1

A komplement rendszer gyakorlati vonatkozásai

(ÁOK 2012)

Buzás Edit

Fülöp A. K. (Szerk.): Immunológiai szemináriumok, 4. fejezet.

2

Rövid tartalom

• Bevezetés• Az aktivációs utak mérése

– Aktivitás– Komponensek

• A komplement aktivitás mint eszköz (mérés komplement aktiválás segítségével)

• A komplement aktiváció szabályozásának betegségei– Egy példa

3

A komplement rendszer

A veleszületett immunitás szolubilis molekuláris rendszere.

A komplement rendszer fehérjéi limitált proteolízissel kaszkádszerűen aktiválják egymást

A komplement rendszer fő effektor funkciói:• a pathogének lízise• opszonizáció

• a pathogén eliminációja• immunkomplexek, apoptotikus testek és nekrotikus

sejttörmelék eltávolítása• gyulladáskeltő hatás

4

C4bC2b

C2bC2a

Klasszikus útvonal Lektin útvonal Alternatív

útvonal

Membrane attack complex (MAC)

5

A szövettenyésztésben alkalmazott magzati borjúsavót miért célszerű 56oC-on 30 ‘-ig inkubálni?

A szérum komplement tartalmának inaktivációja a cél (mely révén pl. komplement mediálta sejtlízis és/vagy opszonizáció következhetne be in vitro)

6

Mire utalhat az alábbi kísérlet eredménye?

birka vvt + anti birka vvt antitest

birka vvt + anti birka vvt antitest + humán szérum

birka vvt + anti birka vvt antitest + 56oC 30’-ig előinkubált humán szérum

A szérum komplement tartalmának hatására az antitestek által kötött vörösvértestek lízise következik be (Hgb szabadul ki). Hő hatására a

komplement inaktiválódik.

7

• Értéke annak a szérumhígításnak a reciproka, mely az antitesttel fedett birka vvt-k 50% -át lizálja.• A CH50 mérés a klasszikus komplement aktiváció mérésére alkalmas. Azt tükrözi, mely mértékben képes a szérum komplement tartalma birka vvt-ket lizálni.

• Értéke csökken, ha az egyes komplement fehérjék • hiányoznak (komplement deficiencia) vagy • felhasználódnak (pl. bizonyos vasculitisekben).

Össz-komplement aktivitás mérés (CH50 teszt)

8

+ savó(amiben mérjük akomplement aktivitást)

Hemoglobin meghatározás

+ savó(amiben mérjük akomplement aktivitást)

+ savó(amiben mérjük akomplement aktivitást)

sC5b-9 meghatározás

G6PDH meghatározás

C aktiváció

hemolízis

lipolízis

+ savó(amiben mérjük akomplement aktivitást)

vvs ellenes antitest(hemolizin)

vvs

+ savó

komplement aktivitást)komplement aktivitást)(amiben mérjük a

komplement aktivitást)

Liposzóma membránellenes antitest

liposzóma

G6PDH

+

+

aggregált Ig

A

B

C

CH50 meghatározás

- reagens kontroll(RK

- lízis kontroll( LK): deszt. víz

- mintából(M) higítási sor

100%

CH50 meghatározás

- reagens kontroll( ): szérum nélkül

- lízis kontroll( ): deszt. víz

- mintából( ) higítási sor

E – E /E = y y * 100 = lízis %

ml szérum

Hemolízis

50%

CH50 = 1 ml / x ml

1

0,1 xml szérum

1

y/1 y

0,1

M RK LK

Össz-komplementtitrálási módszerek alapelvei

Hemolitikusteszt

CH50 ekvivalensELISA

Liposzóma-immunassay

11.3. ábra A CH50/ml érték kiszámítása

9

Normál komplement értékek

Szérum CH50: 142-279 CH50 egységTestnedvekben: az előző 1/3-a, ¼-e-----------------------------------------------------------------------

C1 szint: 16-33 mg/dLC3 szint: férfi: 88-252 mg/dL

nő: 88-206 mg/dLC4 szint:

férfi: 12-72 mg/dLnő: 13- 75 mg/dL

10

Az emelkedett vagy csökkent CH50 érték lehet a gyakoribb?

A leggyakrabban emelkedett érték mérhető, hiszen a legtöbb komplement fehérje akutfázis fehérje is egyben.

A komplement fehérjék hiánya vagy szignifikánsan csökkent szintje rekurrens sinopulmonaris bakteriális fertőzésekre, Neisseria által okozott meningitisre vagy sepsisre hajlamosít.

11

Mire utalhat a csökkent CH50 érték?

Primér hiány: genetikai

Szekunder hiány: elégtelen termelődés vagy fokozott felhasználás (A CH50 értéke gyakran csökken immunkomplex megbetegedésekben, pl. SLE.)

12

Mit mondhatunk ki teljes biztonsággal, ha az összkomplement (CH50) érték normál

tartományba esik?

A normál CH50 érték arra utal, hogy valamennyi komplement komponens (C1 -C9,) jelen van. Ugyanakkor egyes komplement faktorok szintje akár 50 - 80% -kal is csökkenhet a nélkül, hogy a CH50 aktivitás változna. Minthogy gyulladásos betegségekben a szintézis fokozódik, ezért a normál értékek nem jelentik, hogy nincs komplement által közvetített szövetkárosodás.

13

Melyik komplement fehérje van jelen a legnagyobb koncentrációban?

C3

C4bC2b

C2bC2a

14

Mire utal a C3 és C4 együttes csökkenése?

Klasszikus komplement aktivációra utal.

C4bC2b

C2bC2a

15

Mire utal, ha a C3 szint csökken a C4 érték viszont normál tartományba esik?

Az alternatív út aktiválódását jelzi

C4bC2b

C2bC2a

16

A betegek szérumszintje normál tartományba esik vagy emelkedett.

Miért?

Csökkent CH50 titer és komplement fehérje szint jellemzi pl. a rheumatoid arthritises vagy gonococcus arthritises

synoviális folyadékmintákat.Milyen lehet a betegek szérumszintje?

17

A komplement rendszert vizsgáló további módszerek I.

Alternatív komplement aktiváció vizsgálható, ha a elvonjuk a klasszikus és MBL úthoz szükséges Ca2+ ionokat a Ca-kelátor EGTA-val, és feleslegben biztosítjuk az alternatív aktivációhoz szükséges Mg2+ ionokat

18

A komplement rendszert vizsgáló további módszerek II.

Az MBL útvonal vizsgálható, ha a C1q-t blokkoljuk antitesttel (Mab 2204), és kizárjuk az alternatív út lehetőségét (mely >1% savó mellett működik), s így 0,1%-1% savókoncentráció között az MBL út mérhető

19

További vizsgálómódszerek a komplement komponensek mérésére

• ELISA: Pl. C3 mennyisége• Komplementaktivációs ELISA• Komplement fehérjék expressziója: RT-

PCR • Komplement receptor expresszió

kimutatása: RT-PCR, FACS

20

Komplement kötésen/ felhasználódásán alapuló

vizsgálati módszerek

21

antigén

+ komplement

+ indikátor sejt

indikátor sejtlízis

C

C

C

C

C

C

C

C

CC

C

CC

C CC C

C C

IK

komplementkonzumpció

nincskomplementkonzumpció

nincslízis

Immunkomplexek kimutatása/mérése komplement-fixációs (-konzumpciós) teszttel

IC

22

IKK

jelzett anti Ig

jelzett anti Ig

IKK

anti C3

anti C1q

Immunkomplex ( IC) kimutatása ELISA-val

IC

IC

23

A megfelelő HLA-specifitású ellenanyag hozzákötődik a sejtekhez, aktiválja a komplementet: lízis. A tipizáló savók többször terhes nőkből vagy többszörös vérátömlesztésen átesett személyektől származhatnak

HLA-tipizálás komplement függő mikrolimfocitotoxicitási teszttel

Terasaki plate

24

A komplement rendszer aktiválódási útvonalai és szabályozásuk

25

A komplementrendszer betegségeia kaszkád molekulák primer (genetikai eredetű) deficienciái

Nem feltétlenül a sejtek lízise a leglényegesebb fukciója a

komplement rendszernek!?

26

A komplementrendszer betegségei – szabályozó molekulák,receptorok

27

Örökletes angioneurotikus ödéma (HANO)(örökletes C1INH hiány)

Ugyanaz a személy krizis alatt és után

28

• 17 éves lány súlyos hasi fájdalmakkal (gyakori, éles görcsök, hányás)• appendectomia – appendix normális volt• a családban már korábban is előfordult a betegség• Dg: HANO ?• a C1INH szintje a normál érték 16%-a (ELISA)• Naponta szedhető steroid hatására a tünetek gyakorisága és súlyossága csökkent• Tisztított C1INH – időnként i.v.

Fő tünetek:• bőr, belek, légutak duzzanata• súlyos akut hasi fájdalom, hányás• ödéma különféle helyeken (gégeduzzanat – fulladást okozhat)

29

C4bC2b

C2bC2a

A komplement rendszer aktivációja gyakran hisztamin és kemokinek felszabadulását eredményezi ( fájdalmat, hőemelkedést és viszketést okozva).

A HANO-s betegek ödémája miért nem tartalmaz celluláris komponenseket és miért nem okoz viszketést?

• HANO-ban az aktív C1 miatt a C4b és a C2b szabadon termelődik a plazmában.

• A C4b gyorsan inaktiválódik, ha nem tud azonnal sejtfelszínhez kötődni. A C4b és C2b így folyamatosan elhasználódik, de nem keletkezik C3/C5 konvertáz, ezért a C3 és C5 hasítása elmarad, nem jön létre C3a és C5a sem.

• A komplement aktiválást követő hisztamin felszabadulást (hízósejt degranuláció) a C3a okozza, a fő kemotaktikus hatású komplement komponens pedig a C5a.

Stop

30

A C1-INH gátolja a kinin kaszkádot is!

Mivel C5a és C3a nem termelődik, nem azok gyulladáskeltő hatása felelős az ödémáért.

31

Mely komplement komponensek szintjének csökkenése várható? Miért?

• C2 és C4, mert ezeket az állandóan aktív C1 hasítja (diagnosztikai marker)

C4bC2b

C2bC2a

32

Mi történik az alternatív úttal?

Ez az út nem érintett, mert itt a C1 nem játszik szerepet. C4bC2b

C2bC2a

33

Milyen a terminális komponensek szintje?

A terminális komponensek szintje normális.

C4bC2b

C2bC2a

34

Miért nem fogékonyabbak a fertőzésekkel szemben?

Az alternatív útvonal érintetlen, így ez kompenzál. C4bC2b

C2bC2a

35

• Ha anafilaxia okozza (hisztamin felszabadulás), akkor azonnal reagálni fog adrenalinra/epinefrinre, és csalánkiütés is megfigyelhető.

• HANO-ban az adrenalin nem hat, intravénás C1INH kell.

Hogyan lehet eldönteni, hogy anafilaxiás reakció vagy örökletes angioödéma okozza-e a

felső légutak elzáródását (gégeödémát)?

36

1) A természetes immunválasz melyik komponensével (komponenseivel) találkozik először az extracelluláris kórokozó legnagyobb valószínűséggel?

2) A komplement rendszer milyen effektor mechanizmussal járul hozzá a pathogén eliminációjához?3) Hogy nevezik a célsejt lízisét okozó makromolekuláris komplexet?4) Mi az opszonizáció? 5) Mi szükséges az fagocitózishoz még az opszoninen kívül?

Ellenőrző kérdések

6) Milyen receptorok vehetnek részt a patogén fagocitózisában?7) Mi a szerepe a kis komplement komponenseknek?