A noradrenalin- és szerotonin-deficitet a transzmitterek metabolitjainak (MHPG: 3-

metoxi-4-hidroxi-fenilglikol, illetve 5HIAA: 5-hidroxi-indolecetsav) alacsonyabb

22

likvor-szintje mutatja depressziósok körében. Legerősebb összefüggés az alacsony

5HIAA likvor-szint és az öngyilkossági-kísérlet, illetve elkövetés között található (29).

A monoamin hipotézist az antidepresszív szerek terápiás eredményei is alátámasztják. A

triciklikus antidepresszáns szereket ma már specifikusabb, a szerotonin visszavételt

gátló SSRI (Selective Serotonin Reuptake Inhibitor) és noradrenalin visszavételt gátló

SNRI (Selective Noradrenaline Reuptake Inhibitor) szerek váltották fel.

A depresszív kórképek körében eddig a legtöbb kandidáns gén vizsgálat a szerotonerg

polimorfizmusokra irányult. A szerotonin visszavételéért a szerotonin transzporter (5-

hidroxi-triptamin transzporter, 5HTT) felelős a szinapszisban. A szerotonin transzporter

leggyakrabban vizsgált polimorfizmusa az 5HTTLPR (5HTT linked polymorphic

region), amely a gén promoter régiójában található 20–23 bp hosszúságú ismétlődő

szekvencia. Két variánsa a 14 ismétlődést tartalmazó rövid (short, „s”) allél, illetve a 16

ismétlődést tartalmazó hosszú (long, „l”) allél. Számos közlemény bizonyította az

5HTTLPR rövid allélja és a hangulatzavarok kapcsolatát. A megjelent publikációk

adatainak egyik meta-analízise szignifikáns asszociációt mutatott az 5HTTLPR rövid

allél és a bipoláris depresszió között (30). A depresszió további gyakori kandidáns

génjei a szerotonin képződését és lebontását katalizáló enzimek génjei. A szerotonin

bioszintézis sebesség-meghatározó lépését a triptofán-hidroxiláz (TPH) katalizálja.

Idegrendszer-specifikus izoformája a TPH2, melyet 2003-ban írtak le (31). Az eddigi

vizsgálatok során már több mint 300 egypontos nukleotid-polimorfizmust (SNP-t)

fedeztek fel a TPH2 génjében. Ezek közül számos misszenz típusú, aminosav cserével

járó báziscsere, amelyek asszociáció analízise eddig sok egymásnak ellentmondó

eredménnyel szolgált, valószínűleg a ritka allélváltozatok alacsony esetszámai miatt

(32, 33). Az újabb asszociáció vizsgálatok ezért a nem kódoló régiókban elhelyezkedő

variánsok felé irányulnak, melyek előfordulási gyakorisága magasabb, mint 4-5%.

Ezeknek a polimorfizmusoknak is lehet relevanciája a depresszió kialakulásában, mert a

gén szabályozó régiójában lévő SNP-k a gén transzkripciós aktivitását befolyásolhatják.

A TPH2 mRNS szintjét szignifikánsan magasabbnak találták bipoláris depresszióban

szenvedő betegeknél a kontrollokhoz képest (34). Az újabb hipotézisek szerint a

depresszió kialakulásában kulcsfontosságúak bizonyos neurotoxikus illetve

neuroprotektív (neurotróf) folyamatok, illetve a központi idegrendszer fejlődését

szabályzó faktorok (neurodevelopmentális hipotézis); épp emiatt számos genetikai

23

asszociáció vizsgálat foglalkozik az agyi neurotróf faktor (BDNF) szerepével (35). Ezen

kívül a hipotalamusz-hipofízis-mellékvese (HPA) tengely fokozott aktivitására is

vannak adatok, amelyet a kóros dexametazon-szupressziós teszt laborértékei is

jelezhetnek, mely a HPA-tengely negatív visszacsatolásának defektusát sejteti major

depresszióban. Egy német populáció vizsgálatával összefüggést mutattak ki a

glükokortikoid receptor (GR) R23K polimorfizmusánakelőfordulása és a HPA-tengely

kóros működése között major depressziós betegekben (36). Érdekes megfigyelés, hogy

a depressziók egy csoportja szezonálisan lép fel, főleg az őszi, téli hónapokban.

Ugyancsak zavart mutat a napi ritmus is, súlyosabbak a depresszív tünetek a reggeli

órákban (37). A megfigyelés mögött a cirkadián ritmus és az alvás szabályozásában

szerepet játszó szuprakiazmatikus nukleusz-tobozmirigy tengely zavarát sejtik. A

tobozmirigy által termelt melatonin a fenti folyamatokon kívül a hangulati élet és a

viselkedés befolyásolásában is szerepet játszik. Ezt az elméletet támasztja alá az

agomelatin, egy melatonin agonista, antidepresszánsként való sikeres alkalmazása major

depresszió kezelésében (38).

A DM szintén egy komplex öröklődésű betegség, melynek kialakulásában a

környezeti rizikófaktorok (elhízás, mozgásszegény életmód, nem megfelelő diéta,

vírusinfekciók, stb.) mellett öröklött tényezők is szerepet játszanak. A cukorbetegség

hátterében szereplő genetikai rizikófaktorok egyenként általában kis hatásúak, és csupán

más genetikai és környezeti faktorokkal együtt járulnak hozzá a betegség kialakulásához

(39). A DM1 örökölhetőségében általánosan igazolt genetikai tényezőként tartjuk

számon a HLA (humán leukocita antigén) II osztályú gének közül a DRB1 és DQB1

géneket, melyek a betegség genetikai meghatározottságának kb. 50%-áért felelősek

(40). A gének által kódolt MHC (major histocompatibility complex) II molekulák

szerepe egyrészt az, hogy megkötik és a T-sejtek felé prezentálják a betegség

kialakulásában szerepet játszó processzált antigéneket, másrészt a DR és DQ gének által

kódolt molekulák kulcsszerepet játszanak a béta-sejtek pusztulását okozó, autoreaktív

T-sejtek csecsemőmirigyben való kiválasztódásában és aktiválódásában. Több, nem-

HLA génről is viszonylag régóta ismert, hogy kisebb mértékben ugyan, de

egyértelműen hajlamosít DM1 kialakulására. Ilyen például az inzulin (41, 42), a

citotoxikus T-limfocita asszociált protein 4 (CTLA4) (43, 44), a nem-receptor típusú

24

protein tirozin foszfatáz 22 (PTPN22) (45, 46), valamint az interleukin 2 receptor alfa

(IL2RA) (47-49) génje.

A DM2 kandidáns génjei közül a monogénes diabéteszt (MODY – maturity onset

diabetes of the young) okozó génekről régóta tudják, hogy működési zavaruk

cukorbetegség kialakulásához vezet. Ebbe a csoportba bizonyos máj- és hasnyálmirigy-

specifikus transzkripciós faktorok, illetve glukóztranszporterek funkcióvesztő mutációi

tartoznak. Feltételezhető volt, hogy ugyanezen gének kisebb hatású polimorfizmusai

ugyan önmagukban nem okoznak diabéteszt, de más rizikófaktorokkal együtt hatva

hajlamosíthatnak a kialakulására. Ezek közül a HNF1B (hepatocita nukleáris faktor-1-

beta) gén intronjában elhelyezkedő rs757210 SNP-ről és a WFS1 (wolframin) gén 2

SNP-jéről (rs10010131 és rs6446482) sikerült igazolni egyértelmű asszociációt DM2-al

(50, 51). A WFS1 gén a wolframin fehérjét kódolja, mely az endoplazmás retikulum

membránjában található és mutációi Wolfram-szindrómához vezetnek, mely egy

komplex, a szénhidrát-anyagcsere zavarát is magába foglaló tünetegyüttes. A PPARγ

(peroxiszóma proliferátor-aktivált receptor-gamma) kezdettől fogva egy különösen

vonzó kandidáns gén volt DM-ban, hiszen a gén terméke a cukorbetegség kezelésében

használatos tiazolidindionok célmolekulája. Így nem meglepő, hogy a PPARγ génben

azonosítottak először multifaktoriális DM-ra hajlamosító génvariánst (Pro12Ala). A

témában mérföldkőnek számító meta-analízis igazolta, hogy - érdekes módon - a

gyakoribb prolin allél a rizikófaktor, mely homozigóta formában 20%-al növeli a DM2

kialakulási valószínűségét (52). A DM kezelésének egy másik célmolekulája az

inzulinszekréció szabályzásában kulcsfontosságú szulfanilurea-receptor, mely egyik

alegységének génje (ABCC8) csupán néhány kilobázisnyi távolságra található a

KCNJ11 géntől. A KCNJ11 a szulfanilurea receptor funkcionális partnere, a pankreász

szigetsejt ATP szenzitív K+-csatornájának Kir2.6 alegységét kódolja. Több vizsgálatban

igazolták a KCNJ11 egyik aminosav-cserét okozó polimorfizmusának (Glu23Lys)

szerepét, mely a kóros inzulinelválasztással hozható összefüggésbe (53, 54).

2.1.2 Kapcsoltsági analízisek és teljes genomi asszociáció vizsgálatok

A kandidáns gén vizsgálatok legnagyobb hátránya, hogy szükséges hozzá az adott

betegség patomechanizmusának ismerete vagy egy megalapozott hipotézis megléte.

Azonban számos esetben - mint például a pszichiátriai kórképeknél - a háttérben lévő

25

molekuláris mechanizmusok részben még ismeretlenek, ilyenkor kifejezetten fontosak a

hipotézis nélküli, nagy lefedettséget biztosító teljes genom vizsgálatok. A kapcsoltsági

analízisek leginkább olyan, a populációban ritka genetikai variánsok felkutatására

alkalmasak, melyek erős hatást mutatnak és mendeli öröklődést követnek. Általában

olyan családok vagy kis, zárt közösségek genetikai vizsgálatát jelentik, ahol egy

bizonyos fenotípus gyakorisága az átlagpopulációhoz képest magasabb. Az egyes

genetikai markerek alléljainak mendeli eloszlását figyelembe véve azonosíthatók olyan

kromoszómarégiók, melyek összefüggésbe hozhatók az adott fenotípussal. A genetikai

kapcsoltságot alapul véve pedig ezen régiókban található géneket azonosíthatunk az

adott betegség prediszponáló tényezőjeként (55). Erre példa a depresszió egyik új

kandidáns génje, a P2RX7 (purinergic receptor P2X, ligand-gated ion channel, 7) gén

előtérbe kerülése, amely részletesebben a következő alfejezetben kerül bemutatásra.

Az utóbbi évek látványos genomikai fellendülése (olyan konzorciumok létrehozása,

mint például a Psychiatric GWAS Consortium, illetve kutatóközpontok

együttműködése, pl. HapMap project) és a genotipizálási technikák fejlődése a nagy

áteresztőképességű módszerek előtt nyitották meg az utat. A teljes genomi asszociáció

vizsgálat előnye, hogy egyszerre több százezer, a genom különböző pontjain előforduló

SNP vizsgálatát képes elvégezni, mellyel sokkal átfogóbb és sokkal kevésbé elfogult

(előfeltételezéstől mentes) eredményt lehet elérni, mint a kandidáns gén vizsgálatokkal.

Segítségével korábban nem vizsgált gének szerepe vetül fel komplex, a szervezet több

rendszerét is érintő kórképekben.

A DM2 vonatkozásában is több GWAS készült már, melyek reprodukálható

eredményeit egy átfogó meta-analízis értékeli (56). A közel négyezer beteg és ötezer

kontroll mintán mintegy négyszáz ezer SNP újravizsgálatát végezték el a brit

vizsgálatban. Eredményeik alapján a 6-os kromoszómán található CDKAL1 (ciklin-

dependens kináz 5 regulátor alegység asszociált fehérje 1-szerű fehérje 1) lókusz

mutatta az egyik legerősebb asszociációt. Emellett sikeresen replikálták a HHEX

(hematopoietically expressed homeobox) génrégió és az IGFBP2 (inzulinszerű

növekedési faktor 2 mRNS kötő fehérje 2) valamint az SLC30A8 (cink-transzporter 8)

génekben korábban DM2-vel asszociációba hozott polimorfizmusokat. A vizsgálat

további új kandidáns gének (CDKN2A/CDKN2B; ciklin-dependens kináz inhibitor 2A

és 2B) felfedezéséhez is vezetett. A publikáció eredményeit az a tény teszi még

26

érdekesebbé, hogy az összes fent említett régió összefüggésbe hozható a pankreász béta-

sejtek fejlődésével és működésével.

Depresszió vonatkozásában a bipoláris zavar három GWAS eredményeit összegezve

(4387 beteg adataival) szignifikáns asszociációt mutattak ki a sejtmotilitásban és -

proliferációban jelentős szerepet játszó ankirin G gén (ANK3), valamint az L-típusú

feszültség-függő kalcium csatorna alfa-1C alegység (CACNA1C) gén régiójában (57).

Major depresszióban a GWAS eredményei nem mutattak genom-szintű szignifikáns

asszociációt, azonban egy újabb meta-analízis, amely több mint hatezer, bipoláris

zavarban vagy major depresszióban szenvedő beteg adatait egyesítette, alátámasztotta a

CACNA1C gén szerepét hangulatzavarokban (58). A teljes genom vizsgálatok

segítenek elrugaszkodni az irodalomban meggyökeresedett, de sokszor elavult

elképzelésektől, ugyanakkor zavarba ejtő, hogy az eredmények a legritkábban esnek

egybe korábbi kandidáns génvizsgálatok eredményével.

2.1.3 A P2X7 receptor variánsok szerepe depresszió kialakulásában

A P2RX7 egy genetikailag homogén kanadai populáción végzett kapcsoltsági analízis

eredményeként került fókuszba. A vizsgálat a 12q23-q24 kromoszóma-régiót hozta

összefüggésbe bipoláris zavarral (59, 60) és major depresszióval (61). A kromoszóma-

régió további részletes vizsgálata a P2RX7 gén aminosavcserét okozó Gln460Arg

polimorfizmusát (rs2230912) azonosította rizikó faktorként (62). A polimorfizmus

szerepét később megerősítették asszociáció vizsgálatok major depresszióban (63) és

bipoláris zavarban is (64). Ez idáig sem a P2RX7 Gln460Arg polimorfizmusnak, sem

magának a P2X7 purin receptornak a szerepe nem tisztázott a depresszió

patogenezisében. Az ATP-függő P2X receptorok kationszelektív ioncsatornák, nagy

kálcium áteresztőképességgel, melyek nagyon gyors, extracelluláris ATP-közvetítette

jelátvitelre képesek azokban a szinaptikus résekben, ahova ATP kerül ürítésre (65, 66).

A purinerg jelpálya létét – mind a perifériális, mind a központi idegrendszerben –

Geoffrey Burnstock fedezte fel az 1970-es években. Különböző receptorok léteznek az

adenozin (P1 receptor család) és az ADP/ATP (ionotróp P2X és metabotróp P2Y

receptor családok) számára (67, 68). A P2X receptorcsaládban ezidáig hét különböző

gén által kódolt alegységet azonosítottak. A különböző receptorok ezen – topológiailag

nagyon hasonló – egységekből állnak össze (2. ábra) (65).

27

2. ábra: A P2X7 receptor alegységének struktúrája és polimorf pontjai A fehérje alegység a P2X receptorokban általánosan két transzmembrán régióval rendelkezik, melyek közül a második szegélyezi a csatorna pórusát. Az amino- és a karboxilvég intracellulárisan található, míg az ATP-kötő domén extracellulárisan. Minden P2X-receptor rendelkezik egy konzervált PKC-foszforilációs hellyel az amino-terminális közelében. A pirossal jelölt pontok funkcióvesztéses mutációt jelölnek, míg a zöldek funkciónyeréses mutációt kódolnak. A narancssárga Q460R polimorfizmus a leggyakrabban vizsgált funkciónyeréses génvariációt jelöli. A kékkel árnyékolt régiók dileucin motívumokat jelölnek. Lila négyzetek jelölik az N-glikozilációs helyeket.

A P2X7 receptor homomer alegység-szerkezetű és számos sejttípus, például

hematopoetikus sejtek (makrofágok, bizonyos limfociták), oszteoblaszt, endotél sejt,

fibroblaszt felszínén fejeződik ki (68). Emellett az idegrendszer különböző sejttípusain

is megtalálható, mint pl. mikroglia, asztrocita, oligodendrocita, Schwann-sejt és

neuronok (69). Ma még nem teljesen tisztázott, hogy pontosan milyen fiziológiás

folyamatokban játszik szerepet a P2X7 purin receptor az idegrendszerben. A Ca2+ és

Na+ ionok beáramlásának szabályozása mellett legfontosabb szerepének a gyulladásos

citokinek exocitózisában való részvételét tartják (70). Valószínűleg szerepe lehet a

28

neuronális sejthalál befolyásolásában az interleukin-1β szekrécióján keresztül, mely

citokin a neurodegeneráció, a krónikus gyulladás és fájdalom egyik fő mediátora (66).

Legvalószínűbben ezen funkción keresztül lehet szerepe a depresszió patogenezisében

figyelembe véve, hogy a gyulladásos citokinek feltételezhetően nagy szerepet játszanak

a depresszió molekuláris hátterének kialakulásában (pl.: TNFα adása

intracerebroventrikulárisan depresszióhoz nagyon hasonló viselkedést idéz elő

állatokban). Mindemelett a preszinaptikus P2X7 receptorok számos neurotranszmitter

exocitózisát serkentik az idegvégződésekben, ami ugyancsak azt valószínűsíti, hogy a

fehérje funkciójának megváltozása befolyásolhatja az agy normális működését, mely

végső soron pszichiátriai kórképekhez vezethet (69, 71). Néhány kísérleti eredmény

indirekt módon is valószínűsíti a receptor szerepét a depresszió patogenezisében.

P2RX7 génkiütött egerek depressziós és szorongásos modellekben az antidepresszáns

kezelésben már részesült állatok viselkedését mutatták (72). Alvás megvonáskor pedig,

mely a depresszió gyógyszeres kezelésének egyik alternatívája, a P2RX7 expressziója

szignifikáns növekedést mutatott a perifériás mononukleáris vérsejtekben (73). LÉ

2.2 A mikroRNS és polimorfizmusai

2.2.1 A mikroRNS szerepe a transzláció szabályozásában

A mikroRNS (miRNS) olyan rövidszálú nem kódoló RNS-molekula, mely szekvencia

specifikus módon, poszttranszkripciós szinten vesz részt a génexpresszió

szabályozásában. A miRNS-ek felfedezése a Caenorhabditis elegans genetikai

modellállat fejlődésének vizsgálatakor történt (74). Azóta több száz miRNS-t

azonosítottak szinte az összes többsejtű élőlény, így az ember genomjában is. A

miRNS-ek számos szövetben kifejeződhetnek és különféle fejlődési és fiziológiai

folyamatok szabályozásában vehetnek részt. Felfedezésük új dimenzióval gazdagította a

sejtszintű szabályozásról alkotott eddig is komplex képünket.

Az RNS-családok hagyományos felosztása szerint megkülönböztetünk tRNS-eket,

mRNS-eket, rRNS-eket, snRNS-eket és snoRNS-eket. Az utóbbi évek felfedezése

alapján az RNS-világ családjait tovább bővíthetjük a szabályozó funkciót betöltő, népes

miRNS és a kis interferáló RNS-ek (siRNS) csoportjával. A két csoport közt nem lehet

éles különbséget vonni, annyi mindenestre kijelenthető, hogy amellett, hogy

29

keletkezésük módja több ponton is eltér egymástól az siRNS-ek az RNS

célszekvenciával való bázispárosodás után az mRNS molekula enzimatikus

degradációját idézik elő. A folyamatot RNS interferenciának nevezzük és feltétele a

tökéletes bázispárosodás. Feltételezések szerint az siRNS-ek külső genetikai elemek

(vírusok, transzpozonok) elleni ősi védekezési mechanizmus részei, melyet a modern

tudomány célzott gének csendesítésére használ ki (75).

A miRNS-ek 21-26 nukleotidból álló nukleinsav molekulák. Többnyire a korábban

“szemét” DNS-nek nevezett genomiális régióban kódoltak, de gyakori, hogy gének

intronikus régiójában helyezkednek el. Ilyenkor expressziójukat a „host” gén promotere

szabályozza. A miRNS-ek transzkripciójában az RNS polimeráz II vesz részt, amely

először egy hosszú „hajtű-prekurzort”, a primer mikroRNS-t (pri-miRNS) hoz létre. Az

érett miRNS kialakulásában az első lépés a stemloop (törzshurok) rész leválasztása a

DROSHA (III-as típusú endoribonukleáz: kettős szálú RNS-re specifikus aktivitás)

által. Ez a hasítás egy körülbelül 70 nukleotid hosszú köztes terméket eredményez, amit

pre-miRNS-nek nevezünk. A következő lépés a pre-miRNS kijuttatása a sejtmagból,

amelyben az Exportin-5 vesz részt. A pre-miRNS-en belül az érett miRNS-tag a

hajtűkanyaros szekvencia egyik karjának része, ennek a kivágását a ribonukleoprotein-

komplex (miRISC) és a DICER végzi. Utolsó lépésben a kivágott kettős lánc szétválik,

majd a 3’-5’ komplementer szál degradálódik (76). Az érett miRNS-ek jellemzően a

megfelelő mRNS-ek 3’ végi, nem transzlálódó részéhez (3’ UTR: untranslated region)

kapcsolódnak (3. ábra).

30

3. ábra: A miRNS és a siRNS érése és a poszt-transzkripciós szupresszió általános folyamata (76). Magyarázatot lásd a szövegben.

Ezt követően a szabályozás döntően a transzláció gátlása révén valósul meg, de a

mRNS-t lebontó endonukleázok aktiválásával (RNS-degradáció) is történhet. A cél-

mRNS-molekulához való kötődéshez állatokban nem szükséges az RNS heteroduplex

közötti teljes komplementaritás. Jelen adatok alapján, a célszekvenciához kapcsolódás

következménye növényekben inkább RNS-degradáció (a csaknem teljes fokú

komplementaritás miatt RNS-interferenciaszerű mechanizmus) vagy a kromatin

metilációs mintázatának módosításával a transzkripciós csendesítés, míg állatokban

inkább a transzláció gátlása (77). Emberben eddig több mint 1000 miRNS-t írtak le

(http://www.mirbase.org alapján) és folyamatosan tökéletesítik azoknak a

bioinformatikai módszereknek a kereső algoritmusát, amelyekkel előre jelezhetik magát

31

a molekulát és feltételezett kötőhelyét. Jelenleg úgy gondolják, hogy a humán gének

mintegy 30%-a miRNS-függő poszttranszkripciós szabályzás alatt áll (78). A miRNS-

eknek a sejtek normális működésében, fejlődésében és differenciálódásában betöltött

szerepét régóta kutatják. A miRNS-ek sejtdifferenciálódásban valószínűsített általános

szerepét támasztja alá az a megfigyelés, hogy a differenciálódás azonos fokán hasonló

miRNS-mintázat figyelhető meg a különféle fejlődési vonalakban (79). Fiziológiás

folyamatokban betöltött szerepük fontossága feltételezi, hogy szabályozó szerepük

megváltozása patológiás folyamatokat indíthat be, melyek különböző betegségek

kialakulásához vezethetnek (80). Az utóbbi évek kutatásai valószínűsítik a miRNS-ek

szerepét az idegrendszer fejlődésében, különösképpen a szinapszisok kialakulásában és

érésében. Deregulációjuk pedig idegrendszeri zavarok hátterében is állhat (81).

2.2.2 A miRNS-kötőhelyek polimorfizmusai

Bár a szabályozás kifejtéséhez nem szükséges teljes komplementaritás, a miRNS 5’ végi

2-7 pozíciójában lévő nukleotidja közti ún. mag (seed) régiójának tökéletes

bázispárosodása a cél-mRNS-molekulával elengedhetetlen (82). Ebben a régióban a

heteroduplex bármelyik tagjában bekövetkező bárminemű változás meggátolja a

folyamat érvényre jutását. Egy bázis cseréje a kötőhelyen megakadályozhatja a miRNS

kötődését, ezáltal befolyásolva annak szabályozó szerepét, vagy éppen tökéletes

szekvencia egyezés alakul ki egy eredetileg nem az adott mRNS-hez asszociált miRNS

magrégiója számára. A polimorf kötőhely tehát a megfelelő fehérje transzlációját

csökkentheti vagy növelheti, ilyenformán funkciónyeréses vagy funkcióvesztéses gén

variánsként értelmezhető. Manapság több adatbázis elérhető, amelyekben az egyes

SNP-k hatását vizsgálják és gyűjtik össze a már leírt miRNS-ek relációjában. A

Patrocles (83) (http://www.patrocles.org/) valamint a polymiRTS adatbázis (84)

(http://compbio.uthsc.edu/miRSNP/) szisztematikusan összegyűjti és kereshetővé teszi a

gének 3’ UTR régiójában leírt SNP-ket és a régió által érintett már ismert miRNS-eket.

A polimorfizmusok által befolyásolt feltételezett kölcsönhatások számos esetben

bizonyultak valódinak, ezáltal egy újabb interpretációt adva a polimorfizmusok gének

működését befolyásoló hatásának, ráirányítva a figyelmet a genetikai variánsok és a

miRNS-ek kapcsolatára.

32

Az egyik legelső munka ebben a témában a SLITRK1 gén erősen konzervált 3’ UTR

régiójában leírt polimorfizmussal (var321) kapcsolatban jelent meg, melyet Tourette

szindrómával hoztak összefüggésbe. A var321 variáns a miR-24 feltételezett kötőhelyén

található. Kotranszfekción alapuló in vitro kísérletekkel bizonyították, hogy a miR-24

kötődése megnőtt a mutáció hatására a gén által kódolt transzkriptumhoz. In situ

hibridizációval pedig kimutatták, hogy a SLITRK1 mRNS-expressziós mintázata

egéragyban korrelál a miRNS expressziós mintázatával (85).

Egy másik klasszikus példa az angiotenzin-II receptor 1-es típusának (AGTR1) 3’ UTR

régiójában található rs5196 SNP-je, melyett számos kardiovaszkuláris betegséggel,

főleg magas vérnyomással hozták összefüggésbe. A polimorfizmus funkcionális

hatásaként sikerült kimutatni a miR-155 csökkent kötődését a gén által kódolt mRNS-

hez, mely a receptor fehérje felszaporodását eredményezte (86). A receptor szelektív

blokkolásával reményteli klinikai kísérletek során más antihipertenzív terápiákkal

ellentétben sikerült a kardiovaszkuláris eredetű morbiditást és mortalitást csökkenteni

egy adott cukorbeteg alcsoportban (87). A terápiában résztvevő egyének AGTR1

miRNS-kötőhely polimorfizmusának vizsgálata hozzájárulhat a kezelés

hatékonyságának növeléséhez.

A DM2-vel összefüggésben az egyik legerősebb asszociációt a 3’ UTR területén

lokalizált polimorfizmusok közül egy ACAA inszerció/deléció mutatta, mely az IGF2R

(inzulinszerű növekedési faktor 2 receptor) génben található (88). In silico predikció

alapján a régió a miR-657 kötőhelyét tartalmazza, melyet a leíró munkacsoport luciferáz

riporter rendszerben is bebizonyított. Továbbá az is bizonyítást nyert, hogy az említett

miRNS részt vesz az IGF2R szabályozásában, amit a vizsgált polimorfizmus jelentősen

képes befolyásolni.

A szerotonin géneknél is kimutattak miRNS-kötődést befolyásoló SNP-ket, mint

például a szerotonin 1B receptor gén represszióját befolyásoló rs13212041. Jensen és

munkatársai luciferáz riporter rendszerben bebizonyították, hogy az SNP G variánsa

gátolja a miR-96 gátló hatását, ezáltal növeli a génexpressziót (89).

2.3 Teljes genomi expressziós vizsgálatok diabétesz mellituszban

Az expressziós genomikai kutatások egyik hatékony megközelítését szolgálják a DNS

microarray (hibridizációs mikrochip) technológián alapuló eljárások. Segítségükkel az

33

egyedi, génszintű megközelítés helyett gének tízezreit lehetséges egyszerre vizsgálni

rendszer szinten. A vizsgált biológiai mintából - mintegy pillanatfelvételt készítve -

képet kaphatunk annak transzkripciós aktivitásáról. A rengeteg gén egyidőben történő

vizsgálata lehetőséget nyújt hipotézismentes, nem várt funkciók felderítésére. A

módszernek hatékonysága miatt számos alkalmazási területe van: új betegség altípusok

megismerése, új diagnosztikai eszközök fejlesztése, betegségek patomechanizmusának

és gyógyszerek hatásmechanizmusának megértése. Mivel a módszer emberi mértékkel

kezelhetetlen mennyiségű adatot szolgáltat, rendkívüli odafigyelés szükséges a helyes

kísérleti terv kidolgozásakor, a biológiai minta szakszerű feldolgozáskor, valamint az

adatok bioinformatikai úton történő kiértékelésekor.

Az inzulinrezisztencia perifériális hatását feltérképező vizsgálatok egy része ilyen

típusú génexpressziós microarray mérést használt. A DM2-ban kialakult

inzulinrezisztencia sejtszinten az inzulin-jelpálya számos lépésének defektusát jelenti.

Izomszövetben például a GLUT4 inzulin által kiváltott transzlokációja zavart szenved.

Az inzulinrezisztencia visszafordítását célzó farmakológiai megoldások ezért például az

inzulinreceptor tirozin-kináz-aktivitásának növelését célozzák. Emellett az

inzulinreceptor-szubsztrát-1 (IRS-1) tirozin-foszforilációja vagy az inzulinfüggő

foszfatidilinozitol-3-kináz-aktivitás növelése is lehet egy célpont (90). Az

inzulinreceptor által aktivált szignáltranszdukciós útvonalak számos gén transzkripcióját

befolyásolják: az emelkedett illetve csökkent expressziójú gének száma eléri a 150-et

(91). A DM2 által leginkább érintett szövetek a vázizomszövet, a zsírszövet és a máj. A

továbbiakban néhány olyan eredményt ismertetek, amelyek globális DNS-microarray

segítségével térképezték fel ezen szövetek megváltozott expressziós profilját.

2.3.1 Génexpressziós változások a zsírszövetben

Régóta ismert, hogy adipocitákban az inzulinrezisztencia hátterében valószínűleg a

GLUT4 csökkent expressziója áll (92). Emellett Yang és munkatársai az inzulinszerű

növekedési faktor 2 (IGF2) csökkent expresszióját mutatták ki egy nagy elemszámú

DM2-ben szenvedő kínai beteg populáción microarray kísérletben (93). Az IGF2

alacsony szérumszintjét mások összefüggésbe hozták viszcerális elhízással egy normál

glükóz toleranciájú populáció 4 éves követéses vizsgálatában (94). Genetikai

vizsgálatok is valószínüsítik az IGF2 szerepét inzulinrezisztencia kialakulásában, mert

34

bizonyos génvariánsainál asszociációt lehetett kimutatni a túlzott kalóriabevitellel

kapcsolatba hozható metabolikus változásokkal és a csökkent inzulinérzékenységgel

(95). Szintén microarray kísérlet alapján írták le a RORC (reténsav kötő receptor γ)

megnövekedett expresszióját cukorbetegek körében (93). Normál esetben a gén

transzkripciós aktivitása az adipociták differenciálódásakor fokozódik. A gént korábbi

asszociáció vizsgálatok alapján a 2-es típusú diabétesz kandidáns génjének kiáltották ki

(96). A PTPN1 (nem receptor típusú protein tirozin foszfatáz 1) géntermék mennyisége

szintén fokozódik. Ez a fehérje az inzulin-jelpálya negatív modulátora azáltal, hogy

defoszforilálja az inzulinreceptor-kináz foszfotirozin-oldalláncait izomszövetben (97).

PTPN1 génkiütött egereken végzett kísérletek alapján úgy gondolják, hogy a gén által

kódolt fehérje döntő szerepet játszik az inzulinérzékenység és az energia metabolizmus

negatív regulációjában, ezáltal potenciális gyógyszercélpont lehet a DM2 kezelésében

(98). Zsírszövetben a fentieken kívül a stressz, az immunválasz és a metabolizmus

kategóriáiba tartozó gének mutattak expressziós változást (93). Más független

módszerrel (pl.: real-time PCR) ugyan nem sikerült validálni a változásoknagy részét,

de a betegség patomechanizmusának megértésében segíthetnek, ezért érdemes

megemlíteni őket. Néhány példa a teljesség igénye nélkül: CES1 (karboxilészteráz 1),

BZRAP1 (periferiális benzodiazepin receptor asszociált fehérje 1), PPA2 (inorganikus

pirofoszfatáz 2), MGLL (monoglicerid lipáz) csökkent expressziót mutat, IGKC (kappa

konstans immunoglobulin), IGKV1D-13 (kappa variábilis 1D-13 immunoglobulin),

ALDH1A1 (acetaldehid dehidrogenáz 1), ADH1B (alkohol dehidrogenáz 1B) pedig

emelkedett expressziót mutat (93).

2.3.2 Génexpressziós változások az izomszövetben

Ugyancsak Yang és munkatársai megfigyelése, hogy izomszövetben a PKM2 (piruvát-

kináz M2), mely a piruvát-kináz szövetspecifikus izoformája, megnövekedett

expressziót mutat cukorbetegségben (93). Az enzim a glikolízis egyik fontos regulációs

egysége, mely egy foszfát csoport transzferét katalizálja a foszfoenol-piruvátról ADP-

re. A folyamat eredményeként ATP és piruvát keletkezik. Az enzimnek 4 különböző

izotípusa ismert (M1, M2, L és R), melyek szövetspecifikusan expresszálódnak és

fruktóz-1,6-biszfoszfát hatására aktiválódnak. A PKM2-nek két fő formája ismert a

sejtekben: a nagy aktivitású tetramer és a kis aktivitású dimer forma. Magas

35

glükózkoncentráció elősegítheti az egyensúly eltolódását a tetramer forma irányába,

megnövelve ezáltal a PKM2 enzimatikus aktivitását (99). A PKM2-expresszió

növekedésének hátterében a diabéteszben megfigyelhető magas glükózszintre adott

kompenzatórikus válaszreakció sejthető. Ugyanez a microarray vizsgálat kimutatta (bár

független vizsgálat megerősíteni nem tudta) 3 hemoglobin alegység (α1, β és δ)

csökkent expresszióját. Hasonlóan az előző eredményekhez, DNS-chippel ugyan

kimutatták az ACOX3 (acil-CoA oxidáz 3) és a NAA35 (N-alfa-aciltranszferáz 35)

emelkedett, valamint a SAT1 (spermidin/spermin N1-acetiltranszferáz 1) lecsökkent

expresszióját, de ezt megismételni real-time PCR-al már nem sikerült (93). A

metabolizmus mellett a másik nagy, változást mutató génkategória a sejt jelátvitele és a

sejtek közötti kommunikáció volt. Ezeket az eredményeket itt sem sikerült reprodukálni,

ami a microarray kísérlet kiértékelésének sajátosságaiból (nagy elemszámú

normalizálás, eltérő statisztika) is származhat, de érdemes megemlíteni.

2.3.3 Génexpressziós változások a májban

A diabétesznek a máj transzkriptomjára gyakorolt hatásáról meglepően kevés

microarray vizsgálaton alapuló eredményt lehet találni. A genomszintű kutatások

többnyire bizonyos antidiabetikus hatóanyagok hatásmechanizmusát próbálták feltárni,

melyek segítségével – fordított megközelítéssel – a DM2 patomechanizmusáról is

többet megtudhatunk. Matsumoto és munkatársai a kolesztiraminnak a máj

génexpressziós mintázatára gyakorolt hatását vizsgálták DM2 egérmodellben (NSY/Hos

törzs) (100). A kolesztiramin és rokon hatású vegyületei képesek megkötni a bélben az

epesavakat, létrehozva egy nem oldódó komplexet, mely később a széklettel ürül a

szervezetből. Az epesavak visszaszívódásának gátlásán keresztül elősegítik a

koleszterin ürítését a szervezetből, ezért gyakran alkalmazzák hiperkoleszterinémia

kezelésére. Az utóbbi években számos kísérleti és klinikai kutatás kimutatta az

epesavkötő gyanták pozitív hatását DM2-ban is, például a colestimide egérmodellben

pozitív hatást gyakorolt az inzulinrezisztenciára és a glükóztoleranciára egyaránt (101),

illetve koleszevelam szedése javította a cukorbetegek glikémiás kontrollját (102). A

vizsgálat eredményeként Matsumoto és munkatársai kimutatták, hogy a kolesztiramin-

kezelés hatására a koleszterin és az epesavak szintéziséért felelős fehérjék génjei mellett

megemelkedett az LDLR (low-density lipoprotein receptor) gén expressziója is.

36

Ugyanakkor csökkent az ABCG5 és az ABCG8 (ATP-binding cassette g5 és g8)

expressziója, melyek együtt alkotnak egy transzporter fehérjét, mely szelektív

pumpaként működve a felszívódó koleszterint és növényi szterolokat a bélhámsejtekből

a béllumen felé, a hepatocitákból pedig az epekapillárisok felé visszapumpálja. Ezek az

eredmények adják azoknak a vér-biokémiai méréseknek a molekuláris biológiai hátterét,

miszerint kolesztiramin hatására csökkent a plazmában az összkoleszterin, a nem HDL-

koleszterin, a trigliceridek, a glükóz és az inzulin szintje (101), ami azt sugallja, hogy

más epesavkötő anyagokhoz képest hatása lehet a diszlipidémia és DM2 kialakulásáért

felelős gének szabályozásában.

2.4 Idegrendszeri változások diabétesz mellituszban, a 3-as típusú diabétesz

koncepciója

2.4.1 Az inzulin hatása az agyra

Sokáig úgy gondolták, hogy a központi idegrendszer glükóz metabolizmusára nincs

hatással az inzulin, ezért az agyat inzulin-inszenzitív szervként definiálták. Ma már

elmondhatjuk, hogy ez nem így van és habár az agy nem számít az inzulin klasszikus

értelemben vett célpontjának, az utóbbi időszak e téren folytatott kutatásai azt

bizonyítják, hogy ez a polipeptid hormon fontos szerepet tölt be fiziológiás és

patológiás körülmények közt is a neuronok működésében.

Az inzulinreceptorok az agyban általánosan elterjedtek. Ezt először Havranka és

munkatársai mutatták ki autoradiográfiás assay segítségével (103). Azóta számos

közlemény igazolta ezt. A legnagyobb mennyiségben a bulbus olfactoriusban, a

hypothalamusban, a cerebrális kortexben és a hippocampusban expresszálódnak (104),

ahol feltételezhetően szerepet játszanak a glükóz metabolizmus szabályozásában, a

táplálék felvétel és a testsúly szabályozásában, illetve a tanulásban és a memória

kialakulásában (105). A felnőtt emlős agyban az inzulinreceptoroknak két típusa

található meg: a perifériális típus, mely csak a gliasejteken található és az agyspecifikus,

mely a neuronokban expresszálódik (106). Úgy tűnik azonban, hogy jelátvitelükben

nincs különbség. Az agyi inzulin eredetével kapcsolatban nincsenek egyértelmű

irodalmi adatok. Az régóta ismert, hogy az inzulin jelen van az agyban és ott az IGF-1

és a FOXO transzkripciós faktor expresszióját befolyásolja (107), azonban sokáig

váratott magára annak tisztázása, hogy az agyi inzulint valóban az agy neuronjai

37

termelik vagy a vér-agy gáton átjutva kerül az agy állományába. Irodalmi adatok

alapján minkettőre találunk példákat. A 90-es évek elején reverz transzkripciós

módszerrel több fajból, így patkányból is, kimutatták az agy saját inzulintermelését

(108). Azonban ezek az adatok döntően azt valószínűsítik, hogy az agyi iznulintermelés

leginkább csak az embrionális fejlődés alatt jellemző. A felnőtt agy inzulintermelését

csak neuronális sejttenyészeteken, sejtvonalakon és halakban mutatták ki (109-111).

Tehát az agy saját inzulinszintézise a mai napig kétséges. A legvalószínűbb, hogy a

centrális inzulin a perifériális inzulinból származik, mely receptor-mediált

transzcitózissal jut át a vér-agy gáton (112). A transzport telítési reakcióhoz hasonlít. A

két oldal inzulin koncentrációja nem korrelál egymással.

Úgy tűnik, hogy a központi idegrendszeri inzulinrezisztencia korrelál a perifériás

inzulinrezisztenciával. Fiziológiás helyzetben a zsírsejtekből felszabaduló leptin az

agyba eljutva interakcióba lép az inzulinnal, és együttesen szabályozzák az

energiaegyensúlyt a táplálékbevitel csökkentése és súlyvesztés révén. Ezen szabályozó

körök megszakadása elhízáshoz és DM2 kialakulásához vezethet. A folyamat hátterében

az állhat, hogy a hiperinzulinémia deszenzitizálja a vér-agy gát inzulin receptorait,

melyek centrális inzulinrezisztenciához vezetnek (113). Fiziológiás koncentrációban az

inzulin jótékonyan befolyásolja a neuronok túlélését, ugyanis számos kísérletesen

indukált apoptózis esetén bizonyult neuroprotektívnek (114). DM2-ban ugyanakkor az

inzulinrezisztencia miatt az inzulinra adott válaszképesség csökken, ezáltal csökken a

protektív hatás, a sejtek neurotoxikus hatásokra rosszabbul reagálnak (114). Egyre több

adat szól amellett, hogy az inzulinszint és a kognitív teljesítmény között direkt kapcsolat

van. A neurodegeneráció és a kognitív hanyatlás kockázata megnő azoknál az

inzulinrezisztenciát mutató betegeknél is, akiknél még nincs hiperglikémia

(prediabétesz) (115), azt sejtetve, hogy az inzulinhatás kiesése ebben az esetben

ugyanolyan fontos, mint a magas vércukorszint. A magas inzulinszint gátolhatja a

neuronok tüzelését és csökkentheti a kolin-acetiltranszferáz aktivitását, mely enzim a

memóriában és tanulásban érintett neurotranszmitter, az acetilkolin képzésében játszik

szerepet. Az inzulin más neurotranszmitterek működésében is érintett: GABAA-

receptor közvetítette szinaptikus transzmisszióban szabályozó szerepet tölt be azáltal,

hogy serkenti az összeállt receptor plazmamembránba való kihelyeződését a

citoplazmából (116); AMPA receptorok internalizációját serkenti, mely LTD-t (long-

38

term depression) indukál (117), vagyis az inzulin a szinaptikus plaszticitás

szabályozásában is szerepet játszhat. Az inzulinnak a kognitív funkciókban betöltött

szerepét valószínűsíti az a vizsgálat, melyben 718 nem diabéteszes, 60-as évei elején

járó nőnél mértek C-peptid szintet, majd 10 év múlva telefoninterjú során értékelték

különböző kognitív funkcióikat. A C-peptid a proinzulin-inzulin átalakuláskor 1:1

arányban hasad le az inzulin α- és β-láncával együtt. Felezési ideje 2-5-ször hosszabb a

keringésben, mint az inzuliné, így az inzulinképződés stabil indikátora. A kognitív

funkciók szignifikánsan a legrosszabbak azoknál a nőknél voltak, akiknek a C-peptid

szintje a legmagasabb volt (118).

2.4.2 A demencia és a diabétesz mellitusz kapcsolata

A demencia az agy patológiás öregedésének egyik legjellemzőbb és legfeltűnőbb

lehetséges következménye, melyre jellemző a szociális és kognitív képességek

progresszív leépülése. Néhány kivételtől eltekintve a folyamat visszafordíthatatlan és a

betegek gyors leépülést követően az egyszerű napi tevékenységek elvégzésében is

mások segítségére szorulnak. A demencia egyik leggyakoribb okozója az Alzheimer-kór

(időskori demencia), ahol az életkor a legnagyobb rizikófaktor (119). A patológiás agyi

öregedés számos más neurodegeneratív betegség, mint például a cerebrovaszkuláris

kórképek, a Parkinson-kór és az amiotrófiás laterálszklerózis hátterében is állhat.

A kognitív funkciók romlását és a fennálló diabétesz kapcsolatát már huzamosabb ideje

vizsgálják. Asszociáció vizsgálatok sora írt le kognitív hanyatlást és demenciára való

rizikót diabéteszes populációban (120). Retrospektív analízisek azt mutatják, hogy a

DM legalább kétszeresére növeli a demencia kockázatát, akárcsak a hiperinzulinémia

(121). Egy longitudinális vizsgálat szerint, mely több mint 1200 beteg követésén

alapszik, kapcsolat mutatható ki DM és stroke okozta demencia (vaszkuláris demencia)

valamint kognitív deficienciák közt, melyek súlyosbodva Alzheimer-kórhoz

vezethetnek (122). Egyes vizsgálatok azt valószínűsítik, hogy csak a memóriát

befolyásolják a cukorbetegséghez köthető faktorok, ugyanis csak a verbális

memóriatesztekben figyeltek meg rosszabb teljesítményt, míg más kognitív

képességben és az információ feldolgozásában nem (123). A DM2 bizonyítottan

rizikófaktora az Alzheimer-kórnak, ez a rizikó sokkal erőteljesebb, ha az adott egyén

39

hordozza az APOE-ε4 allélt, mely az időskori demencia egyik genetikai rizikófaktora

(124).

Nem sok irodalmi adatot találni arra vonatkozóan, hogy a centrális inzulinrezisztencia

vagy a hiperinzulinémia okozta neurotoxicitás felelős-e a megnövekedett kockázatért a

demencia kialakulásában. A krónikus hiperglikémiára adott válasz neurológiai

szempontból aktív és passzív lehet. Akut hiperglikémiában mindkét válasz a

homeosztázis fenntartását szolgája és átmenetileg előnyös, azonban hosszú távon

komplikációk kialakulásához vezethet. Az aktív válasz a génexpresszió és génműködés

megváltozásában jelentkezik. A kognitív és viselkedési deficithez vezető állapotok

hátterében a kálcium-homeosztázis megváltozását sejtik. Mind kísérletes, mind humán

krónikus diabéteszben megfigyelték, hogy a hippocampális neuronokban megnövekszik

a citoplazmatikus Ca2+ koncentrációja, melynek hátterében a regulációs mechanizmusok

megbomlása állhat, ami neurondegenerációhoz vezet (125) (4. ábra). Emellett csökken

az antiapoptótikus hatású inzulinszerű növekedési faktor (IGF) expressziója, valamint

lecsökken az inzulinreceptorok és az inzulinszerű növekedési faktor receptorok száma,

ezért fokozódik a hippocampus neuronjainak apoptózisa (126). A cukorbetegek

memóriadeficitjét specifikus, hippocampus-függő tesztek bizonyítják (127). A

deklaratív memória (adatok, tények ismerete) a hosszan fennálló hiperglikémiára

szenzitív és romlása a hippocampus szinaptikus plaszticitásában bekövetkező

változásokkal magyarázható (128).

Az agyban a cukorfölösleget számos metabolikus út vezeti el, melyek függetlenek a

neuron aktivitásától, tehát neurológiai szempontból passzív választ jelentenek. Ilyen út

például a polyol-útvonal, mely NADPH-felhasználáshoz és glutation-deplécióhoz vezet,

ezáltal csökkenti az intracelluláris oxidatív károsodás elleni védelmet. Előtérbe kerül a

diacilglicerol – protein-kináz C reakcióút, fokozódik a vaszkuláris mediátorok

képződése és csökken a nitrogén-monoxid termelődése. Ezen kerülőutak aktiválódása a

véráramlásra és a vaszkuláris permeabilitásra kedvezőtlen hatást gyakorol (128). A

szénhidrát-anyagcsere mellett a lipid- és fehérje-anyagcsere is megváltozik, ugyanis az

alternatív anyagcsereutak ezeket is érintik. A hiperglikémia egyrészt celluláris stresszt

indukál, az oxidatív stressz pedig szabadgyökös folyamatokat indít el, melyek károsítják

a fehérje, az aminosav és a lipid struktúrákat, másrészt nem enzimatikus glikáció is

elkezdődik, melynek során a glükóz molekula aminosavakhoz, fehérjékhez, lipidekhez

40

és a nukleinsavak szabad amino csoportjaihoz kötődik. A további kémiai átalakulások

során (oxidáció, dehidráció, kondenzáció) végglikációs termékek (advanced glycation

endproduct, AGE) képződnek, melyek hosszú élettartamú fehérjékhez, így például

mielinhez kapcsolódva okoznak irreverzibilis károsodást (129). Az AGE-ek instabilak,

reaktívak és toxikusak, károsítják az extracelluláris mátrixot, és tovább fokozzák az

oxidatív stresszt (4. ábra). Az AGE-ek nemcsak az érintett fehérjéket károsítják, hanem

a receptoraikkal (RAGE) való kapcsolódást követően proinflammatórikus anyagok

(interleukinok, növekedési faktorok) felszabadulását is aktiválják (130).

4. ábra: Diabétesszel összefüggésbe hozható patológiás mechanizmusok feltételezett hatása az Alzheimer-kór kialakulásában. Mitokondriális diszfunkció, oxidatív stressz, kálcium homeosztázis szabályozásának megbomlása; mind összefüggésbe hozható diabétesszel és mind hozzájárulhat Alzheimer-kór kifejlődéséhez. A glükóz autooxidációja végglikációs termékek (AGE) létrejöttéhez vezethet, melyek receptoraikon keresztül diverz szignáltranszdukciós kaszkádokat és számos biokémiai útvonalat aktiválhatnak, köztük reaktív oxigén gyökök képződését (ROS) is, mely oxidatív stresszhez és ezen keresztül mitokondriális diszfunkcióhoz vezet. Az oxidatív stressz és a megnövekedett intracelluláris Ca2+ szint együttesen pedig egy öngerjesztő folyamaton keresztül folyamatos mitokondrium-károsodást okoz, mely neuron elhalást és végül Alzheimer-kórt okoz (131).

2.4.3 Alzheimer-kórra jellemző génexpressziós változások

Az Alzheimer-kór egy olyan komplex neurodegeneratív betegség, mely számos

agyterületet érint. A vizsgált agyterülettől és a betegséglefolyás állapotától függően az

hiperglikémia diabétesz mellitusz

↑ intracelluláris Ca2+ szint

neuron diszfunkció

Alzheimer-kóroxidatív stressz

gyulladás

↑ glükóz

AGE

ROS

neurontoxicitás

mitokondriális

diszfunkció

41

érintett neuronokban számos megváltozott, rosszul funkcionáló folyamat van egyszerre

jelen, melyek a sejtek halálához vezetnek. A fokozott ütemű sejthalál pedig végül egyes

agyterületek zsugorodásához vezet, mely a kór legjellemzőbb hisztopatológiai tünete.

Molekuláris szinten jellemző az amiloid prekurzor fehérje enzimatikus bomlási

folyamatának hibája, mely β-amiloid felhalmozódáshoz és plakk képződéshez vezet a

sejt közötti térben. Jellemző még a tubulin-asszociált tau fehérje hiperfoszforilációja,

mely a mikrotubuláris rendszer összeomlásához vezet (132).

A normális öregedés során bekövetkező folyamatok közül számos jellemzi az

Alzheimer-kórt is, ezért sokan tartják e kórképet az agy normál öregedésének egy

extrém formájaként. Komputertomográfiás és MRI-vizsgálatok alapján megfigyelhető

az agykamrák térfogatának növekedése és az agytérfogat csökkenése a kor

előrehaladtával (133). Az öregedési folyamatra jellemző jelenségek még a szinaptikus

plaszticitás csökkenése (134), neurotranszmitterek és neurotranszmitter receptorok

szintjének megváltozása (135), oxidatív stressz elleni védelem csökkenése, gyulladásos

folyamatok aktiválódása (136), melyek egyelőre nem teljesen tisztázott módon additíve

memóriavesztéshez és más kognitív funkciók csökkenéséhez vezetnek. Egy

nagyszabású meta-analízis microarray alapú génexpressziós vizsgálatok adatait

összesítve igazolta is az átfedést az Alzheimer-kór és a normál öregedés közt (137). A

két különböző vizsgálatból származó adatokat összehasonlítva nagyfokú, nem várt

egyezést tapasztaltak a vizsgált minták transzkripciós aktivitásában. Különösen az ún.

csomóponti gének szerepének megértése lehet kulcsfontosságú. A CDK5 (ciklin-

dependens kináz 5) például az egyik legfontosabb tau-kináz fehérjét kódolja. Egy másik

ilyen potenciális közös gén, az YWHAZ (tirozin-3-monooxigenáz/triptofán-5-

monooxigenáz aktivációs fehérjéje, zéta-polipeptid) a sejt jelátvitelében, a sejtciklus

szabályozásában és a citoszkeletális struktúra kialakításában fontos fehérjét kódol.

Egy másik vizsgálat a kezdeti Alzheimer-kór hátterében lévő megváltozott expressziós

mintázat feltérképezésére tett kísérletet (138). Blalock és munkatársai a hippokampális

génexpresszióban bekövetkező változásokat követték nyomon 31 postmortem

agymintán, amely vegyesen származott különböző súlyosságú demenciával

diagnosztizált betegekből. A diagnózistól függetlenül korrelációt kerestek az egyes

agyminták génexpressziós mintázata és a betegség súlyosságát jelző neuropatológiai és

42

kognitív státusz mérőszámai között. Az Alzheimer-kór előrehaladottságát az NFT

(neurofibrillary tangle) érték alapján mérték, melynek nagysága a neurofibrilláris

kötegek sűrűségével áll összefüggésben. A betegek kognitív státuszát pedig az MMSE

(Mini Mental State Examination) számmal jellemezték, melynek értéke fordítottan

korrelál a betegség előrehaladottságával. A kutatócsoportnak e módszerrel sikerült

olyan géneket azonosítania, melyek a korai Alzheimer-kórra tűnnek specifikusnak. A

legnagyobb géncsoport, ahol megemelkedett génexpressziót sikerült kimutatni, a

transzkripciós faktorok voltak, mint például néhány tumorszupresszor gén és kofaktora

(RBBP1, RBAK, PML, PRKR), valamint a lipid- és koleszterinszintézisben és

zsírsejtdifferenciációban résztvevő transzkripciós faktorok (PPARBP, NCOA3, RXRB).

Emellett emelkedett génexpressziós aktivitást mutattak az adhézió, az apoptózis és a

kezdeti gyulladásos folyamatok csoportjába tartozó gének. Csökkent az expressziója

viszont néhány, a fehérjék helyes tekeredéséért és transzportjáért felelős génnek, mint

például az immunofilineket, chaperonokak, hősokk fehérjéket kódoló géneknek. Voltak

olyan eredmények is, ahol az adott géncsoport alulműködést, viszont egyes elemei

felülműködést mutattak, mint például a Ca2+-függő jelátviteli útvonalak és

transzportrendszerek, illetve az ide tartozó EP300, a CREB (cAMP response element-

binding protein) koaktivátora, valamint a calpain inhibitor CAST (calpastatin) és a

DAPK2 (death-associated protein kinase 2), mely egy Ca2+-függő apoptótikus jelpálya

tagja. A megváltozott Ca2+-jelátvitel egyébként mind Alzheimer-kórban, mind a normál

öregedés folyamán fellépő jelenség (139).

Egy harmadik tanulmány a neocortexet érintő génexpressziós változást tárgyalja (140).

Tan és munkatársai 5485 gén szignifikáns változását mutatta ki Alzheimer-kórban,

melyek szinaptikus diszfunkcióhoz, megváltozott neurotranszmisszióhoz és neurális

gyulladási folyamatok aktiválódásához vezetnek. A leginkább túlműködő gén az AQP1

(aquaporin 1) volt. Ez azért érdekes, mert korábban kimutatták, hogy a β-amiloid

lerakódások közvetlen környezetében az AQP1 fehérjét expresszáló asztrociták vannak

(141), emellett az Alzheimer-kór kezdeti szakaszára is jellemző az AQP1 emelkedett

expressziója (142). Ezen adatok alapján feltételezhető, hogy az aberráns AQP1

expresszió a víz- és ionfluxus normálistól eltérő regulációján keresztül szerepet játszhat

az APP (amiloid prekurzot protein) feldolgozásában. A megnövekedett expressziójú

43

gének közül érdemes még megemlíteni az MT2A-t (methallothionein 2A), melynek

expressziónövekedése a neurális gyulladási folyamatok beindulásának lehet a

kifejeződése (143), míg a Hsp27 (27 kDa hősokk fehérje) utalhat a celluláris

stresszválasz aktiválódására, de kimutatták szerepét a tau foszforiláció fokozásában is

(144). Az alulműködő gének közül érdemes megemlíteni az NPTX2-t (neuronális

pentraxin II), amelynek a hosszútávú szinaptikus plaszticitás kialakulásában van szerepe

(145). Ezért az NPTX2 alulműködése súlyosbíthatja a szinaptikus diszfunkciót

Alzheimer-kórban. Ezzel ellentétben, Parkinson-kórban erőteljesen felülműködik az

NPTX2 gén (146), mely példaként szolgál a neurodegeneráció hátterében álló

molekuláris mechanizmusok eltérésére a két betegségben. A bemutatott tanulmányokat

összegezve megállapítható, hogy a főbb érintett biokémiai útvonalak megegyeznek. Az

átfedés azonban nem tökéletes és az eltérések nem csak a vizsgált agyrégiók

különbözősége miatt lehetségesek, hanem származhatnak a betegek állapota és a

betegség előrehaladott volta közti eltérésekből, a különböző microarray platformokból

vagy akár populációs eltérésekből.

2.4.4 3-as típusú diabétesz

Az Alzheimer-kórt a DM egy lehetséges változataként először Suzanne de la Monte

csoportja definiálta a szakirodalomban. Postmortem vizsgálatukban Alzheimer-kórral

diagnosztizált és normál öregedésű agyszövetekben tettek kísérletet az inzulin, az

inzulinszerű növekedési faktor és receptoraik génexpressziójának mérésére.

Tanulmányukban kimutatták, hogy Alzheimer-kórban erőteljesen lecsökken az inzulin

és az IGF-1 mRNS expressziója, csakúgy mint receptoraik kifejeződése. Azok a

jelátviteli útvonalak, amelyek az inzulin és az IGF hatását közvetítik, szintén változást

szenvedtek (csökkent IRS-1 expresszió) (147). Ezt megelőzően is történtek kísérletek az

inzulinrezisztencia, a hiperinzulinémia és a DM2 lehetséges szerepének tisztázására az

Alzheimer-kór patogenezisében, valamint az asszociált neuronális citoszkeletális léziók

és β-amiloid felhalmozódások cukorbetegséggel kapcsolatba hozható értelmezésére

(148). A neuroendokrin rendszer szerepét Alzheimer-kórban már 20-25 évvel ezelőtt

feltételezték, mikor zavart észleltek a hipotalamusz-agyalapi mirigy tengely

működésében (149), azonban csak az említett vizsgálat vetette fel először a 3-as típusú

44

diabétesz kifejezést. Később, ugyancsak de la Monte és munkatársai intracerebrális

streptozotocin (STZ) alkalmazásával fiatal patkányokban a 3-as típusú diabétesz

kísérletes modelljét is megalkották. Makroszkópos szinten a legegyértelműbb változás

az agy és különösen a cerebellum méretének látványos csökkenése. A kezelés hatására

agyspecifikus inzulin- és IGF-depléció lép fel, továbbá lecsökken a megfelelő

receptorok ligandkötő képessége. Emellett súlyos neurodegeneráció figyelhető meg,

mely biokémiai és sejtszinten nagyban hasonlít az Alzheimer-kórban tapasztaltakra.

Eltérések jelentkeznek például az acetilkolin-homeosztázisban, az amiloid prekurzor

fehérje pedig felülszabályzódik, miközben a pankreász struktúrája és az inzulin

expressziója nem szenved zavart (150). Rendkívül érdekes módon a folyamat PPAR-

agonistákkal kivédhető. A legszembetűnőbb az agyi neurodegenerációra gyakorolt

protektív hatás volt; az inzulin és IGF-2 receptort kifejező neuronok is épek maradtak.

PPAR-δ agonista hatására jelentősen javult a tanulási- és memóriateljesítmény egészen

a kontrollokkal összemérhető szintig. Ezen kívül PPAR-α és PPAR-δ agonisták hatására

megemelkedett az oligodendrogliák száma (melyet a MAG marker növekedése jelzett),

így az Alzheimer-kór korai fázisára jellemző oligodendroglia-degeneráció és -pusztulás

is visszafordítható volt. Ez a megfigyelés egy újabb párhuzamot von a

cukorbetegséggel, hiszen a PPAR-agonisták alkalmazása a DM2 egyik lehetséges

gyógymódja (151). A 3-as típusú diabétesz, mint kifejezés tehát azon a felismerésen

alapul, hogy az Alzheimer-kór a diabétesznek egy olyan speciális formája lehet, mely

specifikusan csak a központi idegrendszert érinti, hiszen molekuláris és biokémiai

aspektusaiban is számos ponton átfed a cukorbetegség 1-es és 2-es típusával.

45

3 CÉLKIT ŰZÉSEK

A szakirodalmi adatok és laboratóriumunk előzetes vizsgálatai alapján feltételezhető

volt, hogy a P2RX7 gén polimorfizmusai a depresszió és a szorongás

kialakulásának rizikófaktorai lehetnek mind depressziós, mind cukorbetegek

körében.

A jelen dolgozatban bemutatott munka egyik fő célkitűzése a P2RX7 gén új típusú

funkcionális polimorfizmusainak vizsgálata volt. E cél megvalósítása érdekében a

következő feladatokat tűztük ki:

1. In silico vizsgálatok annak eldöntésére, hogy kimutathatók-e putatív miRNS

kötőhelyeket megváltoztató polimorfizmusok a P2RX7 gén 3’ nem kódoló régiójában

2. Genotipizáló módszerek kidolgozása a putatív miRNS kötőhely polimorfizmusok

populációs felmérésére

3. Genetikai asszociáció vizsgálat elvégzése a két betegcsoporton annak eldöntésére,

hogy a putatív miRNS kötőhely polimorfizmus(ok)nak van-e kimutatható fenotípusos

hatása.

A dolgozat másik fő célkitűzése az volt, hogy molekuláris szinten megvizsgáljuk a

cukorbetegség lehetséges hatásait az agy működésére. E cél megvalósítását

állatmodellekben, patkányok agyterületeinek teljes genomi expressziós analízisével

kívántuk megvalósítani. Fő kérdéseink a következők voltak:

1. Kimutatható-e szignifikáns génexpresszió-változás az agyban 1-es és 2-es típusú

diabétesz mellitusz patkánymodellben a kontrollhoz képest?

2. Mely agyterületeket érintik elsősorban ezek a változások?

3. Milyen fő útvonalakba tömörülnek az expresszió változást mutató gének?

46

4 MÓDSZEREK

4.1 A P2RX7 gén polimorfizmusának vizsgálata

4.1.1 A genetikai asszociáció analízisben résztvevő személyek

A vizsgált pszichiátriai betegpopulációt (N=152) a Kútvölgyi Klinikai Tömb

Pszichiátriai Osztályán major depresszióval (N=95) vagy bipoláris zavarral (N=57)

diagnosztizált betegek alkották. A diagnózis felállítása a DSM-IV (5) alapján történt. A

betegek átlagéletkora 47,9 ± 10,8 év, nemek aránya pedig 25,3% férfi és 74,7% nő volt.

A cukorbeteg populációt (N=218) a II. számú Belgyógyászati Klinikán gondozott

betegek alkották. A betegek átlagéletkora 58, 0 ± 13,6 év, a nemek eloszlása 48,2% férfi

és 51,8% nő volt. A kontrollcsoportot pszichiátriai zavartól és cukorbetegségtől mentes

önkéntesek alkották, akik az Eötvös Loránd Tudományegyetem Pszichológia

Intézetének hallgatói voltak. A vizsgálatokhoz az ETT-TUKEB adott etikai engedélyt,

és minden résztvevő részletes tájékoztatást követően írásos beleegyezését adta a

vizsgálathoz.

4.1.2 A depresszió súlyosságának mérése

A depresszív és szorongásos tüneteket a HADS kérdőív (152) segítségével jellemeztük.

A HADS (Hospital Anxiety and Depression Scale) egy 14-tételes önbeszámolón alapuló

kérdőív a szorongás és depresszió mérésére, mely 7 kérdésben a szorongást, és 7

kérdésben a depresszió tüneteit méri (Lásd függelék 12. táblázat ). A kérdőívet 1983-

ban fejlesztették ki nem pszichiátriai beteg-populáció hangulatának felmérésére, melyet

azóta több nyelvre (köztük magyarra) is lefordítottak (153). A HADS kérdőívet

alkalmazó több mint 700 publikáció adatai alapján a skála jól használható beteg és

egészséges populációk jellemzésére. A kérdőív tételeire adott válaszok pontértéke 0-3-

ig változhat, így maximum 21 pont lehet egy-egy skála össz-pontszáma, mely 0-7-ig

normális, 8-10-ig közepesen súlyos, 11 fölött pedig súlyos pszichés állapotra utal.

4.1.3 Mintavétel és DNS-izolálás

A DNS-mintavétel a laboratóriumunkban kidolgozott nem-invazív módon történt.

Vattapálcával 15–20 másodperces dörzsöléssel az íny és a bucca területéről

szájnyálkahártya-sejteket gyűjtöttünk. Ez elegendő mennyiségű DNS-t biztosított a

genotipizáláshoz. Egy személytől egyidejűleg két mintát (A és B) vettünk. A mintákat

47

izolálásig –20 °C-on tároltuk, majd a mintát 400 µl össztérfogatú mintavevő pufferbe

helyeztük, amelynek összetétele: 0,1 M NaCl, 0,01 M Tris-HCI (pH = 8), 0,5% SDS,

0,2 mg/ml proteináz K. A DNS-izolálást egy éjszakán át tartó 56 °C-os inkubálás előzte

meg, ezalatt a sejtek lizáltak, az SDS denaturálta, a proteináz K pedig megemésztette a

fehérjéket. A lizátum centrifugálással eltávolítható a vattapálcáról (2000 g, 10 perc). A

DNS-izolálás az így kapott oldat 400 µl-éből a Puregene DNS izoláló kit (Gentra)

segítségével, a gyártó útmutatásait követve történt.

4.1.4 Genotipizálás RFLP-vel

4.1.4.1 Restrikciós fragmentum hosszúság-polimorfizmus (RFLP)

Ez a módszer akkor alkalmazható, ha a vizsgált SNP egy restrikciós endonukleáz

hasítási helyére esik. A vizsgálni kívánt szakaszt PCR-rel felsokszoroztuk, ezt egy

restrikciós emésztési lépés követte. A módszer lényege, hogy hasítás akkor és csak

akkor történt, ha a polimorf gén egyik meghatározott allélváltozata volt jelen, a másik

allél esetén a hasítási hely szekvenciájának megváltozása a hasítást meghiúsította. Így

az adott allélra jellemző hosszúságú terméket kaptunk. Általában követelmény, hogy az

amplifikált DNS-szakasz egy kontroll hasítási helyet is tartalmazzon, mert ennek

segítségével ellenőrizhető a restrikciós endonukleáz megfelelő működése. Az emésztés

során az Eco24I restrikciós enzimet használtuk, az emésztés a 4.1.4.3 fejezetben leírtak

szerint zajlott.

4.1.4.2 A PCR-elegy összetétele

A polimeráz láncreakció 10 µl-es térfogatban zajlott, a reakcióelegy a következő

végkoncentrációjú összetevőket tartalmazta: 200-200 µM dNTP (dATP, dTTP, dCTP és

dGTP), mindkét primerből 1–1 µM, 0,025 U HotStarTaq DNS polimeráz (Qiagen), a

gyártó által forgalmazott 1× végkoncentrációjú puffer (1,5 mM MgCl2) és 1× Q-oldat

(Qiagen), valamint 10-20 ng DNS-templát. A primereket az NC_000012.10 számú

contig szekvenciája alapján terveztük, melyek a következők voltak: szenz 5’-AGG CAC

AGC AAA CTG AGC C-3’, antiszenz 5’-TCA GAC ACA GAG AGC AAC AGA AG-

3’. A PCR-termociklus első lépése a 95 °C-on 15 percig tartó kezdeti denaturáció volt,

melynek során szétváltak a DNS szálai és aktiválódott a HotStarTaq polimeráz enzim.

Ezt 40 termociklus követte, ciklusonként három lépéssel: 1 perc denaturálás 94 °C-on,

48

30 sec annelálás 54 °C-on és végül 1 perc extenzió 72 °C-on. A PCR lezárásaként a 72

°C-on történő 10 perces végső extenzió után a mintákat 8 °C-ra hűtöttük le, majd a

további vizsgálatokig –20 °C-on tároltuk.

4.1.4.3 Restrikciós emésztés

Az amplifikációt követő restrikciós emésztés során a restrikciós enzimelegyet 1:4

arányban adtunk a PCR termékekhez (4 µl PCR termék és 16 µl enzimkeverék). Az

enzimkeverék 1 U Eco24I–t és 1× Tango puffert (Fermentas) tartalmazott. Az emésztés

37°C-on zajlott 4 órán keresztül. Mivel nem állt módunkban kontroll hasítási helyet

alkalmazni a PCR terméken belül, ezért pozitív kontrollként külön csőben zajló reakciót

végeztünk, ahol nem polimorf enzim hasítási helyet alkalmaztunk templátként. Minden

esetben betegenként két független DNS-mintából párhuzamosan történt az amplifikáció

majd a restrikciós hasítás.

4.1.4.4 Fragmentanalízis

A restrikciós PCR-fragmentumok elválasztása két különböző módszerrel történt. A

hagyományos, alámerülő agaróz-gélelektroforézishez kevert gélt használtunk, mely

1,5% agarózt és 2% metaphor agarózt tartalmazott. Futtató pufferként 1× TAE puffert

alkalmaztunk (40 mM Tris-bázis, 10 mM Na2EDTA, 1% ecetsav, pH = 8,5). Az

elektroforézis 6,6 V/cm térerő alkalmazásával történt, szobahőmérsékleten, egy órán át.

Az elektroforézis befejezése után a gélt 5 percig 1 mg/ml etídium-bromidot tartalmazó,

4 °C-ra hűtött TAE-pufferoldatban festettük. Az értékelés BioRad GelDoc 1000

(BioRad) géldokumentációs rendszerrel történt. Egy automatizált módszer beállítása

végett a fragmentumok elválasztását a QIAxcell multikapilláris gélelektroforetikus

rendszer (korábban, mint eGene HDA-GT12 volt ismert) segítségével is elvégeztük,

melyhez egy 12 kapillárist tartalmazó gélkazettát használtunk. Az elektroforézis 6000 V

szeparációs feszültség és 40 másodperces injektálási idő alkalmazásával

szobahőmérsékleten történt.

A genotipizálási módszer pontosságának ellenőrzésére 9 minta (3-3 minta mindegyik

genotípusból) direkt szekvenálását is elvégeztük. A PCR-reakcióhoz a következő

primert használtuk: 5’-TGA GGT CGG GAG TTG GAG-3’, az antiszenz primer és a

PCR termociklus körülményei megegyeztek a fent leírtakkal. A szekvenálást a gödöllői

Biomi Kft. végezte.

49

4.1.4.5 Statisztikai analízis

A genotipizálási módszer pontosságának ellenőrzésére Hardy-Weinberg tesztet

végeztünk. Az emésztés után keletkező különböző méretű fragmentumokhoz tartozó

relatív migrációs idők statisztikai analízisét kétmintás t-próbával végeztük. Az

rs1653625 és rs2230912 SNP-k közt fennálló kapcsoltság mérésére a Haploview

programot (154) használtuk. A dimenzionális asszociáció-elemzéshez a HADS kérdőív

depresszív és szorongásos tünetskáláját használtuk fel. A statisztikai analízishez az

SPSS program 17.0 (IBM) verzióját; a MANCOVA (multivariate analysis of

covariance) elemzésben az életkor és a nem szerepelt kovariánsként. A haplotípusok

hatását a HADS skálákra a THESIAS programmal mértük fel (155).

4.2 Patkány diabétesz mellitusz modellek agyi expresszióváltozásának vizsgálata

4.2.1 Kísérleti állatok

Vizsgálatainkat 10 hetes hím patkányokon végeztük. Kontrollként Wistar patkányokat

(N=9), STZ-indukálta diabétesz modellként 6 hetes korukban farokvénába adott STZ

injekcióval (65 mg/ttkg) kezelt hím Wistar patkányokat (N=9), melyeket további 4 hétig

tartottunk, illetve 10 hetes Goto-Kakizaki (GK) patkányokat (N=9) hasonlítottunk össze

a kísérletek során. Az állatokat állandó hőmérsékleten (20°C) tartottuk, szabad víz- és

táplálék hozzáféréssel. Az állatokat általános anesztézia után (50 mg/ttkg nátrium-

pentobarbitál) dekapitáltuk, testtömegük és vércukorszintjük regisztrálásra került (1.

táblázat). A kísérletek során betartottuk az állatkísérletek végzéséről szóló 243/1998.

XII.31. Kormányrendelet hatályos rendelkezéseit.

1. táblázat: A kísérleti állatok testsúly, kor és vércukorszint értékei a feldolgozás időpontjában. Kísérleti állatok Testsúly (g) Kor (hét) Vércukorszint (mM)

K patkányok 289,53±9,47 10 7,64±0,48

STZ patkányok 252,16±16,87 10 26,34±2,9

GK patkányok 276,67±46,1 10 13,9±2,4

50

4.2.2 Az 1-es típusú diabétesz mellitusz kísérletes modellje

Streptozotocin injekció patkányba oltva az inzulintermelő és -szekretáló béta-sejtekre

szelektíven toxikus, azokat elpusztítja, így DM1-t és hiperglikémiát modellez. A STZ

egy nitrózurea származék, amelyet Streptomyces achromogenesből izolálnak.

Transzportere a GLUT2. Erős alkilálószer, hatással van a glükóz transzportra, a

glükokináz funkciójára, valamint többszörös DNS-száltörést indukál. Az egyszeri nagy

dózisú STZ feltehetőleg a direkt toxikus hatásai miatt okoz DM-t a patkányokban. Az

STZ-re fogékony rágcsálókban az inzulinhiányos DM kialakulásában - csakúgy, mint a

humán DM1-ban - szerepet játszik az immunrendszer kóros aktivációja is (156).

4.2.3 A 2-es típusú diabétesz mellitusz kísérletes modellje

A Goto-Kakizaki patkány a humán DM2 modellállata. A tenyésztés során beltenyésztett

Wistar patkányok közül szelektálják ki az alkalmas állatokat a glükóz-tolerancia értékük

alapján. Így biztosítják, hogy az emberben poligénes öröklésmenetet mutató DM2

öröklődését modellezze. Ezekre a patkányokra ivarérett korukra jellemzőek lesznek a

humán DM2-ban leírt metabolikus, hormonális, mikro- és makrovaszkuláris eltérések,

leszámítva azt, hogy a GK-patkányok nem elhízottak. Enyhe éhomi hiperglikémia és

hiperinzulinémia áll fenn náluk, kisebb a pankreász β-sejttömege, csökkennek a

hasnyálmirigy inzulinraktárai és csökkent inzulinszekréció kíséri a vércukorszint

változásokat. A csökkent glükóztolerancia mérsékelt perifériás inzulinrezisztenciával jár

együtt. Ugyan a humán DM2 genetikai háttere máig nem tisztázott, azt azonban tudjuk,

hogy a GK-patkányok eddig a legmegfelelőbb genetikai modellnek bizonyultak a DM2

molekuláris biológiai megközelítése szempontjából (157).

4.2.4 Agyi disszekció és RNS-izolálás

A patkányok megfelelő agyterületeit, a hippocampust, a prefrontális kérget és a

striatumot dekapitálás után azonnal eltávolítottuk és 3 állatonként összecsoportosítva

(összesen 150 mg-os mintát) Qiagen RNáz-gátolt oldatba helyeztük, folyékony

nitrogénnel lefagyasztottuk és a feldolgozásig -80°C-on tároltuk. Az egyes agyterületek

disszekcióját Dr. Szász Bernadett (Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti

Orvostudományi Kutatóintézete) végezte. Az össz-RNS izolálása az RNeasy Mini Kittel

(Qiagen) történt a gyártó protokollja alapján. Az esetleges DNS-szennyezést DNázos

emésztéssel elimináltuk (RNase-Free DNase Set, Qiagen).

51

4.2.5 Génexpressziós microarray mérés

A génexpresszió globális, microarray alapú vizsgálatához Agilent Whole Rat Genome

Oligo Microarray 4x44K lemezeket (Agilent Technologies) használtunk. A minták

előkészítését és a microarray-el történő hibridizációt és leolvasást a Semmelweis

Egyetem, Genetikai-, Sejt- és Immunbiológiai Intézetének „Microarray Core Facility”

csoportja végezte szolgáltatás keretében.

A kinyert RNS mennyiségét NanoDrop ND-1000 spektrofotométerrel (NanoDrop

Technologies) mérték, minőségét Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)

készülék segítségével határozták meg. Csak azok a minták kerültek felhasználásra,

melyek RNS-integritás száma meghaladta a 7,0-as értéket, valamint a NanoDrop

készüléken, a megfelelő hullámhosszakon mért optikai denzitásuk aránya (260/280 és

260/230) nagyobb volt, mint 1,8. A nem használható minták helyett az adott biológiai

csoport másik két párhuzamosának 1:1 arányú keverékéből készült minta. Az ezt követő

lépések (reverz transzkripció, Cy3 jelölés, hibridizáció) mindegyikénél a One-Color

Microarray-Based Gene Expression Analysis Protocol, Version 5.5 (Agilent

Technologies) szerint jártak el. A reverz transzkripció 1 µg RNS felhasználásával

történt, a Cy3 festék beépülésének hatékonysága 8,0 pmol festék/µg cRNS érték felett

került elfogadásra. A hibridizáció 65 °C-on 17 órán keresztül történt. A hibridizáció

során a mintákból származó fluoreszcens jelöléssel rendelkező cRNS-molekulák

versengenek a microarray felületén lévő, velük komplementer 60 nukleotid hosszúságú

próbákhoz való kötődésért. A hibridizáció után a Cy3 jelintenzitás mértéke megmutatja,

hogy egy adott transzkriptum az egyes mintákban milyen mértékben fejeződött ki. A

lemezek ezek után Agilent Microarray Scanner segítségével lettek leolvasva. A kapott

képek tömörítése és az adatok normalizálása Feature Extraction Software 9.1 (Agilent

Technologies) segítségével default egyszínű high density protokollal történt.

4.2.6 A microarray adatok bioinformatikai értékelése

A microarray adatok további bioinformatikai és statisztikai értékelését a GeneSpring

GX 7.3 program (Agilent Technologies) segítségével végeztük. A kiértékelés részletes

leírását az eredmények fejezetben tárgyaljuk. Az analízist megelőzően a kiértékelési

protokollnak megfelelően néhány minőségellenőrzési lépést is elvégeztünk. Először a

nyers adatokon főkomponens elemzést végeztünk, amely egy olyan matematikai eljárás,

52

mely kovariáns mátrix segítségével több összetartozó, egymással lineárisan korreláló

mért tételt (item-et) egyetlen mutatóval próbál meg helyettesíteni. Az eljárás tehát

szempontokat – jelen esetben expressziós profilokat – keres, amely alá a legtöbb gént be

tudja sorolni. Ha a mintákat az egyes főkomponensek tengelyén próbáljuk meg

ábrázolni, olyan képet kaphatunk, hogy az egyes párhuzamosok mennyire alkotnak

valóban egy csoportot. Hasonló célból alkalmaztunk a nyers adatokon hierarchikus

klaszterezést, mely a különböző mintákhoz tartozó próbák közt páronkénti

összehasonlítást végez és ez alapján rendezi őket csoportba. Ennek eredménye egy

olyan dendrogram (fastruktúra), ahol az egymásra leginkább hasonlító minták egymás

melletti ágakra kerülnek. Mindkét eljárás eredményeként azt kaptunk, hogy az egyes

párhuzamosok jól korrelálnak egymáshoz.

A microarray adatértékelés során kapott eredmények alapján a különbözőképpen

expresszálódó géneket funkcionális génontológiai analízisnek vetettük alá. A Gene

Ontology (GO) konzorcium adatbázisa a géntermékek jellemzésének (úgynevezett GO

terminusok, osztályok) ellenőrzött rendszere, melyben tájékoztatást kaphatunk a

génekről kifejeződő fehérjék molekuláris funkciójáról, valamint a különböző biológiai

folyamatokban való részvételéről. Ezen kívül megtudhatjuk azt is, hogy az adott protein

(ha szerkezeti elemről van szó például) milyen sejtalkotórész kialakításában vesz részt.

A GeneSpring program GO elemzés modulja azt vizsgálja, hogy egyes GO-terminusok

a microarray adatfeldolgozás során kapott génlistán belül milyen gyakorisággal

fordulnak elő ahhoz a gyakorisághoz képes, amivel a teljes adathalmazon belül

előfordulnak. Szemléletesen: vegyünk egy bizonyos GO-osztályt, és nevezzük el „G”-

nek. Tegyük fel, hogy van egy olyan microarray adatsorunk, amely „n” gént tartalmaz,

ebből „m” gén a „G” GO terminusba sorolható. Ezután az adatfeldolgozás során az „n”

génből valamilyen statisztikai próba felhasználásával „x” gént szignifikánsan

megváltozott expressziójúnak találtunk. Tegyük fel, hogy ebből az „x” génből „y” a „G”

GO terminusba tartozik. A kérdés az, hogy vajon van-e valamilyen feldúsulása „G”-nek,

vagyis y/x szignifikánsan nagyobb-e, mint m/n. A GeneSpring program a

hipergeometrikus eloszlás alapján p-értéket számol az említett szignifikancia

kifejezésére. A p-érték az adott GO terminus relatív fontosságát (az úgynevezett

„enrichment score” értékét) jelzi a kiválasztott génlistán belül az összes gént tartalmazó

53

adatsorhoz képes. Az elemzéseink során csak azokkal a GO-terminusokkal

foglalkoztunk, amelyeknek p-értéke kisebb 0,05-nél.

4.2.7 Validálás valós idejű PCR-módszerrel

Azokat a géneket, amelyek teljesítették a bioinformatikai elemzés kritériumait,

kvantitatív valós idejű PCR (quantitative real time PCR) módszerrel, TaqMan Low

Density Array (TLDA, Applied Biosystems) segítségével validáltuk a gyártó protokollja

alapján. A TLDA-kártyák a felhasználó által kiválasztott, a gyártó által előre definiált

gének primer és próba keverékét tartalmazzák liofilizálva 96-os plate formátumban. A

reakcióelegy összemérését, a PCR-reakciót és a kiértékelést az UD-Genomed Kft.

végezte laborunk megbízásából ABI Prism 7900 (Applied Biosystems) készüléken.

A TaqMan-technikán alapuló PCR módszer elve, hogy a DNS szenz és antiszenz

szálához kötődő oligókon (ún. forward és reverse primer) kívül egy próbának nevezett

oligonukleotid is kötődik az egyszálú célszekvenciához a két primer tapadási helye

közötti területen. A próba mindkét végén egy-egy fluoreszcens festékkel jelölt. Az

oligonukleotid 5’ végén lévő festéket „reporter” festéknek (esetünkben VIC vagy

FAM), a 3’ végen lévőt „quencher” festéknek (általában MGB, minor groove binding)

nevezzük. Amíg a próba intakt, a quencher festék közelségéből adódóan jelentősen

lecsökken a reporter fluoreszcenciáját adott hullámhosszon. A jelenség neve FRET

(fluorescence resonance energy transfer). A célszekvenciához való kötődést követően, a

PCR reakció extenziós fázisában a reakcióelegyben lévő Taq-polimeráz 5’ exonukleáz

aktivitásának köszönhetően a próba molekula nukleotidjaira hidrolizál. A hasadás

következményeként a reporter festék felszabadul, lehetővé téve a kémiailag rá jellemző

fluoreszcencia mérését adott hullámhosszon történő gerjesztés mellett. A PCR során

keletkező amplikon mennyiségével párhuzamosan, azzal összevethető mértékben nő a

detektált fluoreszcencia intenzitása. A ciklusonként mért intenzitás-adatokra

támaszkodva és a PCR-módszer exponenciális jellegéből fakadóan matematikai

módszerrel kvantifikálhatjuk a célszekvencia relativ mennyiségét adott mintában egy

kontroll mintához képest. A vizsgálathoz cDNS-t szintetizáltunk reverz transzkripció

(High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit, Applied Bioszstems) segítségével,

ugyanazokból az RNS mintákból, mint amelyeket a microarray kísérlethez is

felhasználtunk. Mintánként 1 µg RNS került átírásra. A relatív génexpressziós adatokat

54

a 2-∆∆CT matematikai metódus segítségével számoltuk, ennek részletes leírását lásd

Livak és Schmittgen cikkében (158). Összesen 6 ún. háztartási gén került kiválasztásra,

mint belső kontroll. Ezek relatív expressziójának egymáshoz viszonyított és a minták

közti variabilitásának megállapítása után a következő 3 gén került kiválasztásra,

melyeket a legstabilabbnak ítéltünk (értsd: expressziójuk nem vagy minimális változást

mutatott a különböző minták összevetésében): Hdac3 (hiszton-dezacetiláz 3), Tbp

(TATA-box kötő fehérje), Rn18S (18S riboszómális RNS). A target gének expressziója

ennek a 3 kontroll génnek az expressziós átlagára lett később normalizálva. A

küszöbciklus értékek (CT, cycle treshold) a PCR logaritmizált amplifikációs görbéjének

exponenciális fázisában kerültek megállapításra. A ∆∆CT-értékek az adott gén adott

mintában mért CT-értékének és a kontrollgének átlagos CT-értékének különbsége adta,

melyet ezután a kontroll patkány agymintában mért értékhez viszonyítottunk. Ennek a

2-re emelt negatív hatványa (2-∆∆CT) adta a relatív expressziós értéket, mely az

összehasonlítás alapját képezi. Az eredményeket végül statisztikai analízisnek vetettük

alá, melyhez Mann-Whitney próbát használtuk p < 0,01 mellett.

55

5 EREDMÉNYEK

5.1 A P2RX7 gén mikroRNS-kötőhelyének polimorfizmusa

5.1.1 A feltételezett mikroRNS-kötőhelyek in silico vizsgálata

Vizsgálataink első kérdése az volt, hogy feltételezhető-e a P2RX7 gén 3’ UTR

régiójában polimorf miRNS-kötőhely jelenléte. A keresést in silico, számítógépes

adatbázisok használatával végeztük.

5. ábra: A P2RX7 mRNS feltételezett polimorf mikroRNS kötőhelyei. Két független adatbázis által prediktált kötőhelyek. A: PolymiRTS találata. B: Patrocles találatai. A piros színű szekvencia jelöli a miRNS-t; míg a fekete a komplementer mRNS-szekvenciát. Azok a nukleotidok, melyek nem vesznek részt a bázispárosodásban, a releváns szekvenciák alatt, illetve felett láthatók. A “seed” régió párosított nukleotidjai szaggatott vonallal vannak körbekerítve. A szekvenciák alatt jelöltük a genom e szakaszában előforduló SNP-ket. A kiemelt SNP (rs1653625) mindkét adatbázisban szerepel.

A PolymiRTS (http://compbio.utmem.edu/miRSNP/) és a Patrocles

(http://www.patrocles.org) adatbázisok segítségével három olyan SNP-t sikerült

3’ UA CAU 5’UCG UU ACAGGGUU

//------CCAGCCUGGGAGGCACAGC AA UGUCCCAAAAAAAAAAAAAAGAGU-//AC

3’ U G G 5’GUCG GA AGGGGGU

//------CCAGCCUGGGAGGCACAGC CU UCCCCCAAAAAAAAAAAAGAGU-//AAA G

A

3’ GGA ACC CCC A 5’GU UU A AGGGGUG

//---CCAGCCUGGGAGGCACA CA AA U UCCCCACAAAAAAAAAAAGAGU-//G C G

miR-1302

miR-1275

miR-491-5p

B Patrocles adatbázis

rs1653625

rs1718106

rs28969482

miR-6253’ U A A 5’ CC G U UC UUGA AGGGGGA

//------CCAGCCUGGGAGG C A AG AACU UCCCCCAAAAAAAAAA AAGAGU-//C CA G

A PolymiRTS adatbázis

rs1653625

*A

P2RX7 mRNS

P2RX7 mRNS

P2RX7 mRNS

P2RX7 mRNS

A

*

*

*

C

56

azonosítanunk, melyek megfelelnek a kritériumainknak, azaz (1) az SNP a kötődés

szempontjából esszenciális „seed” régióban található, és (2) létrehozza vagy

megszünteti egy adott miRNS lehetséges kötődését (5. ábra). A három, egymáshoz

közeli SNP további kérdéseket vetett fel: melyek azok a haplotípusok, melyek az egyes

miRNS-ek kötődését megakadályozhatják, vagy más miRNS-ek számára új

kötőhelyként funkcionálnak. Azonban a 3 SNP közül csak egyetlen olyan volt

(rs1653625), mely mindkét adatbázis algoritmusa szerint megváltoztat miRNS kötődést,

valamint a ritkább allél frekvenciája meghaladta a 10%-ot, ezek alapján ennek a

polimorfizmusnak a vizsgálatát kezdtük meg.

5.1.2 Az rs1653625 SNP genotipizálására kifejlesztett módszer

A szekvencia, mely az rs1653625 A/C SNP-t körülveszi a genotipizálás szempontjából

problémásnak bizonyult, ugyanis az egyik oldalon egy poli-A régió, míg a másik

oldalon egy citozinban gazdag szakasz található, így sem allélspecifikus próbákat, sem

allélspecifikus restrikciós hasítást nem tudtunk közvetlenül alkalmazni. Ezért egy

korábban leírt módszerrel próbálkoztunk (159), ahol az egyik primer segítségével az

általunk vizsgált SNP közelében hibás (mismatch) bázispárosodással az Eco24I

restrikciós enzim számára hoztunk létre hasító helyet.

Az rs1653625 SNP genotipizálására kifejlesztett RFLP-módszert a 6. ábra foglalja

össze vázlatosan. A primert tehát úgy terveztük meg, hogy a vizsgált SNP közelében

kötődjön be, de magát az SNP-t ne érintse. A célunk az volt, hogy két „hibás” bázis

PCR-termékbe való beépítésével egy Eco24I restrikciós enzim által felismerhető helyet

(GRGCYC) hozzunk létre. Az így módosított PCR-termékben az rs1653625 A-allélja

esetén nem történt hasítás, ami egy 176 bp terméket eredményezett, míg C allél esetén a

hasítás egy 157 bp és egy 19 bp terméket adott.

57

6. ábra. A P2RX7 3’ UTR A/C SNP (rs1653625) genotipizálása. A: A PCR-hez használt szenz primer pozíciója. A két hibás nukleotid (AG) piros színnel van jelölve. A vizsgált SNP szürkével van kiemelve. B: Allélspecifikus hasítás A-allél esetén. Ebben az esetben nem történik hasítás, mely egyetlen, 176 bp terméket ad. C: Allélspecifikus hasítás C-allél esetén. A felsokszorozott 176 bp-os termék egy 157 bp és egy 19 bp termékre hasad Eco24I-el történő emésztés hatására.

A méretükben csupán 19 bp-al eltérő DNS-fragmentumok egymástól történő

elválasztásához a vegyes, agarózt és metaphor agarózt egyaránt tartalmazó gél tűnt a

legmegfelelőbbnek, klasszikus horizontális gélelektroforézist használva (7/A. ábra).

Habár a 19 bp-os fragmentumot nem tudtuk detektálni, a 176 és a 157 bp fragmentum

elválasztása megfelelőnek bizonyult a megbízható genotipizáláshoz. A 7. ábrán hat,

reprezentatív, humán DNS-minta duplikátumainak elektroferogramja látható. A P2RX7

3’UTR A/C SNP (rs1653625) homozigóta AA genotípus esetén egyetlen 176 bázispáros

fragmentumot ad; az egyetlen 157 bázispáros fragmentum esetén CC homozigóta

genotípusra következtethetünk, míg az AC heterozigóta minták mindkét fragmentumot

tartalmazni fogják. Az ábrán jól megkülönböztethetők egymástól az emésztetlen (A01-

A02 és A09-A10), az emésztett (A05-A06) és a két fragmentumot egyszerre tartalmazó

heterozigóta minták (A03-A04, A07-A08 és A11-A12).

ACAGGCACAGCAAACTGTCCC CAAAAAAAAAAAAGAGT

5’ 3’AG

P2RX7 gén

A:PCR

GAGCCA

176 bp

Eco24I

/ /

/ /

B:RFLP, A-allél

GAGCCC

19bp 157 bp

Eco24I

/ /

/ /

C:RFLP: C allél

58

7. ábra. Néhány reprezentatív elektroferogram a P2RX7 3’ UTR A/C SNP (rs1653625) genotipizálásában. A: 12 minta (6 személy párhuzamos mintái) horizontális agaróz gélelektroferotikus képe (6/6 V/cm, 1 óra, 1,5% agaróz és 2% metaphor agaróz). B: Ugyanazon minták multikapilláris gélelektroforézisen alapuló szétválasztása (QIAxcel, 40 sec injekciós idő, 6 kV szeparációs feszültség).

A hagyományos horizontális gélelektroforézis mellett multikapilláris gélelektroforézis

rendszert is alkalmaztunk a fragmentumok azonosítására. Ez a módszer ugyan

költségesebb a hagyományos módszernél, de gyors elválasztást és jó felbontást

eredményezett, és a 96-os tálcákkal működő, automata mintafelvitel lényegesen

megkönnyítette a munkát. A 7/B. ábrán a multikapilláris elektroforézis rendszerrel

kapott képen látható, hogy a 176 és a 157 bp fragmentumai jól elválaszthatók, mely

lehetővé teszi az egyértelmű genotipizálást az rs1653625 AA, AC és CC genotípusok

esetében.

100bp

200bp

15bpmarker

1000bpmarker

400bp

300bp

A

B

AA AC CC ACAC AA

A01 A02 A03 A04 A05 A06 A07 A08 A09 A10 A11 A12

59

2 perc 3 perc

Rel

atív

eg

ység

CC

AA

AC3. minta

2. minta

1. minta

15bpmarker

1000bpmarker

A B

157 bp

176 bp

8. ábra. A P2RX7 3’ UTR A/C SNP (rs1653625) genotípusainak reprezentatív elektroferogramjai és szekvenálási eredményei. A: Három különböző minta elektroferogramja RFLP-t követően (40 sec injekciós idő, 6 kV szeparációs feszültség). B: Ugyanazon minták eredménye DNS szekvenálás után a kérdéses régióval. Nyilak jelölik a vizsgált SNP pozícióját.

A kidolgozott genotipizáló módszerünk megbízhatóságának ellenőrzésére mindegyik

genotípusból 3 PCR-amplikont küldtünk el szekvencia-meghatározásra. Az

eredményeket a 8. ábra mutatja be. Az ábrán a háromféle genotípus egy-egy

reprezentatív mintájának eredménye látható. A 8/A. ábra a három, különböző

genotípusú minta RFLP-t követő kapilláris-gélelektroferogramját ábrázolja. CC

genotípus esetén csak egyetlen csúcsot láthatunk, mely a 157 bp hosszúságú terméknek

felel meg, mely az Eco24I-vel történt teljes emésztés eredménye (1. minta), míg az

emésztetlen AA genotípus szintén egyetlen csúcsot eredményez, de a 176 bázispárnyi

terméknek megfelelő helyen (2. minta). A 3. minta az AC heterozigóta genotípust

ábrázolja, ebben az esetben mindkét csúcs megjelenik. Az ily módon megállapított

genotípusokat szekvenálással validáltuk (8/B. ábra). A bemutatott eredményekhez

hasonlóan, mind a 9 minta szekvenálása a korábban RFLP-módszerrel megállapított

genotípust támasztotta alá.

60

5.1.3 A P2RX7 mikroRNS-kötőhely SNP és a depresszió súlyosságának asszociáció

analízise

A kidolgozott genotipizáló módszert két beteg csoport genetikai asszociáció elemzéshez

használtuk fel, az egyik csoportban 152 bipoláris vagy major depresszióban szenvedő

beteg szerepelt, a másik csoportot pedig 218 cukorbeteg alkotta. Viszonyításképpen

egy egészséges populáció (egyetemista önkéntesek) adatait is felmértük. Az rs1653625

polimorfizmus és a HADS depresszió, valamint a szorongás súlyossága között mindkét

betegcsoportban szignifikáns asszociációt sikerült kimutatni a MANCOVA elemzéssel,

ahol a nem és az életkor szerepelt kovariánsként (2. táblázat). Az összehasonlítás

kedvéért a Gln460Arg (rs2230912) genotípus csoportjai szerinti adatokat a 3. táblázat

tartalmazza. A genotípus frekvenciákat alapul véve nem tapasztaltunk eltérést a Hardy-

Weinberg egyensúlytól, ami alátámasztja a kidolgozott módszer pontosságát.

2. táblázat: P2RX7 rs1653625 genotípusok és a hozzájuk tartozó HADS depresszió és szorongás skálaértékei depressziós, diabéteszes és kontroll csoportokban. A táblázat tartalmazza az egyes genotípusok számbeli eloszlását a különböző csoportokban és a HADS kérdőív két skálájának átlagértékeit és szórását az adott genotípus csoportban.

Genotípus pszichiátriai betegek diabéteszes betegek kontroll személyek N átlag ± szórás N átlag ± szórás N átlag ± szórás

depresszió AA 39 15,31 ± 3,89 56 5,93 ± 3,86 83 3,53 ± 2,72 AC 71 12,39 ± 5,00 113 4,72 ± 3,52 130 3,03 ± 2,16 CC 42 11,31 ± 5,00 49 3,78 ± 2,64 53 2,72 ± 2,28

p-érték 0,002 0,013 0,204 szorongás AA 39 14,94 ± 3,57 56 7,38 ± 3,68 83 6,55 ± 3,43 AC 71 13,04 ± 4,83 113 5,71 ± 4,07 130 6,44 ± 3,43 CC 42 12,39 ± 4,76 49 5,10 ± 3,11 53 6,72 ± 3,63

p-érték 0,076 0,013 0,909

61

3. táblázat: P2RX7 Gln460Arg (rs2230912) genotípusok és a hozzájuk tartozó HADS depresszió és szorongás skálaértékei depressziós, diabéteszes és kontroll csoportokban. A táblázat tartalmazza az egyes genotípusok számbeli eloszlását a különböző csoportokban és a HADS kérdőív két skálájának átlagértékeit és szórását az adott genotípus csoportban.

Genotípus pszichiátriai betegek diabéteszes betegek kontroll személyek N átlag ± szórás N átlag ± szórás N átlag ± szórás

depresszió AA 105 11,94 ± 4,93 145 4,31 ± 3,22 174 3,16 ± 2,35 AG 41 14,49 ± 4,52 68 5,74 ± 3,83 81 3,17 ± 2,45 GG 6 17,33 ± 2,94 5 7,00 ± 4,00 13 2,31 ± 2,17

p-érték 0,001 0,011 0,507 szorongás AA 105 12,88 ± 4,66 145 5,52 ± 3,71 174 6,52 ± 3,45 AG 41 13,91 ± 4,36 68 7,00 ± 4,07 81 6,64 ± 3,49 GG 6 17,67 ± 2,25 5 6,40 ± 2,61 13 6,29 ± 3,40

p-érték 0,017 0,064 0,589

Mivel a Haploview program kapcsoltságot mutatott a két SNP között (D’= 1,0; LOD =

22,04; r2 = 0,175), amely alapján csupán három haplotípus van jelen a lehetséges

négyből (a Gln460Arg A ~ rs1653625 C haplotípus 48-51% valószínűséggel, a

Gln460Arg A ~ rs1653625 A haplotípus 32-34% valószínűséggel, illetve a Gln460Arg

G ~ rs1653625 A haplotípus 17-18% valószínűséggel), kvantitatív asszociáció elemzést

végeztük e három haplotípusra. A THESIAS program a leggyakoribb becsült haplotípus

csoport átlagpontszámához képest adja meg a többi haplotípus csoport skálaértékének

különbségét, jelen esetben a referencia haplotípus a Gln460Arg A ~ rs1653625 C

csoport volt. Mindkét beteg csoportban emelkedett HADS depresszió értéket becsült a

program a Gln460Arg A ~ rs1653625 A haplotípus csoportban: pszichiátriai betegeknél

1,21 emelkedés (95% CI: 0,002 – 2,41; p = 0,049), cukorbetegeknél 0,76 emelkedés

(95% CI: 0,008 – 1,52; p = 0,048), azonban a Gln460Arg G ~ rs1653625 A haplotípus

csoportban még nagyobb pontszám emelkedés volt megfigyelhető: pszichiátriai

betegeknél 3,21 (95% CI: 1,61 – 4,81; p ˂ 0,001), cukorbetegeknél 1,67 (95% CI: 0,78

– 2,56; p ˂ 0,001). A HADS szorongás skálaértéknél hasonló hatás volt a Gln460Arg G

~ rs1653625 A haplotípus csoportban: pszichiátriai betegeknél 1,99 emelkedés (95%

CI: 0,42 – 3,57; p = 0,013), cukorbetegeknél pedig 1,57 emelkedés (95% CI: 0,53 –

2,62; = 0,003). Fontos megjegyezni, hogy az rs1653625 A-allélja a Gln460Arg A-allélja

mellett is hatással volt a fenotípusra, de a legerősebb hatást a két rizikó allél együttes

62

jelenléte (Gln460Arg G ~ rs1653625 A haplotípus) adja mind a depressziós, mind a

szorongásos tünetek súlyosságára.

5.2 Agyi expressziós változások diabétesz patkánymodellekben

5.2.1 Kísérleti elrendezés

Az inzulinhiány illetve az inzulinrezisztencia esetleges hatásait az agyszövetre három

állatcsoporton vizsgáltuk (9. ábra): kontroll, DM1 modell és DM2 modell. A DM1

patkányok streptozotocin-kezelést kaptak, míg a DM2 modelljeként a Goto-Kakizaki

patkányokat használtunk. Vizsgálatainkat nem teljes agyi homogenátumban, hanem

gondosan izolált, jól definiált agyterületeken végeztük. Minden patkányban három

agyterület került disszekcióra: a hippocampus, a prefrontális kéreg és a corpus striátum,

melyekből RNS-kivonat készült. Csoportonként összesen 9 állattal dolgoztunk, de az

állatok egyes agyterületekről származó mintái hármasával összecsoportosítva kerültek

vizsgálatra. Így csoportonként 3 biológiai parallel (3 expressziós chip) készült.

9. ábra. A kísérleti elrendezés Hipp: Hippocampus, Pfc: prefrontális kéreg, Str: striatum

Kontroll Streptozotocin Goto-Kakizaki

Hipp,Pfc,Str

Hipp,Pfc,Str

Hipp,Pfc,Str

Hipp,Pfc,Str

Hipp,Pfc,Str

Hipp,Pfc,Str

Hipp,Pfc,Str

Hipp,Pfc,Str

Hipp,Pfc,Str

Kontroll Streptozotocin Goto-Kakizaki

Hipp,Pfc,Str

Hipp,Pfc,Str

Hipp,Pfc,Str

Hipp,Pfc,Str

Hipp,Pfc,Str

Hipp,Pfc,Str

Hipp,Pfc,Str

Hipp,Pfc,Str

Hipp,Pfc,Str

63

5.2.2 A normalizálás koncepciója

A kiértékelés alapvetően egy a gyártó által javasolt, előre meghatározott protokoll

szerint történt, mely azonban számos ponton hagy szabad döntési lehetőséget

számunkra a kísérlet koncepciója szerint. A normalizálási lépések és a kísérleti

elrendezés helyes megválasztása nagyban befolyásolhatja a végső eredményt.

Esetünkben az egyes minták hibridizációjából származó adatok kiértékeléshez történő

csoportosítása bizonyult kritikusnak. Teljesen eltérő eredményt kaptunk ugyanis abban

az esetben, ha minden mintát - összesen 27 kimenetel - egy csoportként kezelünk, vagy

ha valamilyen megfontolásból több csoportra osztjuk őket. Mivel a különböző

kezeléseknek az egyes agyterületekre gyakorolt specifikus hatására voltunk kíváncsiak,

azt tartottuk célravezetőnek, ha a mintákat az utóbbi elv szerint osztjuk fel (10. ábra).

Mindemellett az irodalmi adatok is azt valószínűsítik, hogy a diabétesz az agyszövet jól

körülírt funkcióit befolyásolja, melyek szorosan köthetők egyes anatómiai

struktúrákhoz. Ennek megfelelően a három különböző agyterületről származó mintákat

tettük egy csoportba és végeztük el a normalizálást majd az analízist külön-külön.

10. ábra. A kiértékelés csoportosítási elve A kiértékelés során az egyes agyterületekre (prefrontális kéreg, hippocampus, striátum) vonatkozó eredményeket külön kezeltük, míg az adott agyterületeken a kezeléseket összevontuk. Így a 3 kezelés 3 biológiai parallelje (9 chip) képezte az alapját a normalizálásnak.

5.2.2.1 „Per chip” normalizálás

A normalizálást azzal a céllal végeztük el, hogy csökkentsük a DNS-chipek közötti

kezelésekből eredő variabilitást amellett, hogy a számunkra érdekes biológiai

variabilitást a lehető legnagyobb mértékben megtartsuk. A normalizálásnak két szintjét

alkalmaztuk. Először az ún. chip szintű normalizálást végeztük el, mely a nem biológiai

eredetű, vagyis a microarray technológiából és az azt megelőző lépesekből

Prefrontális kéreg Hippocampus Striatum

Kontroll DM1 DM2 Kontroll DM1 DM2 Kontroll DM1 DM2

64

(mintapreparáció, RNS-jelölés, hibridizáció) eredő variabilitás eliminálását célozza

meg. A normalizálást a mediánra végeztük - minden egyes próba mért fluoreszcens

intenzitásértékét elosztottuk a microarray-re jellemző medián intenzitással -, melynek

eredményeként az egyes chipek medián értéke a logaritmikus skálán 1 köré esett (11.

ábra). Ennek elvi alapja az, hogy akármilyen kezelést is alkalmazunk, nagy

valószínűséggel a teljes genomot tekintve a gének többségének expressziós szintje nem

változik, vagyis az egyes chipek közti különbségek elsősorban a chip kezelése és

értékelése során létrejövő technikai variabilitásból származnak.

11. ábra. Chip szintű normalizálás eredménye dobozdiagram ábrázolással Az ábra a hippocampusból származó minták génexpressziós értékét jeleníti meg logaritmikus skálán, dobozdiagram ábrázolási módban, a „per chip” normalizálást követően. Az egyes színes dobozok a gének azon 50%-át reprezentálják, melyek a dobozon belül vonallal jelzett medián értékhez képest magasabb (25%) vagy alacsonyabb (25%) fluoreszcens jelet adtak. A gének másik 50%-a nagy expresszióbeli szórásuk miatt a dobozon kívül van jelölve. A várakozásnak megfelelően minden minta medián értéke 1 körül van és a kezelések párhuzamosai közt sincs jelentős különbség.

Nor

mal

ized

inte

nsity

(log

scal

e)

Kontrol Goto-Kakizaki Streptozotocin

65

5.2.2.2 „Per gén” normalizálás

Az ezt követő normalizálási lépés a gének szintjén történt, mely segítségével azonos

relatív skálára hoztuk az összes gén expressziós szintjét, így egységesítve a relatív

génexpressziós változásokat. Esetünkben a viszonyítás a kontroll minták

génexpressziójára történt, vagyis egy adott próba adott mintában mért expressziós

értéke el lett osztva ugyanazon gén kontroll mintákban mért medián értékével. Ha

ezután tekintünk a minták box plot ábrájára (12. ábra), jól láthatjuk, hogy az egyes

mintákon belül sikerült a próbák szórását jelentősen csökkenteni (kisebb dobozok) ami

lehetővé teszi ezután a minták összehasonlítását.

12. ábra. Génszintű normalizálás eredménye dobozdiagram ábrázolással Az ábra a hippocampusból származó minták génexpressziós értékét jeleníti meg logaritmikus skálán, dobozdiagram ábrázolási módban, a „per gén” normalizálást követően. A dobozok alatt és fölött a medián értékhez képest legalább másfélszeres vagy annál nagyobb eltérést adó próbák vannak ábrázolva. Az ábra jól szemlélteti a kontroll mintákon belüli kis szórást, valamint kifejezettebbé vált az egyes párhuzamosok közt meglévő kis különbség is.

Ezen a szinten már bizonyos fokig „valódi” eredményeket látunk, azaz bizonyos

előfeltételezéssel is élhetünk az egyes kezelések nagyságrendbeli hatását tekintve. Ha

Nor

mal

ized

inte

nsity

(log

scal

e)

Kontrol Goto-Kakizaki Streptozotocin

66

ugyanis még az analízist megelőzően összevetjük a streptozotocin kezelésből és a Goto-

Kakizaki patkányokból származó expressziós adatokat, megállapíthatjuk, hogy a GK-

patkányok egyes agyterületein nagyobb változást várhatunk az STZ-kezeléshez képest

(13. ábra).

13. ábra: Normalizált expresszió változások (adatszűrés nélkül) Az ábra a normalizált adatok relatív változásait mutatja be a kontroll állat és a. Goto-Kakizaki patkány, illetve a kontroll és a streptozotocinnal kezelt patkány viszonylatában a hippocampus területén. Az ábrán a chip-en levő valamennyi próba (41 129 db) reprezentálva van, mivel még semmilyen szűrés nem történt. Az Y-tengelyen a relatív expressziós adatok értékei vannak feltüntetve, logaritmikus skálán. Egy-egy vonal egy adott gén expressziós változását mutatja a GK-patkányban, illetve az Stz-vel kezelt patkányban a kontroll állatokhoz képest. Az expresszióváltozás mértékét az alkalmazott színskála (jobb oldalt részletezve) is szemléletessé teszi. Egy adott gén expressziója az adott kezelés hatására nőtt (pirossal jelölve), csökkent (kékkel jelölve) vagy nem változott (sárga) a kontrollhoz képest. Mivel a GK-patkányban jól láthatóan több piros,

67

ill. kék vonalat látunk, azt feltételeztük, hogy ott nagyobb mértékű változást fogunk tudni kimutatni.

5.2.3 Technikai adatszűrés

A normalizálást követően és a statisztikai analízist megelőzően egy technikai jellegű

szűrést volt szükséges elvégeznünk, mely egyrészt a minták minőségi kontrollját jelenti,

másrészt az analízisre így csak azok a próbák kerültek, melyek technikai szempontból

relevánsak. Ezt két szinten végeztük el, mely során eliminálásra kerültek azok a próbák,

ahol a fluoreszcens jel minőségi szempontból nem megfelelő („flag”-szűrés) és amelyek

a különböző kísérleti kondíciókban abszolút értelemben nem mutattak változást („nem

változó” gének kiszűrése). A „flag”- szűrés eredményeképp csak azon próbák kerültek

további szűrésre, melyeknél a mért fluoreszcens jel intenzitása eléri a detektálási

küszöbértéket egy adott agyterület 9 mintája (3 kísérleti kondíció x 3 biológiai parallel)

közül legalább 3-ban. A szűrést követően az eredeti próbák kb. 75%-a maradt meg (4.

táblázat). A „nem változó” gének kiszűrésekor kizártunk a további vizsgálatból minden

olyan próbát, melyek normalizált intenzitásértéke az összes kísérleti kondíciót

figyelembe véve adott agyterületen belül 10-es alapú logaritmikus skálán 0,667 és 1,334

közötti értéket adott. Ezzel figyelmen kívül hagytunk minden olyan próbát, melyek

változása mindhárom állapotot (kontroll, DM1, DM2) figyelembe véve nem érte el –

akár pozitív, akár negatív irányban - a kétszeres értéket. Erre a szűrési lépésre azért volt

szükség, mert valószínűleg ezek a próbák biológiai jelentést nem hordoznak, illetve a

hatalmas próbaszámot tekintve praktikussági és könnyebb adatkezelési szempontoknak

is eleget tettünk, amennyiben az a végső célunk, hogy a lehető legkisebb még kezelhető

génszámú listát kapjunk eredményként. A szűrés eredményeképp a génlisták

drasztikusan lecsökkentek (4. táblázat). Ez alátámasztja az alkalmazott normalizálás

koncepcióját, vagyis azt, hogy a gének legnagyobb részében nincs jelentős expressziós

szintváltozás adott agyterületen.

5.2.4 Statisztikai adatszűrés

Ezt követően az adatokat matematikai alapon, statisztikai próba segítségével szűrtük a

valódi változások detektálására. Azokra a próbákra voltunk kíváncsiak, melyek legalább

68

kétszeres, statisztikailag szignifikáns expresszióváltozást mutatnak valamelyik kezelés

hatására a kontroll állapothoz képest. Ehhez kétmintás t-próbát alkalmaztunk,

feltételezve, hogy a csoportok közötti variancia nem egyenlő (Welch korrekció),

Benjamini-Hochberg többszörös hipotézis korrekcióval. A korrigált p-értéket 0,05 alatt

fogadtuk el. A számítást egy, a Genespring programba beépített algoritmus segítségével

végeztük el, melynek grafikus megjelenítése látható a 14. ábrán.

14. ábra. Statisztikai adatszűrés – Volcano plot. A statisztikai adatszűrés kritériuma a következő volt: legalább kétszeres intenzitásnövekedés (log2[Fold Change]≥1) vagy csökkenés (log2[Fold Change]≤-1) a kontrollhoz képest, mely statisztikailag szignifikáns (p<0,05, azaz -lgp<1,3). A kritériumnak megfelelő próbák piros színnel, a kiesők sárgával vannak jelölve. Az ábrán a hippocampusban kimutatható változás grafikus megjelenítése látható.

Az adatszűrés eredménye alátámasztotta korábbi feltételezésünket, miszerint a Goto-

Kakizaki patkányokban nagyobb expresszióbeli változást tudunk kimutatni, mint a

streptozotocinnal kezelt állatokban. A 4. táblázat adataiból jól látható, hogy a GK

patkányok (DM2 modell) expressziós mintázata sokkal jobban eltér a kontroll

állatokétól, mint az Stz-patkányoké (DM1 modell). Ugyanakkor az egyes agyi területek

közt is jelentős eltérést kaptunk. A GK-állatok hippocampusában 504 próba mutatott

legalább kétszeres eltérést a kontrollhoz képest, a prefrontális kéregben 232 próbát

sikerült kiszűrni, míg a striatumban csak 3 db ilyen próbát találtunk.

69

4. táblázat: Az agyterület-specifikus génlisták alakulása a kiértékelés során A kiindulási lista 41129 próbát tartalmazott a legfrissebb annotációnak megfelelően. A táblázatban feltüntettük az egyes szűrési lépések után megmaradt próbák számát, illetve azok kiindulási állapothoz viszonyított százalékát.

DM2 DM1 DM2 DM1 DM2 DM1504 7 232 0 3 0

1,23% 0,02% 0,56% 0,00% 0,01% 0,00%

266 0 147 0 3 00,65% 0,00% 0,36% 0,00% 0,01% 0,00%

Utószűrés

Kiindulási állapot

"Flag" szűrés

Nem változó gének kiszűrése

100% 100% 100%

Statisztikai analízis

6199 9704 1064623,6%

3050774,3% 75,3% 74,2%

15,1%

Hippocampus Prefrontalis kéreg Striatum

25,9%

41129 41129 41129

30560 30984

5.2.5 Utószűrés

További adatredukciós célból adatainkon egy utolsó szűrési lépést is végeztünk. Ennek

keretében eliminálásra kerültek mindazon próbák, melyekben a fluoreszcens jel a három

párhuzamos mérés közül kettőben vagy többen nem éri el a detektálási küszöbértéket.

Ezzel a lépéssel azokat az álpozitív eredményeket szűrtük ki, melyek ugyan a csoportok

összehasonlításában nagy eltérést adnak, statisztikailag tehát kimutatható különbséget

mutatnak, ám mindez csupán az alacsony jelintenzitásból származik. Továbbá töröltük

azokat a próbákat is a listákból, melyek nyers intenzitásértéke nem ér el egy határértéket

(normalizálás előtti jelintenzitás < 100).

Az így kapott végső adatok alapján készített Venn-diagram halmazábrája a

hippocampus és a prefrontális kéreg összevetésében (15. ábra) jól szemlélteti, hogy a

DM2 modellben kapott expressziós változások egy része átfed az egyes agyterültek

között, de azért jelentősnek nevezhető a specifikus hatás is. Míg csupán 3 db próba

mutatott szignifikáns változást mindhárom agyterületen, a hippocampus-specifikus

expresszióváltozást 180, a prefrontális kéregre specifikus expresszió változást 61 próba

jelzi, míg mindkét agyterületen 83 próba jelzett változást. Az agyterület-specifikus

eredmények listája a függelékben látható (13, 14, 15 és 16. táblázat). Megjegyzendő,

hogy a striatumban egyáltalán nem kaptunk terület-specifikus változást. Mindezek

70

alapján úgy döntöttünk, hogy a továbbiakban a GK-patkányokból származó

hippocampus és prefrontális kéreg mintákra koncentrálunk.

15. ábra: 2-es típusú diabétesz modellben változást mutató gének eloszlása az egyes agyterületek közt Hipp: hippocampus, Pfc: prefrontális kéreg, Str: striatum

5.2.6 Végső adatszűrés az útvonal-analízis és az RT-PCR validálás alapján

A fennmaradó próbákkal ezután útvonal-analízist végeztünk, hogy az egyes listáknak

biológiai tartalmat kölcsönözzünk, mivel eddig pusztán matematikai szempontból

végeztünk adatredukciót. Az útvonal-analízishez a Gene Ontology, a KEGG (Kyoto

Encyclopedia of Genes and Genomes) és a GenMapp (Gene Map Annotator and

Pathway Profiler) adatbázis klasszifikációját használtuk fel és kerestünk átfedést saját

listáinkkal. Azokat az útvonalakat tekintettük aktívnak, melyekben a szoftver által

használt statisztikai próba szerint az egyes génlisták elemei szignifikánsan (p<0,05)

reprezentálva vannak, tehát fel vannak dúsulva. Az összes adatbázist tekintve a

18083

61

30 0

0

Hipp

Str

Pfc18083

61

30 0

0

Hipp

Str

Pfc

71

hippocampus esetében 64, míg a prefrontális kéreg területéről 36 olyan gént sikerült

találni, amelyik tagja volt valamely dúsulást mutató génontológiai halmaznak. A

legtöbb átfedést a Gene Ontology adatbázisban sikerült találnunk (5. táblázat).

5. táblázat: A Gene Ontology, a KEGG és a GenMapp adatbázisok útvonalaiban dúsulást mutató gének száma

Szignifikáns útvonalhoz tartozó gének

Hippocampus 57Prefrontális cortex 32Hippocampus 44Prefrontális cortex 29Hippocampus 11Prefrontális cortex 9Hippocampus 2Prefrontális cortex 8

GO, Biological process

GO, Molecular function

KEGG

GenMapp

A fenti eredményeket egy valós idejű PCR-alapú validálási lépés során ellenőriztük. A

viszonylag nagy génszám miatt ezt nem egyesével, hanem egyszerre végeztük el az

Applied Biosystems cég Taqman Low Density Array (TLDA) rendszere segítségével.

Ez a platform egyszerre 96 gén együttes értékelését teszi lehetővé, de a mérés elvégzése

idején csak a gyártó által felkínált, előre gyártott génspecifikus kitek használata volt

lehetséges. A fennmaradó helyeket egyéb, más megfontolásból érdekesnek ítélt

génekkel (a szakirodalomból ismert és gyakran vizsgált bona fide kandidáns génekkel)

töltöttük fel. A sikeresen validált géneket az alábbiakban táblázatba szedve közöljük.

(Az egyes gének expressziós változása a kontrollhoz képest mért változást jelenti, így az

1-nél magasabb értékek a géntermék expressziójának növekedését, az 1-nél alacsonyabb

értékek annak csökkenését jelentik.)

72

6. táblázat: Validált gének listája a hippocampusban A génexpressziós változás mértéke a microarray kiértékeléséből származó adat

Gén megnevezése

Expressziós változás

Génbank elérhet őség

Géntermék rövidítése

A_44_P991924 2,053 NM_017193 AADAT A_44_P242329 0,472 NM_130433 ACAA2 A_44_P257522 2,021 XM_574228 AGRP A_43_P22936 3,339 NM_001005557 AKAP3 A_44_P1029403 2,363 NM_198134 BST2 A_42_P534172 3,426 NM_053983 CD52 A_43_P17784 0,435 NM_001025722 CDK10 A_44_P452176 0,248 NM_053560 CHI3L1 A_43_P12024 2,127 NM_019329 CNTN3 A_42_P508984 2,469 NM_001007729 CXCL4 A_44_P992662 3,347 NM_053567 FTCD A_42_P614175 2,168 NM_033237 GAL A_44_P192568 2,049 NM_172335 GM2A A_43_P15751 2,242 XM_343470 GRM2 A_44_P151482 0,335 NM_001003404 IL22RA2 A_43_P15993 0,327 NM_012711 ITGAM A_42_P603096 3,237 NM_053981 KCNJ12 A_44_P167930 0,276 NM_012720 MOBP A_44_P214846 4,508 NM_134350 MX2 A_42_P729340 3,111 NM_138913 OAS1 A_44_P200116 0,248 NM_022236 PDE10A A_44_P728469 2,029 NM_022224 PTER A_42_P787160 0,477 NM_033099 PTPRVP A_44_P402507 2,165 NM_145084 RETSAT A_44_P196401 2,399 Y13890 RT1-AW2 A_44_P384017 0,205 NM_031688 SNCG A_44_P424723 2,047 NM_021693 SIK1 A_44_P301608 0,486 NM_019354 UCP2 A_44_P996233 0,398 NM_001008768 PRIM1 A_44_P426792 0,388 NM_001008853 RT1-M6-2

73

7. táblázat: Validált gének listája a prefrontális kéregben A génexpressziós változás mértéke a microarray kiértékeléséből származó adat

Gén megnevezése

Expressziós változás

Génban elérhet őség

Géntermék rövidítése

A_44_P323106 0,476 NM_178095 ABCA1 A_43_P12768 2,133 NM_053328 BHLHE40 A_43_P12559 2,032 NM_031338 CAMKK2 A_43_P11971 2,162 NM_019195 CD47 A_44_P452176 0,327 NM_053560 CHI3L1 A_44_P141051 0,481 NM_019274 COLQ A_44_P278387 2,243 NM_147211 CR16 A_44_P992662 5,127 NM_053567 FTCD A_43_P11961 0,377 NM_019172 GALR2 A_44_P192568 2,457 NM_172335 GM2A A_43_P15751 4,436 XM_343470 GRM2 A_42_P621642 2,385 XM_341964 LSP1 A_44_P167930 0,342 NM_012720 MOBP A_44_P440514 2,064 NM_001008842 RT1-CE4 A_43_P11932 0,272 NM_017352 NR4A3 A_42_P729340 3,447 NM_138913 OAS1 A_42_P774448 2,188 NM_012628 PRKCG A_44_P308662 0,439 NM_012643 RET A_44_P196401 2,534 Y13890 RT1-AW2 A_42_P511118 0,232 NM_053427 SLC17A6 A_44_P416617 0,305 NM_057129 TFF1 A_44_P494274 0,271 NM_053686 TRPV6

Az útvonal-analízissel kiválasztott gének validálási aránya hippocampus esetén 71%,

prefrontális kéreg esetén 81% volt (8. táblázat). Számszerűen tehát 30, ill. 22 gént

sikerült validálnunk, melyek alapján egyes korábban vélelmezett útvonalak törlésre

kerültek. Azokat az útvonalakat fogadtuk el, melyben legalább 1 gént sikerült

validálnunk. Az így kapott végeredményből alkottuk meg hipotézisünket. Számunkra a

Gene Ontology adatbázis Biological Process doménja volt az, melynek egyes kategóriái

releváns biológiai információt hordoztak és irodalmi adatokkal, valamint saját

hipotézisünkkel is a leginkább összeegyeztethetőnek találtunk. A Gene Ontology

Molecular Function, a KEGG valamint a GenMapp adatbázisban dúsulást mutató

validált gének listája a függelékben megtalálható (17 és 18. táblázat).

74

8. táblázat: Az útvonal-analízissel kiválasztott majd validált gének száma az egyes régiókban.

Útvonalakban dúsult gének 64 36Validálásra kiválasztott gének 42 27Validált gének 30 22

Hippocampus Prefrontális kortex

A TLDA-platform már említett sajátosságából adódóan számos olyan gén is validálásra

került, melyek nem a fent vázolt logika alapján lettek kiválasztva. Ezek olyan

útvonalakhoz tartoznak, amelyeket a statisztikai próba nem talált szignifikánsnak, de a

vizsgálat szempontjából relevánsnak ítéltük saját és az irodalomban felállított

hipotézisek alapján. A 9. táblázat ezeket a géneket listázza.

9. táblázat. Nem útvonal-analízissel kiválasztott gének expressziója a validálás eredményeként. Az egyes génekhez tartozó értékek a génexpresszió változás mértékét jelzik kontrol állapothoz képest. Csak azok a változások vannak jelezve, amelyek egyeznek az in silico analízis eredményével.

Génnév Hippocampus Prefrontális kéregBTBD9 0,467DNAJB13 0,406KCNJ16 2,164LGALS3BP 2,194MAWBP 0,201MGL1 3,297OLR821 2,184PXMP4 3,218RBMS2 2,641SLCO1 0,475

Szintén a validáláshoz használt rendszer sajátosságának következménye, hogy a

bioinformatikai elemzéssel kiválasztott és agyterület-specifikusnak tekintett gének

expressziós változását mindkét agyterületen lemérhettük. Az itt kapott eredmény

érdekesnek bizonyult: számos olyan gén mutatott kvantitatív PCR-al

expresszióváltozást azon az agyterületen, ahol az in silico analízis szerint nem

mutatható ki eltérés (Függelék 19. táblázat).

75

A célszerűség és a könnyebb áttekinthetőség érdekében csak azokat az eredmények

fogadtuk el végül és vontunk le belőle következtetéseket, melyek mindkét módszerrel

azonos eredményt adtak. Ugyanakkor mindenképp meg kell hogy említsük, hogy

további érdekes és relevánsnak tekinthető hipotézisek felállítását tenné lehetővé

ezeknek az adatoknak a kiértékelése is.

76

6 MEGBESZÉLÉS

6.1 A P2RX7 gén polimorfizmusai és kapcsolatuk a depresszióval

A P2RX7 gén először egy genom szintű kapcsoltsági analízis során került az érdeklődés

középpontjába. A depressziókutatásban ezáltal egy új gén került fókuszba, mely olyan

hipotézisek előtt nyitotta meg az utat, melyek a monoamin rendszerek korábbi

hangsúlyos szerepén kívűl más folyamatokat is felelőssé tesznek a pathogenezisben. A

kromoszóma-régió részletes vizsgálata a P2RX7 gén aminosavcserét okozó Gln460Arg

polimorfizmusát (rs2230912) azonosította rizikófaktorként (62). A polimorfizmus

szerepét később megerősítették asszociáció vizsgálatok major depresszióban (63) és

bipoláris zavarban is (64). Ezidáig a P2X7 purin receptornak a szerepe nem tisztázott a

depresszió patogenezisében. Az ATP-függő P2X receptorok kationszelektív

ioncsatornák. Extracelluláris ATP hatására nyílnak ki és kalciumra nézve nagy

áteresztőképességgel rendelkeznek. A P2RX7 az agyban neuronok, asztrociták,

valamint oligodendrociták és mikroglia sejtek felszínén fejeződik ki (66),

valószínűsíthetően immunfolyamatok és neurotranszmitterek felszabadulásának

szabályozásában játszik szerepet (160).

Kutatócsoportunk korábban a P2RX7 Gln460Arg polimorfizmusát megvizsgálva eset-

kontroll analízisben nem látott szignifikáns hatást, melyet a nem túl nagy esetszám (171

beteg, 178 kontroll személy) magyarázhat. A dimenzionális elemzésünk viszont

összefüggést mutatott az irodalomban rizikófaktorként számon tartott, arginint kódoló

allél és a súlyosabb depresszív tünetek között (161). Cukorbetegek körében végzett

vizsgálatunk során szintén sikerült asszociációt kimutatnunk a depresszió súlyosságát

mérő skálaérték és a rizikófaktorként valószínűsíthető allélvariáns között (162).

A vizsgált misszensz mutáció az ioncsatorna C-terminális régiójában található, mely

kulcsfontosságú a fehérje helyes működése szempontjából. A Gln460Arg

polimorfizmus funkcionális hatását vizsgáló munkacsoport humán monocitákon végzett

vizsgálatával kimutatta, hogy a 460-as pozícióban lévő arginin variáns megnövekedett

pórusaktivitást mutat (163). Egyes újonnan publikált adatok azonban megkérdőjelezik a

tárgyalt SNP közreműködését bipoláris és major depresszióban (164). A legújabb

funkcionális vizsgálatok is azt valószínűsítik, hogy a funkciónyeréses mutáció hatása

csak egy másik (His155Tyr), a Gln460Arg polimorfizmussal kapcsoltságban lévő SNP-

77

vel együtt képes kifejteni hatását (165). Ezek alapján felmerült, hogy az észlelt hatás

közvetítéséért a gén 3’ UTR régiójában lévő feltételezett miRNS-kötőhely

polimorfizmusok lehetnek a felelősek, melyek kapcsoltságban állhatnak a Gln460Arg

polimorfizmussal. In silico vizsgálattal sikerült 3 A/C polimorfizmust találni egymás

mellett. Ezek mindegyike külön-külön is befolyásolhatja a miRNS kötődését.

Munkánk során a 2164 A/C (rs1653625) SNP vizsgálatát végeztük el, mivel előzetes

szekvenálási adatok alapján a ritka allél frekvenciája a három polimorfizmus közül

kizárólag ennek az esetében volt 10% fölött. Laboratóriumunk tapasztalata szerint 10%

alatti allélgyakoriság esetén statisztikailag szignifikáns genetikai asszociációt nagyon

nehéz találni, legfeljebb akkor, ha a ritka homozigótákat és a heterozigótákat

összevonjuk.

Az rs1653625 SNP-t korábban nem vizsgálták behatóan, valószínűleg a PCR

szempontjából problematikus, 3’-irányban található, adeninben illetve citozinban

nagyon gazdag régiók miatt. Ezek, valamint a szomszédos két SNP megakadályozzák

az allélspecifikus próbák vagy primerek alkalmazását. Az egyetlen megbízható

megoldásnak a szekvenálás tűnt egy külső primer segítségével. A szekvenálás azonban

az alkalmazott mintaszám esetén túl költséges lett volna, ezért kifejlesztettünk, majd

sikeresen alkalmaztunk egy RFLP módszert, melyhez mindössze 10-20 ng genomiális

DNS szükséges templátként a P2RX7 asszociáció vizsgálatához. Eredményeink alapján

szignifikáns asszociációt sikerült kimutatnunk az rs1653625 A-allélja és a depresszió

súlyossága között mind pszichiátriai betegek, mind cukorbetegek körében. Mivel az

rs1653625 A/C SNP kapcsoltságban van a korábban említett Gln460Arg

polimorfizmussal (rs2230912) és az rs1653625 A-alléja laborunk korábbi vizsgálata

alapján (161) gyakoribbnak tűnik, mint a 460Arg variáns, azt gondoljuk, hogy

valószínűleg a 3’ UTR-ben lévő SNP az, amelyik közvetíti a P2RX7 és depresszió

között fennálló asszociációt. A két allél együttes előfordulása funkcionálisan erősítheti

is egymás hatását, mivel az rs1653625 SNP A-alléje megakadályozza a miR-625

feltételezett kötődését így magasabb fehérjeszinteket várhatunk, mely egybecseng a

460Arg variáns pórusaktivitást növelő hatásával. Ennek alátámásztásaképpen haplotípus

elemzésünk azt mutatta, hogy a legerősebb hatást a két rizikó allél együttes jelenléte

(460Arg variáns és rs1653625 A-allél kombinációja) adja a fenotípusra, mind a

depressziós, mind a szorongásos tünetek súlyossága szempontjából. Mindenképpen

78

hangsúlyoznunk kell azonban, hogy eredményeink egyelőre még előzetes adatok,

melyet nagyobb és/vagy független mintákon meg kell ismételni, hogy a fenti kijelentést

meg lehessen erősíteni. További vizsgálatok tárgya eldönteni, hogy az egymással

kapcsoltságban lévő polimorfizmusok közül melyik felelős legnagyobb mértékben a

kimutatott asszociációért, valamint annak tisztázása, hogy a vizsgált

polimorfizmusoknak a miRNS kötőhelyen van-e funkcionális hatása. Ezek a vizsgálatok

nagyobb mintapopuláción és egyszerre több SNP együttes vizsgálatával már folynak

laboratóriumunkban. A funkcionális hatást luciferáz alapú riporter rendszerben, a

polimorf allélt a luciferáz gén mögé klónozva igyekszünk tisztázni, feltételezve, hogy a

bázissorrend megváltozása következtében módosuló seed-szekvenciához a miRNS más

affinitással kötődik, s ennek a génexpresszióra hatása lehet.

6.2 Agyi expressziós változások a 2-es típusú diabétesz patkánymodelljében

Mivel az inzulin és receptorai bizonyítottan expresszálódnak az agyban és ott részt

vesznek számos folyamat szabályozásában, indokolt volt számunkra, hogy megváltozott

génexpressziós mintázatokat feltételezzünk 1-es és 2-es típusú diabéteszben, melyek

hátterében az inzulin abszolút vagy relatív hiánya áll. Jelen munkánkban jelentős

eltérést sikerült kimutatnunk egy 2-es típusú diabétesz állatmodell génexpressziós

profiljában a kontroll állatokéhoz képest. A Goto-Kakizaki patkány spontán módon,

genetikai faktorok hatására kialakuló cukorbetegsége miatt kitűnő modellként szolgált

számunkra a betegség genetikai hátterének vizsgálatához. Az állatokban kimutatott

nagymértékű génexpressziós elváltozás arra enged következtetni, hogy az inzulin-

jelpálya hosszan fennálló, normálistól eltérő működése jól detektálható hatással van a

központi idegrendszerre. Ugyanakkor a streptozotocin-indukált diabétesz modellünkben

csak igen kis mértékű változást sikerült kimutatnunk, amiből arra következtetünk, hogy

az akut inzulinhiány és hiperglikémia nem okoz szignifikáns változást az agy

génexpressziós mintázatában a teljes genom szintjén, vagy legalábbis ez nem

kimutatható microarray alapú vizsgálattal, 4 héttel a toxinnal való kezelés után.

Elképzelhető magyarázatként szolgálhat esetleg az is, hogy ezek az állatok sikeresen

kompenzálják a streptozotocin-kezelés hatására kialakult alacsony perifériális inzulin

szintet azáltal, hogy megnő az agy saját inzulintermelése. Az agy saját

79

inzulintermelésével kapcsolatos ellentmondásos adatok azonban inkább azt

valószínűsítik, hogy mivel a streptozotocin-kezelt állatokban a STZ nem tud átjutni a

vér-agy gáton, így nem tudja kifejteni sejtpusztító hatását, ezáltal expressziós változások

sem következnek be (166). Az akut hiperglikémiát pedig az agy akár jelentősebb

génexpresszió változás nélkül is tolerálhatja. Egy másik lehetséges magyarázat az lehet,

hogy a GK állatok teljes élettartama során fennállt az inzulinrezisztencia, míg a STZ-al

diabetizált állatokban csak négy héten keresztül állt fenn az inzulinhiány, és ez az

időbeli különbség az agyi génexpressziós profil változásában is jelentkezik.

Kísérletünkben három fő agyrégiót vizsgáltunk: a prefrontális kéreg és a hippocampus a

tanulásban valamint a memória kialakításában játszott jól ismert szerepük miatt kerültek

kiválasztásra, míg a striatum egy anatómiailag jól definiált, könnyen kiboncolható

struktúra. Emellett pedig a substantia nigra egyik legfontosabb projekciós területe és

mivel egyes neurodegeneratív betegségek (jellemzően Parkinson-kór) hátterében a

dopamintermelő sejtek apoptózisa áll, feltételeztük, hogy a mi modellünkben ezen az

agyterületen is sikerül génexpressziós szinten hatást kimutatnunk. Az adatok

kiértékelése során – normalizálás, technikai adatredukció és statisztikai analízis – csak a

Goto-Kakizaki törzs génexpressziós profiljában sikerült jelentős és szignifikáns

változást kimutatnunk. A hippocampusban 266, míg a prefrontális kéregben 147 gén

mutatott eltérést a kontroll állatokkal összevetve. Ezek közül 83 gén mutatott átfedést a

két agyrégió között. A striatumban ellenben csak 3 génnél sikerült expressziós változást

mérni, melyek közül egyik sem bizonyult régióspecifikusnak. A génontológiai analízis

tovább szűkítette a gének listáját, de az ismert biokémiai útvonalakkal való átfedés

hozzájárult releváns hipotézisek felállításához. A validálást követően végül 30 gént

találtunk megváltozottnak a hippocampus és 22-t a prefrontális kéreg területéről. Csak

azokkal a génekkel foglalkoztunk, melyek mindkét rendszerben (microarray és real-time

PCR) azonos irányú expressziós változást mutattak. Szintén nem képezik részét jelen

dolgozatnak azok az eredmények, melyek a kiértékelési és validálási logikán kívül, a

TLDA platform sajátosságainak köszönhetően kerültek a látóterünkbe (nem útvonal-

analízissel kiválasztott gének). Hipotézisünket csak a Gene Ontology Biological Process

doménjában kapott találatok alapján alkottuk meg.

Érdemes még megjegyezni, hogy a streptozotocinnal kezelt patkányokban csak a

hippocampusban sikerült kismértékű változást kimutatni. Ez a megfigyelés jól korrelál

80

azokkal a munkákkal, melyek azt mutatták ki, hogy az inzulin és receptorai legnagyobb

mértékben a hippocampusban fejeződnek ki az agyállományon belül, illetve azzal, hogy

a streptozotocin állatkísérletekben intracerebrovaszkulárisan alkalmazva jelentős

memóriadeficitet okoz (107).

6.2.1 A hippocampus validált expressziós változásai 2-es típusú diabétesz-modellben

Az útvonal-analízis segítségével sikerült felfednünk, hogy a hippocampusban

expresszióváltozást mutató gének közül a legtöbb az oxidatív stresszel, DNS-

károsodással, immunfolyamatokkal és a sejtciklus szabályzásával hozható

összefüggésbe. Ez a négy terület logikailag összekapcsolható, hiszen immunfolyamatok

következtében reaktív oxigéntartalmú szabadgyökök keletkezhetnek, amelyek a DNS-

bázisait károsítva a sejtciklus leállását okozhatják. Ugyanakkor érintettek voltak még a

központi idegrendszer fejlődéséért és lipidmetabolizmusáért felelős reakcióutak,

valamint a táplálkozási viselkedés szabályozása is (16. ábra). Ezt az eredmény a

cukorbetegség patomechanizmusainak ismeretében jól megokolható, hiszen az inzulin

egyfajta növekedési faktorként és antiapoptotikus szignálként is funkcionál

neuronokban (részben közvetlenül, részben az inzulinszerű növekedési faktorok

modulálása révén), jelentős hatást gyakorol az éhezés és táplálkozásfelvétel

hipotalamikus szabályzására, illetve kifejezett anabolikus tulajdonságai miatt a lipidek

anyagcseréjét is irányítása alatt tartja. A 10. táblázatban szereplő géneket alaposabban

megvizsgálva azonnal szembetűnik a galanin (GAL) fontossága, mely a legtöbbször

előforduló gén a kiszűrt útvonalakban. A galanin feltételezett szerepét a későbbiekben

külön alfejezetben (6.2.4.) foglalom össze.

81

16. ábra: Validált gének eloszlása génontológiai kategóriákban a hippocampus területéről

A validált gének között sok olyat sikerült találnunk, melyeket korábban összefüggésbe

hoztak diabétesszel vagy különböző pszichiátriai zavarokkal, ill. neurológiai

kórképekkel. A CHI3L1 (kitináz 3-szerű fehérje 1) gént, mely modellünkben majd

ötszörös expressziócsökkenést mutatott, a 2-es típusú diabétesz új markereként említik,

amelynek kifejeződése a testtömeg-indextől függetlenül mutatott asszociációt a vizsgált

cukorbetegek körében (167). Emellett skizofréniában is sikerült asszociációt kimutatni

egy, a gén promoterében található SNP vizsgálata alapján (168). Az irodalmi adatok

szerint a gén a celluláris sejtválasz koordinációjában játszhat szerepet, melyet

valószínűsíthetően az ASK1 (apoptózis szignál szabályozó kináz 1) gátlásán keresztül

fejt ki. Jellemzően aktivált makrofágok szekretálják és döntően gyulladásos

folyamatokban játszik szerepet. Meg kell jegyezzük ugyanakkor, hogy ez az elmélet a

gén megnövekedett expressziójára vonatkozik.

A γ-synuclein (SNCG) a synucleinek családjába (α, β és γ) tartozik, melyek egymással

nagy homológiát mutató fehérjék és feltételezhetően szerepet játszanak a

neurotranszmisszió szabályozásában és nagy mennyiségben a preszinaptikus

Idegrendszerfejlődése, 2

Táplálkozásiviselkedés, 2

Oxidatív stressz/DNS károsodás/Sejt ciklus reguláció, 10

Inzulin / növekedési hormonszekréció, 2

Egyéb, 9

Lipid metabolizmus, 2

82

végződésben találhatók. Rendszerünkben nagymértékű csökkenést mutattunk ki a

hippocampus területén. Az α-synucleinről korábban már bebizonyították, hogy jelentős

mértékben közreműködik a monoamin-neurotranszmitter homeosztázis fenntartásában,

mégpedig a sejtfelszíni dopamin, szerotonin és noradrenalin-transzporterek

expressziójának szabályozásán keresztül. Kiemelkedő és jól dokumentált szerepet

játszik a Parkinson-kór patogenezisében (169). A γ-synuclein az α-val feltételezhetően

szinergista módon tölti be szerepét. Ezt támasztja alá, hogy sem az alfa-null, sem a

gamma-null génkiütött állatok nem mutattak nyilvánvaló magatartásbeli különbséget

sem a nyílt tér típusú tesztben (open field test) sem az „útvesztő” tesztben (T-maze).

Ugyanakkor a kettős génkiütött állatok hiperaktív viselkedést mutattak az open field és

alacsonyabb értéket értek el a T-maze tesztekben. Ezekben az állatokban

megnövekedett extracelluláris dopamin-koncentrációt lehetett kimutatni, melynek

hátterében a dopamin-felszabadulás fokozódását sejtik (170). A neurodegeneratív

betegségekben játszott szerepét támasztja alá, hogy az SNCG-t túltermelő transzgenikus

egerekben komoly, az öregedő agyra jellemző neuropatológiás elváltozások fejlődtek ki,

motoros deficitben szenvedtek és korán elpusztultak (171). Transzfekciós kísérlettel

támasztották alá a depresszióban betöltött szerepét; szerotonin receptorral

kotranszfektálva a szerotoninfelvétel a kifejeződő SNCG mennyiségének arányában

csökkent (172). Egy új publikáció pedig adipocitákban is kimutatta a gén jelenlétét,

amelynek kifejeződése korrelál a leptin expressziójával és az obezitás mértékével. Ezek

az eredmények is aláhúzzák, hogy a gamma-synuclein fontos szerepet játszhat a

zsírsejtek homeosztázisában. Sőt mi több, a fehérje mennyisége a sejtek érésével

párhuzamosan nőtt, ami valószínűsíti a γ-synuclein adipocita-differenciációban betöltött

szerepét is (173).

83

10. táblázat: Validált gének által érintett biokémiai útvonalak a hippocampusban A megnövekedett expressziójú gének piros, a csökkent expressziójú gének kék színnel vannak jelölve.

Kategória GO Biological processes /HIPPOCAMPUS Validált gének

Inzulin, növekedési hormon szekréció

GO:30073: inzulin szekréció GAL

GO:30252: növekedési hormon szekréció GAL

Oxidatív stressz, DNS-károsodás, Sejtciklus-szabályzás

GO:6950: stresszválasz GAL

GO:305: válasz oxigén gyökre CXCL4

GO:303: válasz szuperoxidra AKAP3

GO:302: válasz reaktív oxigén gyökökre GAL

GO:15992: proton transzport UCP2

GO:6977: válasz DNS károsodásra, p53-szerű sejtciklus blokkolók szignál transzdukciója PTPRV

GO:42770: válasz DNS károsodásra, szignál transzdukció FTCD GO:7346: mitotikus sejtciklus progressziójának regulációja SIK1

GO:6269: DNS replikáció, RNS primer szintézis PRIM1 GO:7089: mitotikus sejtciklus kezdő kontroll pontján való áthaladás CDK10

Lipid metabolizmus GO:1573: gangliozid metabolizmus GM2A

GO:6695: choleszterin bioszintézis ACAA2

Táplálkozasi viselkedés GO:7631: táplálkozási viselkedés GAL, AGRP

GO:42755: evési viselkedés AGRP

Idegrendszer fejlődése GO:7399: idegrendszer fejlődése

GAL , MOBP, CNTN3

GO:7422: perifériális idegrendszer fejlődése SNCG

Egyéb

GO:50776: immunválasz szabályozása GAL , IL22RA2

GO:6952: védekezési válasz MX2

GO:7194: adenin cikláz negatív szabályozása GRM2

GO:6032: kitin lebontás CHI3L1

GO:42572: retinol metabolizmus RETSAT

GO:45123: sejtkiáramlás ITGAM

GO:19637: organofoszfát metabolizmus PTER

GO:6928: sejt mozgékonyság AKAP3, GRM2

GO:9615: válasz vírusinfekcióra MX2, OAS1

84

6.2.2 A prefrontális kéreg validált expressziós változásai 2-es típusú diabétesz

modellben

Ami a prefrontális kéreg génexpressziójában bekövetkezett változásokat illeti,

megállapíthatjuk, hogy a leginkább érintett útvonalak a neurotranszmisszió és a lipid

metabolizmus tárgykörébe tartoznak (17. ábra).

17. ábra. Validált gének eloszlása génontológiai kategóriákban a prefrontális kéreg területén

Közülük említésre méltó egyes agyi jelátviteli útvonalak érintettsége, melyek

megváltozása fémjelezheti a DM2 agyi hatásait. Három olyan, a jelátvitelben érintett

gént (protein-kináz C gamma és epszilon, RET tirozin-kináz) sikerült kimutatnunk,

melyek kortikális expressziója számottevő eltérést mutatott a Goto-Kakizaki

patkányokban (11. táblázat). Korábban mindegyik gént összefüggésbe hozták bizonyos

neuropatofiziológiás folyamatokkal. A neuronspecifikus protein-kináz C gamma

izoformája (PRKCG), amely tanulási folyamatok szabályozásában és a memória

kialakulásában játszik szerepet, a GK patkányok prefrontális kérgében kétszeres

expressziós növekedést mutatott. Ezen gén bizonyos polimorfizmusai asszociációt

mutatnak diszinhibícióval (szégyen és zavar érzésének elvesztése, mely nem megfelelő,

illetlen viselkedést eredményez) és figyelemhiányos hiperaktivitás-zavarral (ADHD,

Egyéb, 10

Lipid metabolizmus, 2Neurotranszmisszió, 5

85

attention deficit hyperactivity disorder) emberi populációban. Mindemellett PKC-

gamma génkiütött egerekben impulzivitást, szorongást és kísérletes körülmények között

megnövekedett ad libitum alkoholfogyasztást mutattak ki (174).

Kiemelendő, hogy a protein-kináz C epszilon izoformája (PRKCE) is túltermelődött a

DM2 állatmodelljében. Erről a kinázról leírták, hogy szerepe van egyes ioncsatornák

aktiválásában, apoptotikus folyamatok szabályozásában és az inzulin exocitózisában is.

Béta-sejtekben összefüggésbe hozták a szekretált inzulinra adott válaszképesség

elvesztésével, amely a DM2 előszobájaként is értelmezhető (175). Bizonyított szerepe

van továbbá a drogfüggés kialakulásának patomechanizmusában és a

szenvedélybetegségek viselkedési aspektusában (176). Major depresszióban szenvedő

betegek postmortem agymintáiban a PRKCE csökkent fehérjeszintjét mutatták ki (177).

Végül a harmadik szignálpeptid, amelynél viszont a PKC-izoformáktól eltérően

csökkent expressziós változást sikerült kimutatnunk, a RET protoonkogén. Ez a gén egy

receptor tirozin-kinázt kódol, amely a cadherinek szupercsaládjába tartozik és sarkalatos

szerepe van a velősánc kialakulásában a központi idegrendszer embrionális fejlődése

során. Ez a szerep arra vezethető vissza, hogy a receptor legfontosabb ligandjai a

GDNF, egy glia eredetű növekedési faktorcsalád tagjai. A gén egy aminosavcserét

okozó mutációja (Met918Thr), amely a receptor konstitutív aktiválódását idézi elő, a

diabétesszel együtt járó 2B típusú multiplex endokrin neoplázia (MEN2B)

kialakulásához vezet (178). MEN2B knock-in egerekben – amelyekben a mutáció

hatására kialakuló konstitutív Ret-aktivitás hatását kívánták vizsgálni – meglepődve

tapasztalták, hogy a dopamin és metabolitjainak koncentrációja erőteljesen

megnövekedett. Emellett a tirozin-hidroxiláz fehérje mennyisége a striatumban és a

substantia nigraban megnőtt, illetve a striatalis dopamin-transzporter szintje is

növekedést mutatott. Mindemellett a kísérleti állatok kokainra adott válaszérzékenysége

is nőtt, ami jól korrelál a fent leírtakkal (179).

86

11. táblázat: Validált gének által érintett biokémiai útvonalak a prefrontális kéregben A megnövekedett expressziójú gének piros, a csökkent expressziójú gének kék színnel vannak jelölve.

Kategória GO Biological processes /PREFRONTÁLIS KÉREG Validált gének

neurotranszmisszió

GO:7611: tanulás és/vagy memória GALR2 , PRKCG, GM2A

GO:7268: szinaptikus transzmisszió GALR2 , PRKCG, GRM2

GO:1507: acetilkolin lebontás a szinaptikus résben COLQ

GO:1504: neurotranszmitter felvétel SLC17A6

GO:17158: kálcium ion-függő exocitózis szabályozása TRPV6

lipid metabolizmus GO:1573: gangliozid metabolizmus GM2A

GO:45332: foszfolipid transzlokáció ABCA1

egyéb

GO:9649: a cirkadián óra befoláyolása BHLHE40

GO:8228: opszonizáció CD47

GO:6032: kitin lebontás CHI3L1

GO:6547: hisztidin metabolizmus FTCD GO:7497: középbél kezdemény hátsó szakaszának fejlődése RET

GO:30277: gasztrointesztinális epitélium védelme TFF1

GO:6936: izom kontrakció GALR2 , LSP1

GO:19882: antigén prezentáció RT1-CE4, RT1-AW2

GO:9615: válasz vírus infekcióra OAS1

GO:7635: kemoszenzoros viselkedés PRKCG, PRKCE

6.2.3 3-as típusú diabétesz

A 3-as típusú diabétesz teóriáját illetően az adataink közt sikerült néhány olyan gént is

találnunk, amelyek kapcsolatot jelenthetnek a DM és a neurodegeneráció jelensége

között. A fent említett γ-synuclein mellett ebben az összefüggésben említést érdemel az

UCP2 (2-es típusú szétkapcsoló fehérje), az ABC transzporter ABCA1 és a sejtfelszíni

antigén CD47. Az UCP2 egy jól ismert mitokondriális membránfehérje, amely a

protoncsorgás szabályozásával szétkapcsolja az oxidatív foszforilációt a

mitokondriumban, csökkentve ezzel az ATP szintézisét, miközben hő termelődik. A

87

kisebb energiatermelés pedig a zsírsavszintézis csökkenéséhez és a lipolízis

fokozódásához vezethet. Az említett folyamatok alapján nem meglepő, hogy a gén

bizonyos polimorfizmusaival kapcsolatban asszociációt sikerült kimutatni elhízással,

diabétesszel és az inzulinszekréció szabályozásával (180). Ugyanakkor az UCP2

aktiválásán keresztül fejti ki hatását a ghrelin, ami a mitokondriális légzés, a

mitokondrium-biogenezis és a reaktív oxigéngyök-termelés befolyásolásához vezet, ami

neuroprotektív hatásként jelentkezik (181). Az UCP2 expressziója szignifikáns

csökkenést mutatott vizsgálatunkban hippocampusban a 2-es típusú diabétesz

modelljében, ami arra enged következtetni, hogy a diabéteszes agyban hiányzik az általa

közvetített neuroprotektív hatás.

Az ABCA1 koleszterinpumpa a sejtből történő koleszterin-kiáramlás legismertebb aktív

tényezője. Mutációja Tangier-betegséghez, gyorsult érelmeszesedéshez és szív-

érrendszeri megbetegedésekhez vezet. A betegségben szenvedők körében elvégzett

vizsgálat szerint a génnek szerepe lehet a pankreász béta-sejtek inzulinszekréciójának

modulálásában is (182). Néhány, a génben előforduló SNP-t sikerült kapcsolatba hozni

demenciával (rs2230805) (183) és Alzheimer-kórral (rs1800977 és rs2422493) (184).

Az ABCA1 tekintetében csökkent expressziós sikerült kimutatnunk Goto-Kakizaki

patkányokban a kontrollhoz képest a prefrontális kéreg területén, ami alapján logikailag

azt feltételezzük, hogy az ezzel együtt járó megnövekedett intracelluláris

koleszterinszint a neuronok túlélését csökkenti azáltal, hogy a plazmamembrán

rugalmasságának csökkentésén keresztül negatívan befolyásolja a membránba ágyazott

receptorok és ioncsatornák működését.

A CD47 gén egy olyan fehérjét kódol, amely sejtadhéziós folyamatokban játszik

szerepet és ezen keresztül a sejten belüli szabad kalciumszintet is megnövelheti. Számos

kísérleti adat támasztja alá a CD47 szerepét a pankreász béta-sejtek

inzulinszekréciójában (185). Emellett kimutatták, hogy sok más sejtfelszíni fehérje

mellett kötődik a béta-amiloid fehérjéhez Alzheimer-kórban (186). DM2-es állatainkban

mind a hippocampusban, mind a prefrontális kéregben megnövekedett CD47 mRNS-

szintet mutattunk ki, ami kézenfekvő kapcsolatot feltételez a centrális

inzulinrezisztencia és az Alzheimer típusú neurodegeneráció között.

88

6.2.4 A galanin és receptorai

A Goto-Kakizaki patkányok hippocampusában szignifikánsan emelkedett expressziót

mutató galanin neuropeptidről alapos okunk van feltételezni, hogy túlműködése szerepet

játszhat a diabéteszben fellépő agyi változások közvetítésében. A galanint számos egyéb

neuropeptidhez hasonlóan először a vékonybélből izolálták és klónozták, majd később

az agytörzs raphe és coeruleus magvaiban, illetve a limbikus rendszerben és

kimondottan a hippocampusban kotranszmitterként is megtalálták (187). Újabban a

hippocampus ún. extrinsic modulátor neuropeptidjeként említik, amely képes arra, hogy

a nagy piramissejtek moharostos szinapszisaiban a kolinerg, noradrenerg, szerotoninerg

és glutamáterg beidegzés által létrehozott excitátoros poszt-szinaptikus potenciálok

létrejöttét és ezáltal a tanulás folyamatát gátolja (187). Ezzel összhangban kimutatták,

hogy a galanin intracerebroventriculáris, vagy közvetlenül a hippocampusba adott

infúziója a hippocampushoz kötött tanulási folyamatot, a rövid távú asszociációk és a

hosszú távú memória kialakulását is gátolja (188). Figyelemreméltó, hogy a galanin az

acetilkolin-felszabadulás gátlásával képes lehet az Alzheimer-kórban észlelt globális

agyi acetilkolin-hiányt előidézni, sőt a galaninreceptorok számának növekedését is

kimutatták. A galanin túlsúly és memóriakárosodás közvetlen kapcsolatát az is

alátámasztja, hogy a galanin receptor-antagonista peptidekkel kezelt állatok kognitív

teljesítőképessége számottevően javult, illetve a galanint túltermelő génmanipulált

állatok a térbeli tájékozódást és memóriát kívánó „útvesztő” kísérletek során rendre

alulteljesítettek vad típusú társaikhoz képest (188). Érdekes módon a galanin génkiütött

egereken nem annyira a tanulási folyamatok csökkent hatékonyságát, hanem az étvágy

és a táplálékfelvétel csökkenését figyelték meg (189).

A galanin hatásait G-fehérjékhez kapcsolt membrán receptorok közvetítik. Három

ismert receptora közül az általában idegvégződéseken lokalizálódó 1-es és 3-as típusúak

egyértelműen gátló hatásúak a cAMP szint csökkenése és a CREB transzkripciós faktort

aktiváló foszforilációs folyamat elmaradása, valamint egy káliumcsatorna aktiválásával

kapcsolatos hiperpolarizáció miatt. Ezen receptorok aktiválása a neurotranszmitter-

leadás gátlásához vezet (190). Ezzel szemben a 2-es típusú receptor túlnyomórészt a

neuronok sejttestjén expresszálódik és kalcium-jelen keresztül depolarizációt és

aktiválást, illetve a túlélési jelet aktiválva az apoptótikus kaszpázok gátlását

eredményezi (191). Feltételezik, hogy az Alzheimer-kórban észlelt galanin és 2-es

89

típusú galanin receptor túlprodukció a megmaradt kolinerg neuronok túlélését

szolgálhatja, egyfajta védő, antiapoptotikus, neurotróf funkciót tölt be. Ezzel

összefüggésben megfigyelték, hogy az 1-es és 3-as típusú galanin receptorok

agonistáival állatkísérletekben depresszív tüneteket lehetett kiváltani, ugyanakkor a 2-es

típusú receptorok stimulációja antidepresszív hatást eredményezett (192).

Elgondolkodtató, hogy a kísérletesen előidézett agyi inzulinhiány (agykamrákba adott

streptozotocin-injekció) kísértetiesen hasonlít a galanin túltermelésével kiváltott

centrális tünetegyüttesre: mindkét esetben a kognitív funkciók hanyatlásával, az étvágy

és táplálékfelvétel növekedésével, valamint depresszióval állunk szemben (193).

Véleményem szerint a klinikai kép ilyetén átfedése miatt elképzelhető, hogy az agyi

inzulinhatás kieséséből fakadó tünetek kialakulásáért részben vagy egészben az általunk

elsőként leírt fokozott agyi galanin expresszió lehet a felelős.

90

(agyi) inzulinhiány

(194) (195)

diabétesz (196-198) galanin

18. ábra A cukorbetegség összefüggése az agyi inzulin és galanin aktivitással. A tengelyeken feltüntetett számok az irodalmi hivatkozásokra utalnak; részletesebb magyarázatot lásd a szövegben.

Hipotézisünk szerint (18. ábra) szoros összefüggés van a diabétesz, az (agyi)

inzulinhiány és a galanin termelés között, amit a következő irodalmi adatok is

alátámasztanak:

1. 2-es típusú diabéteszben centrális inzulinrezisztencia alakul ki, többek között

erősen lecsökken az inzulin kötődése a vér-agy gát inzulin receptoraihoz (194);

2. a galanin erősen csökkenti a béta-sejtek inzulinszekrécióját. Ezt a hatást

valószínűleg az 1-es típusú galanin receptorok aktiválta káliumcsatorna okozta

membrán-hiperpolarizáció közvetíti (195);

3. a galanin plazmakoncentrációja számottevően emelkedik 2-es típusú

cukorbetegségben, illetve egészséges fiatal egyéneken végzett orális

glukóztolerancia-teszt esetén a plazma galanin szintje kifejezett emelkedést

mutat (196, 197);

4. 1-es típusú cukorbetegségben emelkedett galanin szintek mérhetők a ganglion

coeliacumban (198).

Ezeket a faktorokat szervesen kiegészíti saját kísérleti eredményünk, a hippocampus

galanin szintjének emelkedése 2-es típusú diabétesz modellben. Amennyiben

feltételezzük, hogy a pankreász béta-sejtjeihez hasonlóan a galanin az agyban is

91

csökkenti az inzulin elválasztását, akár egy önrontó kör is kialakulhat, mert az

inzulinhiány okozta galanin túlsúly az agy saját inzulintermelésének további

csökkenését eredményezi.

A diabétesz és a fokozott agyi galanin expresszió kapcsolatának bizonyítása

szükségessé teszi a galanin gén promoterét szabályzó transzkripciós faktorok, illetve a

preprogalanin peptid proteolízisét végző enzimek szabályzásának vizsgálatát is.

Amennyiben sikerülne bizonyítani az agyi inzulinhiány oki szerepét a galanin fokozott

expressziójának hátterében, akkor a galanin receptorok farmakológiai modulációjával

tompíthatnánk az inzulin központi idegrendszeri hiányából fakadó tüneteket, illetve

lehetőség nyílna az Alzheimer kórhoz vezető „3-as típusú diabétesz” progressziójának

lassítására, sőt talán megállítására is.

92

7 KÖVETKEZTETÉSEK

A cukorbetegséggel komorbid depresszió egyik lehetséges kandidáns génjének, a

P2RX7 új funkcionális polimorfizmusainak vizsgálatakor a következő célkitűzéseket

sikerült teljesítenünk:

1. In silico adatbázis kutatás segítségével a P2RX7 gén 3’ nem kódoló régiójában 3

olyan SNP-t sikerült találnunk, melyek megakadályozhatják vagy előidézhetik a

megfelelő miRNS kötődését, ezáltal molekuláris szinten befolyásolva a

transzkriptum kifejeződését.

2. A leggyakoribb P2RX7 miRNS-kötőhely polimorfizmus (rs1653625) populációs

vizsgálatához sikerült egy új módszert kidolgoznunk. Mivel a vizsgált szakasz

genotipizálás szempontjából problémásnak bizonyult, vizsgálata egyik

konvencionális és költséghatékony módszerrel sem volt megoldható, azonban

módosított primerekkel beállítottunk egy restrikciós fragmenthossz-

polimorfizmuson alapuló módszert, amellyel az egyes genotípusok biztonsággal

elkülöníthetővé váltak.

3. Genetikai asszociáció vizsgálattal szignifikáns összefüggést mutattunk ki az

rs1653625 SNP A-allélja és a depresszió súlyossága között mind a pszichiátriai,

mind a diabéteszes betegcsoportban. Kimutattuk, hogy a vizsgált miRNS-

kötőhely polimorfizmus kapcsoltságban van a gén egy korábban vizsgált,

aminosavcserét okozó SNP-jével (Gln460Arg, ahol a G = Arg allél tekinthető

rizikó faktornak). A haplotípus elemzésünk kimutatta, hogy az rs1653625 A-

allélja a Gln460Arg A-allélja mellett is hatással van a fenotípusra, de a

legerősebb hatást a két rizikó allél együttes jelenléte (Gln460Arg G-allél és

rs1653625 A-allél kombinációja) adja.

A diabétesz mellitusz idegrendszerre gyakorolt hatásának molekuláris szintű

vizsgálatához patkánymodelleket alkalmaztunk. Az állatok egyes agyrégiójának

génexpressziós profilját megvizsgálva a következő célkitűzéseket sikerült

megvalósítanunk:

1. Teljes genomi expressziós microarray vizsgálatunk eredményeként sikerült

szignifikáns transzkripciós eltérést kimutatnunk 2-es típusú diabétesz modell

93

agyszövetében kontroll állatokhoz képest. A Goto-Kakizaki beltenyésztett

patkánytörzs agyi expressziós profilja jelentős eltéréseket mutatott, míg a

streptozotocin kezelt állatok, melyek az 1-es típusú diabétesz modelljeként

szolgáltak, elhanyagolhatóan kis változást mutattak. Ismereteink szerint először

végeztük el a diabétesznek az agyszövet génexpressziójára gyakorolt hatásának

vizsgálatát teljes genomi megközelítésben microarray segítségével.

2. Vizsgálatunkat a diabétesz által valószínűsíthetően leginkább érintett

agyrégiókon végeztük el. A kimutatott változások elsősorban a hippocampust és

a prefrontális kéreg területét érintették, nagyrészük az adott régióra specifikus

génexpressziós profilt mutat. A striatumban kimutatott változások mértéke

elenyésző volt, és egyikük sem régióspecifikus.

3. Az expressziós változást mutató gének a hippocampus esetében az oxidatív

stressz, a DNS-károsodás, immunfolyamatok, a sejtciklus regulációja, a központi

idegrendszer fejlődése, a lipidmetabolizmus és a táplálkozási viselkedés

biokémiai útvonalaiban dúsultak fel leginkább. A prefrontális kéreg esetében

ezek az útvonalak a neurotranszmisszió és a lipid metabolizmus tárgykörébe

tartoznak valamint érintettek még bizonyos agyi szignalizációs útvonalak,

melyek összefüggésbe hozhatók 2-es típusú diabétesszel. Mindkét régiót

tekintve kiemelkedik a galanin és receptora (GALR2) érintettsége. A galaniról –

számos, az idegrendszerben leírt hatását figyelembe véve - alapos okunk van

feltételezni, hogy túlműködése szerepet játszhat a diabéteszben fellépő agyi

változások közvetítésében. Jelen tudásunk szerint először írtuk le a centrális

galanin megnövekedett expresszióját diabéteszben. Eredményeink egyrészt

alátámasztják azokat az irodalmi adatokat, amelyek az agyműködés molekuláris

szintű megváltozását taglalják, másrészt új megfigyelésként a galanin

megkülönböztetett szerepére hívtuk fel a fegyelmet.

94

8 ÖSSZEFOGLALÁS

Az elmúlt évek érdekes, epidemiológiai vizsgálatok eredményeként leírt

megfigyelése, hogy cukorbetegek körében kétszer gyakoribb a depresszió előfordulása

az átlagpopulációhoz képest. Jelen munkámban a diabétesz mellitusz és a komorbid

depresszió egy feltételezett genetikai háttértényezőjének vizsgálatát és a lehetséges

patomechanizmusok egy új szemszögből való megközelítését mutatom be.

Laboratóriumunk korábbi vizsgálatainak eredményeként a P2RX7 gén utolsó

exonjának aminosavcserét okozó polimorfizmusa (Gln460Arg) és a depresszió

súlyosságát mérő kérdőívek között szignifikáns összefüggést kaptunk depressziós

betegekben és cukorbetegekben. Hipotézisünk szerint elképzelhető, hogy valójában nem

is a kódoló rész vége felé elhelyezkedő exon polimorfizmus, hanem az ezt követő 3’

nem kódoló régióban található mikroRNS kötődést befolyásoló SNP felelős a hatásért.

A vizsgálni kívánt szakasz genotipizálás szempontjából problémásnak bizonyult, ezért

kifejlesztettünk egy restrikciós fragmenthossz analízisen alapuló módszert a P2RX7 3’

régióban található polimorfizmus meghatározására, majd ezt felhasználtuk az

asszociáció analízis elvégzésére. Előzetesnek tekinthető eredményeink alapján a

vizsgált miRNS kötőhely polimorfizmus kapcsoltságban áll az exon polimorfizmussal

és erős asszociációt mutat a depresszió súlyosságával.

A dolgozat másik felében a cukorbetegség egy új aspektusból való megközelítését

mutatom be. Mivel ez a jelenség elsősorban tüneti szinten ismert, a molekuláris hátteret

általánosabb kérdésfeltevéssel próbáltuk megközelíteni: diabétesz mellitusz

patkánymodell egyes agyterületeinek génexpressziós változásait vizsgáltuk teljes

genomi megközelítésben. Az adatok kiértékelése során látványos eltérést sikerült

kimutatnunk a 2-es típusú diabétesz mellitusz modell agyi expressziós profiljában

kontroll állatokhoz képest. A hippocampusban és a prefrontális kéregben kimutatott

változások egyrészt alátámasztják az irodalomban 3-as típusú diabéteszként aposztrofált

jelenség molekuláris hátterét, másrészt új géneket is sikerült azonosítanunk. Az

útvonalelemzések fényt derítettek arra, hogy az eltérést mutató gének elsősorban a

neuronok lipidanyagcseréjével, szignáltranszdukciós folyamataival, az apoptózis

jelpályáival és a neurotranszmisszióval kapcsolatosak, ami jól megfeleltethető a

cukorbetegségben észlelhető agyi funkcionális eltéréseknek. A változást mutató gének

95

közül kiemelkedő jelentőségűnek tűnik a galanin, egy gátló neuropeptid, mely

emelkedett expressziót mutat a hippocampusban. A szakirodalomból jól ismert, hogy a

galanin túltermelése kognitív deficitet, fokozott táplálékfelvételt és depresszív tüneteket

okoz, amelyek gyakorlatilag megegyeznek az agyi inzulinhiány tüneteivel.

Eredményeink molekuláris szinten támasztják alá, hogy a 2-es típusú diabétesz

mellitusz hatással van az agyműködésre is. Legjobb tudásunk szerint a szakirodalom

szerint elsőként vizsgálatuk, az agy teljes genomi szintű expressziós profiljának

megváltozását cukorbetegségben.

96

9 SUMMARY

The results of the latest epidemiological studies show that depression is twice as

frequent amongst diabetic patients compared to the control population. In this work I

present our genetic analysis of a new candidate gene of depression and I make an

attempt to highlight the possible pathomechanisms of the comorbidity of depression and

diabetes mellitus from a different point of view.

In our previous genetic studies, significant association was found between a non-

synonymous polymorphism in the last exon of the P2RX7 gene (Gln460Arg) and

depression severity among patients with diabetes mellitus and among patients with

major or bipolar depression. According to our hypothesis, it might be possible that a

SNP in the 3’ non-coding region, that influences microRNA binding, is responsible for

the above mentioned genetic effect and not the exon polymorphism located at the end of

the coding sequence. Therefore, we searched for polymorphisms in putative miRNA

target sites in the 3’ untranslated region of the P2RX7 gene. However, the identified

SNP (rs1653625) subsided in a methodologically problematic region of the P2RX7 3’

region, therefore, we developed a method based on restriction fragment length analysis

in order to genotype this polymorphism. We successfully used this genotyping method

to perform the genetic association analysis, which indicated an association of the

studied miRNA binding site polymorphism with depression severity.

The second part of my thesis aims to study the central nervous system complications of

diabetes mellitus. We aimed to study the molecular background of this issue with a

generalized approach: we assayed gene expression changes in specific brain regions of a

rat model of diabetes mellitus. After evaluating the whole genome expression data, we

could detect significant changes in the expression profile of specific brain regions of

type 2 diabetes mellitus model compared to the controls. On the one hand, the changes

detected in the hippocampus and the prefrontal cortex support the molecular

background of the so-called type 3 diabetes. On the other hand, we managed to identify

new genes in the pathomechanisms of diabetes mellitus. The pathway analyses showed

that genes with altered expression level were connected to the lipid metabolism, signal

transduction processes, apoptosis signaling pathways, and neurotransmission. All of

these pathways can be related to the previously described discrepancies in the brain due

97

to diabetic complications. Among the genes showing altered expression, galanin (an

inhibitory neuropeptide) seems to be of utmost importance. Galanin showed up-

regulation in the hippocampus of our type 2 diabetes model, and it is known that the

overproduction of galanin leads to cognitive deficit, it also increases nutrient intake and

causes depressive symptoms. These symptoms highly overlap with the symptoms

described in the absence of insulin in the brain. Therefore, our results prove that type 2

diabetes mellitus can affect the brain on a molecular level. As far as we know, our

expression assay was the first one that analyzed whole genome expression profile

changes in specific brain regions of diabetes mellitus animal models.

98

10 IRODALOMJEGYZÉK

1. Field LL. (2002) Genetic linkage and association studies of Type I diabetes:

challenges and rewards. Diabetologia, 45(1):21-35.

2. Florez JC, Hirschhorn J, Altshuler D. (2003) The inherited basis of diabetes

mellitus: implications for the genetic analysis of complex traits. Annu Rev Genomics

Hum Genet, 4:257-291.

3. Hyttinen V, Kaprio J, Kinnunen L, Koskenvuo M, Tuomilehto J. (2003) Genetic

liability of type 1 diabetes and the onset age among 22,650 young Finnish twin pairs: a

nationwide follow-up study. Diabetes, 52(4):1052-1055.

4. Poulsen P, Kyvik KO, Vaag A, Beck-Nielsen H. (1999) Heritability of type II

(non-insulin-dependent) diabetes mellitus and abnormal glucose tolerance--a

population-based twin study. Diabetologia, 42(2):139-145.

5. Association AP. Diagnostic and statistical manual of mental disorders 4th edition.

Washington, DC: American Psychiatric Press; 1994.

6. Kelsoe JR. (2003) Arguments for the genetic basis of the bipolar spectrum. J Affect

Disord, 73(1-2):183-197.

7. McGuffin P, Rijsdijk F, Andrew M, Sham P, Katz R, Cardno A. (2003) The

heritability of bipolar affective disorder and the genetic relationship to unipolar

depression. Arch Gen Psychiatry, 60(5):497-502.

8. Sullivan PF, Neale MC, Kendler KS. (2000) Genetic epidemiology of major

depression: review and meta-analysis. Am J Psychiatry, 157(10):1552-1562.

9. Anderson RJ, Freedland KE, Clouse RE, Lustman PJ. (2001) The prevalence of

comorbid depression in adults with diabetes: a meta-analysis. Diabetes Care,

24(6):1069-1078.

10. Ciechanowski PS, Katon WJ, Russo JE. (2000) Depression and diabetes: impact of

depressive symptoms on adherence, function, and costs. Arch Intern Med,

160(21):3278-3285.

11. Lustman P, Carney R, Amado H. (1981) Acute stress and metabolism in diabetes.

Diabetes Care, 4(6):658-659.

99

12. Testa MA, Simonson DC. (1998) Health economic benefits and quality of life

during improved glycemic control in patients with type 2 diabetes mellitus: a

randomized, controlled, double-blind trial. JAMA, 280(17):1490-1496.

13. Lustman PJ, Griffith LS, Freedland KE, Clouse RE. (1997) The course of major

depression in diabetes. Gen Hosp Psychiatry, 19(2):138-143.

14. Fisher L, Chesla CA, Mullan JT, Skaff MM, Kanter RA. (2001) Contributors to

depression in Latino and European-American patients with type 2 diabetes. Diabetes

Care, 24(10):1751-1757.

15. Peyrot M, Rubin RR. (1997) Levels and risks of depression and anxiety

symptomatology among diabetic adults. Diabetes Care, 20(4):585-590.

16. Everson-Rose SA, Meyer PM, Powell LH, Pandey D, Torrens JI, Kravitz HM,

Bromberger JT, Matthews KA. (2004) Depressive symptoms, insulin resistance, and

risk of diabetes in women at midlife. Diabetes Care, 27(12):2856-2862.

17. Musselman DL, Betan E, Larsen H, Phillips LS. (2003) Relationship of depression

to diabetes types 1 and 2: epidemiology, biology, and treatment. Biol Psychiatry,

54(3):317-329.

18. Musselman DL DC, Nathan KI, Kilts CD, Schatzberg AF, Nemeroff CB. Biology

of mood disorders. In: Schatzberg AF NC, editor. American Psychiatric Press Textbook

of Psychopharmacology. 2nd edition ed. Washington DC: Apa Press; 1998. p. 550-588.

19. Martinot JL, Hardy P, Feline A, Huret JD, Mazoyer B, Attar-Levy D, Pappata S,

Syrota A. (1990) Left prefrontal glucose hypometabolism in the depressed state: a

confirmation. Am J Psychiatry, 147(10):1313-1317.

20. Gamberino WC, Brennan WA, Jr. (1994) Glucose transporter isoform expression

in Huntington's disease brain. J Neurochem, 63(4):1392-1397.

21. Simpson IA, Chundu KR, Davies-Hill T, Honer WG, Davies P. (1994) Decreased

concentrations of GLUT1 and GLUT3 glucose transporters in the brains of patients with

Alzheimer's disease. Ann Neurol, 35(5):546-551.

22. Kent S, Bluthe RM, Kelley KW, Dantzer R. (1992) Sickness behavior as a new

target for drug development. Trends Pharmacol Sci, 13(1):24-28.

23. Frommberger UH, Bauer J, Haselbauer P, Fraulin A, Riemann D, Berger M. (1997)

Interleukin-6-(IL-6) plasma levels in depression and schizophrenia: comparison

100

between the acute state and after remission. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci,

247(4):228-233.

24. Fried SK, Bunkin DA, Greenberg AS. (1998) Omental and subcutaneous adipose

tissues of obese subjects release interleukin-6: depot difference and regulation by

glucocorticoid. J Clin Endocrinol Metab, 83(3):847-850.

25. Fernandez-Real JM, Vayreda M, Richart C, Gutierrez C, Broch M, Vendrell J,

Ricart W. (2001) Circulating interleukin 6 levels, blood pressure, and insulin sensitivity

in apparently healthy men and women. J Clin Endocrinol Metab, 86(3):1154-1159.

26. Hotamisligil GS, Peraldi P, Budavari A, Ellis R, White MF, Spiegelman BM.

(1996) IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-

alpha- and obesity-induced insulin resistance. Science, 271(5249):665-668.

27. Schildkraut JJ, Kety SS. (1967) Biogenic amines and emotion. Science,

156(3771):21-37.

28. Nestler EJ, Barrot M, DiLeone RJ, Eisch AJ, Gold SJ, Monteggia LM. (2002)

Neurobiology of depression. Neuron, 34(1):13-25.

29. Traskman L, Asberg M, Bertilsson L, Sjostrand L. (1981) Monoamine metabolites

in CSF and suicidal behavior. Arch Gen Psychiatry, 38(6):631-636.

30. Lasky-Su JA, Faraone SV, Glatt SJ, Tsuang MT. (2005) Meta-analysis of the

association between two polymorphisms in the serotonin transporter gene and affective

disorders. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet, 133B(1):110-115.

31. Walther DJ, Peter JU, Bashammakh S, Hortnagl H, Voits M, Fink H, Bader M.

(2003) Synthesis of serotonin by a second tryptophan hydroxylase isoform. Science,

299(5603):76.

32. Zhang X, Gainetdinov RR, Beaulieu JM, Sotnikova TD, Burch LH, Williams RB,

Schwartz DA, Krishnan KR, Caron MG. (2005) Loss-of-function mutation in

tryptophan hydroxylase-2 identified in unipolar major depression. Neuron, 45(1):11-16.

33. Van Den Bogaert A, De Zutter S, Heyrman L, Mendlewicz J, Adolfsson R, Van

Broeckhoven C, Del-Favero J. (2005) Response to Zhang et al (2005): loss-of-function

mutation in tryptophan hydroxylase-2 identified in unipolar major Depression. Neuron

45, 11-16. Neuron, 48(5):704; author reply 705-706.

101

34. De Luca V, Likhodi O, Van Tol HH, Kennedy JL, Wong AH. (2005) Tryptophan

hydroxylase 2 gene expression and promoter polymorphisms in bipolar disorder and

schizophrenia. Psychopharmacology (Berl), 183(3):378-382.

35. Levinson DF. (2006) The genetics of depression: a review. Biol Psychiatry,

60(2):84-92.

36. Claes S. (2009) Glucocorticoid receptor polymorphisms in major depression. Ann

N Y Acad Sci, 1179:216-228.

37. Tringer L. A pszichiátria tankönyve. Budapest: Semmelweis Kiadó; 2001. 574 p.

38. Srinivasan V, De Berardis D, Shillcutt SD, Brzezinski A. (2012) Role of melatonin

in mood disorders and the antidepressant effects of agomelatine. Expert Opin Investig

Drugs.

39. Frayling TM. (2007) Genome-wide association studies provide new insights into

type 2 diabetes aetiology. Nat Rev Genet, 8(9):657-662.

40. Redondo MJ, Fain PR, Eisenbarth GS. (2001) Genetics of type 1A diabetes. Recent

Prog Horm Res, 56:69-89.

41. Vafiadis P, Bennett ST, Todd JA, Nadeau J, Grabs R, Goodyer CG,

Wickramasinghe S, Colle E, Polychronakos C. (1997) Insulin expression in human

thymus is modulated by INS VNTR alleles at the IDDM2 locus. Nat Genet, 15(3):289-

292.

42. Barratt BJ, Payne F, Lowe CE, Hermann R, Healy BC, Harold D, Concannon P,

Gharani N, McCarthy MI, Olavesen MG, McCormack R, Guja C, Ionescu-Tirgoviste C,

Undlien DE, Ronningen KS, Gillespie KM, Tuomilehto-Wolf E, Tuomilehto J, Bennett

ST, Clayton DG, Cordell HJ, Todd JA. (2004) Remapping the insulin gene/IDDM2

locus in type 1 diabetes. Diabetes, 53(7):1884-1889.

43. Nistico L, Buzzetti R, Pritchard LE, Van der Auwera B, Giovannini C, Bosi E,

Larrad MT, Rios MS, Chow CC, Cockram CS, Jacobs K, Mijovic C, Bain SC, Barnett

AH, Vandewalle CL, Schuit F, Gorus FK, Tosi R, Pozzilli P, Todd JA. (1996) The

CTLA-4 gene region of chromosome 2q33 is linked to, and associated with, type 1

diabetes. Belgian Diabetes Registry. Hum Mol Genet, 5(7):1075-1080.

44. Ueda H, Howson JM, Esposito L, Heward J, Snook H, Chamberlain G, Rainbow

DB, Hunter KM, Smith AN, Di Genova G, Herr MH, Dahlman I, Payne F, Smyth D,

102

Lowe C, Twells RC, Howlett S, Healy B, Nutland S, Rance HE, Everett V, Smink LJ,

Lam AC, Cordell HJ, Walker NM, Bordin C, Hulme J, Motzo C, Cucca F, Hess JF,

Metzker ML, Rogers J, Gregory S, Allahabadia A, Nithiyananthan R, Tuomilehto-Wolf

E, Tuomilehto J, Bingley P, Gillespie KM, Undlien DE, Ronningen KS, Guja C,

Ionescu-Tirgoviste C, Savage DA, Maxwell AP, Carson DJ, Patterson CC, Franklyn JA,

Clayton DG, Peterson LB, Wicker LS, Todd JA, Gough SC. (2003) Association of the

T-cell regulatory gene CTLA4 with susceptibility to autoimmune disease. Nature,

423(6939):506-511.

45. Bottini N, Musumeci L, Alonso A, Rahmouni S, Nika K, Rostamkhani M,

MacMurray J, Meloni GF, Lucarelli P, Pellecchia M, Eisenbarth GS, Comings D,

Mustelin T. (2004) A functional variant of lymphoid tyrosine phosphatase is associated

with type I diabetes. Nat Genet, 36(4):337-338.

46. Smyth D, Cooper JD, Collins JE, Heward JM, Franklyn JA, Howson JM, Vella A,

Nutland S, Rance HE, Maier L, Barratt BJ, Guja C, Ionescu-Tirgoviste C, Savage DA,

Dunger DB, Widmer B, Strachan DP, Ring SM, Walker N, Clayton DG, Twells RC,

Gough SC, Todd JA. (2004) Replication of an association between the lymphoid

tyrosine phosphatase locus (LYP/PTPN22) with type 1 diabetes, and evidence for its

role as a general autoimmunity locus. Diabetes, 53(11):3020-3023.

47. Vella A, Cooper JD, Lowe CE, Walker N, Nutland S, Widmer B, Jones R, Ring

SM, McArdle W, Pembrey ME, Strachan DP, Dunger DB, Twells RC, Clayton DG,

Todd JA. (2005) Localization of a type 1 diabetes locus in the IL2RA/CD25 region by

use of tag single-nucleotide polymorphisms. Am J Hum Genet, 76(5):773-779.

48. Lowe CE, Cooper JD, Brusko T, Walker NM, Smyth DJ, Bailey R, Bourget K,

Plagnol V, Field S, Atkinson M, Clayton DG, Wicker LS, Todd JA. (2007) Large-scale

genetic fine mapping and genotype-phenotype associations implicate polymorphism in

the IL2RA region in type 1 diabetes. Nat Genet, 39(9):1074-1082.

49. Qu HQ, Montpetit A, Ge B, Hudson TJ, Polychronakos C. (2007) Toward further

mapping of the association between the IL2RA locus and type 1 diabetes. Diabetes,

56(4):1174-1176.

50. Winckler W, Weedon MN, Graham RR, McCarroll SA, Purcell S, Almgren P,

Tuomi T, Gaudet D, Bostrom KB, Walker M, Hitman G, Hattersley AT, McCarthy MI,

103

Ardlie KG, Hirschhorn JN, Daly MJ, Frayling TM, Groop L, Altshuler D. (2007)

Evaluation of common variants in the six known maturity-onset diabetes of the young

(MODY) genes for association with type 2 diabetes. Diabetes, 56(3):685-693.

51. Sandhu MS, Weedon MN, Fawcett KA, Wasson J, Debenham SL, Daly A, Lango

H, Frayling TM, Neumann RJ, Sherva R, Blech I, Pharoah PD, Palmer CN, Kimber C,

Tavendale R, Morris AD, McCarthy MI, Walker M, Hitman G, Glaser B, Permutt MA,

Hattersley AT, Wareham NJ, Barroso I. (2007) Common variants in WFS1 confer risk

of type 2 diabetes. Nat Genet, 39(8):951-953.

52. Altshuler D, Hirschhorn JN, Klannemark M, Lindgren CM, Vohl MC, Nemesh J,

Lane CR, Schaffner SF, Bolk S, Brewer C, Tuomi T, Gaudet D, Hudson TJ, Daly M,

Groop L, Lander ES. (2000) The common PPARgamma Pro12Ala polymorphism is

associated with decreased risk of type 2 diabetes. Nat Genet, 26(1):76-80.

53. Nielsen EM, Hansen L, Carstensen B, Echwald SM, Drivsholm T, Glumer C,

Thorsteinsson B, Borch-Johnsen K, Hansen T, Pedersen O. (2003) The E23K variant of

Kir6.2 associates with impaired post-OGTT serum insulin response and increased risk

of type 2 diabetes. Diabetes, 52(2):573-577.

54. Florez JC, Burtt N, de Bakker PI, Almgren P, Tuomi T, Holmkvist J, Gaudet D,

Hudson TJ, Schaffner SF, Daly MJ, Hirschhorn JN, Groop L, Altshuler D. (2004)

Haplotype structure and genotype-phenotype correlations of the sulfonylurea receptor

and the islet ATP-sensitive potassium channel gene region. Diabetes, 53(5):1360-1368.

55. Dawn Teare M, Barrett JH. (2005) Genetic linkage studies. Lancet,

366(9490):1036-1044.

56. Zeggini E, Weedon MN, Lindgren CM, Frayling TM, Elliott KS, Lango H,

Timpson NJ, Perry JR, Rayner NW, Freathy RM, Barrett JC, Shields B, Morris AP,

Ellard S, Groves CJ, Harries LW, Marchini JL, Owen KR, Knight B, Cardon LR,

Walker M, Hitman GA, Morris AD, Doney AS, McCarthy MI, Hattersley AT. (2007)

Replication of genome-wide association signals in UK samples reveals risk loci for type

2 diabetes. Science, 316(5829):1336-1341.

57. Ferreira MA, O'Donovan MC, Meng YA, Jones IR, Ruderfer DM, Jones L, Fan J,

Kirov G, Perlis RH, Green EK, Smoller JW, Grozeva D, Stone J, Nikolov I, Chambert

K, Hamshere ML, Nimgaonkar VL, Moskvina V, Thase ME, Caesar S, Sachs GS,

104

Franklin J, Gordon-Smith K, Ardlie KG, Gabriel SB, Fraser C, Blumenstiel B, Defelice

M, Breen G, Gill M, Morris DW, Elkin A, Muir WJ, McGhee KA, Williamson R,

MacIntyre DJ, MacLean AW, St CD, Robinson M, Van Beck M, Pereira AC,

Kandaswamy R, McQuillin A, Collier DA, Bass NJ, Young AH, Lawrence J, Ferrier

IN, Anjorin A, Farmer A, Curtis D, Scolnick EM, McGuffin P, Daly MJ, Corvin AP,

Holmans PA, Blackwood DH, Gurling HM, Owen MJ, Purcell SM, Sklar P, Craddock

N. (2008) Collaborative genome-wide association analysis supports a role for ANK3

and CACNA1C in bipolar disorder. Nat Genet, 40(9):1056-1058.

58. Liu Y, Blackwood DH, Caesar S, de Geus EJ, Farmer A, Ferreira MA, Ferrier IN,

Fraser C, Gordon-Smith K, Green EK, Grozeva D, Gurling HM, Hamshere ML,

Heutink P, Holmans PA, Hoogendijk WJ, Hottenga JJ, Jones L, Jones IR, Kirov G, Lin

D, McGuffin P, Moskvina V, Nolen WA, Perlis RH, Posthuma D, Scolnick EM, Smit

AB, Smit JH, Smoller JW, St Clair D, van Dyck R, Verhage M, Willemsen G, Young

AH, Zandbelt T, Boomsma DI, Craddock N, O'Donovan MC, Owen MJ, Penninx BW,

Purcell S, Sklar P, Sullivan PF. (2011) Meta-analysis of genome-wide association data

of bipolar disorder and major depressive disorder. Mol Psychiatry, 16(1):2-4.

59. Morissette J, Villeneuve A, Bordeleau L, Rochette D, Laberge C, Gagne B, Laprise

C, Bouchard G, Plante M, Gobeil L, Shink E, Weissenbach J, Barden N. (1999)

Genome-wide search for linkage of bipolar affective disorders in a very large pedigree

derived from a homogeneous population in quebec points to a locus of major effect on

chromosome 12q23-q24. Am J Med Genet, 88(5):567-587.

60. Shink E, Morissette J, Sherrington R, Barden N. (2005) A genome-wide scan

points to a susceptibility locus for bipolar disorder on chromosome 12. Mol Psychiatry,

10(6):545-552.

61. Abkevich V, Camp NJ, Hensel CH, Neff CD, Russell DL, Hughes DC, Plenk AM,

Lowry MR, Richards RL, Carter C, Frech GC, Stone S, Rowe K, Chau CA, Cortado K,

Hunt A, Luce K, O'Neil G, Poarch J, Potter J, Poulsen GH, Saxton H, Bernat-Sestak M,

Thompson V, Gutin A, Skolnick MH, Shattuck D, Cannon-Albright L. (2003)

Predisposition locus for major depression at chromosome 12q22-12q23.2. Am J Hum

Genet, 73(6):1271-1281.

62. Barden N, Harvey M, Gagne B, Shink E, Tremblay M, Raymond C, Labbe M,

Villeneuve A, Rochette D, Bordeleau L, Stadler H, Holsboer F, Muller-Myhsok B.

105

(2006) Analysis of single nucleotide polymorphisms in genes in the chromosome

12Q24.31 region points to P2RX7 as a susceptibility gene to bipolar affective disorder.

Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet, 141B(4):374-382.

63. Lucae S, Salyakina D, Barden N, Harvey M, Gagne B, Labbe M, Binder EB, Uhr

M, Paez-Pereda M, Sillaber I, Ising M, Bruckl T, Lieb R, Holsboer F, Muller-Myhsok

B. (2006) P2RX7, a gene coding for a purinergic ligand-gated ion channel, is associated

with major depressive disorder. Hum Mol Genet, 15(16):2438-2445.

64. McQuillin A, Bass NJ, Choudhury K, Puri V, Kosmin M, Lawrence J, Curtis D,

Gurling HM. (2009) Case-control studies show that a non-conservative amino-acid

change from a glutamine to arginine in the P2RX7 purinergic receptor protein is

associated with both bipolar- and unipolar-affective disorders. Mol Psychiatry,

14(6):614-620.

65. Khakh BS. (2001) Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at

synapses. Nat Rev Neurosci, 2(3):165-174.

66. Skaper SD, Debetto P, Giusti P. (2010) The P2X7 purinergic receptor: from

physiology to neurological disorders. FASEB J, 24(2):337-345.

67. Burnstock G, Krugel U, Abbracchio MP, Illes P. (2011) Purinergic signalling: from

normal behaviour to pathological brain function. Prog Neurobiol, 95(2):229-274.

68. Wiley JS, Sluyter R, Gu BJ, Stokes L, Fuller SJ. (2011) The human P2X7 receptor

and its role in innate immunity. Tissue Antigens, 78(5):321-332.

69. Sperlagh B, Vizi ES, Wirkner K, Illes P. (2006) P2X7 receptors in the nervous

system. Prog Neurobiol, 78(6):327-346.

70. Chakfe Y, Seguin R, Antel JP, Morissette C, Malo D, Henderson D, Seguela P.

(2002) ADP and AMP induce interleukin-1beta release from microglial cells through

activation of ATP-primed P2X7 receptor channels. J Neurosci, 22(8):3061-3069.

71. Bennett MR. (2007) Synaptic P2X7 receptor regenerative-loop hypothesis for

depression. Aust N Z J Psychiatry, 41(7):563-571.

72. Basso AM, Bratcher NA, Harris RR, Jarvis MF, Decker MW, Rueter LE. (2009)

Behavioral profile of P2X7 receptor knockout mice in animal models of depression and

anxiety: relevance for neuropsychiatric disorders. Behav Brain Res, 198(1):83-90.

106

73. Backlund L, Lavebratt C, Frisen L, Nikamo P, Hukic Sudic D, Traskman-Bendz L,

Landen M, Edman G, Vawter MP, Osby U, Schalling M. (2012) P2RX7: Expression

Responds to Sleep Deprivation and Associates with Rapid Cycling in Bipolar Disorder

Type 1. PLoS One, 7(8):e43057.

74. Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. (1993) The C. elegans heterochronic gene lin-4

encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell, 75(5):843-854.

75. Hammond SM, Caudy AA, Hannon GJ. (2001) Post-transcriptional gene silencing

by double-stranded RNA. Nat Rev Genet, 2(2):110-119.

76. He L, Hannon GJ. (2004) MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene

regulation. Nat Rev Genet, 5(7):522-531.

77. Valencia-Sanchez MA, Liu J, Hannon GJ, Parker R. (2006) Control of translation

and mRNA degradation by miRNAs and siRNAs. Genes Dev, 20(5):515-524.

78. Mendes ND, Freitas AT, Sagot MF. (2009) Current tools for the identification of

miRNA genes and their targets. Nucleic Acids Res, 37(8):2419-2433.

79. Monticelli S, Ansel KM, Xiao C, Socci ND, Krichevsky AM, Thai TH, Rajewsky

N, Marks DS, Sander C, Rajewsky K, Rao A, Kosik KS. (2005) MicroRNA profiling of

the murine hematopoietic system. Genome Biol, 6(8):R71.

80. Thum T, Galuppo P, Wolf C, Fiedler J, Kneitz S, van Laake LW, Doevendans PA,

Mummery CL, Borlak J, Haverich A, Gross C, Engelhardt S, Ertl G, Bauersachs J.

(2007) MicroRNAs in the human heart: a clue to fetal gene reprogramming in heart

failure. Circulation, 116(3):258-267.

81. Garbett KA, Horvath S, Ebert PJ, Schmidt MJ, Lwin K, Mitchell A, Levitt P,

Mirnics K. Novel animal models for studying complex brain disorders: BAC-driven

miRNA-mediated in vivo silencing of gene expression. Mol Psychiatry, 15(10):987-

995.

82. Saunders MA, Liang H, Li WH. (2007) Human polymorphism at microRNAs and

microRNA target sites. Proc Natl Acad Sci U S A, 104(9):3300-3305.

83. Georges M, Clop A, Marcq F, Takeda H, Pirottin D, Hiard S, Tordoir X, Caiment

F, Meish F, Bibe B, Bouix J, Elsen JM, Eychenne F, Laville E, Larzul C, Milenkovic D,

Tobin J, Charlier AC. (2006) Polymorphic microRNA-target interactions: a novel

source of phenotypic variation. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 71:343-350.

107

84. Bao L, Zhou M, Wu L, Lu L, Goldowitz D, Williams RW, Cui Y. (2007)

PolymiRTS Database: linking polymorphisms in microRNA target sites with complex

traits. Nucleic Acids Res, 35(Database issue):D51-54.

85. Abelson JF, Kwan KY, O'Roak BJ, Baek DY, Stillman AA, Morgan TM, Mathews

CA, Pauls DL, Rasin MR, Gunel M, Davis NR, Ercan-Sencicek AG, Guez DH, Spertus

JA, Leckman JF, Dure LSt, Kurlan R, Singer HS, Gilbert DL, Farhi A, Louvi A, Lifton

RP, Sestan N, State MW. (2005) Sequence variants in SLITRK1 are associated with

Tourette's syndrome. Science, 310(5746):317-320.

86. Martin MM, Buckenberger JA, Jiang J, Malana GE, Nuovo GJ, Chotani M,

Feldman DS, Schmittgen TD, Elton TS. (2007) The human angiotensin II type 1

receptor +1166 A/C polymorphism attenuates microrna-155 binding. J Biol Chem,

282(33):24262-24269.

87. Kintscher U, Foryst-Ludwig A, Unger T. (2008) Inhibiting angiotensin type 1

receptors as a target for diabetes. Expert Opin Ther Targets, 12(10):1257-1263.

88. Lv K, Guo Y, Zhang Y, Wang K, Jia Y, Sun S. (2008) Allele-specific targeting of

hsa-miR-657 to human IGF2R creates a potential mechanism underlying the association

of ACAA-insertion/deletion polymorphism with type 2 diabetes. Biochem Biophys Res

Commun, 374(1):101-105.

89. Jensen KP, Covault J, Conner TS, Tennen H, Kranzler HR, Furneaux HM. (2009)

A common polymorphism in serotonin receptor 1B mRNA moderates regulation by

miR-96 and associates with aggressive human behaviors. Mol Psychiatry, 14(4):381-

389.

90. Musi N, Goodyear LJ. (2006) Insulin resistance and improvements in signal

transduction. Endocrine, 29(1):73-80.

91. Mounier C, Posner BI. (2006) Transcriptional regulation by insulin: from the

receptor to the gene. Can J Physiol Pharmacol, 84(7):713-724.

92. Shepherd PR, Kahn BB. (1999) Glucose transporters and insulin action--

implications for insulin resistance and diabetes mellitus. N Engl J Med, 341(4):248-257.

93. Yang YL, Xiang RL, Yang C, Liu XJ, Shen WJ, Zuo J, Chang YS, Fang FD.

(2009) Gene expression profile of human skeletal muscle and adipose tissue of Chinese

Han patients with type 2 diabetes mellitus. Biomed Environ Sci, 22(5):359-368.

108

94. Sandhu MS, Gibson JM, Heald AH, Dunger DB, Wareham NJ. (2003) Low

circulating IGF-II concentrations predict weight gain and obesity in humans. Diabetes,

52(6):1403-1408.

95. Ukkola O, Sun G, Bouchard C. (2001) Insulin-like growth factor 2 (IGF2 ) and

IGF-binding protein 1 (IGFBP1) gene variants are associated with overfeeding-induced

metabolic changes. Diabetologia, 44(12):2231-2236.

96. Wang H, Chu W, Das SK, Zheng Z, Hasstedt SJ, Elbein SC. (2003) Molecular

screening and association studies of retinoid-related orphan receptor gamma (RORC): a

positional and functional candidate for type 2 diabetes. Mol Genet Metab, 79(3):176-

182.

97. Zabolotny JM, Haj FG, Kim YB, Kim HJ, Shulman GI, Kim JK, Neel BG, Kahn

BB. (2004) Transgenic overexpression of protein-tyrosine phosphatase 1B in muscle

causes insulin resistance, but overexpression with leukocyte antigen-related phosphatase

does not additively impair insulin action. J Biol Chem, 279(23):24844-24851.

98. Elchebly M, Payette P, Michaliszyn E, Cromlish W, Collins S, Loy AL,

Normandin D, Cheng A, Himms-Hagen J, Chan CC, Ramachandran C, Gresser MJ,

Tremblay ML, Kennedy BP. (1999) Increased insulin sensitivity and obesity resistance

in mice lacking the protein tyrosine phosphatase-1B gene. Science, 283(5407):1544-

1548.

99. Ashizawa K, Willingham MC, Liang CM, Cheng SY. (1991) In vivo regulation of

monomer-tetramer conversion of pyruvate kinase subtype M2 by glucose is mediated

via fructose 1,6-bisphosphate. J Biol Chem, 266(25):16842-16846.

100. Matsumoto K, Yokoyama S. (2010) Gene expression analysis on the liver of

cholestyramine-treated type 2 diabetic model mice. Biomed Pharmacother, 64(6):373-

378.

101. Kobayashi M, Ikegami H, Fujisawa T, Nojima K, Kawabata Y, Noso S, Babaya N,

Itoi-Babaya M, Yamaji K, Hiromine Y, Shibata M, Ogihara T. (2007) Prevention and

treatment of obesity, insulin resistance, and diabetes by bile acid-binding resin.

Diabetes, 56(1):239-247.

102. Fonseca VA, Rosenstock J, Wang AC, Truitt KE, Jones MR. (2008) Colesevelam

HCl improves glycemic control and reduces LDL cholesterol in patients with

109

inadequately controlled type 2 diabetes on sulfonylurea-based therapy. Diabetes Care,

31(8):1479-1484.

103. Havrankova J, Roth J, Brownstein M. (1978) Insulin receptors are widely

distributed in the central nervous system of the rat. Nature, 272(5656):827-829.

104. Wickelgren I. (1998) Tracking insulin to the mind. Science, 280(5363):517-519.

105. Stockhorst U, de Fries D, Steingrueber HJ, Scherbaum WA. (2004) Insulin and the

CNS: effects on food intake, memory, and endocrine parameters and the role of

intranasal insulin administration in humans. Physiol Behav, 83(1):47-54.

106. Adamo M, Lowe WL, Jr., LeRoith D, Roberts CT, Jr. (1989) Insulin-like growth

factor I messenger ribonucleic acids with alternative 5'-untranslated regions are

differentially expressed during development of the rat. Endocrinology, 124(6):2737-

2744.

107. Agrawal R, Tyagi E, Shukla R, Nath C. (2011) Insulin receptor signaling in rat

hippocampus: a study in STZ (ICV) induced memory deficit model. Eur

Neuropsychopharmacol, 21(3):261-273.

108. Devaskar SU, Singh BS, Carnaghi LR, Rajakumar PA, Giddings SJ. (1993) Insulin

II gene expression in rat central nervous system. Regul Pept, 48(1-2):55-63.

109. Devaskar SU, Giddings SJ, Rajakumar PA, Carnaghi LR, Menon RK, Zahm DS.

(1994) Insulin gene expression and insulin synthesis in mammalian neuronal cells. J

Biol Chem, 269(11):8445-8454.

110. Singh BS, Rajakumar PA, Eves EM, Rosner MR, Wainer BH, Devaskar SU.

(1997) Insulin gene expression in immortalized rat hippocampal and

pheochromocytoma-12 cell lines. Regul Pept, 69(1):7-14.

111. Hrytsenko O, Wright JR, Jr., Morrison CM, Pohajdak B. (2007) Insulin expression

in the brain and pituitary cells of tilapia (Oreochromis niloticus). Brain Res, 1135(1):31-

40.

112. Banks WA. (2004) The source of cerebral insulin. Eur J Pharmacol, 490(1-3):5-12.

113. Kern W, Benedict C, Schultes B, Plohr F, Moser A, Born J, Fehm HL, Hallschmid

M. (2006) Low cerebrospinal fluid insulin levels in obese humans. Diabetologia,

49(11):2790-2792.

110

114. Cole AR, Astell A, Green C, Sutherland C. (2007) Molecular connexions between

dementia and diabetes. Neurosci Biobehav Rev, 31(7):1046-1063.

115. Luchsinger JA, Tang MX, Shea S, Mayeux R. (2004) Hyperinsulinemia and risk of

Alzheimer disease. Neurology, 63(7):1187-1192.

116. Wan Q, Xiong ZG, Man HY, Ackerley CA, Braunton J, Lu WY, Becker LE,

MacDonald JF, Wang YT. (1997) Recruitment of functional GABA(A) receptors to

postsynaptic domains by insulin. Nature, 388(6643):686-690.

117. Beattie EC, Carroll RC, Yu X, Morishita W, Yasuda H, von Zastrow M, Malenka

RC. (2000) Regulation of AMPA receptor endocytosis by a signaling mechanism shared

with LTD. Nat Neurosci, 3(12):1291-1300.

118. Okereke O, Hankinson SE, Hu FB, Grodstein F. (2005) Plasma C peptide level and

cognitive function among older women without diabetes mellitus. Arch Intern Med,

165(14):1651-1656.

119. Citron M. (2002) Alzheimer's disease: treatments in discovery and development.

Nat Neurosci, 5 Suppl:1055-1057.

120. Gregg EW, Yaffe K, Cauley JA, Rolka DB, Blackwell TL, Narayan KM,

Cummings SR. (2000) Is diabetes associated with cognitive impairment and cognitive

decline among older women? Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch

Intern Med, 160(2):174-180.

121. Cox DJ, Kovatchev BP, Gonder-Frederick LA, Summers KH, McCall A, Grimm

KJ, Clarke WL. (2005) Relationships between hyperglycemia and cognitive

performance among adults with type 1 and type 2 diabetes. Diabetes Care, 28(1):71-77.

122. Luchsinger JA, Tang MX, Stern Y, Shea S, Mayeux R. (2001) Diabetes mellitus

and risk of Alzheimer's disease and dementia with stroke in a multiethnic cohort. Am J

Epidemiol, 154(7):635-641.

123. Cosway R, Strachan MW, Dougall A, Frier BM, Deary IJ. (2001) Cognitive

function and information processing in type 2 diabetes. Diabet Med, 18(10):803-810.

124. Peila R, Rodriguez BL, Launer LJ. (2002) Type 2 diabetes, APOE gene, and the

risk for dementia and related pathologies: The Honolulu-Asia Aging Study. Diabetes,

51(4):1256-1262.

111

125. Levy J, Gavin JR, 3rd, Sowers JR. (1994) Diabetes mellitus: a disease of abnormal

cellular calcium metabolism? Am J Med, 96(3):260-273.

126. Li ZG, Zhang W, Grunberger G, Sima AA. (2002) Hippocampal neuronal

apoptosis in type 1 diabetes. Brain Res, 946(2):221-231.

127. Ferguson SC, Blane A, Perros P, McCrimmon RJ, Best JJ, Wardlaw J, Deary IJ,

Frier BM. (2003) Cognitive ability and brain structure in type 1 diabetes: relation to

microangiopathy and preceding severe hypoglycemia. Diabetes, 52(1):149-156.

128. Klein JP, Waxman SG. (2003) The brain in diabetes: molecular changes in neurons

and their implications for end-organ damage. Lancet Neurol, 2(9):548-554.

129. Somogyi A. SK. (2002) Fokozott kardiovaszkuláris kockázat diabéteszben. .

Diabetologia Hungarica, 10:125-130.

130. Toth C, Schmidt AM, Tuor UI, Francis G, Foniok T, Brussee V, Kaur J, Yan SF,

Martinez JA, Barber PA, Buchan A, Zochodne DW. (2006) Diabetes,

leukoencephalopathy and rage. Neurobiol Dis, 23(2):445-461.

131. Sims-Robinson C, Kim B, Rosko A, Feldman EL. (2010) How does diabetes

accelerate Alzheimer disease pathology? Nat Rev Neurol, 6(10):551-559.

132. Zadori D, Datki Z, Penke B. (2007) [The role of chronic brain hypoperfusion in the

pathogenesis of Alzheimer's disease--facts and hypotheses]. Ideggyogy Sz, 60(11-

12):428-437. A kronikus agyi hipoperfuzio szerepe az Alzheimer-kor kialakulasaban--

tenyek es hipotezisek.

133. Raz N, Lindenberger U, Rodrigue KM, Kennedy KM, Head D, Williamson A,

Dahle C, Gerstorf D, Acker JD. (2005) Regional brain changes in aging healthy adults:

general trends, individual differences and modifiers. Cereb Cortex, 15(11):1676-1689.

134. Burke SN, Barnes CA. (2006) Neural plasticity in the ageing brain. Nat Rev

Neurosci, 7(1):30-40.

135. Iyo M, Yamasaki T. (1993) The detection of age-related decrease of dopamine D1,

D2 and serotonin 5-HT2 receptors in living human brain. Prog Neuropsychopharmacol

Biol Psychiatry, 17(3):415-421.

136. Whalley LJ, Deary IJ, Appleton CL, Starr JM. (2004) Cognitive reserve and the

neurobiology of cognitive aging. Ageing Res Rev, 3(4):369-382.

112

137. Miller JA, Oldham MC, Geschwind DH. (2008) A systems level analysis of

transcriptional changes in Alzheimer's disease and normal aging. J Neurosci,

28(6):1410-1420.

138. Blalock EM, Geddes JW, Chen KC, Porter NM, Markesbery WR, Landfield PW.

(2004) Incipient Alzheimer's disease: microarray correlation analyses reveal major

transcriptional and tumor suppressor responses. Proc Natl Acad Sci U S A,

101(7):2173-2178.

139. Blalock EM, Chen KC, Sharrow K, Herman JP, Porter NM, Foster TC, Landfield

PW. (2003) Gene microarrays in hippocampal aging: statistical profiling identifies

novel processes correlated with cognitive impairment. J Neurosci, 23(9):3807-3819.

140. Tan MG, Chua WT, Esiri MM, Smith AD, Vinters HV, Lai MK. (2010) Genome

wide profiling of altered gene expression in the neocortex of Alzheimer's disease. J

Neurosci Res, 88(6):1157-1169.

141. Misawa T, Arima K, Mizusawa H, Satoh J. (2008) Close association of water

channel AQP1 with amyloid-beta deposition in Alzheimer disease brains. Acta

Neuropathol, 116(3):247-260.

142. Perez E, Barrachina M, Rodriguez A, Torrejon-Escribano B, Boada M, Hernandez

I, Sanchez M, Ferrer I. (2007) Aquaporin expression in the cerebral cortex is increased

at early stages of Alzheimer disease. Brain Res, 1128(1):164-174.

143. Hidalgo J, Penkowa M, Espejo C, Martinez-Caceres EM, Carrasco J, Quintana A,

Molinero A, Florit S, Giralt M, Ortega-Aznar A. (2006) Expression of metallothionein-

I, -II, and -III in Alzheimer disease and animal models of neuroinflammation. Exp Biol

Med (Maywood), 231(9):1450-1458.

144. Bjorkdahl C, Sjogren MJ, Zhou X, Concha H, Avila J, Winblad B, Pei JJ. (2008)

Small heat shock proteins Hsp27 or alphaB-crystallin and the protein components of

neurofibrillary tangles: tau and neurofilaments. J Neurosci Res, 86(6):1343-1352.

145. Bjartmar L, Huberman AD, Ullian EM, Renteria RC, Liu X, Xu W, Prezioso J,

Susman MW, Stellwagen D, Stokes CC, Cho R, Worley P, Malenka RC, Ball S,

Peachey NS, Copenhagen D, Chapman B, Nakamoto M, Barres BA, Perin MS. (2006)

Neuronal pentraxins mediate synaptic refinement in the developing visual system. J

Neurosci, 26(23):6269-6281.

113

146. Moran LB, Hickey L, Michael GJ, Derkacs M, Christian LM, Kalaitzakis ME,

Pearce RK, Graeber MB. (2008) Neuronal pentraxin II is highly upregulated in

Parkinson's disease and a novel component of Lewy bodies. Acta Neuropathol,

115(4):471-478.

147. Steen E, Terry BM, Rivera EJ, Cannon JL, Neely TR, Tavares R, Xu XJ, Wands

JR, de la Monte SM. (2005) Impaired insulin and insulin-like growth factor expression

and signaling mechanisms in Alzheimer's disease--is this type 3 diabetes? J Alzheimers

Dis, 7(1):63-80.

148. Schubert M, Gautam D, Surjo D, Ueki K, Baudler S, Schubert D, Kondo T, Alber

J, Galldiks N, Kustermann E, Arndt S, Jacobs AH, Krone W, Kahn CR, Bruning JC.

(2004) Role for neuronal insulin resistance in neurodegenerative diseases. Proc Natl

Acad Sci U S A, 101(9):3100-3105.

149. Beal MF, Uhl G, Mazurek MF, Kowall N, Martin JB. (1986) Somatostatin:

alterations in the central nervous system in neurological diseases. Res Publ Assoc Res

Nerv Ment Dis, 64:215-257.

150. Lester-Coll N, Rivera EJ, Soscia SJ, Doiron K, Wands JR, de la Monte SM. (2006)

Intracerebral streptozotocin model of type 3 diabetes: relevance to sporadic Alzheimer's

disease. J Alzheimers Dis, 9(1):13-33.

151. de la Monte SM, Tong M, Lester-Coll N, Plater M, Jr., Wands JR. (2006)

Therapeutic rescue of neurodegeneration in experimental type 3 diabetes: relevance to

Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis, 10(1):89-109.

152. Zigmond AS, Snaith RP. (1983) The hospital anxiety and depression scale. Acta

Psychiatr Scand, 67(6):361-370.

153. Muszbek K, Szekely A, Balogh EM, Molnar M, Rohanszky M, Ruzsa A, Varga K,

Szollosi M, Vadasz P. (2006) Validation of the Hungarian translation of Hospital

Anxiety and Depression Scale. Qual Life Res, 15(4):761-766.

154. Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. (2005) Haploview: analysis and visualization

of LD and haplotype maps. Bioinformatics, 21(2):263-265.

155. Tregouet DA, Garelle V. (2007) A new JAVA interface implementation of

THESIAS: testing haplotype effects in association studies. Bioinformatics, 23(8):1038-

1039.

114

156. Rossini AA, Like AA, Chick WL, Appel MC, Cahill GF, Jr. (1977) Studies of

streptozotocin-induced insulitis and diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A, 74(6):2485-

2489.

157. Goto Y, Kakizaki M, Masaki N. (1976) Production of spontaneous diabetic rats by

repetition of selective breeding. Tohoku J Exp Med, 119(1):85-90.

158. Livak KJ, Schmittgen TD. (2001) Analysis of relative gene expression data using

real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods, 25(4):402-

408.

159. Arias B, Arranz MJ, Gasto C, Catalan R, Pintor L, Gutierrez B, Kerwin RW,

Fananas L. (2002) Analysis of structural polymorphisms and C-1018G promoter variant

of the 5-HT(1A) receptor gene as putative risk factors in major depression. Mol

Psychiatry, 7(9):930-932.

160. North RA. (2002) Molecular physiology of P2X receptors. Physiol Rev,

82(4):1013-1067.

161. Hejjas K, Szekely A, Domotor E, Halmai Z, Balogh G, Schilling B, Sarosi A,

Faludi G, Sasvari-Szekely M, Nemoda Z. (2009) Association between depression and

the Gln460Arg polymorphism of P2RX7 gene: a dimensional approach. Am J Med

Genet B Neuropsychiatr Genet, 150B(2):295-299.

162. Nagy G, Ronai Z, Somogyi A, Sasvari-Szekely M, Rahman OA, Mate A, Varga T,

Nemoda Z. (2008) P2RX7 Gln460Arg polymorphism is associated with depression

among diabetic patients. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry, 32(8):1884-

1888.

163. Denlinger LC, Coursin DB, Schell K, Angelini G, Green DN, Guadarrama AG,

Halsey J, Prabhu U, Hogan KJ, Bertics PJ. (2006) Human P2X7 pore function predicts

allele linkage disequilibrium. Clin Chem, 52(6):995-1004.

164. Green EK, Grozeva D, Raybould R, Elvidge G, Macgregor S, Craig I, Farmer A,

McGuffin P, Forty L, Jones L, Jones I, O'Donovan MC, Owen MJ, Kirov G, Craddock

N. (2009) P2RX7: A bipolar and unipolar disorder candidate susceptibility gene? Am J

Med Genet B Neuropsychiatr Genet, 150B(8):1063-1069.

165. Fuller SJ, Stokes L, Skarratt KK, Gu BJ, Wiley JS. (2009) Genetics of the P2X7

receptor and human disease. Purinergic Signal, 5(2):257-262.

115

166. Correia SC, Santos RX, Perry G, Zhu X, Moreira PI, Smith MA. (2011) Insulin-

resistant brain state: the culprit in sporadic Alzheimer's disease? Ageing Res Rev,

10(2):264-273.

167. Nielsen AR, Erikstrup C, Johansen JS, Fischer CP, Plomgaard P, Krogh-Madsen R,

Taudorf S, Lindegaard B, Pedersen BK. (2008) Plasma YKL-40: a BMI-independent

marker of type 2 diabetes. Diabetes, 57(11):3078-3082.

168. Yang MS, Morris DW, Donohoe G, Kenny E, O'Dushalaine CT, Schwaiger S,

Nangle JM, Clarke S, Scully P, Quinn J, Meagher D, Baldwin P, Crumlish N,

O'Callaghan E, Waddington JL, Gill M, Corvin A. (2008) Chitinase-3-like 1 (CHI3L1)

gene and schizophrenia: genetic association and a potential functional mechanism. Biol

Psychiatry, 64(2):98-103.

169. Zarranz JJ, Alegre J, Gomez-Esteban JC, Lezcano E, Ros R, Ampuero I, Vidal L,

Hoenicka J, Rodriguez O, Atares B, Llorens V, Gomez Tortosa E, del Ser T, Munoz

DG, de Yebenes JG. (2004) The new mutation, E46K, of alpha-synuclein causes

Parkinson and Lewy body dementia. Ann Neurol, 55(2):164-173.

170. Senior SL, Ninkina N, Deacon R, Bannerman D, Buchman VL, Cragg SJ, Wade-

Martins R. (2008) Increased striatal dopamine release and hyperdopaminergic-like

behaviour in mice lacking both alpha-synuclein and gamma-synuclein. Eur J Neurosci,

27(4):947-957.

171. Ninkina N, Peters O, Millership S, Salem H, van der Putten H, Buchman VL.

(2009) Gamma-synucleinopathy: neurodegeneration associated with overexpression of

the mouse protein. Hum Mol Genet, 18(10):1779-1794.

172. Wersinger C, Sidhu A. (2009) Partial regulation of serotonin transporter function

by gamma-synuclein. Neurosci Lett, 453(3):157-161.

173. Oort PJ, Knotts TA, Grino M, Naour N, Bastard JP, Clement K, Ninkina N,

Buchman VL, Permana PA, Luo X, Pan G, Dunn TN, Adams SH. (2008) Gamma-

synuclein is an adipocyte-neuron gene coordinately expressed with leptin and increased

in human obesity. J Nutr, 138(5):841-848.

174. Schlaepfer IR, Clegg HV, Corley RP, Crowley TJ, Hewitt JK, Hopfer CJ, Krauter

K, Lessem J, Rhee SH, Stallings MC, Wehner JM, Young SE, Ehringer MA. (2007)

116

The human protein kinase C gamma gene (PRKCG) as a susceptibility locus for

behavioral disinhibition. Addict Biol, 12(2):200-209.

175. Biden TJ, Schmitz-Peiffer C, Burchfield JG, Gurisik E, Cantley J, Mitchell CJ,

Carpenter L. (2008) The diverse roles of protein kinase C in pancreatic beta-cell

function. Biochem Soc Trans, 36(Pt 5):916-919.

176. Olive MF, Messing RO. (2004) Protein kinase C isozymes and addiction. Mol

Neurobiol, 29(2):139-154.

177. Shelton RC, Hal Manier D, Lewis DA. (2009) Protein kinases A and C in post-

mortem prefrontal cortex from persons with major depression and normal controls. Int J

Neuropsychopharmacol, 12(9):1223-1232.

178. Donckier JE, Rosiere A, Heureux E, Michel L. (2008) Diabetes mellitus as a

primary manifestation of multiple endocrine neoplasia type 2B. Acta Chir Belg,

108(6):732-737.

179. Mijatovic J, Airavaara M, Planken A, Auvinen P, Raasmaja A, Piepponen TP,

Costantini F, Ahtee L, Saarma M. (2007) Constitutive Ret activity in knock-in multiple

endocrine neoplasia type B mice induces profound elevation of brain dopamine

concentration via enhanced synthesis and increases the number of TH-positive cells in

the substantia nigra. J Neurosci, 27(18):4799-4809.

180. Gonzalez-Barroso MM, Giurgea I, Bouillaud F, Anedda A, Bellanne-Chantelot C,

Hubert L, de Keyzer Y, de Lonlay P, Ricquier D. (2008) Mutations in UCP2 in

congenital hyperinsulinism reveal a role for regulation of insulin secretion. PLoS One,

3(12):e3850.

181. Andrews ZB, Erion D, Beiler R, Liu ZW, Abizaid A, Zigman J, Elsworth JD,

Savitt JM, DiMarchi R, Tschoep M, Roth RH, Gao XB, Horvath TL. (2009) Ghrelin

promotes and protects nigrostriatal dopamine function via a UCP2-dependent

mitochondrial mechanism. J Neurosci, 29(45):14057-14065.

182. Koseki M, Matsuyama A, Nakatani K, Inagaki M, Nakaoka H, Kawase R, Yuasa-

Kawase M, Tsubakio-Yamamoto K, Masuda D, Sandoval JC, Ohama T, Nakagawa-

Toyama Y, Matsuura F, Nishida M, Ishigami M, Hirano K, Sakane N, Kumon Y,

Suehiro T, Nakamura T, Shimomura I, Yamashita S. (2009) Impaired insulin secretion

117

in four Tangier disease patients with ABCA1 mutations. J Atheroscler Thromb,

16(3):292-296.

183. Reynolds CA, Hong MG, Eriksson UK, Blennow K, Bennet AM, Johansson B,

Malmberg B, Berg S, Wiklund F, Gatz M, Pedersen NL, Prince JA. (2009) A survey of

ABCA1 sequence variation confirms association with dementia. Hum Mutat,

30(9):1348-1354.

184. Rodriguez-Rodriguez E, Vazquez-Higuera JL, Sanchez-Juan P, Mateo I, Pozueta

A, Martinez-Garcia A, Frank A, Valdivieso F, Berciano J, Bullido MJ, Combarros O.

(2010) Epistasis between intracellular cholesterol trafficking-related genes (NPC1 and

ABCA1) and Alzheimer's disease risk. J Alzheimers Dis, 21(2):619-625.

185. Kobayashi M, Ohnishi H, Okazawa H, Murata Y, Hayashi Y, Kobayashi H,

Kitamura T, Matozaki T. (2008) Expression of Src homology 2 domain-containing

protein tyrosine phosphatase substrate-1 in pancreatic beta-Cells and its role in

promotion of insulin secretion and protection against diabetes. Endocrinology,

149(11):5662-5669.

186. Verdier Y, Penke B. (2004) Binding sites of amyloid beta-peptide in cell plasma

membrane and implications for Alzheimer's disease. Curr Protein Pept Sci, 5(1):19-31.

187. Ogren SO, Kuteeva E, Elvander-Tottie E, Hokfelt T. (2010) Neuropeptides in

learning and memory processes with focus on galanin. Eur J Pharmacol, 626(1):9-17.

188. Ogren SO, Kehr J, Schott PA. (1996) Effects of ventral hippocampal galanin on

spatial learning and on in vivo acetylcholine release in the rat. Neuroscience,

75(4):1127-1140.

189. Adams AC, Clapham JC, Wynick D, Speakman JR. (2008) Feeding behaviour in

galanin knockout mice supports a role of galanin in fat intake and preference. J

Neuroendocrinol, 20(2):199-206.

190. Lu X, Sharkey L, Bartfai T. (2007) The brain galanin receptors: targets for novel

antidepressant drugs. CNS Neurol Disord Drug Targets, 6(3):183-192.

191. Elliott-Hunt CR, Pope RJ, Vanderplank P, Wynick D. (2007) Activation of the

galanin receptor 2 (GalR2) protects the hippocampus from neuronal damage. J

Neurochem, 100(3):780-789.

118

192. Kuteeva E, Wardi T, Lundstrom L, Sollenberg U, Langel U, Hokfelt T, Ogren SO.

(2008) Differential role of galanin receptors in the regulation of depression-like

behavior and monoamine/stress-related genes at the cell body level.

Neuropsychopharmacology, 33(11):2573-2585.

193. Deshmukh R, Sharma V, Mehan S, Sharma N, Bedi KL. (2009) Amelioration of

intracerebroventricular streptozotocin induced cognitive dysfunction and oxidative

stress by vinpocetine -- a PDE1 inhibitor. Eur J Pharmacol, 620(1-3):49-56.

194. Schwartz MW, Figlewicz DF, Kahn SE, Baskin DG, Greenwood MR, Porte D, Jr.

(1990) Insulin binding to brain capillaries is reduced in genetically obese,

hyperinsulinemic Zucker rats. Peptides, 11(3):467-472.

195. Ruczynski J, Cybal M, Wojcikowski C, Rekowski P. (2002) Effects of porcine

galanin, galanin(1-15)NH2 and its new analogues on glucose-induced insulin secretion.

Pol J Pharmacol, 54(2):133-141.

196. Legakis I, Mantzouridis T, Mountokalakis T. (2005) Positive correlation of galanin

with glucose in type 2 diabetes. Diabetes Care, 28(3):759-760.

197. Legakis IN, Mantzouridis T, Mountokalakis T. (2007) Positive correlation of

galanin with glucose in healthy volunteers during an oral glucose tolerance test. Horm

Metab Res, 39(1):53-55.

198. Mei Q, Mundinger TO, Lernmark K, Taborsky GJ, Jr. (2006) Increased galanin

expression in the celiac ganglion of BB diabetic rats. Neuropeptides, 40(1):1-10.

119

11 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE

A dolgozat témakörében megjelent publikációk:

1. Abdul-Rahman O, Sasvari-Szekely M, Szekely A, Faludi G, Guttman A,

Nemoda Z. (2010) Analysis of a polymorphic microRNA target site in the

purinergic receptor P2RX7 gene. Electrophoresis, 31(11):1790-5. (IF.: 3,509)

2. Keszler Gergely, Abdul-Rahman Omar, Rosta Klára, Somogyi Anikó és

Sasvári-Székely Mária. (2010) A galanin neuropeptid agyi expresszióváltozása 2-

es típusú diabétesz patkánymodelljén. Magyar Belorvosi Archivum, 63(2):87-90

3. Abdul-Rahman O, Sasvari-Szekely M, Ver A, Rosta K, Szasz BK, Kereszturi E,

Keszler G. (2012) Altered gene expression profiles in the hippocampus and

prefrontal cortex of type 2 diabetic rats. BMC Genomics, 13:81. (IF.: 4,07)

A dolgozat témájához szorosan nem kapcsolódó publikációk:

1. Than NG, Abdul-Rahman O, Magenheim R, Nagy B, Fule T, Hargitai B,

Sammar M, Hupuczi P, Tarca AL, Szabo G, Kovalszky I, Meiri H, Sziller I, Rigo

J Jr, Romero R, Papp Z. (2008) Placental protein 13 (galectin-13) has decreased

placental expression but increased shedding and maternal serum concentrations in

patients presenting with preterm pre-eclampsia and HELLP syndrome. Virchows

Arch, 453(4):387-400. (IF.: 2,082)

2. Nagy G, Ronai Z, Somogyi A, Sasvari-Szekely M, Abdul-Rahman O, Mate A,

Varga T, Nemoda Z. (2008) P2RX7 Gln460Arg polymorphism is associated with

depression among diabetic patients. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,

32(8):1884-8. (IF.: 2,638)

120

12 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Köszönetemet szeretném kinyilvánítani az Orvosi Vegytani Intézet korábbi

igazgatójának, Mandl József professzor úrnak, a Patobiokémiai Doktori Program

vezetőjének, hogy az Intézetben végzett kutatómunkámat lehetővé tette és támogatta.

Szeretném megköszönni laborunk vezetőjének, Sasvári Mária

professzorasszonynak szakmai támogatását, tudományos iránymutatását, megértését és

türelmét, melyet doktori éveim alatt irántam tanúsított. Köszönöm témavezetőmnek,

Nemoda Zsófiának, hogy ötleteivel, építő kritikájával és fáradhatatlan ösztönzésével

munkámat segítette és napi szinten útmutatást adott. Köszönettel tartozom Kereszturi

Évának, aki kísérleti tapasztalatával a labormunka gyakorlati részének elsajátításában

nyújtott nagy segítséget. Külön szeretném megköszönni Keszler Gergely kollégám

segítségét, aki átfogó tudományos ismeretével segített kontextusában megérteni

eredményeink számos összefüggését.

Szeretném megköszönni munkacsoportunk valamennyi volt és jelenlegi tagjának,

mindenekelőtt Rónai Zsoltnak, Barta Csabának, Szpaszokukockaja Tatjanának, Szántai

Eszternek, Héjjas Krisztinának, Bence Melindának, Nagy Rékának, Virga Sándornénak,

Kolmann Gabriellának, hogy segítségükre, véleményükre mindig számíthattam.

Köszönöm Vér Ágota docens asszonynak és Rosta Klárának, hogy az általuk

megtervezett kísérleti kivitelezés kiértékelésébe bevontak és ezáltal megtanulhattam a

DNS-microarray alapú mérések menetét és kiértékelését. Hálás köszönettel tartozom

Tölgyesi Gergelynek a nyers adatok kiértékelésében nyújtott segítségéért. A beteg és

egészséges populáció mintáinak összegyűjtésében köszönöm együttműködő

partnereinkenk, Faludi Gábornak, Somogyi Anikónak, Székely Annának és PhD

diákjaiknak munkáját.

Végül, de semmiképp sem utolsósorban szeretném megköszönni családomnak és

mindenekelőtt feleségemnek, hogy céljaim elérésében mindvégig támogatott, ösztönzött

és nyugodt hátteret biztosított. Köszönöm szeretetét és türelmét, melyre mindig

támaszkodhattam.

121

13 FÜGGELÉK

12. táblázat: A HADS (Hospital Anxiety and Depression Scale) kérdőív

Feszültnek és zaklatottnak érzem magam Legtöbbször Gyakran Időnként Egyáltalán nem

Tudok még úgy örülni, mint azel őtt

Pontosan ugyanannyira Már kevésbé Csak egy kicsit Szinte egyáltalán nem

Félelem fog el, hogy valami borzasztó történhet

Kifejezetten Igen, de nem túlzottan erősen Valamennyire, de igazán nem aggódom Egyáltalán nem

Tudok nevetni, és a dolgok vidám oldalát is észreveszem

Ugyanúgy, mint eddig Már nem annyira Sokkal kevésbe, mint eddig Egyáltalán nem

Aggasztó gondolatok járnak a fejemben

Az idő nagy részében Igen gyakran Időnként, de nem túl gyakran Csak alkalomadtán

Jókedvű, vidám vagyok

Egyáltalán nem Ritkán Néha Majdnem mindig

Jólesően le tudok ülni, és el tudok lazulni

Igen, teljesen Általában igen Nem túl gyakran Egyáltalán nem

Úgy érzem, mintha lelassultam volna

Majdnem mindig Nagyon gyakran Néha Soha

Szorongok, összeszorul a gyomrom

Egyáltalán nem Néha Elég gyakran Nagyon gyakran

Elvesztettem az érdeklődésemet a megjelenésem iránt

Kifejezetten Nem törődöm vele annyira, mint kellene Kevesebbet törődöm vele, mint régebben Ugyanannyit törődöm vele, mit mindig

Nyughatatlan vagyok, mintha állandóan mehetnékem lenne

Igen, valóban Elég sokszor Nem túl sokszor Egyáltalán nem

Örömmel nézek a dolgok elébe

Ugyanannyira, mint eddig Valamivel kevésbé, mint korábban Sokkal kevésbé, mint korábban Szinte egyáltalán nem

Hirtelen pánik fog el

Nagyon gyakran Elég gyakran Nem túl gyakran Egyáltalán nem

Tudok élvezni egy jó könyvet, egy rádió- vagy TV-műsort

Gyakran Néha Ritkán Nagyon ritkán

Az orvosok tisztában vannak azzal, hogy a legtöbb betegségnél az érzelmek fontos szerepet játszanak. Ha az orvosa jobban meg tudja ismerni ezeket az érzelmeket, akkor több lehetősége

122

lesz az Ön gyógyítására. A kérdőív segítségével az orvosa képet kap arról, hogy Ön hogyan érzi magát. Olvassa el az alábbi mondatokat, majd helyezzen egy keresztet annak a válasznak megfelelő kockába, mely legközelebb áll ahhoz, ahogy érezte magát az elmúlt héten. Ne töltsön el túl sok időt a válaszadással; első reakciója a kérdésre valószínűleg pontosabb, mint egy hosszasan megfontolt válasz.

13. táblázat: Hippocampus-specifikus változást mutató gének a kontrollhoz képest mért változás („Expressziós változás”) csökkenő sorrendjében.

Gén megnevezése

Expressziós változás

Génbank elérhet őség

Géntermék rövidítése

A_44_P500478 6,495 AI101373 A_44_P214846 4,508 NM_134350 MX2

A_43_P16413 4,505 XM_341835 RGD1561521_PREDICTED

A_44_P403545 3,971 BQ191078 A_44_P251430 3,646 U48828 A_44_P321716 3,582 AA955932 A_44_P150137 3,56 AA924386 A_44_P389904 3,506 NM_031597 KCNQ3 A_42_P534172 3,426 NM_053983 CD52 A_44_P788597 3,425 AA800490 A_43_P22936 3,339 NM_001005557 AKAP3 A_44_P196997 3,333 XM_343686 A_42_P520349 3,297 NM_022393 CLEC10A A_44_P915530 3,281 A_42_P603096 3,237 NM_053981 KCNJ12 A_44_P1029805 3,225 XM_217035 KRT7 A_44_P271405 3,218 NM_172223 PXMP4 A_44_P466118 3,201 XM_237313 A_44_P906816 3,094 A_44_P185629 3,091 BE117514 A_44_P1033521 3,047 AA875280 A_44_P212964 3,025 NM_001108353 PLAC8 A_44_P547699 3,016 AA900593 A_44_P962786 3,006 A_44_P435618 2,999 NM_017333 EDNRB A_43_P22556 2,951 NM_001170467 CIDEA A_44_P468661 2,95 XM_341414 A_42_P736315 2,949 NM_001108321 RTP4 A_44_P1025411 2,93 XM_573710 A_44_P328998 2,854 AI070971 A_44_P647968 2,743 BI395759 A_44_P791333 2,736 A_43_P15434 2,696 NM_080587 GABRA4 A_44_P860459 2,696 AW507248 A_44_P340088 2,673 XM_214377 A_44_P1013314 2,671 NM_001106700 ISG15 A_44_P820495 2,647 AA859324 A_44_P355294 2,634 AI233846

123

A_44_P250575 2,527 NM_001106049 NUDT15 A_44_P335350 2,479 XM_240481 MYOM2

A_44_P605884 2,475 XM_225147 GOLPH2_PREDICTED

A_44_P518358 2,474 XM_343728 A_42_P508984 2,469 NM_001007729 CXCL4 A_44_P776131 2,463 AABR03074271 A_42_P511265 2,463 NM_001008845 A_44_P138495 2,46 CB545207 A_44_P1017367 2,45 NM_134326 ALB A_44_P720341 2,449 BQ193961 A_44_P320518 2,448 NM_001109205 EID1 A_44_P578950 2,444 A_42_P593020 2,423 NM_013413 RLN1 A_44_P119575 2,42 XM_576437 A_44_P869850 2,405 A_44_P639474 2,384 A_44_P513764 2,364 NM_001130561 NUDCD1 A_44_P1029397 2,363 NM_198134 BST2 A_44_P150017 2,359 XM_235459 A_44_P244257 2,346 NM_139263 FGD4 A_44_P838725 2,333 A_44_P1042360 2,329 XM_342752 A_44_P181163 2,293 BG662864 A_44_P439473 2,286 NM_001130561 KLF7 A_44_P543559 2,239 NM_001100975 VPS13A A_44_P562884 2,236 A_44_P187530 2,223 NM_001008858 RT1-T24-1 A_44_P440944 2,219 XM_341649 A_44_P196172 2,214 NM_138881 A_44_P914033 2,197 A_44_P1042473 2,194 NM_139096 LGALS3BP A_44_P647819 2,194 AW142419 A_44_P792811 2,189 A_44_P654250 2,187 BC088258 A_44_P422152 2,178 XM_343725 A_42_P614175 2,168 NM_033237 GAL A_44_P546234 2,168 A_44_P402507 2,165 NM_145084 RETSAT A_44_P605194 2,159 AW916343 A_44_P487930 2,146 BE112513 A_44_P497282 2,134 NM_001107023 RAB11FIP4 A_43_P12024 2,127 NM_019329 CNTN3 A_44_P777454 2,105 A_44_P856900 2,103 NM_001109117 RNF182

A_43_P22484 2,086 XM_222180 WDR66_PREDICTED

A_44_P191285 2,082 XM_574980 RGD1564171_PREDICTED

A_42_P521242 2,078 XM_213312 RGD1561932_PRE

124

DICTED

A_42_P698150 2,07 NM_020078 ADAM1A A_44_P656737 2,07 A_44_P299167 2,069 BM385390 A_44_P991924 2,053 NM_017193 AADAT A_44_P949940 2,048

A_44_P558188 2,047 XM_237386 RGD1305311_PREDICTED

A_44_P424723 2,047 NM_021693 SIK1 A_43_P19032 2,039 CB548230 A_44_P299086 2,033 AI112947 A_44_P854962 2,032 A_42_P577482 2,03 BM387057 A_44_P728469 2,029 NM_022224 PTER A_43_P22707 2,025 XM_217306 A_44_P515084 2,024 BE108884 A_44_P257522 2,021 XM_574228 AGRP A_44_P533794 2,021 NM_130426 TNFRSF1B A_44_P1029403 2,019 NM_198134 BST2 A_43_P18395 2,014 XM_574550 A_44_P686370 2,013 A_44_P1006977 2,01 NM_001009637 LARS A_44_P1025349 2,007 NM_001106856 UBA7 A_43_P19672 2,006 NM_001106159 STARD4 A_44_P763517 2,005

A_44_P504568 2,004 NM_001109117 RGD1560399_PREDICTED

A_44_P610320 0,498 BC092636 RAB2B A_44_P680445 0,495 AI229310 A_44_P301608 0,486 NM_019354 UCP2 A_44_P854339 0,486 A_44_P1008050 0,485 BC061839 A_44_P731356 0,485 A_44_P312745 0,484 AW918759 A_44_P154579 0,483 XM_229609 A_44_P839802 0,482 A_44_P479777 0,481 BM391657 A_44_P468902 0,479 XM_226288 A_44_P871211 0,478 A_42_P787160 0,477 NM_033099 PTPRV A_44_P491450 0,475 NM_080786 SLCO2B1 A_44_P243134 0,473 NM_013066 MTAP2 A_44_P242321 0,472 NM_130433 ACAA2 A_44_P403209 0,467 NM_001013073 BTBD9 A_44_P454420 0,466 XM_215303 RT1-S3 A_44_P310134 0,466 BF521809 A_44_P157014 0,458 A_44_P609775 0,450 A_44_P621820 0,446

125

A_44_P515978 0,441 XM_576722 A_44_P242329 0,440 NM_130433 ACAA2 A_44_P1057427 0,440 XM_242005 A_43_P17784 0,435 NM_001025722 CDK10 A_44_P144393 0,432 XM_576471 IHPK2 A_44_P471141 0,426 NM_001106196 GALNT2 A_44_P1030830 0,426 XM_236574 RGD1310507 A_44_P381881 0,417 NM_012747 STAT3 A_44_P962754 0,413 A_43_P20849 0,412 XM_230856 SLC35C2 A_44_P351621 0,406 NM_001005885 DNAJB13

A_43_P18228 0,405 XM_343031 RGD1560938_PREDICTED

A_44_P996233 0,398 NM_001008768 PRIM1 A_42_P726091 0,398 XM_347000 A_44_P807536 0,396 A_44_P991335 0,391 A_44_P426792 0,388 NM_001008853 A_43_P21615 0,385 NM_001107021 HIC1 A_44_P267155 0,381 XM_221887 A_44_P1004645 0,380 NM_017229 PDE3B A_44_P456968 0,379 NM_001107547 ST5 A_44_P764119 0,371 A_44_P608485 0,369

A_44_P492897 0,365 XM_573799 RGD1559605_PREDICTED

A_44_P353699 0,364 X89638 MOBP A_44_P475663 0,358 A_44_P151482 0,335 NM_001003404 IL22RA2 A_44_P732338 0,335 A_43_P15993 0,327 NM_012711 ITGAM A_44_P957773 0,327 AA963699 A_44_P700413 0,324 A_44_P578435 0,320 A_44_P534582 0,311 NM_001014271 A_44_P746519 0,309 AI059864 A_43_P10432 0,308

A_44_P267218 0,285 XM_218939 HBXAP_PREDICTED

A_44_P123543 0,279 NM_053514 LIN7A A_44_P745617 0,268 A_44_P215393 0,244 NM_001025129 RGD1306327 A_44_P340587 0,231 CB548303

A_44_P277126 0,215 XM_221369 SENP5_PREDICTED

A_44_P384017 0,205 NM_031688 SNCG A_43_P13290 0,201 NM_138530 MAWBP A_44_P298730 0,197 AW141493 A_44_P464942 0,194 BF545795 A_44_P1000888 0,188 XM_341391 PLAC9_PREDICTE

126

D

A_44_P880417 0,184 BF551339 A_44_P443916 0,145 BG673684 A_44_P792207 0,118

14. táblázat: Prefrontális kéreg-specifikus változást mutató gének a kontrollhoz képest mért változás („Expressziós változás”) csökkenő sorrendjében.

Gén megnevezése

Expressziós változás

Génbank elérhet őség

Géntermék rövidítése

A_44_P220616 3,437 NM_001107009 CCDC42 A_42_P537443 2,759 NM_138875 JUND A_44_P108291 2,641 NM_001025403 RBMS2 A_44_P813903 2,58 A_44_P130166 2,429 CB545260 A_43_P16636 2,392 NM_001011978 DHDDS A_42_P621642 2,385 XM_341964 LSP1 A_44_P222030 2,282 NM_181638 TBX3 A_44_P777483 2,268 A_44_P346822 2,263 NM_001170403 ORAI2 A_44_P929478 2,249 A_43_P12732 2,245 NM_033097 VPS52 A_44_P278387 2,243 NM_147211 CR16 A_44_P884739 2,242 NM_001107550 SEZ6L2 A_42_P774448 2,188 NM_012628 PRKCG A_44_P383992 2,184 NM_001000842 OLR821 A_44_P480390 2,176 NM_001107550 SEZ6L2 A_42_P833096 2,164 NM_053314 KCNJ16 A_43_P15116 2,14 BF556336 A_43_P12768 2,133 NM_053328 BHLHE40 A_44_P189869 2,125 XM_347030 A_42_P757370 2,103 NM_017171 PRKCE A_44_P544121 2,102 NM_001107253 KCTD6 A_44_P379911 2,077 XM_345191 A_44_P440514 2,064 NM_001008842 A_44_P257467 2,059 NM_001013967 RGD1311260 A_43_P12559 2,032 NM_031338 CAMKK2

A_42_P472520 2,029 XM_575113 RGD1561113_PREDICTED

A_44_P402641 2,012 NM_201423 A_44_P115030 0,499 BQ206691 A_44_P701236 0,498

A_44_P253380 0,494 XM_576388 RGD1561216_PREDICTED

A_44_P382727 0,489 XM_217496 RGD1566215_PREDICTED

A_44_P541505 0,482 XM_226288 A_44_P141051 0,481 NM_019274 COLQ A_44_P330847 0,479 XM_344734 A_44_P389590 0,478 NM_001108161 CILP

127

A_44_P323106 0,476 NM_178095 ABCA1 A_44_P716741 0,475 A_44_P902085 0,461 A_43_P15061 0,446 BF555924 A_44_P308662 0,439 NM_012643 RET A_43_P11048 0,427 AI102821 A_43_P14492 0,414 A_44_P955172 0,409 BF409042 A_42_P768732 0,407 AW918387 A_44_P323951 0,396 XM_226313

A_44_P529950 0,379 XM_574212 RGD1565104_PREDICTED

A_44_P236670 0,379 XM_346168 A_43_P11961 0,377 NM_019172 GALR2 A_44_P121790 0,377 XM_226313 A_44_P204001 0,375 XM_226313 A_44_P596376 0,371 A_44_P128848 0,315 A_44_P822061 0,308 XM_576724 A_44_P416617 0,305 NM_057129 TFF1 A_44_P655753 0,294 A_43_P11932 0,272 NM_017352 NR4A3 A_44_P494274 0,271 NM_053686 TRPV6 A_42_P511118 0,232 NM_053427 SLC17A6

A_44_P147538 0,210 XM_233562 MYOM3_PREDICTED

15. táblázat: Hippocampusban és prefrontális kéregben egyaránt változást mutató gének a kontrollhoz képest mért változás hippocampusban mért („Expressziós változás a hippocampusban”) csökkenő sorrendjében. Gén

megnevezése Expressziós változás a

hippocampusban

Expressziós változás a

prefrontális kéregben

Génbank elérhet őség

Géntermék rövidítése

A_44_P406636 9,726 6,677 AI029975 A_44_P238939 9,688 10,38 XM_345411 A_44_P249743 7,303 4,854 BE115963 A_44_P869506 7,237 6,549 A_44_P673362 5,803 7,308

A_44_P215917 4,501 4,285 XM_344018 RGD1563504_PREDICTED

A_44_P331743 4,489 3,819 BM390457 A_44_P134287 4,222 3,089 NM_001107716 TAF13 A_44_P221046 4,041 3,312 AI599930 A_44_P186516 3,921 3,7 BQ211716 A_44_P215467 3,715 3,164 NM_001107716 TAF13 A_44_P792797 3,468 4,513 A_44_P992662 3,347 5,127 NM_053567 FTCD A_43_P15517 3,241 3,932 NM_138875 JUND

128

A_44_P961831 3,179 3,486 A_42_P729340 3,111 3,447 NM_138913 OAS1 A_44_P477212 3,018 3,391 BI278569 A_44_P1039994 2,94 4,532 XM_215121

A_44_P269241 2,899 2,752 XM_225401 RGD1306613_PREDICTED

A_44_P219576 2,712 2,006 BF394800 A_44_P896682 2,688 3,665 AW918186 A_44_P561496 2,648 2,536 A_43_P23188 2,561 3,318 BF557281 A_43_P12801 2,519 2,911 NM_053412 ILF3 A_44_P1000100 2,481 2,109 NM_001106453 TRIM45 A_44_P238246 2,438 2,907 NM_053412 ILF3 A_44_P196401 2,399 2,534 Y13890 RT1-AW2

A_44_P194543 2,387 2,337 XM_341551 ASB13_PREDICTED

A_43_P11971 2,274 2,162 NM_019195 CD47 A_43_P15751 2,242 4,436 XM_343470 GRM2 A_44_P925784 2,239 2,212 AI171022 A_44_P900688 2,13 2,046 A_43_P12973 2,117 2,801 NM_053895 FRAG1 A_44_P975945 2,105 2,856

A_44_P898176 2,062 2,466 XM_573549 RGD1564364_PREDICTED

A_44_P192568 2,049 2,457 NM_172335 GM2A A_44_P378322 0,499 0,359 AA858768 A_44_P788404 0,497 0,429 BG670091 A_44_P283985 0,485 0,324 XM_229861 A_44_P523028 0,478 0,494 XM_344727

A_44_P159613 0,450 0,44 XM_344763 RGD1306894_PREDICTED

A_44_P210994 0,450 0,391 XM_346141 A_44_P429244 0,448 0,361 XM_346141 A_44_P277851 0,446 0,402 AA926247 A_44_P653343 0,441 0,401 A_42_P767467 0,438 0,465 BF556870 A_44_P899198 0,413 0,322 A_44_P868694 0,393 0,35 A_44_P670516 0,392 0,279 A_44_P945741 0,390 0,451 A_44_P207677 0,375 0,372 AA900863 A_44_P140720 0,355 0,227 AA899797 A_42_P638128 0,345 0,33 NM_012893 ACTG2 A_44_P701259 0,344 0,409 A_44_P1060345 0,341 0,222 XM_221545 A_44_P306008 0,340 0,217 AI179380 A_44_P241139 0,334 0,399 XM_341973 A_44_P730004 0,332 0,279

A_43_P16949 0,313 0,248 XM_220884 SGCA_PREDICTED

129

A_44_P422134 0,312 0,215 XM_576656

A_44_P492482 0,310 0,332 XM_234332 PLEKHH1_PREDICTED

A_44_P918516 0,306 0,305 A_44_P462228 0,301 0,285 BE098255 A_44_P373592 0,281 0,251 AA956446 A_44_P560710 0,260 0,21 A_44_P795940 0,260 0,38 A_44_P452176 0,248 0,327 NM_053560 CHI3L1 A_44_P200116 0,248 0,219 NM_022236 PDE10A A_44_P190003 0,220 0,222 A_44_P992673 0,219 0,198 NM_001014162 RGD1309578 A_44_P823114 0,196 0,168 A_44_P839581 0,195 0,17 A_44_P885583 0,175 0,228 A_44_P640472 0,129 0,123 A_44_P322118 0,128 0,125 NM_031570 RPS7 A_44_P114732 0,120 0,114 XM_347069 A_44_P852790 0,103 0,124 A_44_P558249 0,099 0,0979 BF558337 A_44_P729342 0,065 0,0555 XM_576948 A_44_P171143 0,064 0,0558 XM_229366 A_44_P414509 0,059 0,0487 XM_576948 A_44_P112488 0,041 0,0492 XM_343087 GALNTL1

A_44_P152177 0,012 0,015 XM_342134 SPOCK2_PREDICTED

16. táblázat: Hippocampusban, prefrontális kéregben és striatumban egyaránt változást mutató gének a kontrollhoz képest mért változás hippocampusban mért („Expressziós változás a hippocampusban”) csökkenő sorrendjében.

Gén megnevezése

Expressziós változás a

hippocampusban

Expressziós változás a

prefrontális kéregben

Expressziós változás a

striatumban

Génbank elérhet őség

Géntermék rövidítése

A_44_P167930 0,276 0,342 0,275 NM_012720 MOBP A_44_P367761 0,141 0,206 0,11 NM_012923 CCNG1 A_44_P577060 3,755 4,306 3,873

130

17. táblázat: A GO Molecular function, a KEGG és a GenMapp adatbázisok aktivitást mutató útvonalai és a hozzájuk tartozó gének 2-es tipusú diabétesz modell hippocampusában.

GO, Molecular function p-érték Géntermék rövidítése

GO:16004: phospholipase activator activity 0,030 GM2A GO:16212: kynurenine-oxoglutarate transaminase activity 0,012 AADAT GO:16408: C-acyltransferase activity 0,006 ACAA2 GO:1641: group II metabotropic glutamate receptor activity 0,018 GRM2 GO:16564: transcriptional repressor activity 0,017 SIK1 GO:1664: G-protein-coupled receptor binding 0,031 GAL, CXCL4 GO:16742: hydroxymethyl-, formyl- and related transferase activity 0,047 FTCD GO:16841: ammonia-lyase activity 0,041 FTCD GO:1730: 2'-5'-oligoadenylate synthetase activity 0,018 OAS1 GO:1846: opsonin binding 0,030 ITGAM GO:19215: intermediate filament binding 0,012 FTCD GO:19911: structural constituent of myelin sheath 0,002 MOBP GO:30106: MHC class I receptor activity 0,047 RT1-AW2 GO:30170: pyridoxal phosphate binding 0,050 AADAT GO:30407: formimidoyltransferase activity 0,006 FTCD GO:30409: glutamate formimidoyltransferase activity 0,006 FTCD GO:30412: formimidoyltetrahydrofolate cyclodeaminase activity 0,006 FTCD

GO:35091: phosphoinositide binding 0,009 CD52, BST2, CNTN3

GO:3896: DNA primase activity 0,030 PRIM1 GO:3988: acetyl-CoA C-acyltransferase activity 0,001 ACAA2 GO:4063: aryldialkylphosphatase activity 0,047 PTER GO:4112: cyclic-nucleotide phosphodiesterase activity 0,012 PDE10A GO:4114: 3',5'-cyclic-nucleotide phosphodiesterase activity 0,011 PDE10A GO:42017: interleukin-22 binding 0,012 IL22RA2 GO:42018: interleukin-22 receptor activity 0,012 IL22RA2 GO:4563: beta-N-acetylhexosaminidase activity 0,030 GM2A GO:4568: chitinase activity 0,047 CHI3L1 GO:45735: nutrient reservoir activity 0,018 CHI3L1 GO:48503: GPI anchor binding 0,001 CD52, CNTN3 GO:5062: hematopoietin/interferon-class (D200-domain) cytokine receptor signal transducer activity 0,030 RT1-AW2 GO:5184: neuropeptide hormone activity 0,019 GAL, AGRP

GO:5543: phospholipid binding 0,043 CD52, BST2, CNTN3

GO:8081: phosphoric diester hydrolase activity 0,014 PDE10A

GO:8289: lipid binding 0,014 CD52, BST2, CNTN3, GM2A

131

KEGG p-érték Géntermék rövidítése

Type I diabetes mellitus 0,000 RT1-AW2, RT1-M6-2

Antigen processing and presentation 0,001 RT1-AW2, RT1-M6-2

Cell adhesion molecules (CAMs) 0,004 RT1-AW2, RT1-M6-2, ITGAM

Fatty acid elongation in mitochondria 0,008 ACAA2 Bile acid biosynthesis 0,022 ACAA2

GenMapp p-érték Géntermék rövidítése

Fatty Acid Biosynthesis 0,026 ACAA2 Mitochondrial LC-Fatty Acid Beta-Oxidation 0,033 ACAA2

18. táblázat: A GO Molecular function, a KEGG és a GenMapp adatbázisok aktivitást mutató útvonalai és a hozzájuk tartozó gének 2-es tipusú diabétesz modell prefrontális kérgében.

GO, Molecular function p-érték Géntermék rövidítése

GO:16004: phospholipase activator activity 0,017 GM2A GO:1641: group II metabotropic glutamate receptor activity 0,010 GRM2 GO:16564: transcriptional repressor activity 0,010 BHLHE40 GO:1730: 2'-5'-oligoadenylate synthetase activity 0,010 OAS1 GO:19215: intermediate filament binding 0,007 FTCD GO:19911: structural constituent of myelin sheath 0,036 MOBP GO:19992: diacylglycerol binding 0,012 PRKCE, PRKCG GO:30106: MHC class I receptor activity 0,027 RT1-AW2 GO:30295: protein kinase activator activity 0,046 CAMKK2 GO:30409: glutamate formimidoyltransferase activity 0,003 FTCD GO:30412: formimidoyltetrahydrofolate cyclodeaminase activity

0,003 FTCD

GO:3700: transcription factor activity 0,000 NR4A3, TRPV6, BHLHE40

GO:4563: beta-N-acetylhexosaminidase activity 0,017 GM2A GO:4568: chitinase activity 0,027 CHI3L1 GO:45735: nutrient reservoir activity 0,010 CHI3L1 GO:4697: protein kinase C activity 0,001 PRKCE, PRKCG GO:4966: galanin receptor activity 0,010 GALR2 GO:5198: structural molecule activity 0,009 COLQ GO:5199: structural constituent of cell wall 0,020 CR16 GO:5227: calcium activated cation channel activity 0,017 TRPV6 GO:5313: L-glutamate transporter activity 0,043 SLC17A6 GO:5319: lipid transporter activity 0,041 GM2A GO:5516: calmodulin binding 0,014 TRPV6, LSP1, GO:5542: folic acid binding 0,036 FTCD GO:8035: high-density lipoprotein binding 0,023 ABCA1

132

KEGG p-érték Géntermék rövidítése

ABC transporters - General 0,012 NM_178095, ABCA1

One carbon pool by folate 0,039 FTCD

Type I diabetes mellitus 0,045 NM_001008842, RT1-AW2

GenMapp p-érték Géntermék rövidítése

Hypertrophy Model 0,000 NR4A3 Statin Pathway(PharmGKB) 0,009 ABCA1 Nuclear receptors in lipid metabolism and toxicity 0,012 ABCA1 EGFR1 Signaling Pathway 0,013 PRKCG

19. táblázat: Validált, de az in silico kiértékeléssel ellentétes génexpressziós specificitást mutató gének.

Az egyes génnevek mellett megadtam, hogy melyik agyrégióban tapasztaltunk pozitivitást real-time PCR-al és melyikben a microarray-en történt hibiridizációval. Az egyes nyilak a változás irányát jelölik.

Génnév Real-time PCR-al pozitivitás Microarray eredmény

Abca1 Hipp Pfc Pfc ▼

Colq Hipp Pfc Pfc ▼

Lsp1 Hipp Pfc Pfc ▲

Prkcg Hipp Pfc Pfc ▲

Ret Hipp Pfc Pfc ▼

RT1-CE4 Hipp Pfc Pfc ▲

Tbx3 Hipp Pfc ▲

Tff1 Hipp Pfc Pfc ▼

Aadat Hipp Pfc Hipp ▲

Acaa2 Hipp Pfc Hipp ▼

Agrp Hipp Pfc Hipp ▲

Alb Pfc Hipp ▲

Bst2 Hipp Pfc Hipp ▲

Cd52 Hipp Pfc Hipp ▲

Cdk10 Hipp Pfc Hipp ▼

Ednrb Pfc Hipp ▲

Gabra4 Pfc Hipp ▲

Gal Hipp Pfc Hipp ▲

133

Ihpk2 Pfc Hipp ▼

Il22ra2 Hipp Pfc Hipp ▼

Itgam Hipp Pfc Hipp ▼

Kcnj12 Hipp Pfc Hipp ▲

Lars Pfc Hipp ▲

Mx2 Hipp Pfc Hipp ▲

Pde10a Hipp Pfc Hipp; Pfc ▼

Prim1 Hipp Pfc Hipp ▼

Pter Hipp Pfc Hipp ▲

Ptprv Hipp Pfc Hipp ▼

Retsat Hipp Pfc Hipp ▲

RT1-M6-2 Hipp Pfc Hipp ▼

Sncg Hipp Pfc Hipp ▼

Sik1 Hipp Pfc Hipp ▲

Tnfrsf1b Pfc Hipp ▲