A parlagfű gyombiológiai valamint egészségügyi szempontból

DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS

CSEH ANDRÁS ATTILA

PANNON EGYETEM

GEORGIKON KAR

KESZTHELY

2010

2

A PARLAGFŰ GYOMBIOLÓGIAI VALAMINT EGÉSZSÉGÜGYI

SZEMPONTBÓL LEGLÉNYEGESEBB TULAJDONSÁGAINAK

MOLEKULÁRIS GENETIKAI VIZSGÁLATA

NÖVÉNYTERMESZTÉSI ÉS KERTÉSZETI TUDOMÁNYOK

DOKTORI ISKOLA

iskolavezető: Dr. Gáborjányi Richárd

egyetemi tanár, az MTA doktora

témavezető: Dr. Taller János

tudományos főmunkatárs

DOKTORI ÉRTEKEZÉS

Cseh András Attila

Ph.D. hallgató

Keszthely 2010

3

A PARLAGFŰ GYOMBIOLÓGIAI VALAMINT EGÉSZSÉGÜGYI SZEMPONTBÓL LEGLÉNYEGESEBB TULAJDONSÁGAINAK

MOLEKULÁRIS GENETIKAI VIZSGÁLATA

Írta:Cseh András Attila

Készült a Pannon Egyetem Növénytermesztési és Kertészeti Tudományok

Doktori Iskolája keretében

Témavezető: Dr. Taller János

Elfogadásra javaslom (igen / nem)

…………………………………..

(aláírás)

A jelölt a doktori szigorlaton …......... % -ot ért el,

Keszthely, 2010.

…………………………………...

a Szigorlati Bizottság elnöke

Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom:

Bíráló neve: …........................ …................. igen /nem

…………..……………………….

(aláírás)

Bíráló neve: …........................ …................ igen /nem

…………...……………………….

(aláírás)

A jelölt az értekezés nyilvános vitáján ….............% - ot ért el

Keszthely,

………...………………………….

a Bíráló Bizottság elnöke

A doktori (PhD) oklevél minősítése….................................

……………………………………

Az EDT elnöke

4

Kivonat

A parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.) invazív gyom Európában és hatalmas

egészségügyi és gazdasági károkat okoz. Magyarországon az elsőszámú gyomnövény és

a pollene a legveszélyesebb allergének közé tartozik. A fentiek miatt célul tűztük ki,

hogy a parlagfű származásának és terjedésének nyomonkövetésére anyai öröklésű

markereket fejlesszünk, valamint a triazinokkal és az ALS-gátló herbicidekkel szembeni

rezisztencia gyors DNS szintű kimutatását és az amb a I géncsalád pontosabb

megismerését.

A különböző parlagfű populációk genetikai összehasonlításához a kloroplasztisz és

mitokondrium nem kódoló régióit PCR-RFLP módszerrel vizsgáltuk. Az anyai öröklésű

markerek alapján, az általunk vizsgált magyarországi parlagfüvek genetikai értelemben

a kanadaiakhoz álltak közelebb, az USA-ból származók pedig távolabbi csoportot

alkottak.

Az atrazin rezisztens és szenzitív parlagfüvek psbA génjét szekvenáltuk.

Bizonyítottuk, hogy a gén egyetlen pontmutációja felelős a rezisztencia kialakulásáért,

hasonlóan más gyomnövényekhez. Restrikciós enzimeket és bi-PASA primereket

használva kimutattuk, hogy a rezisztens parlagfüvekben a psbA gén szenzitív változata

is megtalálható.

Magyarországi parlagfüvekből és a ’Nova’ napraforgó fajtából az ALS-gátló

herbicidek célgénjének A és B régióját szekvenáltuk és elemeztük. Ha Magyarországon

is megjelenne a rezisztens biotípus, akkor eredményeink felhasználásával a rezisztencia

DNS szinten is igazolható.

A parlagfű pollen allergén fehérjéjét kódoló amb a I gén első felét amplifikáltuk

szekvencia specifikus primerekkel magyarországi parlagfüvekből. Szekvencia

specifikus primerekkel nem sikerült felszaporítanunk a teljes gént, így közvetve

bizonyítottuk a gén változékonyságát és azt, hogy a parlagfű genomban több helyen

kódolt az Amb a I fehérje.

5

ABSTRACT

Common ragweed (Ambrosia artemisiifolia L.) is an invasive weed in Europe,

causing important economic and public health damage. Ragweed is the most

widespread weed in Hungary and is recognized as the most dangerous pollen allergen.

For these reasons, the aims of the present study were to reveal the origin and sperad of

ragweed by developping maternally inherited markers and to detect the resistance

against triazine and ALS–inhibitor herbicides at the DNA level and to expand

knowledge involving the amb a I gene family.

In order to compare different ragweed populations non coding regions of the

chloroplast (cp) and mitochondrial (mt) DNA of common ragweed were analysed by

PCR-RFLP. It was demonstrated that the analysed ragweed plants, collected from

Hungarian populations, may have originated from Canada, rather than the United

States.

The psbA chloroplast gene of atrazine-resistant and susceptible A. artemisiifolia

plants were sequenced. It was demonstrated that the atrazine resistance of ragweed is

caused by a single point mutation in the gene, similarly to other weeds. Restriction

enzyme analysis and bi-PASA primers detected both the atrazine-resistant and

susceptible types of the psbA gene in atrazine-resistant plants.

Regions A and B of the ALS gene (the target gene of ALS-inhibitor herbicides) of

Hungarian ragweed plants and that of the sunflower cultivar ‘Nova’ were also

sequenced in the present study. Our results make it possible to confirm the ALS

resistance in the case that the resistant biotype appears in Hungary.

Sequence-specific primers were used to amplify the Amb a I gene, which encodes the

major allergen of the ragweed pollen with the objective to define polymorphic gene

variants in the Hungarian populations. Sequence specific primers did not amplified the

complete gene, so the polymorphism of the gene was prouved indirectly and also that

the Amb I protein is encoded by multiple loci.

6

ABSTRACT

L ADN chloroplastique et mitochondrial de l’ambroisie á feuilles d'armoise (Ambro-

sia artemisiifolia L.), faisant partie des especes envahissantes et posant d'importants

problemes a la santé humain, avait etait analysé par PCR-RFLP. La detection des

variable regions de l’ADN chloroplastique et mitochondrial aide a charactériser les

relations genetiques entre differents populations. Ces analyses ont confirmé que les

plantes d’ ambroisie de la population hongroise sont plus proches de la poplulation de

Canada plutot que des Etats Units.

Un gene chloroplastique (psbA ) a été amplifié et sequencé ce qui a révélé que l’

atrazine tolérance de l’ambroisie est la conséquence d’ une point-mutation dans ce gene.

Restriction enzymes et PASA primaires paires ont demonstré que les plants resistants a

l’atrazine contient les deux formes (resitant et sensitives) de la psbA gene.

L’ ALS gene (le target gene des ALS-inhibitor herbicides) de l’ambroisie

hongroise et de tournesol NOVA ont été analyses dans le présent travail. La region A et

B de l’ALS gene étaient sequencés pour les comparer avec les populations americains.

Sequence-specifiques primaires etaient utilisés pour analyser l’Amb a I gene, qui

est responsable pour le majeur allergen de l’ambroisie pour obtenir les gene-variétés

dans la population hongroise.

7

Rövidítések Jegyzéke

ALS: Acetolaktát-szintetáz

bp: bázispár

cDNS: complementary DNS

cpDNS: kloroplasztisz DNS

EDTA: Ethylen-diamine tetra-acetic acid

IPTG: isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside

knt: kilonukleotid

mtDNS: mitokondrium DNS

nt: nukleotid

PASA: PCR Amplification of Specific Alleles

PCR: Polymerase Chain Reaction

RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism

SSR: Simple Sequence Repeat

SNP: Single Nucleotide Polymorphism

X-Gal: 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside

8

Tartalomjegyzék

1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉSEK............................................................111.1. Célkitűzések.........................................................................................................14

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS............................................................................152.1. A gyom fogalma..................................................................................................152.2. A parlagfű (Ambrosia altemisiifolia L.) általános jellemzése.......................152.2.1. Morfológia és taxonómia...................................................................................152.2.2. Származása és elterjedése..................................................................................172.2.3. Szaporodásbiológiája.........................................................................................192.2.4. A parlagfű kórokozói..........................................................................................212.5.5. A parlagfű ellen alkalmazott védekezési eljárások............................................222.3. A kloroplasztisz és mitokondrium genom sajátosságai..................................232.3.1. A kloroplasztisz-genom......................................................................................242.3.2. A mitokondriális genom.....................................................................................252.4. Molekuláris genetikai vizsgálati módszerek és molekuláris markerek........252.4.1. Restrikciós fragmentumhossz polimorfizmus (RFLP)........................................25

2.4.2. Polimeráz láncreakció (PCR).............................................................................26 2.4.3. Szekvencia specifikus primerek (SCAR).............................................................26 2.4.4. PCR-RFLP..........................................................................................................26 2.4.5. PASA (PCR amplification of specific alleles).....................................................26 2.4.6. Bi-PASA (bidirectional-PASA)...........................................................................27 2.5. A Genetikai távolság értékelése........................................................................27 2.6. A triazin-rezisztencia..........................................................................................28 2.6.1. Az 1,3,5-triazinok rövid jellemzése.....................................................................28 2.6.2. A triazin-rezisztencia mechanizmusa és öröklődése...........................................29 2.6.3. A parlagfű atrazin-rezisztens biotípusának elterjedése Magyarországon.........31

2.7. Az acetolaktát–szintetáz (ALS) működést gátló herbicidekkel szembeni rezisztencia.................................................................................................................32

2.7.1. Az ALS-gátló herbicidek rövid jellemzése..........................................................322.7.2. Az ALS-gátlókkal szembeni rezisztencia mechanizmusa és öröklődése a gyomnövényekben.........................................................................................................322.8. A parlagfű pollenallergia és az Amb a I géncsalád.......................................34

3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK......................................................................353.1. Növényanyag.......................................................................................................353.1.1. A filogenetikai összehasonlításra használt egyedek...........................................353.1.2. A triazin rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálatához felhasznált növények......................................................................................................................................353.1.3. Acetolaktát–szintetáz (ALS) működést gátló herbicidek célgénjének szekvenálásánál vizsgált növények...............................................................................363.1.4. Az Amb a I géncsalád vizsgálatánál tesztelt növények.......................................363.2. Molekuláris vizsgálatok.....................................................................................363.2.1. DNS izolálás.......................................................................................................363.2.2. DNS amplifikálása polimeráz láncreakcióval (PCR).........................................373.2.2.1. A kloroplasztisz és mitokondrium genom vizsgálata.......................................383.2.2.2. A psbA gén felszaporítása restrikciós emésztéshez és szekvenáláshoz...........403.2.2.3. A psbA gén allél specifikus felszaporítása Bi-PASA (bidirectional-PCR amplification of specific alleles) primerekkel..............................................................41

9

3.2.2.4. Az ALS-A és ALS-B fragmentum amplifikálása..............................................413.2.2.5. Az Amb a I géncsalád vizsgálata specifikus primerekkel................................413.2.3. Restikciós enzimek használata...........................................................................433.2.3.1. A kloroplasztisz és mitokondrium DNS-ének PCR-RFLP vizsgálata..............433.2.3.2. A psbA gén rezisztenciát okozó pontmutációjánál vágó enzimek...................433.2.4. DNS elválasztás gélelektoforézissel és értékelés................................................43

3.2.5. DNS fragmentumok tisztítása gélből..................................................................44 3.2.6. Klónozás és szekvenálás.....................................................................................44

3.2.7. A filogenetikai és a szekvencia adatok értékelése..............................................454. EREDMÉNYEK...................................................................................................47

4.1. A parlagfű populációgenetikai viszgálata PCR-RFLP módszerrel fejlesztett anyai öröklésű markerek segítségével .............................................................474.2. Herbicid célgének és rezisztenciát okozó mutációk jellemzése a parlagfűben.................................................................................................................524.2.1. Az atrazin-rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálata...................................524.2.1.1. A psbA gén rezisztens és fogékony alléljának kimutatása...............................554.2.2. Az ALS-gátlókkal szembeni rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálata........604.3. A parlagfű pollen fő allergénjét kódoló Amb a I géncsalád vizsgálata szekvencia specifikus primerekkel...........................................................................65

5. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK.............................................685.1. Parlagfű populációk genetikai összehasonlítása............................................685.2. A parlagfű triazin-rezisztenciájának molekuláris genetikai háttere............705.3. A parlagfű ALS-gátló herbicidekkel szembeni rezisztenciája.......................715.4. Az Amb a I géncsalád molekuláris genetikai vizsgálata szekvencia specifikus primerekkel...............................................................................................73

6. ÖSSZEFOGLALÁS............................................................................................757. Irodalomjegyzék...................................................................................................778. Új tudományos eredmények.............................................................................879. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS..........................................................................9010. Az értekezés témakörében megjelent publikációk, előadások...........9111. Mellékletek............................................................................................................95

10

1. Bevezetés és célkitűzésekAz ürömlevelű parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.) hatalmas humán egészségügyi

és gazdasági károkat okoz Magyarországon. Ennek a problémának a nagyságát jelzi,

hogy 2004 óta kormányzati szintre emelkedett a parlagfű elleni küzdelem. Megalakult a

"Parlagfűmentes Magyarországért" Tárcaközi Bizottság, melynek célja a parlagfű elleni

harc irányítása, koordinációja. A bizottság állásfoglalása szerint a parlagfű borítottság

és ezzel együtt a parlagfű pollenkoncentrációjának a csökkentését csak az egész

társadalom szervezett erőfeszítéseivel, anyagi, szellemi erőforrásainak, egyéni

kezdeményezéseinek mozgósításával és hatékony felhasználásával lehet elérni.

Az utóbbi néhány évtizedben a parlagfű szó szerint meghódította a Kárpát-medencét,

és úgy tűnik inváziójának egyik égtáj irányában sem sikerül gátat vetni. E gyors terjedés

legkellemetlenebb mellékhatása a pollen által kiváltott allergia, amitől már minden

negyedik-ötödik honfitársunk szenved (Makra és mtsai 2004). Emellett, a parlagfű

irtására vonatkozó szigorú rendelkezések ellenére, az A. artemisiifolia az utóbbi

években a legelterjedtebb gyomnövényünkké vált.

Növényvédelmi szempontból meghatározó kérdés a mezőgazdasági termelésben a

gyomirtás. Az éves növényvédőszer felhasználás nagy részét a herbicidek teszik ki. A

gyomszabályozást többek között a gyomflóra dinamikus változása és herbicidrezisztens

változatok megjelenése nehezíti.

Jól ismert jelenség az új fajok megjelenése, egyes gyomfajok előretörése,

ökológiai illetve termesztéstechnológiai változás vagy emberi beavatkozás hatására egy

adott ökoszisztémában. Ezt figyelhettük meg a parlagfű Európába, és közelebbről a

Kárpát-medencébe való behurcolása esetében is, amit jól alátámasztanak az országos

gyomfelvételezések adatai. Az A. artemisiifolia 1947–53 között a borítottságot tekintve

0,39 százalékkal még csak a 21. volt, de az 1996–1997. évi felvételezésen 4,7

százalékkal a fontossági sorrendben már az első helyen végzett. A legújabb 2007-2008.

évi Országos Szántóföldi Gyomfelvételezés szerint 5,3 %-ra nőtt a borítása.

A parlagfű európai megtelepedése, hogy egy vagy több centrumból indult ki, illetve

terjedésének pontos útvonala sem ismert. Az invázió nyomonkövetése érdekes lehetne

gyombiológiai és növényvédelmi szempontból egyaránt. Ezeknek a nehéz kérdéseknek

a megválaszolásához nyújthatnak segítséget az egyes régiókra, biotípusokra jellemző

molekuláris markerek. A parlagfű kizárólag magokkal szaporodik, ezért célravezető az

11

anyai öröklésű kloroplasztisz és mitokondrium specifikus markereket használni a

terjedés nyomonkövetésére, a megbízhatóság és a nukleáris genomnál egyszerűbb

vizsgálhatóság miatt.

Az energia-központként funkcionáló mitokondrium és a fotoszintézis helye, a

kloroplasztisz kulcsfontosságú sejtszervecskéi a növénynek. Fontosságukat

nyomatékosítja, és sejten belüli részleges „autonómiájukat” mutatja, hogy mindkét

organellum rendelkezik önálló DNS-sel, és a génjeikben bekövetkező változás a teljes

növényre kihat, amire jó példa a citoplazmás hímsterilitás, vagy a triazin-rezisztencia.

1992-ben Somogy megyében találták az első triazin-rezisztens parlagfüvet, és alig

kilenc év elteltével, 2001-ben már Békés megyében is megtalálható volt a rezisztens

biotípus. A felvételezést végző szakemberek szerint ma már Magyarországon

mindenhol előfordul a triazin-rezisztens változat. Elgondolkodtató, hogy noha a triazin-

rezisztencia a kloroplasztisz genomban kódolt mutáció következménye, és így anyai

öröklésű - tehát pollennel nem terjed - mégis a parlagfű esetében néhány év elég volt,

hogy százkilométeres távolságokra megjelenjen a triazinszármazékoknak ellenálló

biotípus. Vajon mezőgazdasági munkagépekkel, járművekkel, ha akaratlanul is, de

terjesztjük a rezisztens magokat, vagy pedig az ugyanazzal a szerrel történő kezelés

kiváltotta szelekciós nyomással, folyamatosan indukáljuk a rezisztenciát? Valószínűleg

mindkét lehetőség igaz, és annyi a közös bennük, hogy bizonyos fokú gondatlanság

eredményei.

A közeljövő nagy feladata, az ALS-gátló herbicidekre rezisztens parlagfű biotípus

magyarországi megjelenésének a megakadályozása, ill. felkészülés a rezisztens parlagfű

terjedésére, gyors monitoring rendszer kidolgozása és erre alapozott pontos gyomirtási

tanácsadások készítése. Az Amerikai Egyesült Államokban 1998-ban jelent meg a

rezisztens biotípus. A kutatások során feltárták a rezisztencia genetikai okát, ami az ALS

génben meghatározott helyeken bekövetkező öt pontmutáció bármelyike lehet. Mivel

egy sejtmagi gén mutációja felelős a rezisztenciáért, ezért a mutáns genotípus a

pollennel is terjedhet, így sokkal gyorsabb és nagyobb területeket érintő invázióra kell

számítani, mint a triazin rezisztencia esetében.

A jelenlegi helyzetet tekintve félő, hogy az ország nagy részét kitevő mezőgazdasági

művelés alatt álló területeken - mezőgazdaságunk általános állapota miatt - a parlagfű

továbbra is megfelelő feltételeket fog találni magának. Ugyanakkor meg kell

jegyeznünk, hogy a parlagfű terjedésének okai nemcsak mezőgazdaságunk kedvezőtlen

viszonyaiban keresendők, hanem kedvező biológiai tulajdonságai és a természetes

12

ellenségeinek hiánya is segítette. Noha jelenleg Európa legfertőzöttebb területének

mondható Magyarország, további terjedése várható az egész kontinensen.

Lengyelországban, pl. már Varsó magasságában is megtalálták, és fertőzött Bulgária ill.

Románia nagy része is. Franciaország középső és a földközi-tengeri részén, és

Olaszországban is elterjedt. Az utóbbi években regisztrálták nagyarányú terjedését

Ausztriában és Svájcban is. Géncentrumában, Észak Amerikában is a fertőzés

erősödését tapasztalják.

Környezetvédelmi szempontból nemcsak a gyomirtó szerek jelentenek problémát a

parlagfű elleni védekezésben. A nem szakszerűen végzett kaszálás következtében a

talajhoz közel eső rügyekből erős oldalhajtás képződés indul meg, melyek hatalmas

mennyiségű pollent és magot produkálnak. Ugyanakkor a rendszeres kaszálásnak

országos szinten hatalmas az üzemanyagigénye, ami jelentős légszennyező. Megoldás

lehetne a fiatal növények gyökerestül történő kézi kitépése, de erre a fertőzött terület

méretei miatt egyszerűen nincs, és nem is lesz kapacitás. A védekezés hatékonyságának

növeléséhez és az új eljárások kidolgozásához szükség van új, más szemléletű

kutatásokra.

Az elmúlt pár évtizedben szemtanúi lehettünk a molekuláris genetikai vizsgálati

módszerek látványos fejlődésének. Ugyanakkor jelentősége ellenére, nemcsak hazai

szinten, de világviszonylatban is kevés szakirodalom található a parlagfű molekuláris

genetikai vizsgálatáról. Genton és munkatársai (2005) mikroszatellit markerekkel

hasonlítottak össze észak-amerikai és franciaországi parlagfű populációkat. A

franciaországi populációkban nagyobb genetikai változatosságot találtak mint az

amerikaiakban, mely eredményből arra következtetnek, hogy több forrásból

történthetett a parlagfű inváziója. Amerikában Patzoldt és mtsai (2001) és Tranel és

mtsai (2004) vizsgálták az ALS-gátló herbicidekkel szembeni rezisztencia molekuláris

genetikai okait az A. artemisiifolia, Xanthium strumarium, Amaranthus hybridus és az

Amaranthus tuberculatus gyomfajokban.

Ez a kevés eredmény meglehetősen érthetetlen, hiszen orvos-biológiai vonatkozású

kutatások tömege jelzi a pollenallergia okozta probléma súlyosságát, de az allergiát

kiváltó növény molekuláris genetikai természetének megismerésével mégsem

foglalkoznak mélyebben.

A parlagfűpollen allergén fehérjéjét, már immunológusok azonosították, ezt az

összetett fehérjét az amb a I géncsalád kódolja. A génnek több cDNS szekvencia

váláltozata ismert. Alapkutatás szintű vizsgálatok szükségesek a gén szerkezetének jobb

13

megismeréséhez és hasznos információt jelenthetne a magyarországi génváltozatok

meghatározása is.

1.1 CélkitűzésekA fentiek miatt, a jelen kutatási program célja a parlagfűről molekuláris genetikai

információk gyűjtése, melyek felhasználhatóak további kutatásokhoz ill. közvetlenül

alkalmazhatóak gyombiológiai vizsgálatokhoz, így populáció-genetikai

összehasonlításokhoz, a triazinokkal és az ALS-gátló herbicidekkel szembeni

rezisztencia gyors DNS szintű meghatározásához és az amb a I géncsalád pontosabb

megismeréséhez.

14

2. Irodalmi áttekintés2.1 A gyom fogalma

A világ mezőgazdaságilag művelt területén átlagban 0-25%-nyi termésveszteséget

okoznak a kártevő rovarok, 10-15%-nyit a gyomok és mintegy 10-15%-ra tehető az

élősködő gombák, vírusok stb. okozta kár.

A gyom fogalmát, már többen is meghatározták:

Ujvárosi (1957) szerint gyomnak tekinthető minden olyan növény, amelyet nem

vetettünk, hasznot nem hoz, és jelenléte káros leginkább azzal, hogy a vetett növény

elől elfoglalja a helyet, vagy felhasználja a talaj tápanyag- és vízkészletét.

Hunyadi (1988) megfogalmazása szerint gyomnak nevezzük bármelyik fejlődési

stádiumban lévő olyan növényt vagy növényi részt (rizóma, tarack, hagyma,

hagymagumó, stb.), amely ott fordul elő, ahol nem kívánatos.

A parlagfű ezeknek a meghatározásoknak a kereteit is feszegeti, mert nem csak

jelenlétével káros és nem csak a kultúrnövényektől vesz el helyet és tápanyagot, ahol

előfordul ott biztosan nem kívánatos, hanem közvetlenül az emberre veszélyes allergén

pollent is termel.

2.2 A parlagfű (Ambrosia altemisiifolia L.) általános jellemzése

2.2.1 Morfológia és taxonómia

Az A. artemisiifolia ürömlevelű parlagfű a

fészkesek (Asteraceae) családjába, a csöves virágúak

(Asteroideae) alcsaládjába a parlagfű (Ambrosia)

nemzetségbe tartozó egyéves T4-es életformájú gyom. A

fajon belül három változatot különítettek el, ezek

közül Magyarországon szinte csak az A.

artemisiifolia var. elatior (L.) Descourtils változat

fordul elő (Szigetvári és Benkő 2004). A csíranövény

kelésekor a sziklevelek széles tojásdadok, lekerekített csúcsúak, rövid nyelűek (1. ábra).

Az első lomblevelek keresztben átellenesek és szárnyasan hasogatottak, a későbbi

lomblevelek pedig szórt állásúak, rövid nyelűek, kontúrjuk tojásdad, szárnyaltak,

szeldeltek. A legfelső szárlevelek esetenként tagolatlanok. A levelek színe sötétzöld,

vastagon, tompán szőrözött, fonákuk sötétszürke, sűrűn szőrözött (Béres és mtsai 2005).

15

A kifejlett növény közepes vagy nagy termetű, felálló, dúsan, terpedten elágazó,

tompán négyélű szárú növény, rányomott és elálló szőrökkel borítva. Levelei rövid

nyelűek egy-kétszeresen, szárnyasan szeldeltek. A szeletek tojásdadok, pelyhesek. Az

ágak végén füzérekben helyezkednek el a sárga porzós virágok, míg a termős virágok

lentebb, a füzérek alján, illetve a felső lomblevelek hónaljában ülnek. A termős fészek

egyvirágú, a termőt szőrös hatfogú burok zárja körül, amely a terméssel együtt hullik le

(Béres és mtsai. 2005).

Termését jellemezve elmondható, hogy az egymagú fészek külső héja a fészek

vackából és a murva pikkelyekből fejlődött ki, kehely alakú, a peremén 5-7 bütyökkel a

pikkelyek csúcsaival (1. ábra). A kehelyre csúcsos fedő borul. Az egymagvú fészek

sárgásbarna vagy szürkésbarna, érdes, fénytelen, törékeny. Ha ez a héj széttörik,

szabaddá válik a kaszat, amely citrom alakú csúcsa szélesen gömbölyű, rajta rövid

bibecsonk található. Ez fedi a tojás alakú faggyúszerű magot (Németh 2000).

1. ábra: Az ürömlevelű parlagfű szaporítóképletei: a – egymagvú fészek, b – kaszat. Ambrisia

artemisiifolia csíranövény (c). (Abonyi Zsuzsanna rajzai)

16

2.2.2 Származása és elterjedése

Az A. artemisiifolia Észak-Amerika déli területeiről származó egyéves növény. Az

Egyesült Államokból, ahol 1838-ban fedezték fel, mint gyomnövényt (Wagner és Beals

1958), többször is behurcolták Európába heremag, gabona és burgonya

szállítmányokkal. Németországban már az 1800-as évek közepe táján regisztrálták,

azonban klimatikus okokból, a termése nem tudott beérni, és így nem honosodott meg

(Hegi 1960). A tényleges megtelepedés és a felszaporodása az első világháború

környékén indult meg Fiume és Trieszt kikötői felől fertőzött gabonaszállítmányokkal.

A gyors terjedés a második világháború után kezdődött el. Az európai inváziójának két

központja volt: a kisebbik Délnyugat-Franciaországban, Lyon körzetében, a nagyobbik

Délnyugat-Magyarország és Horvátország határos részein (Szigetvári és Benkő 2004).

A parlagfű 1923-ban már megtalálható volt Somogy megyében (Lengyel 1923), majd

1924-ben Zala és Veszprém megyékben is (Moesz 1926). Később a Duna-Tisza közén

Szegedtől kiindulva terjedt északra (Tímár 1955). Ma már az ország teljes területén

megtalálható (2. ábra).

2. ábra: A parlagfű hazai elterjedése megjelenésétől a hetvenes évek végéig (Béres 1981). A

sötétebb színek a nagyobb borítottságot szemléltetik.

Az országos gyomfelvételezések adatai szerint az A artemisiifolia 1947 – 53 között a

borítottságot tekintve 0,39 %-kal még csak a 21. volt, de az 1996–1997. évi

17

felvételezésen 4,7 %-kal a fontossági sorrendben már az első helyen végzett (Novák és

mtsai 2009). A parlagfű mezőgazdasági művelés alatt álló területeken, szántóföldeken,

szőlőkben, gyümölcsösökben gyakori, de előfordul legelőkön, árokparton, útszéleken,

erdők szélén és különösen parlagon hagyott területeken terjed gyorsan. Gyakorlatilag

mindenhol megtalálható, még a városokban is (3. ábra).

3. ábra: A parlagfű fertőzöttség mértéke és a borítási %-a Magyarországon (Parlagfű

kézikönyv, 2007).

Kiss és Béres (2006) szerint az ürömlevelű parlagfű tömeges felszaporodásának okai

a következők lehetnek: közrejátszanak biológiai jellemzői, mint a nagyfokú

alkalmazkodó képessége, a hidegtűrő képességének növekedése, jó kompetíciós

képessége, talajjal szembeni igénytelensége, jó szárazságtűrése, gyors regenerálódó

képessége, rezisztens biotípusának kialakulása, allelopatikus hatású anyagok képzése.

Meghatározó szerepe azonban a helytelen emberi tevékenységeknek van, melyek a

múltban is elősegítették elszaporodását (Kiss és Béres 2006). Ezek a hibák a következők

lehettek: gyomos táblaszegélyek növekedése, gondozatlanul hagyott területek

gyarapodása, kezdeti védekezések elmulasztása, gyommaggal fertőzött vetőmag

használata, a bérmunkák során a művelő-, betakarító- és szállítóeszközökkel

széthurcolás, a szakismeret hiánya, a gyomirtási technológiák helytelen megválasztása

és jelentős költsége, a gabonatarlók ápolási munkáinak elhagyása, késői elvégzése és

18

rossz minőségű talajmunkák végzése (Tóth és mtsai 2001, Tóth és mtsai 2004, Szentey

és mtsai 2004).

2.2.3 Szaporodásbiológiája

A parlagfű hímnős növény, a porzós virágzatok a hajtások csúcsain, míg a termős

fészkek a felső lomblevelek hónaljában a porzós virágzatok alatt helyezkednek el. A

porzós virágzatban 10-100 halványsárga virág van (Basset és Crompton 1975). A pollen

viszonylag nagy 10-25 mikron átmérőjű. A termős fészkek rendszerint egyvirágúak,

ülők, és murvapikkellyel borítottak. A szaporítóképlet háromféle módon fordulhat elő:

egymagvú fészek, kaszat és mint csupasz mag (Schermann 1966), de a leggyakoribb a

fészek. A dús olajtartalmú mag faggyúszerű, tojásalakú. Ezer kaszat súlya 2,0-2,3

gramm (Béres 1981).

Az A. artemisiifolia csak magvakkal szaporodik. A növények kb. 95%-a monoikus,

egylaki növény. Előfordulnak azonban olyan egyedek is, amelyek kizárólag termős

virágokat hoznak, illetve olyanok, amelyeken vagy a termős vagy a porzós virágok

vannak túlsúlyban (Gebben 1965). Hegi (1960) szerint sűrű állomány esetén csaknem

kizárólag porzós, míg ritkább térállásban, jó talajon inkább termős virágokat hoz. A

termős virágok nyílását a porzósak mintegy 7-10 nappal megelőzik.

Elsősorban szélporozta növény, a pollenje akár több száz kilométerre is eljut (Bíró

2003). Egy gramm parlagfű pollenben 30-35 millió virágporszem van, és egyetlen

növény képes akár nyolcmilliárd virágporszemet is termelni (Juhász és Juhász 2002). A

virágzás legintenzívebb szakasza augusztusra esik, azonban július második felétől

szeptember végéig virágzik (4. ábra).

19

4. ábra: A parlagfű életciklusa (Béres 1981).

Az idegenmegporzás mellett önmegporzással is életképes magokat hoz létre. A

kisebb növények átlagos magszáma néhány száz, míg a közepeseké 3000 (Béres és

Hunyadi 1980), de a nagyobb növények magprodukciója a 62000-t is eléri (Dickerson

és Sweet 1971). A növény zöldtömege és magprodukciója között arányosan növekvő,

szoros összefüggés figyelhető meg (Dickerson 1968). A csírázási idő szintén

befolyásolja a maghozamot. Külföldi adatok szerint a május közepéig kikelt növények

átlagosan 32000 magot hoztak, míg a július elején kikeltek csak 3.100 darabot (Basset

és Crompton 1975). A frissen érett magvak ősszel nyugalomban vannak. A nyugalmi

állapot 8 hetes 4°C-on történő stratifikációval megszüntethető (Willemsen és Rice

1972). A magvak csírázását a változó hőmérséklet és a primer dormancia megszűnése

után a fény is segíti (Maguire és Overland 1959, Béres és Hunyadi 1980). A magvak

csírázását a gibberellines kezelés jelentősen nem fokozza (Kosikova, 1960). Toole és

Brown (1946) szerint a talajban tárolt magvak 39 évig megőrizték csírázóképességüket.

Béres és mtsai (2005) arra az eredményre jutottak, hogy a magnyugalmat a

termésekben lévő vízzel ki nem mosható endogén gátló anyagok felhalmozódása

okozza, melyek 6-12 hetes sztratifikáció után válnak inaktívvá. Az A. artemisiifolia

termések nyugalma tehát Crocker (1916) klasszikus felosztása alapján „endogén

anyagcsere akadályok” típusba sorolható.

20

2.2.4 A parlagfű kórokozói

Magyarországon eddig tíz növénykórokozó gomba jelenlétét mutatták ki az

ürömlevelű parlagfüvön (Entyloma polysporum, Albugo tragopogonis, Plasmopara

halstedii, Verticillium dahliae, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Macrophomina

phaseolina, Septoria epambrosiae, Sclerotinia sclerotiorum, Phyllachora ambrosiae)

(Kiss és mtsai 2003). Ezek közül csupán a Ph. ambrosiae és a P. halstedii okozott egy-

egy évben komolyabb károkat a hazai parlagfű állományban.

Az 1999-es évben az ország egész területén a Ph. ambrosiae okozott járványt (Bohár

és mtsai 2000, Vajna és mtsai 2000). Ebben az évben egy hónappal megrövidült a

parlagfű pollenszórási időszaka (Kiss és mtsai 2001). A járvány nem ismétlődött meg,

de sikerült meghatározni a Ph. ambrosiae rDNS ITS-régió nukleotid sorrendjét és

fajspecifikus primereket tervezni, így lehetővé vált a kórokozó kimutatása (Varga és

Kiss 2003).

A Plasmopara halstedii 2001 őszén okozott járványos megbetegedést az ürömlevelű

parlagfüvön (Vajna 2002). Ebben az időszakban a sokéves átlag egytizedére csökkent a

levegő parlagfűpollen koncentrációja (Kiss és mtsai 2003).

Kiss és mtsai (2003) szerint 6 amerikai gombafaj tűnik perspektivikusnak a biológiai

védekezésre: a Puccinia xanthii, P. canaliculata, P. conoclinii, Entyloma polysporum,

E. compositarum és Protomyces gravidus fajok. Ezeket a gombafajokat eddig még csak

Észak-Amerikában írták le a parlagfüvön, tehát ezek a parlagfűre specializálódott

rozsdagombák nem követték gazdanövényüket Európába (Kiss és mtsai 2003).

P. xanthii gombafajt csak amerikai herbáriumi gyűjteményekben sikerült kimutatni a

parlagfüvön, gyűjtőutakon nem találták meg, így csak az elméleti lehetősége adott a

gombafaj biológiai védekezésben való használatának (Kiss 2007). A parlagfű fertőzés

mérsékléséhez a biológiai védekezés is hozzájárulhatna, bár önmagában valószínűleg

nem jelentene teljes megoldást (Béres és mtsai 2005).

Biológiai gyomirtásra a vírusok nem használthatók, mert polifág kórokozók, de a

gyomnövények vírusrezervoár szerepe nagy jelentőségű. A parlagfű növényvirológiai

szempontból történő alaposabb megismerése azért is fontos, mivel igen nagy számban

megtalálható az egész ország területén. Schmelzer és Wolf (1977) szerint az ürömlevelű

parlagfűn előforduló vírusok a következők: dohány mozaik vírus (Tobacco mosaic),

dohány gyűrűsfoltosság vírus (Tobacco ringspot), dohány csíkosság vírus (Tobacco

streak) és uborka mozaik vírus (Cucumber mosaic). Ilyen irányú kutatásokat végeztek a

Pannon Egyetem Georgikon Karán, Keszthelyen Takács és mtsai (2001). A parlagfű

21

vírus-ellenállóságát vizsgálták a burgonya Y-vírus (Potato Y virus) N törzsével (PVYN)

és NTN (PVYNTN) törzsével, a Chenopodium mozaik vírussal (Sowbane mosaic virus), a

dohány mozaik vírus OB törzsével (Tobacco mosaic virus), az uborka mozaik vírus

U/246 törzsével (Cucumber mosaic virus) és legutóbb a cukkíni sárga mozaikvírussal

(Zucchini yellow mosaic virus) szemben. A kísérlet során a mesterségesen inokulált

növényekben a vírusok jelenlétét a fertőzést követő ötödik héten DAS-ELISA

szerológiai módszerrel és visszaizolálással ellenőrizték. Megállapították, hogy az

általuk vizsgált vírustörzsekkel szemben a parlagfű rezisztens, azaz a fertőzést követően

a vírusokra jellemző lokális és szisztemikus tünetek nem mutatkoztak (Takács és mtsai

2001, Takács és mtsai 2002).

Kazinczi (2004) vizsgálatában a szabadföldről gyűjtött tünetmentes minták 8 %-ából

az uborka mozaik vírust (Cucumber mosaic virus) sikerült szerológiai úton és bioteszttel

is kimutatni.

2.2.5 A parlagfű ellen alkalmazott védekezési eljárások

Béres és mtsai (2005) szerint a védekezés integrált és célirányos kell, hogy legyen. A

kémiai védekezés során a szükségtelen herbiciddel történő kezelés gazdaságtalan és

káros. A herbicides kezelésnek komoly gyakorlati korlátai vannak, ugyanis használatuk

elsősorban mezőgazdasági művelés alatt álló területekre - és a szer hatóanyagától,

típusától függően - ott is csak bizonyos kultúrákra korlátozódik. A herbicidek

rendszeres egyoldalú használata következtében rezisztens gyompopulációk alakulhatnak

ki, mint ahogy Magyarországon is megjelent a triazin-rezisztens parlagfű biotípus.

Az ürömlevelű parlagfű a legnagyobb gyomirtási problémát a kapás kultúrákban

okozza, de szinte minden kultúrában eredményesen irtható a megfelelő herbicid

alkalmazásával (Béres és mtsai 2005).

Béres és mtsai (2005) szerint a mechanikai védekezés leghatékonyabb módját a

növény gyökerestül történő eltávolítása jelentené, de ez csak kis területen, esetleg

városokban lehet hatékony. A kapálás is jól alkalmazható kisebb bolygatott területeken.

A kaszálással történő védekezés legnagyobb problémája, hogy a kaszálásra a parlagfű

nem pusztul ki, hanem rövid idő alatt a talajjal párhuzamosan futó új hajtásokat fejleszt.

A kaszálás időpontjának helyes megválasztásával nagyban nő a hatékonysága. Egyszeri

kaszálás esetén a leghatásosabb közvetlenül a virágzás előtt kaszálni, de a porzós

virágok újrafejlődésének a megakadályozásához további 1-2 kaszálásra lehet még

szükség (Béres és mtsai 2005). Az ürömlevelű parlagfű a bolygatott talajú, növényekkel

22

nem leárnyékolt területeken érzi jól magát, ezért fűfélék telepítése vagy mulcs réteggel

történő talajtakarás is jó lehetőséget jelent a parlagfű elleni védekezésre (Béres és mtsai

2005).

A mezőgazdasági művelés során a gabonatarlók és tarlóhántásban részesített

területek kiváló lehetőséget kínálnak a mechanikai védekezésre. A tarlóhántás időbeni

elvégzésével megakadályozzuk, hogy magot érleljen, majd a terület többszöri

művelésével sok gyommag csírázását serkentjük és ezzel jelentősen csökken a talajok

magkészlete (Béres és mtsai 2005).

Biológiai védekezés: A behurcolt gyomokkal szemben a biológiai védekezés

leghatékonyabb módja az őshazájukból származó természetes ellenségeik körültekintő

alkalmazása (Kiss és mtsai 2003).

Goeden és mtsai (1974) szerint az ürömlevelű parlagfüvön táplálkozó rovarok közül a

Tarachidia candefacta és a Zygogramma suturalis (parlagfű levélbogár) fajok a

legígéretesebbek. A parlagfű levélbogarat több országba betelepítették (Horvátország,

Kína, volt Szovjetunió), ahol károsítást nem okozott a kultúrnövényekben, viszont a

parlagfűben sem tett komoly kárt (Reznik és mtsai 1994, Igrc és mtsai 1995). Japán

szabadföldi kísérletekben az Ophraella communa faj a parlagfüvet jelentősen károsította

(Yamazaki és mtsai 2000).

A biológiai védekezésben kulcsszerepet játszhatnának a parlagfűre specializálódott

gombák, azonban még nem adtak hírt egyik gombafaj kitűnő agrotechnikai

alkalmazhatóságáról sem.

2.3 A kloroplasztisz és mitokondrium genom sajátosságaiA növényi genom különlegessége, hogy a mitokondriumok mellett a színtestekben is

található DNS-állomány (Mátyás 2002). A három genom mérete és öröklődése is eltér

egymástól.

Az organellum-DNS felhasználása széles körű a rokon fajok közötti és fajon belüli

genetikai távolságok elemzésére, a megbízhatóság, a nukleáris DNS-hez képest

egyszerűbb vizsgálhatóság és a génáramlásban betöltött különleges szerepe miatt (Clegg

és mtsai 1984, Pillay és Hilu 1990, Hultquist és mtsai 1997, Perez de la Rosa és mtsai

1995, Cipriani és mtsai 1998, Parducci és Szmidt 1999). A kloroplasztisz és

mitokondrium DNS vizsgálata jobban rávilágíthat az evolúciós kapcsolatokra, mivel

ezek mutációs rátája jóval kisebb, mint a nukleáris DNS-nek (Wolfe és mtsai 1987). Az

organellum-DNS vizsgálatok hatékonyságát növeli, ha a vizsgálni kívánt növényfaj

23

maggal szaporodik és szélbeporzású. A pollen migrációs távolsága igen nagy lehet,

ugyanakkor a mag terjedőképessége korlátozott. A sejtmag DNS-ében kódolt allélok

hatékony génáramlásával szemben tehát az anyai öröklésmenet helyi genotípusok

fennmaradását teszi lehetővé. Ezért különböző területek populációinak genotípizálására

az organellum-DNS markerek is jól alkalmazhatóak (Mátyás 2002). Markerként való

alkalmazásukhoz ki kell emelni, hogy az organellumgenom haploid, ritkán

rekombinálódik, azaz a változások zöme csak mutációk révén alakulhat ki és csak az

egyik szülő által örökíthető át (Mátyás 2002).

A DNS-t tartalmazó sejtorganellumok, a kloroplasztisz és a mitokondrium az

endoszimbionta elmélet szerint az eukarióta szervezetek „fogságába” került

baktériumszerű sejtekből alakultak ki, amelyek a mai fotoszintetizáló lila

baktériumokkal és Cyanobacteriumokkal, állnak rokonságban (Gray 1989). A

kloroplasztisz-DNS (cpDNS) és a mitokondriális DNS (mtDNS) kétszikűekben,

kizárólagosan anyai öröklődést mutat, a pollenből hiányzik, így csak a petesejt

citoplazmájával kerül át az utódba (Heifetz 2000, Bock és Hagemann 2000).

2.3.1 A kloroplasztisz-genom

A kloroplasztiszok genomja kettősszálú, gyűrű alakú DNS-molekula. A legfontosabb

termesztett növények így a búza: Yasunari és mtsai 2000, rizs: Hiratsuka és mtsai 1989,

kukorica: Maier és mtsai 1995 és sok más faj (lúdfű: Shusei és mtsai 1999) teljes

kloroplasztisz DNS szekvenciáját meghatározták, ezért pontos ismeretekkel

rendelkezünk a gének számáról és sorrendjéről, amelyek távoli fajokban is

megegyeznek. A teljes színtestgenom 130-160 ezer nukleotid, amely mindig

tartalmazza a riboszomális géneket, amelyek a kloroplasztisz felépítéséhez szükségesek,

de ezek a színtestecske működéséhez a fotoszintézishez nem elegendőek, ebben a

nukleáris gének is közreműködnek (Velich 2001). A kloroplasztisz genomra jellemző a

tömör szerveződés, intronok csak rövid szakaszokban fordulnak elő és az ismétlődő

szekvenciák előfordulása sem jellemző, egyetlen ilyen szekvencia ismert, amely a

legtöbb növényben 20-25 knt (kilonukleotid) (Velich 2001). A színtestekben 10-100

DNS molekula lehet és minden növényi sejt tartalmazhat 10-100 kloroplasztiszt, tehát

ezerszeres kópiaszámú is lehet a színtestgenom (Velich 2001).

24

2.3.2 A mitokondriális genom

A mitokondriumok DNS-állománya a kloroplasztiszokénál lényegesen nagyobb,

300-2500 knt közé esik (Mátyás 2002). A magasabb rendű növények mitokondriális

genomjára az a jellemző, hogy a gének intronokkal lehetnek megszakítva, a kódoló

szekvenciák között nagyobb nem átíródó szakaszok találhatók és nagy az ismétlődő

szekvenciák aránya is. A genom több algenomikus gyűrűből áll, melyek az ismétlődő

szekvenciáknál fűződnek le és a gyűrűk dinamikus egyensúlyban vannak (Velich 2001).

A növényi mitokondrium általában mindössze 40-50 gént tartalmaz, amelyek jórészt a

glikolízis és az elektrontranszport fehérjéit kódolják (Mátyás 2002). Nagyon kevés

szervezetben ismert a mitokondrium-DNS-ének teljes nukleotidsorrendje, a genom

mérete és a gyűrűfajták állandó változása miatt.

2.4 Molekuláris genetikai vizsgálati módszerek és molekuláris markerekA molekuláris genetika robbanásszerű fejlődése számtalan új DNS vizsgálati

módszer és új molekuláris marker típus kifejlesztését eredményezte. A DNS markerek

alkalmazását a „Southern blot” hibridizáció és az ezen alapuló RFLP (Restriction

Fragment Length Polymorphism) módszer, majd a polimeráz láncreakció (Polymerase

Chain Reaction) kifejlesztése tette lehetővé.

2.4.1 Restrikciós fragmentumhossz polimorfizmus (RFLP)

Az első DNS marker, melyet Botstein és mtsai 1980-ban írtak le az RFLP

(Restriction Fragment Length Polymorphism) volt. Ennek a felfedezésnek az alapját a

restrikciós enzimek működésének megismerése teremtette meg. A leggyakoribb

restrikciós endonukleázok 4 illetve 6 bp nagyságú DNS szekvenciákat „ismernek fel”,

majd elvágják a kétszálú DNS molekulát. A különböző genomok eltérő pozíciókban

tartalmaznak restrikciós emésztési helyeket, ezért különböző méretű fragmentumokra

darabolódnak fel az emésztés során. A növényi genom nagy mérete miatt, a restrikciós

enzimek olyan sok darabra vágják a DNS-t, hogy pontos elválasztásuk nem lehetséges,

ezért a gélelektroforézis után jelölt próbákkal Southern-hibridizációt (Southern 1975)

végeznek a genomok megkülönböztetéséhez. Az így kapott fragmentumok kodomináns

markerként viselkednek, tehát a heterozigóták is kimutathatók a segítségükkel. A

módszer hátránya, hogy nagy mennyiségű DNS-t igényel és a jelölt próbák alkalmazása

miatt hosszadalmas és költséges eljárás (Heszky és mtsai 2005).

25

2.4.2 Polimeráz láncreakció (PCR)

A polimeráz láncreakciót (Polymerase Chain Reaction) először 1985-ben Saiki és

mtsai írták le a β-globin gén amplifikálására. A reakcióval a sejtekben végbemenő DNS

replikációt utánozzuk. A PCR ciklusokból áll, amelyekben a primerek kapcsolódási

helyétől kiinduló DNS szintézis történik. A ciklusok ismétlésével a primerek közötti

DNS szakasz exponenciálisan amplifikálódik, mert a polimeráz enzim az újonnan

készített DNS szálakat is templátként használja. Az így kapott DNS mennyiség már

egyszerű agaróz gélelektroforézissel kimutatható, míg a templátként használt DNS kis

mennyisége miatt nem látszik (Kiss 1999). A napjainkban is használt hőstabil Taq

polimeráz enzimet Saiki és mtsai 1988-ban izolálták a Thermus aquaticus baktériumból,

ezzel lehetővé vált a specifikus PCR egyetlen reakcióelegyben, a hőmérséklet gyors és

pontos változtatásával.

2.4.3 Szekvencia specifikus primerek (SCAR)

Marker fragmentumok, gének manapság akár teljes genomok szekvenálásával pontos

szekvencia adatokhoz juthatunk. Ezután ezekre a szekvenciákra specifikus, 18-26 bp

nagyságú primereket tervezhetünk, ezek az ún. Sequence Characterized Amplified

Regions (SCAR) primerek. Ezekkel a primerekkel jól reprodukálható termékeket

várhatunk, melyek egyúttal kodomináns markerek is lehetnek (Heszky és mtsai 2005).

2.4.4 PCR-RFLP

Specifikus primerek alkalmazása során gyakran azonos méretű, de eltérő

szekvenciájú termékeket kapunk. Ezeknek a termékeknek a markerként való

alkalmazásához és SNP-k detektálásához az egyik lehetséges módszer a PCR termékek

restrikciós enzimekkel történő emésztése. Ha a termékekben voltak nukleotid eltérések

és a megfelelő restrikciós endonukleázzal dolgoztunk, akkor különböző méretű

restrikciós fragmentumokat fogunk látni a gélelektroforézis után. Ezzel a módszerrel

kodomináns CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) markereket kaphatunk

(Heszky és mtsai 2005).

2.4.5 PASA (PCR amplification of specific alleles)

Az SNP-k (Single Nucleotide Polymorphism), a csupán egyetlen nukleotidban eltérő

allélok kimutatásának gyors PCR alapú módszere a PASA (allél-specifikus PCR). A

módszer elve az, hogy a szekvencia ismeretében a mutáció helyére két primert

26

tervezünk, melyek végein találhatóak a polimorf nukleotidokkal komplementer bázisok.

A harmadik primert az SNP-től megfelelő távolságba (100-500 bp) az ellentétes szálra

tervezzük. A PCR reakció allél specifikusságát növeli, ha az SNP-hez készített primerek

3’ végétől 5 nukleotid távolságra egy nukleotid cserét (mismatch) is beiktatunk (Gaudet

és mtsai 2007). A primerek tervezésekor fontos figyelembe venni, hogy mind a három

primer kapcsolódási hőmérsékletének azonosnak kell lennie. Ezzel a módszerrel két

PCR reakció szükséges a heterozigóták és a homozigóták elkülönítéséhez.

2.4.6 Bi-PASA (bidirectional-PASA)

A bi-PASA (kétirányú allél-specifikus amplifikáció) a PASA módszer

továbbfejlesztett változata, amellyel egyetlen PCR reakcióban alkalmazott két

primerpárral, allél specifikus termékeket kapunk. Tehát a hetero és homozigóták jól

elkülöníthetőek az alapján, hogy egy vagy két allél specifikus (különböző méretű)

termék szaporodik fel a PCR reakcióban (Liu és mtsai 1997). A primerek tervezésénél

nagy hangsúlyt kell fektetni az azonos kapcsolódási hőmérsékletekre, a megfelelő

méretkülönbségre a két allél-specifikus termék között és a primer-dimerek

kialakulásának lehetőségével is számolni kell.

2.5 A Genetikai távolság értékelése Ha két vagy több populáció genetikai elkülönülését szeretnénk értékelni, akkor a

genetikai azonosság mértékét kell kiszámolnunk. Egy vagy több génhelyre

vonatkoztatva, a genetikai azonosság (I = identitás) az X és Y jelű populációk között:

∑∑∑

⋅

⋅=

22

)(

ii

iixy

yx

yxI , ahol

xi és yi az allélok gyakoriságai a két populációban.

I értéke 0 és 1 között változhat. Ha értéke 1, a két populáció azonos. A genetikai

azonosság tulajdonképpen annak az átlagos valószínűségét fejezi ki, hogy a két

populációban véletlenszerűen kiválasztott allél azonos lesz-e (Mátyás 2002).

Nei (1975) a genetikai azonosságot felhasználva a két populáció genetikai távolságát

(genetic distance ) az allélgyakoriságban mutatkozó eltéréssel jellemzi:

D = - lnI ( I = identitás)

27

A genetikai távolság a két populációban mért allélgyakoriságok különbségéből is

számítható:

∑ −= )(21

ii yxd

A két populáció azonossága esetén D ill. d értéke 0.

Nei és Li (1979) a genetikai távolság (GD) meghatározására, ha RFLP vizsgálat

eredményeiből szeretnénk meghatározni, a következő összefüggést javasolja:

, ahol

Nxy a két egyed azonos fragmentumainak a száma, Nx az első minta fragmentumainak

a száma, Ny a második minta fragmentumainak az összege. Két vagy több populáció

egyedei között, ezzel az összefüggéssel kiszámíthatóak a genetikai távolságok. Az

eredményeket egy genetikai távolság mátrixba rendezhetjük.

Populáció genetikai elemző programok segítségével a genetikai távolság mátrix

egyszerűbben meghatározható, és az eredmények jobb és érthetőbb szemléltetése

érdekében dendogrammot is szerkeszthetünk klaszteranalízissel.

A klaszteranalízis jól ismert módszer a genetikai eredmények kiértékelésének

gyakorlatában. Ilyen módszer az UPGMA (Unweighted Pair Group Method with

Arithmetic mean), vagy a WPGMA (weighted pair group method with averaging) is.

Ezek a módszerek a klaszterek közötti különbségek számítási módjában térnek el

egymástól. A leggyakrabban alkalmazott UPGMA csoportátlag módszer, egy

hierarchikus osztályozó algoritmus, melyben két csoport távolságát a tagjaik közötti

összes távolságérték mértani átlaga fejezi ki (Sokal és Michener 1958). A mértani közép

alapján súlyozás nélkül számoló UPGMA módszerrel lehet az egyes csoportok közötti

különbségeket a leginkább kimutatni (Sneath és Sokal 1973).

2.6 A triazin-rezisztencia

2.6.1 Az 1,3,5-triazinok rövid jellemzése

Az 1,3,5-triazinok a fotoszintézist gátló herbicidek csoportjába tartoznak. A

xylémben transzlokálódnak. Pre- és posztemergensen is alkalmazzuk egyéves kétszikű

és néhány egyszikű gyom ellen, talajherbicidként. A triazinokat környezetvédelmi

28

megfontolásokból 2007 végéig lehetett használni Magyarországon kivéve a terbutilazin

hatóanyagot. A hatáskifejtésükhöz bemosó csapadékra van szükség. A klóramino-

trazinok rendkívül perzisztensek, és vízoldékonyságuk a legrosszabb. Felhasználási

területük széles: leggyakrabban a kukoricában, de szántóföldi kultúrákban (gabona,

burgonya, cukorrépa), négy évesnél idősebb szőlőben, almástermésűeknél, kertészeti

kultúrákban és erdészetekben használjuk. Az 1,3,5-triazinok csoportjába tartozik a

terbutilazin, a terbumetoncianazin, a terbutrin, az aziprotrin, a prometrin, a dipropetrin

és a legismertebb, a II-klór-4-etil-amino-6-izopropilamino-1,3,5-triazin, azaz az atrazin

(Kádár 2001).

2.6.2 A triazin-rezisztencia mechanizmusa és öröklődése A triazinok hatásukat a fotoszintézis gátlásával fejtik ki. Ezt úgy érik el, hogy a II.

fotószisztéma területén az elektrontranszportot szétkapcsolják a primer (Q) és a

szekunder (plasztokinon) elektron akceptor között. Pontosabban a kloroplasztiszban

hozzákötődnek a D1 thylakoid membrán fehérjéhez, ezzel helyéről elmozdítják a

plasztokinont, így gátolják a fotoszintetikus elektrontranszportot (Berzsenyi 2000) (5.

ábra).

5. ábra: A triazinok fotoszintézis gátlása (Kádár 2001).

29

A triazin herbicidekkel szembeni rezisztenciának három fő formája ismert. Az első a

gyökérzet elhelyezkedésén alapuló szelektivitás, amely számos kultúrnövény ellenálló

képességének alapja. Ebben az esetben a növények gyökérzete mélyebben helyezkedik

el, mint a herbicid bemosódási zónája (Warwick 1976). A második a triazin herbicidek

biokémiai alapokon nyugvó hatástalanítása. A detoxifikálás három formáját ismerjük:

I. hidroxi atrazin képzés

II. oldallánchasítás (dealkiláció)

III. glutation-konjugáció (Jensen és Bandeen 1979).

A harmadik rezisztenciát okozó változás a D1 thylakoid membrán fehérje

szerkezetében következhet be. Mivel e 32 kDa méretű fehérjéhez ezután már nem tud

kötődni az atrazin, és így tovább működhet a fotoszintézis.

A D1 fehérjét a psbA gén kódolja a kloropasztisz genomban (Steinback és mtsai

1981), tehát extra kromoszomális öröklődésű. A psbA gént először Spinacea

oleraceaból illetve Nicotiana debneyből izolálták és szekvenálták (Zurawsky és mtsai

1982). Azóta különböző fotoszintetikus szervezetekből klónozták, és a szekvenálás

eredményei a gén nagyfokú konzerváltságát mutatják (Holt és mtsai 1993). Egyetlen

primerpárral a psbA konzervált régiója kimutatható volt a kultúrnövények közül

búzában, kukoricában, repcében, lucernában. A növények egy részénél a triazin

rezisztencia a psbA gén 264-es kódonján bekövetkezett egyetlen pontmutáció

eredménye (Botterman és Leemans 1988, Rios és mtsai 2003). Ez a nukleotid csere

adenin helyett guanint eredményez, ami a fentiek szerint változtatja meg a D1 fehérje

tulajdonságait. Mivel hasonló molekuláris változásokat figyeltek meg a repcében (Reith

és Strauss 1987), az árpában (Rios és mtsai, 2003) és a gyomnövények közül az

Amaranthus fajokban (Hirschberg és McIntosh 1983), a Solanum nigrum-ban

(Goloubinoff és Edelman 1984) és a Poa annua-ban (Barros és Dyer 1988), ebből e

tulajdonság konzervált változékonyságára lehet következtetni. Erre Botterman és

Leemans (1988), majd Holt (1993) is felhívta a figyelmet. Cheung (1993) egy

primerpárt fejlesztett ki, amellyel repcében, a Chenopodium spp.-ben és az Amaranthus

spp.-ben egyetlen PCR reakcióval ki tudták mutatni a psbA gén régióját, ahol a mutáció

bekövetkezett. Ugyanezzel a primerpárral több növény fajban, még egyszikűekben is,

mint az árpa (Rios és mtsai 2003) ugyanazt a fragmentumot kapták. Ez a primerpár egy

277 bp méretű PCR terméket ad mind a triazin rezisztens, mind a triazin fogékony

növényekben. E fragmentumon belül a pontmutáció szekvenálás nélkül is kimutatható.

A psbA gén atrazin rezisztens biotípusa elkülöníthető a fogékonytól, mivel a BstXI-es

30

restrikciós endonukleáz a mutáció helyén vágja ezt a szekvenciát (Thomzik és Hain

1988). A MaeI restrikciós enzim felismerési szekvenciája szintén itt található, de csak a

fogékony biotípust vágja (Cheung és mtsai 1993).

A teljes psbA gén amplifikálása egy másik primerpárral (trnH+trnK) lehetséges,

melyet Demesure és mtsai (1995) fejlesztettek ki. Ezt a primerpárt szintén

univerzálisnak tartják, mivel különféle növényeken végzett vizsgálatok során egyetlen

1.800 bp méretű, a psbA gént tartalmazó fragmentumot szaporított fel. Ez a fragmentum

tartalmazza az egész gént és a gén promóter és 5’UTR (5’ untranslated region) régióját

is. A psbA gén fényre indukálódik, és a legintenzívebben átíródó növényi gén (Kim és

mtsai 1993, Mayfield és mtsai 1995). A promóter a génkifejeződés szabályozásában a

transzkripció szintjén vesz részt, az 5’UTR pedig a transzláció folyamatában játszik

szerepet. A psbA gén promótere egy jól ismert promóter, amely tartalmazza a ”-10”

(TATAAT) és a “-35” (TTGACA) konzervált elemeket (Igloi és Kössel 1992, Hayashi

és mtsai 2003). Az 5’UTR a promóter és a gén kódoló régiója között helyezkedik el, és

szabályozza, hogy fény hatására a psbA gén mRNS-éről a D1 fehérje transzlációja

induljon el (Staub és Maliga 1993). Így meghatározó szerepe van a

poszttranszkripcionális génszabályozásban (Shen és mtsai 2001).

Frey és mtsai (1999) a psbA gént vizsgálták a közönséges aggófűben (Senecio

vulgaris). Eredményeik arra utaltak, hogy e növény kloroplasztisz genomja polimorf, de

ez a polimorfizmus nem csak egyedszintű, hanem az egyes növények levelei között is

találhatók eltérések. Ezt a jelenséget, amikor egy növényben illetve egy sejtben több

kloroplasztisz vagy mitokondrium genotípus található meg, heteroplazmásságnak

nevezzük.

2.6.3 A parlagfű atrazin-rezisztens biotípusának elterjedése Magyarországon

A rezisztens gyombiotípusok megjelenését és elterjedését az ország egész területére

kiterjedő monitoring vizsgálatokkal a Komárom-Esztergom Megyei és a Somogy

Megyei Növény- és Talajvédelmi Szolgálat követi nyomon. A rezisztens biotípust

először az 1992-ben gyűjtött Somogy megyei magmintákból mutatták ki. Az 1999-2001

között Somogy megyei minták 50 százaléka atrazin rezisztensnek bizonyult. 2000-re a

rezisztens változat már megjelent Vas és Tolna, valamint az Alföldön is Békés

megyében. Baranya és Zala megyéket 2001-ben érte el, és az országosan vizsgált összes

csíraképes magminta 36 százaléka bizonyult rezisztensnek. Ezeknek az adatoknak az

ismeretében megállapítható, hogy a parlagfű atrazin-rezisztens biotípusa hasonlóan –

31

bár sokkal rövidebb idő alatt – terjedt el, mint korábban a hazánk délnyugati részéből

kiinduló szenzitív típus (Hartmann és mtsai 2003).

2.7 Az acetolaktát–szintetáz (ALS) működést gátló herbicidekkel szembeni

rezisztencia

2.7.1 Az ALS-gátló herbicidek rövid jellemzése

Az ALS (acetolaktát-szintetáz) enzim, amely azonos az AHAS-sal (hidroxi-ecetsav-

szintetáz) az elágazó szénláncú aminosavak (leucin, izoleucin, valin) szintézisében

játszik szerepet, öt herbicidcsoport hatáshelye (Scarabela és mtsai 2004). Ez az öt

herbicidcsoport, melyekhez számtalan hatóanyag tartozik a szulfonil-ureák,

imidazolinonok, triazolpirimidin szulfonanilidek, pirimidiniltio-benzoátok és

szulfonilaminokarbonil-triazolinonok. Ezekbe a csoportokba tartozó hatóanyagok

megjelenésével, kezdve a legelsővel a klórszulfuronnal forradalmi változás kezdődött a

herbicidek felhasználásában az addig alkalmazott kg/ha-os dózisokat a g/ha váltotta fel.

Mára az ALS-gátlók a legszélesebb körben használt herbicidek lettek a világon (Tranel

és Wright 2002).

A kultúrnövények toleranciája az ALS-gátló herbicidekkel szemben a gyors

metabolikus lebontásából ered. A termesztett növények, mint a búza, kukorica, árpa,

rizs és a szója más-más helyen hatástalanítják, bontják meg a hatóanyag szerkezetét

(Kádár 2001).

Az ALS-gátlók a xylémben és a floémben egyaránt transzlokálódó szisztemikus

mikroherbicidek, melyek a gyökéren és a levélen keresztül is képesek elpusztítani az

érzékeny növényeket. Felhasználási területük széles, pre- és posztemergensen is

alkalmazhatóak egy- és kétszikű gyomok ellen. A herbicid felvétele gyors, a pusztulás

azonban hosszú, általában 7-17 nap (Kádár 2001).

2.7.2 Az ALS-gátlókkal szembeni rezisztencia mechanizmusa és öröklődése a

gyomnövényekben

Jelenleg a világon az ALS gátló herbicidekkel szemben 95 rezisztens gyomfaj ismert.

Az ALS gátló herbicidekkel szemben rezisztens parlagfüveket először 1998-ban, az

USA-ban találtak, Magyarországon még nem ismert ez a biotípus

(www.weedscience.org). Az ALS gén két reprezentatív szakasza az A és a B régió. Ez a

két szakasz kódolja az ALS fehérjének azon részét, ahol a herbicidek kapcsolódnak az

32

http://www.weedscience.org/

enzimhez, így megakadályozák annak működését (Tranel és Wright 2002). Az ALS

fehérje funkcióját a kloroplasztiszban fejti ki, az első enzim az elágazó szénláncú

aminosav bioszintézisben (Tranel és Wright 2002). Az ALS gén a nukleáris genomban

kódolt és a Mendeli öröklésmenetet követi, így az ALS gén alléljai a pollennel és a

maggal is terjednek (Tranel és Wright 2002). Az ALS-A és ALS-B régiókban, ha

bekövetkezik a Sathasivan és mtsai (1990) által Arabidopsis thaliana-ban meghatározott

öt pontmutáció valamelyike, akkor kialakul a rezisztencia (Gutteri és mtsai 1996,

Wright és mtsai 1998). A rezisztenciát okozó aminosav cserék a különböző

gyomnövényekben az ALS-A régióban a következők voltak: Ala122/Thr122, Pro197/Ser197,

Ala205/Val205 az ALS-B régióban: Trp574/Leu574, Ser653/Thr653 (McNaughtona és mtsai

2005).

Patzoldt és mtsai (2001) négy fogékony és két rezisztens parlagfüvet hasonlítottak

össze az ALS-A és ALS-B szekvencia alapján. Arra a következtetésre jutottak, hogy a

rezisztenciát ebben a populációban a Trp574-es aminosav (triptofán) leucinra cserélődése

okozza. Azt is bizonyították, hogy az általuk vizsgált mintákban a 653-as aminosav, -

amely a legtöbb növényben szerin - a parlagfűben alaninra változott, de ez az aminosav

csere nem váltott ki rezisztenciát. Zheng és mtsai (2005) szerint a parlagfű ALS

rezisztenciájának meghatározó oka a Trp574/Leu574 aminosav csere, valamint a

rezisztencia mértékét befolyásolja, hogy a mutáció heterozigóta vagy homozigóta

formában van-e jelen az adott növényben. Keresztrezisztenciát is kimutattak,

szulfonilureákkal, imidazolinokkal és a triazol-pirimidinekkel szemben (Taylor és mtsai

2002, Tranel és mtsai 2004, Zheng és mtsai 2005).

Tranel és mtsai (2004) az USA három államában - Illinois, Minnesota és Ohio -

vizsgálták az ALS-A szekvencia változatosságát 24 db parlagfűben (Ambrosia

artemisiifolia), 24 db bojtorján szerbtövisben (Xanthium strumarium) és 10-10 db

disznóparéjban (Amaranthus hybridus, Amaranthus tuberculatus). A legtöbb

polimorfizmust a parlagfűben találták, a 24 egyedben 48 db SNP-t (Single Nucleotide

Polymorphism) detektáltak. A két Amaranthus faj húsz egyedében összesen 7 polimorf

nukleotid volt, a szerbtövisben nem fedeztek fel eltérést az egyedek között.

2.8 A parlagfű pollenallergia és az Amb a I géncsaládAz allergia fogalmát a 20. század első évtizedében Clement von Pirquet vezette be a

tuberkulózissal kapcsolatban. A fogalmat ma szélesebb körben használják: betegségek

és állapotok sorát jelöli, amelyeknél egy adott szervezet másképpen reagál a külső

33

antigénekkel (legtöbbször fehérjékkel) szemben egy ismételt találkozásnál, mint

ahogyan azt más emberi szervezetek teszik és ezen reakció során kóros és ártó tünetek

jelentkeznek (Cserháti 2006). A XX. század második felében rohamosan növekedett

világszerte az allergiás és asztmás betegek száma elsősorban a technikai civilizáció

közepes vagy magasabb szintjén álló országokban, és e betegségek kezelése egyre

növekvő költségeket jelent (Cserháti 2006). Magyarországon 2005-ben a légúti

allergiák kezelésére 17 milliárd forintot fordítottak (Nékám és Páldy 2008).

Világszerte az allergiás megbetegedések egyik leggyakoribb kiváltói a pollenek. Az

általánosan elfogadott szakmai vélemény szerint a pollinózisok legalább 50%-ában a

parlagfű oki vagy társtényező (Kazinczi és mtsai 2009). Ennek az a magyarázata, hogy

a parlagfűpollen erős allergén és egy átlagos növény nyolcmilliárd virágporszem

termelésére képes 2-3 hónap alatt (Béres és mtsai 2005). Juhász és Juhász (2002)

megállapítása szerint Magyarországon az ürömlevelű parlagfű virágpora a szezonális

pollenkoncentráció 60-71 %-át teszi ki. Pollenje erős allergén, mert nagyon aktív, és

hatékony antigént tartalmaz, amely a pollenből az orrnyálkahártyán keresztül

másodpercek alatt diffundál, így a tünetek szinte azonnal jelentkeznek (Béres és mtsai

2005). Ez az antigén egy fehérje, amit az Amb a I géncsalád kódol (Rafnar és mtsai

1991). Az Amb a I fehérje a pollen fehérjetartalmának a 6%-át teszi ki, de az allergiás

reakciók kb. 90 %-áért az Amb a I specifikus antitestek a felelősek (Lockey és Ledford

2008). Amb a 2-től egészen Amb a 9-ig izoláltak már kisebb molekulasúlyú allergén

fehérjéket, de ezek jelentősége is jóval kisebb az allergia kialakulásában (Lockey és

Ledford 2008).

Az Amb a I fehérje 38 kDa nagyságú, lánc formájú és savas jellegű (Rafnar és mtsai

1991). Az Amb a I génnek eddig négy változatát azonosították cDNS szinten. Rafnar és

mtsai (1991) parlagfű pollenből izolált mRNS-eket írták át cDNS-é és elemezték az

Amb a I.1, Amb a I.2 és Amb a I.3 génváltozatokat nukleinsav és aminosav szinten.

Griffitha és mtsai (1991) az Amb a I gén kódoló régiójának negyedik változatát (Amb a

I.4) is leírták. A parlagfű genetikai változékonyságából arra lehet következtetni, hogy a

génnek még több változata létezhet.

34

3. Anyagok és módszerek3.1 Növényanyag

3.1.1 A filogenetikai összehasonlításra használt egyedek

A vizsgálatokhoz Kelet-Magyarországról Hódmezővásárhely közeléből származó

egymástól több km-re lévő parlagfüvekről gyűjtött magokat és Nyugat-Magyarországról

Keszthely térségéből gyűjtött parlagfű magokat használtunk. Kanadában Montreal

környékén és az USA-ban Madison közelében gyűjtött magokat szintén bevontunk a

vizsgálatokba, de itt a növények csak 300-400 m-re voltak egymástól. Az amerikai és

kanadai növények magjait Dr. Kiss Levente (MTA Növényvédelmi Kutatóintézet)

bocsátotta a rendelkezésünkre. A begyűjtött magokat tenyészedényben csíráztattuk és a

fiatal növényekről szedtünk leveleket a DNS izoláláshoz. Mindegyik populációból négy

növényt választottunk ki a genetikai vizsgálatokhoz, amelyek magjai különböző

anyanövényekről származtak. A vizsgálatoknál referenciaként használtunk két

napraforgó fajtát is, mivel ez a növény is a fészkesek családjába tartozik. Az ’Iregi

Szürke’ szabadelvirágzású fajtát és a ’Nova’ hibridet is tenyészedényben neveltük és

fiatal levelekről szedtünk mintákat a DNS izolálásához.

3.1.2 A triazin rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálatához felhasznált

növények

A triazin rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálatánál 36 fogékony és 12

rezisztens növényt használtunk. A növények magjait Hoffmanné Pathy Zsuzsannától

(Somogy Megyei Mezőgazdasági Szakigazgatási Hivatal Növény- és Talajvédelmi

Igazgatóság) kaptuk. A rezisztencia kimutatása növényházi körülmények között 10 cm

átmérőjű műanyag tenyészedényekben, 3 ismétlésben történt. A kísérletben

tenyészedényenként legalább 10 értékelhető növény volt, melyek ugyanarról az

anyanövényről származtak. A kezelést az atrazin 2,0 kg/ha-os dózisával közvetlenül a

vetés után, preemergensen végeztük. A rezisztensnek tűnő mintákat minden esetben

ugyanezzel a dózissal posztemergens kezelésben is részesítettük. A növényeket

hőmérsékleti igényüknek megfelelően és természetes megvilágítás mellett, szükség

szerint öntözve neveltük. Az értékelés a pusztulás meghatározásával, a keléstől

számított 10. napon történt. A DNS izolálása a kezeletlen kontroll egyedei közül

véletlenszerűen kiválasztott növény, fiatal leveleiből történt, a rezisztencia teszt

eredményének ismeretében.

35

3.1 Acetolaktát–szintetáz (ALS) működést gátló herbicidek célgénjének

szekvenálásánál vizsgált növények Az ALS-A fragmentum szekvenciáját hét véletlenszerűen begyűjtött parlagfűben és

egy napraforgóban (Nova hibrid) határoztuk meg. A parlagfüvek közül négy származott

Keszthelyről, kettő Hódmezővásárhelyről és egy Montreálból (Kanada).

Az ALS-B fragmentumot három keszthelyi, egy hódmezővásárhelyi parlagfűből és

egy napraforgóból (Nova hibrid) szekvenáltuk.

3.1.4 Az Amb a I géncsalád vizsgálatánál tesztelt növények

Az Amb a I.1, Amb a I.2, Amb a I.3 cDNS-ekre tervezett primerek: RW32, RW38,

RW45 (Rafnar és mtsai 1991) tesztelését öt parlagfű DNS-én végeztük. Melyek közül

három keszthelyi és kettő hódmezővásárhelyi gyűjtésből származott. Az általunk

tervezett Amb a I specifikus primereket szintén ezen az öt egyeden teszteltük, majd a

vizsgálatokat kiterjesztettük további hét növényre melyek magjai közül egyet

Keszthelyen, kettőt Hődmezővásárhelyen és 2-2 Montreal és Madison közelében

gyűjtöttünk.

3.2 Molekuláris vizsgálatok3.2.1 DNS izolálás

A DNS-t minden növényből Walbot és Warren (1988) eljárását követve izoláltuk, de

kisebb módosításokat hajtottunk végre.

Felhasznált anyagok:

- Lízis oldat: 15 % szacharóz

50 mM Tris HCl (pH 8.0)

50 mM EDTA (pH 8.0)

500 mM NaCl

- 20T – 10E puffer: 20 mM Tris HCl (pH 8.0)

10 mM EDTA (pH 8.0)

- TE puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 8.0)

1.5 mM EDTA (pH 8.0)

- 7,5 M ammónium-acetát

- 20 % SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)

- Izopropanol

36

- CIA: kloroform/izoamil-alkohol: 24 : 1 arányban

- 3 M nátrium-acetát

- 96 %-os és 70 %-os etanol

A növények fiatal leveleit (100 mg) folyékony nitrogén jelenlétében porrá zúztuk,

majd 1,5 ml lízis oldatot adtunk a mintákhoz. Egy centrifugálást követően eltávolítottuk

a folyadékot és 300 μl 20T-10E pufferrel finoman rázva föloldottuk a csapadékot. A

mintákhoz 20 μl 20 %-os SDS-t adtunk, és vortexelés után 15 percig 70 °C-on

inkubáltuk. Az oldathoz 150 μl 7,5 M-os ammónium-acetátot kevertünk, és 30 percre

darált jégbe állítottuk a mintákat. Centrifugálás (10 perc, 4 C˚, 15000 rpm) után a felső

tiszta réteget, körülbelül 450 μl-t átpipettáztunk egy másik steril csőbe, majd azonos

mennyiségű izopropanolt adtunk hozzá, és 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk.

Újabb centrifugálás (5 perc, 4 C˚, 8000 rpm) után a folyadékot leöntöttük, és 500 μl TE

pufferben a csapadékot feloldottuk. A CIA kezelést követően, 40 μl 3 M-os nátrium-

acetátot valamint 1 ml etanolt adtunk a mintákhoz, majd ismét centrifugáltunk. Végül

egy 70% etanolos tisztítás után kiszárítottuk a mintákat és 200 μl TE pufferben

feloldottuk.

3.2.2 DNS amplifikálása polimeráz láncreakcióval (PCR)

A PCR reakciót minden esetben Robocycler (Stratagene, USA) készülékben hajtottuk

végre. A reakciót mintánként 20µl reakció eleggyel indítottuk, amely a következő

komponenseket tartalmazta:

- 25 ng templát DNS,

- 100 μM dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP),

- 10x PCR puffer [(1 x 10mM TrisHCl (pH 8.8), 1,5 mM MgCl2, 50mM KCl és

0,1% Triton X-100)],

- 0,2 μM a primerpár mindkét tagjából (Metabion, Germany),

- 0,5 unit DynaZyme DNS polymeráz enzim (Finnzymes Oy, Finland).

A PCR profilt az alkalmazott primerek kapcsolódási hőmérsékletének és a

felszaporítani kívánt termékek méretének megfelelően választottuk meg.

37

3.2.2.1 A kloroplasztisz és mitokondrium genom vizsgálata

A kloroplasztisz és a mitokondrium genom vizsgálatánál Al-Janabi és mtsai (1994),

Demesure és mtsai (1995), Dumolin-Lapegue és mtsai (1996), Hiratsuka és mtsai

(1989), Petit és mtsai (1998) és Wu és mtsai (1998) által kifejlesztett univerzális primer

párokat teszteltük. Az alkalmazott 12 db kloroplasztisz és a 12 db mitokondrium genom

specifikus primer pár jelölését, szekvenciáját és az alkalmazott kapcsolódási

hőmérsékleteket az 1. táblázatban közöljük. A PCR profil a következő volt: 1 ciklus

94˚C 3 perc, majd ezt követte 35 cikluson át 94˚C 30 másodperc, X ˚C 1 perc, 72˚C 2

perc, a végső lánchosszabítás 72˚C 5 perc.

38

1. táblázat: A kloroplasztisz és a mitokondrium nem kódoló régióinak

felszaporításához alkalmazott primerek szekvenciái és kapcsolódási hőmérsékletei

Kloroplasztiszprimer párok

Primer szekvenciákKapcsolódásiHőmérséklet

(oC)psbC2-trnS1

Demesure et.al. (1995)

psbC2 5'-GGTCGTGACCAAGAAACCAC-3'57trnS1 5'-GGTTCGAATCCCTCTCTCTC-3'

trnS2-trnfM


trnS2 5'-GAGAGAGAGGGATTCGAACC-3'62trnfM 5'-CATAACCTTGAGGTCACGGG-3'

trnS4-trnT3


trnS4 5'-CGAGGGTTCGAATCCCTCTC-3'57,5trnT3 5'-AGAGCATCGCATTTGTAATG-3'

trnF-trnV

Dumolin-L. et al. (1996)

trnF 5'-CTCGTGTCACCAGTTCAAAT-3'57,5trnV 5'-CCGAGAAGGTCTACGGTTCG-3'

trnK f-trnK r


trnK f 5'-GGGTTGCCCGGGACTCGAAC-3'53,5trnK r 5'-CAACGGTAGAGTACTCGGCTTTTA-3'

trnQ-trnR


trnQ 5'-GGGACGGAAGGATTCGAACC-3'57,5trnR 5'-ATTGCGTCCAATAGGATTTGAA-3'

rpoC1-rpoC2

Petit et al. 1998

rpoC1 5'-TAGACATCGGTACTCCAGTGC-3'55rpoC2 5'-AAGCGGAATTTGTGCTTGTG-3

trnD-trnT1


trnD 5'-ACCAATTGAACTACAATCCC-3'54,5trnT1 5'-CTACCACTGAGTTAAAAGGG-3

trnT2-psbC2


trnT2 5'-GCCCTTTTAACTCAGTGGTA-3'55psbC2 5'-GAGCTTGAGAAGCTTCTGGT-3'

psaA-trnS4


psaA 5'-ACTTCTGGTTCCGGCGAACGAA-3'58trnS4 5'-AACCACTCGGCCATCTCTCCTA-3'

trnV-rbcL


trnV 5'-CGAACCGTAGACCTTCTCGG-3'57,5rbcL 5'-GCTTTAGTCTCTGTTTGTGG-3'

rbcL1-rbcL2

Hiratsuka et al. (1989)

rbcL1 5'-ATGTCACCACAAACAGAAACTAAAGC-3'55rbcL2 5'-CTTCACAAGCAGCAGCTAGTTCAGGA-3’

39

Mitokondriumprimer párok

Primer szekvenciákKapcsolódási Hőmérséklet

(oC)18S-5S

Al-Janabi et al. (1994)

18S 5'-GTGTTGCTGAGACATGCGCC-3'58

5S 5'-ATATGGCGCAAGACGATTCC-3'nad5a f-nad5 r

Wu et al. (1998)

nad5a f 5'-GAAATGTTTGATGCTTCTTGGG-3'60nad5 r 5'-ACCAACATTGGCATAAAAAAGT-3'

nad5d f-nad5d r

Wu et al. (1998)

nad5d f 5'-ATAAGTCAACTTCAAAGTGGA-3'60nad5d r 5'-CATTGCAAAGGCATAATGAT-3'

nad1B-nad1C


nad1B 5'-GCATTACGATCTGCAGCTCA-3'57,5nad1C 5'-GGAGCTCGATTAGTTTCTGC-3'

nad4exon1-nad4exon2a


nad4exon1 5'-CAGTGGGTTGGTCTGGTATG-3'57,5nad4exon2a 5'-TCATATGGGCTACTGAGGAG-3'

atp6 f-atp6 r

Wu et al. (1998)

atp6 f 5'-GGAGGIGGAAAITCAGTICCAA-3'55atp6 r 5'-TAGCATCATTCAAGTAAATACA-3'

cob f-cob r

Wu et al. (1998)

cob f 5'-AGTTATTGGTGGGGGTTCGG-3'64cob r 5'-CCCCAAAAGCTCATCTGACCCC-3'

cox1 f-cox1 r

Wu et al. (1998)

cox1 f 5'-GGTGCCATTGCGGAGTGATGG-3'60cox1 r 5'-TGGAAGTTCTTCAAAAGTATG-3'

nad3 f-nad3 r

Wu et al. (1998)

nad3 f 5'-GAAATGTTTGATGCTTCTTGGG-3'58nad3 r 5'-TTCATAGAGAAATCCAATCGT-3'

rps14 f-rps14 r

Wu et al. (1998)

rps14 f 5'-ATACGAGATCACAAACGTAGA-3'55rps14 r 5'-CCAAGACGATTTITTTATGCC-3'

nad4exon2b-nad4exon4


nad4exon2b 5'-TGTTTCCCGAAGCGACACTT-3'55nad4exon4 5'-AACCAGTCCATGACTTAACA-3'

rps14-cob


rps14 5'-CACGGGTCGCCCTCGTTCCG-3'57,5cob 5'-GTGTGGAGGATATAGGTTGT-3'

3.2.2.2 A psbA gén felszaporítása restrikciós emésztéshez és szekvenáláshoz

A psbA gént tartalmazó 1800 bp nagyságú fragmentum amplifikációját a trnH: 5’-

ACGGGAATTGAACCCGCGCA-3’ és a trnK: 5’-CCGACTAGTTCCGGGTTCGA-

3’ (Demesure és mtsai 1995) primerekkel végeztük. A PCR reakció profil a következő

volt: 94oC 3 perc; 30 ciklus: 94oC 45 másodperc , 55oC 1 perc, 72oC 2 perc, és a végső

extenzió 72oC-on 10 perc volt. A psbA gén belső 277 bp méretű fragmentumát a 5’-

ATGAGGGTTACAGATTTGGTC-3’ (f277) forward és a 5’-

AGATTAGCACGGTTGATGATA-3’ (r277) (Cheung és mtsai 1993) reverz primerek

segítségével szaporítottuk fel. A PCR reakcióhoz a következő programot alkalmaztuk:

94oC 2 perc; 30 ciklus: 94oC 5 másodperc, 50oC 10 másodperc, 72oC 30 másodperc,

végül 72oC 5 percig.

40

A psbA gén szekvenálásához a trnK+r277 és a f277+trnH primerpárokkal is

felszaporítottuk a gén két felét. A PCR profil megegyezett a trnK+ trnH primerpárnál

alkalmazottal.

3.2.2.3 A psbA gén allél specifikus felszaporítása Bi-PASA (bidirectional-PCR

amplification of specific alleles) primerekkel

A psbA gén 278 bp méretű mutációt tartalmazó darabját és a fogékony egyedekre

jellemző 208 bp ill. a rezisztensekben felszaporodó 109 bp nagyságú fragmentumokat a

PsbaF (5’-ATGAAGGTTACAGATTCGGTC-3’), PsbaR (5’-

AAGGTTAGCACGGTTAATGATA-3’), BPMMF (5’-

ATTGATCTTCCAATATACTA-3’) és BPMMR (5’-

GAATGAGAGTTGTTGAAACC-3’) primereket egy reakcióban használva

amplifikáltuk. A vastaggal szedett nukleotidok a specifikusság növelése érdekében

alkalmazott nukleotod cseréket (MisMatch) jelölik. A PCR reakció az alábbiak szerint

történt: 94oC 2 perc; 45 ciklus: 94oC 15 másodperc, 53oC 15 másodperc, 72oC 30

másodperc, végül 72oC 3 percig.

3.2.2.4 Az ALS-A és ALS-B fragmentum amplifikálása

Az ALS-A régió felszaporítása a forward 5’-AGCTCTGGAACGTGAAGGC-3’ és

reverz 5’-CGTGTTACCTCAAGAGTTAGC-3’ (Patzoldt és mtsai 2001) primereket

használva a következő PCR profillal történt: 94oC 3 perc; 35 ciklus: 94oC 30 másodperc,

57oC 1 perc, 72oC 1 perc, végül 72oC 5 perc.

Az ALS-B régióra specifikus primerek a következők voltak: F: 5'-

ATGAACGTTCAAGAGTTAGC-3', R: 5'-CCTTCGGTGATCACATCCTTGAA-3'

(Patzoldt és mtsai 2001). A PCR reakció profilja megegyezett az ALS-A régióéval az 53 oC-os kapcsolódási hőmérséklet kivételével.

3.2.2.5 Az Amb a I géncsalád vizsgálata specifikus primerekkel

Első lépésként Rafnar és mtsai (1991) által publikált primereket teszteltük le,

melyek a következők voltak: RW38, RW45, RW32.1, RW32.2, RW32.3 (2. táblázat). A

PCR reakciót az alábbi profil szerint állítottuk be: 94oC 3 perc; 5 ciklus: 94oC 30

másodperc, 65oC 1,5 perc, 72oC 4 perc, 30 ciklus: 94oC 30 másodperc, 55oC 1,5 perc,

72oC 4 perc végül 72oC 5 perc.

41

2. táblázat: Az Amb a I gén elejére (RW38), közepére (RW45) és végére (RW32.1,

RW32.2, RW32.3) tervezett primerek (Rafnar és mtsai 1991).

Primer Nevek Primer Szekvenciák Primer Lokalizáció(nukleotidokban)

RW38 5’-TCTTGTATTTTACCTTAG-3’ 27-43RW45 5’-ACCATCGTTGGACTTAA-3’ 540-557RW32.1 5’-TCATTATAAGTGCTTAGT-3’ 1211-1223RW32.2 5’-ATTATAAAAAGCTTAGG -3’ 1211-1223RW32.3 5’-ATAGCAAAAGCTTAGGAG-3’ 1211-1223

A három génváltozat elkülönítésére irányuló vizsgálatokat a PrimerSelect

(DNAStar Inc., Madison, USA) (3.táblázat) és Primer3 (Rozen és mtsai 2000) (4.

táblázat) programokkal tervezett specifikus primerekkel végeztük. A primerek

megtervezéséhez használt szekvenciákat az 1. mellékletben közöljük.

3. táblázat: A PrimerSelect programmal tervezett primerek, melyek az Amb a I gén

három variánsának első felén lokalizáltak.

Primer Nevek

Primer Szekvenciák Primer Lokalizáció(nt-okban)

KapcsolódásiHőmér. oC

(X)Amba 1-2E 5’-ATGGGGATCAAACACTG-3’ 2-18 52Amba 1K 5’-GGCCTCCTGGATTCACTT-3’ 516-533Amba 1-2E 5’-ATGGGGATCAAACACTG-3’ 2-18 52Amba 2K 5’-TGCCTCCTGGACAAACTT-3’ 516-533Amba 3E 5’-ATGGGGATCAAACAATG-3’ 2-18 53Amba 3K 5’-TGCCTCCTGGAAGCACTT-3’ 516-533

42

4. táblázat: A primer3 programmal az Amb a I.1, Amb a I.2 és Amb a I.3 génekből

specifikus termékek amplifikációjára tervezett primerek.

Primer Nevek Primer Szekvenciák Primer Lokalizáció(nt-okban)

KapcsolódásiHőmér. oC

(X)Amba 1P530 5’- GGCCTGATTAAGTCCAACGA-3’ 530-550 55Amba 1P1172 5’-GGCATGAGAGTACACCAGCA-3’ 1152-1172Amba 1P298 5’-TCCAAAAGAAGGCACACTCC-3’ 298-318 55Amba 1P968 5’-CATTTTTCTTGCTGCGTTCA-3’ 948-968Amba 1-2P224 5’-AGGTTTTGCAAAGGGAACCT-3’ 224-244 55Amba 1-2P891 5’-ACGTTCCCCATCTGTCGTAG-3’ 871-891Amba 3P232 5’-AGGTTTTGCAAAGGGAACCT-3’ 232-252 55Amba 3P899 5’-ACGTTCCCCATCTGTCGTAG-3’ 879-899

A PCR során a programok által meghatározott primer kapcsolódási hőmérsékleteket

(X) alkalmaztuk. A profil a következő volt: 94oC 3 perc; 35 ciklus: 94oC 30 másodperc,

XoC 1 perc, 72oC 2 perc a végső extenzió 72 oC 5 perc.

3.2.3 Restikciós enzimek használata

3.2.3.1 A kloroplasztisz és mitokondrium DNS-ének PCR-RFLP vizsgálata A restrikciós emésztésekhez 10 µl PCR terméket használtunk fel. Az enzimekből 10

unitot kevertünk a mintákhoz és 4 órára vízfürdőbe helyeztük őket. A Taq I restrikciós

enzimnél 65oC-os, a BstU I-nél 60 oC-os az Aci I, Dde I, EcoR I, Hae III, Hha I, Mse I

és az Rsa I-es restrikciós endonukleáznál 37 oC-os hőmérsékletet alkalmaztunk a gyártó

(New England Biolabs, US) leírása szerint.

3.2.3.2 A psbA gén rezisztenciát okozó pontmutációjánál vágó enzimek

A PCR termékekből 10 µl-t használtunk az emésztésekhez. A BstXI-es

endonukleázból 8 unitot adtunk a mintákhoz, a MaeI-esből 3 unitot. Az emésztéseket 4

órán át 50oC-on ill. 45 oC-on végeztük.

3.2.4 DNS elválasztás gélelektroforézissel és értékelés

A különböző méretű DNS fragmentumok elválasztására horizontális agaróz

gélelektroforézist alkalmaztunk. A PCR és a restrikciós termékeket 1,5%-os agaróz

(Promega, USA) gélen, a heteroplazmásság vizsgálatakor 2,5%-os Metaphor (Cambrex,

USA) gélen 0,5xTBE pufferben választottuk szét (220V 1,5 óra). A géleket 20 percig

43

ethidium-bromidot tartalmazó TE pufferben (85µl/1000ml) festettük. A kapott

mintázatot, a Syngene GeneGenius géldokumentációs rendszerével detektáltuk és

értékeltük. A fragmentumok méretét 50 bp-os és 100 bp-os súlymarkerhez (Fermentas,

Litvánia) viszonyítottuk.

3.2.5 DNS fragmentumok tisztítása gélből

Az izolálni kívánt fragmentumokat a transilluminátorra helyezett gélből steril

szikével kimetszettük, majd a NovaGene SpinPrep Gel DNA Kit (Novagene, USA)

segítségével tisztítottuk a gyártó útmutatása szerint.

3.2.6 Klónozás és szekvenálás

A klónozáshoz a pGEM-T Easy Vector System-et (Promega, USA) használtuk a

gyártó leírása szerint. Első lépésként steril, IPTG (isopropyl-beta-D-

thiogalactopyranoside) és X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside)

tartalmú ampicillines LB táptalajt és SOC tápoldatot készítettünk.

Egy liter LB táptalaj a következőket tartalmazta:

- 10 g Bacto-tryptone

- 5 g Bacto-yeast kivonat

- 5 g NaCl

- 0.1 g Ampicillin

- 0.119 g IPTG

- 0.08 g X-Gal

100 ml SOC tápoldatot az alábbi alkotóelemekből állítottunk össze:

- 2 g Bacto-tryptone

- 0.5 g Bacto-yeast kivonat

- 1 ml 1M NaCl

- 0,25 ml 1M KCl

- 1 ml 2M Mg2+

- 1 ml 2M Glükóz

Ezt követte a gélből izolált fragmentumok ligálása a plazmidba.

A ligálási reakcióelegy a következőket tartalmazta:

44

- 5 µl 2X Rapid Ligation puffer

- 1 µl pGEM-T Easy Vector

- 2 µl Gélből izolált PCR termék

- 1 µl T4 DNS Ligáz

- 1 µl Steril IEW

A ligálási reakcióelegyet egy éjszakán át 4oC-on tartottuk a maximális számú

transzformáns létrehozásához.

A JM109-es kompetens sejtek transzformálása és a transzformánsok kiválogatása a

következő módon történt. A ligálási reakcióelegyből 2 µl-t egy steril 1,5 ml-es

eppendorf csőbe mértünk és a jégen felolvasztott JM109-es kompetens sejteket

tartalmazó szuszpenzióból 50 µl-t adtunk a mintákhoz. Húsz percig jégen tartottuk a

csöveket, majd pontosan 47 másodpeces 42oC-os hősokkot alkalmaztunk. Ezután 2

percre ismét jégre helyeztük a mintákat. A transzformált sejteket is tartalmazó

szuszpenzióhoz 950 µl SOC tápoldatot kevertünk, majd másfél órán át 37oC-on 150

rpm-el rázattuk a csöveket. Lamináris bokszban az egyes mintákból 100-100 µl-t

kentünk szét két petricsészébe, amelyek az ampicillin, IPTG és X-Gal tartalmú LB

táptalajt tartalmazták. A petricsészéket egy éjszakán át 37 oC-on inkubáltuk. Másnap a

fehér színű telepeket kolónia PCR-el ellenőriztük és egyben átoltottuk egy új ampicillin,

IPTG és X-Gal tartalmú LB táptalajra. A kolónia PCR a klónozó helyre specifikus

primerekkel történt T7: 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3', SP6: 5'-

ATTTAGGTGACACTATAG-3' 50oC-os primer kapcsolódási hőmérsékleten. A

megfelelő méretű inzertet tartalmazó telepekből egyet belemostunk egy 2ml-es

eppendorf csőbe, amely 1,5 ml SOC tápoldatot tartalmazott. A csöveket 37oC-on egy

éjszakán át rázattuk. Az így keletkezett sejtkultúrából a plazmidokat az EZ-10 Spin

column plasmid DNA Kit-el (Biotechnology Department Bio Basic Inc., Canada)

izoláltuk a gyártó leírása szerint. Az izolált plazmid DNS oldatot ismét leellenőriztük a

T7 és SP6 primerekkel. A megfelelő inzertet tartalmazó mintákat szekvenáltattuk. A

szekvenálás a 3100 Genetic Analyzerrel (Applied Biosystems, USA) történt, melyet a

Biomi Kft. végzett el.

3.2.7 A filogenetikai és a szekvencia adatok értékelése

A kloroplasztisz és a mitokondrium DNS-ének PCR-RFLP viszgálatánál kapott

restrikciós fragmentumok jelenlétét 1-esel a hiányát 0-ával jelöltük. Az így kapott

binomiális mátrixot a Treecon 1.3b softver (Van de Peer és De Wachter 1994)

45

segítségével elemeztük. Kiszámoltuk a Nei-féle (Nei és Li 1979) genetikai

távolságmátrixot, majd ez alapján UPGMA (Unweighted Pair Group Method with

Arithmetic Mean) dendogrammot készítettünk. A restrikciós fragmentumokból kapott

adatmátrixon nem végeztük el a bootstrap analízist, mert a restrikciós fragmentumok

egymástól nem függetlenek, mivel egyetlen nukleotid csere egy fragmentum elvesztését

vagy két új fragmentum keletkezését eredményezheti, így a bootstrap analízis téves

eredményre vezetne (Felsenstein 2007).

A szekvenálásból kapott ABI fájlok szekvencia adatait a SeqMan (DNAStar Inc.,

Madison, USA) program segítségével illesztettük egymáshoz és határoztuk meg a

pontmutációkat ill. a kódoló szekvenciák által meghatározott aminosavsorrendet.

A nukleotid és aminosav szintű homológia kereséseket a BLAST program (Altschul

és mtsai 1990) segítségével a http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-e.html internetes oldalon

végeztük el.

46

http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-e.html

4. Eredmények4.1 A parlagfű populációgenetikai viszgálata PCR-RFLP módszerrel

fejlesztett anyai öröklésű markerek segítségével Az univerzális primer párok tesztelése során a felszaporított Cp és Mt nem

kódoló régiók mérete 250 és 3000 bp között volt (5. táblázat). A cpDNS vizsgálatánál

12 univerzális primerpárt teszteltünk le ebből 4 primerpárral kaptunk az összes mintánál

egyetlen terméket. Ezeket a kloroplasztisz fragmentumokat bevontuk az RFLP

vizsgálatokba és 9 restrikciós enzimmel emésztettük. A mtDNS összehasonlításánál 12

primerpárral kísérleteztünk, ebből 7-tel kaptunk terméket, de a cobf - cobr és a rps14f -

rps14r primerpárokkal felszaporítható mtDNS fragmentumok mérete csupán 250-300

bp volt. Ezeken a kisebb termékeken nem végeztük el a 8 enzimmel a restrikciós

emésztéseket, mert csak kevés vágási helyre számíthattunk.

5. táblázat: A felszaporított kloroplasztisz és mitokondrium régiók mérete

bázispárban.

Cp primer párok

Termékek db

Méret bp

Mt primer párok Termékek db

Méret bp

psbC2-trnS1 1 1600 18S-5S 1 1000trnS2-trnfM 1 1200 nad5a f-nad5 r 1 1000trnS4-trnT3 1 1500 nad5d f-nad5d r 1 1000trnF-trnV 1 3000 nad1B-nad1C 1 950trnK f-trnK r több nad4exon1-nad4exon2a 1 2000trnQ-trnR több cob f-cob r 1 300rpoC1-rpoC2 több rps14 f-rps14 r 1 250trnD-trnT1 több atp6 f-atp6 r nincsrbcL1 –rbcL2 több cox1 f-cox1 r nincspsaA –trnS4 több nad3 f-nad3 r nincsTrnV -rbcL több nad4exon2b-nad4exon3 nincstmT2 –psbC2 nincs rps14-cob nincs

A PCR-RFLP során a psbC2-trnS1, trnS2-trnfM, trnS4-trnT3 és trnF-trnV

primerpárokkal felszaporított Cp régiók hossza összesen 7.300 bp volt. A vizsgált Mt

régiók mérete összesen 5.950 bp, melyeket a 18S-5S, nad5af-nad5r, nad5df-nad5dr,

nad1B-nad1C és nad4exon1-nad4exon2a primerekkel amplifikáltunk. A restrikciós

enzimekkel végzett kezelések után, a mintákat agaróz gélen választottuk el és

digitálisan dokumentáltuk a gélfotókat (6. ábra).

47

Cp: trnS2+trnfM, emésztve MseI-el Mt: Nad5d F+R, emésztve RsaI-el

6. ábra: PCR-RFLP vizsgálatok agaróz elektroforetogrammjai. Minták: Emésztett

fragmentum: 0, K-Magyarország (Hódmezővásárhely): 1, 2, 13, 14; Ny-

Magyarország (Keszthely): 3, 4, 15, 16; USA: 5, 6, 7, 8; Kanada: 9, 10, 11, 12;

Napraforgó: 17, 18; 100 bp-os DNS marker: M.

Az emésztések utáni különböző méretű termékek számát a kloroplasztisz és

mitokondrium régiók emésztése során a parlagfűben a napraforgóban és a két

növényben együtt vizsgálva a 6/a és 6/b táblázatok foglalják össze.

48

6/a táblázat: A kloroplsztisz régiók restrikciós emésztés után kapott fragmentumok

száma a különböző enzimekkel.

Restrikciós enzimek

Fajok Cp primerpárokpsbC2-trnS1

trnS2-trnfM

trnS4-trnT3 trnF-trnV

Taq I A. A. 2 4 (2) 6 (6) 10 (2)H. A. 2 2 (0) 3 (3) 8 (2)Σ 2 4 (2) 9 (0) 12 (8)

Hha I A. A. 0 (0) 0 4 (4) 2 H. A. 2 (2) 0 1 (1) 2 Σ 2 (0) 0 5 (0) 2

Dde I A. A. 7 0 9 (9) 6 (2)H. A. 7 0 7 (7) 8 (4)Σ 7 0 16 (0) 10 (4)

Hae III A. A. 3 6 (0) 6 (6) 6 (2)H. A. 3 9 (3) 3 (3) 7 (3)Σ 3 10 (7) 9 (0) 9 (4)

EcoR IA. A. 0 0 4 (2) 8 (4)H. A. 0 0 7 (3) 5 (0)Σ 0 0 7 (2) 9 (5)

BstU I A. A. 0 2 4 0 H. A. 0 2 4 0 Σ 0 2 4 0

Aci I A. A. 13 (1) 3 2 13 (2)H. A. 12 (0) 3 2 13 (3)Σ 13 (12) 3 2 14 (9)

Rsa I A. A. 5 5 2 5 (2)H. A. 5 5 2 7 (4)Σ 5 5 2 9 (3)

Mse I A. A. 4 5 (1) 10 (1) 6 (2)H. A. 4 4 (1) 9 (0) 7 (3)Σ 4 6 (3) 10 (9) 8 (3)

Az A. A. jelöli a parlagfüvet a H. A. a napraforgót és a ∑ az összes fragmentumot a két

növényben. A zárójeles számok az adott fajra jellemző specifikus fragmentumok számát

jelentik, a ∑ utáni zárójeles szám mindkét növényfajban előforduló fragmentumok

számát mutatja.

49

6/b táblázat: A mitokondrium régiók restrikciós emésztés után kapott fragmentumok

száma a különböző enzimekkel.

Restrikciós enzimek

Fajok Mt primerpárok18S-5S nad5a f-

nad5 rnad5d f-nad5d r

nad1B- nad1C

nad4exon1-nad4exon2a

Taq I A. A. 8 (2) 7 (3) 0 5 7 (2)H. A. 6 (0) 4 (0) 0 5 5 (0)Σ 8 (6) 7 (4) 0 5 7 (5)

Hha I A. A. 3 5 5 4 (0) 6 (1)H. A. 3 5 5 6 (2) 5 (0)Σ 3 5 5 6 (4) 6 (5)

Dde I A. A. 7 (1) 6 (0) 2 3 (1) 4 H. A. 6 (0) 7 (1) 2 2 (0) 4 Σ 7 (6) 7 (6) 2 3 (2) 4

Hae III A. A. 7 5 0 6 (0) 4 (1)H. A. 7 5 0 7 (1) 5 (2)Σ 7 5 0 7 (6) 6 (3)

EcoR IA. A. 2 2 0 0 8 (2)H. A. 2 2 0 0 5 (0)Σ 2 2 0 0 8 (6)

BstU I A. A. 4 5 (1) 2 4 5 (1)H. A. 4 4 (0) 2 4 4 (0)Σ 4 5 (4) 2 4 5 (4)

Aci I A. A. 3 10 (4) 2 5 (0) 4 H. A. 3 6 (0) 2 8 (5) 4 Σ 3 10 (6) 2 9 (4) 4

Rsa I A. A. 2 5 (2) 4 (0) 3 (0) 6 (1)H. A. 2 3 (0) 5 (1) 5 (2) 5 (0)Σ 2 5 (3) 5 (4) 5 (3) 6 (5)

Mse I A. A. 0 - - - - - - - -H. A. 0 - - - - - - - -Σ 0 - - - - - - - -

Az A. A. jelöli a parlagfüvet a H. A. a napraforgót és a ∑ az összes fragmentumot a két

növényben. A zárójeles számok az adott fajra jellemző specifikus fragmentumok számát

jelentik, a ∑ utáni zárójeles szám mindkét növényfajban előforduló fragmentumok

számát mutatja.

A napraforgó és a parlagfű cpDNS-ét összehasonlítva 36 emésztésből 17-szer, ami

47%-nak felel meg a mtDNS emésztésénél 41-ből 19-szer, ami 46%-ot jelent, eltérő

számú és/vagy méretű restrikciós fragmentumokat kaptunk. A konzerváltabb Cp

genomnál a restrikciós fragmentumok száma összesen 213 volt a két fajban. A

parlagfüvekben 134 különböző emésztési terméket találtunk ebből 15 (11,2%) bizonyult

50

polimorfnak. A napraforgókkal összehasonlítva, további 79 polimorf fragmentum

keletkezett. A jobban rekombinálódó mitokondriális DNS-ben 224 különböző emésztési

terméket tudtunk összeszámolni. A parlagfűben az emésztések során 173 termék

keletkezett, és ezek közül 32 (18,5%) bizonyult polimorfnak. Még további 15 polimorf

fragmentumot találtunk a napraforgó mintákat is vizsgálva.

A genetikai távolságmátrix alapján szerkesztett dendogram (7. ábra) jól szemlélteti,

hogy a két napraforgó teljesen elkülönült a parlagfüvektől. A parlagfű populációk két

csoportra váltak szét az USA-ból származó egyedek egymással szoros kapcsolatot

mutattak, de a többi egyedtől elkülönültek.

7. ábra: UPGMA dendogram, a Nei-féle (Nei és Li 1979) genetikai távolságmátrix

alapján a Treecon 1.3b programmal (Van de Peer és De Wachter 1994) szerkesztve.

51

A hármas és négyes számú Hódmezővásárhely környéki parlagfű két kanadai mintához

állt a legközelebb. A többi minta viszonylag kis genetikai távolságra volt egymástól, de

a gyűjtési helyük szerint párokat alkottak.

4. 2 Herbicid célgének és rezisztenciát okozó mutációk jellemzése a

parlagfűben

4.2.1 Az atrazin-rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálata

A psbA gént szenzitív és atrazin rezisztens parlagfüvekből is izoláltuk a trnH+trnK

primerekkel. A PCR reakciók során a gént is tartalmazó 1800 bp méretű terméket

kaptunk. A szekvenálás megkönnyítése érdekében ezt a fragmentumot két részletben is

felszaporítottuk a trnK+r277 és a trnH+f277 primereket használva. A szekvenálást ezen

a két fragmentumon és a mutáció helyét tartalmazó belső fragmentumon - amit a

f277+r277 primer párral amplifikáltunk - is elvégeztük. A három szenzitív és a három

rezisztens parlagfű psbA génjének nukleotid-sorrendje nem különbözött egymástól,

csupán egyetlen bázispár eltérést találtunk a rezisztens egyedekben, a 790-es pozícióban

(7. ábra). Ez a pontmutáció a szakirodalomban közölt más növényekhez hasonlóan a

parlagfűben is egy adenin/guanin csere, ami szerin/glicin aminosav váltást okoz a D1

fehérjében az atrazin kötődési helyén.

52

8. ábra: A psbA gén szekvenciája az atrazin rezisztens parlagfűben. A szekvencia elején

a start (ATG) a végén a stop (TAA) kódon aláhúzva. A rezisztenciáért felelős nukleotid

“G”, aminek a pozíciójában a szenzitív típusban adenin található, bekeretezve látható.

A CTAG nukleotidok alatti csillagok jelölik a második MaeI vágási helyet. A szürkével

kiemelt szekvenciák a belső 277 bp méretű fragmentum primerjei, az aláhúzással az

univerzális primerektől való eltérést jelöltük.

A Cheung és mtsai (1993) által tervezett primer párral a várt 277 bp méretű, a

pontmutációt tartalmazó belső régiót sikerült felszaporítanunk, annak ellenére, hogy

mindkét primerben két nukleotid eltérés van a parlagfű szekvenciához viszonyítva (8.

ábra). A parlagfű szekvenciának megfelelő primereket szintetizáltattunk, azonban

ezekkel is ugyanazt az eredményt kaptuk, mint a Cheung féle primerekkel.

A D1 fehérje aminosav-sorrendje nagyon konzervált a magasabb rendű növények

között. Ennek ellenére a genetikai kód degenerációja miatt, a mutációk hatására lehet

nukleotid szinten különbségeket kimutatni a psbA génben. A homológiakeresés

eredményét a 7. táblázat tartalmazza. Látható, hogy az 1062 bp nagyságú génben a több

tízes nagyságrendű nukleotid eltérések nem vagy csak néhány aminosav megváltozását

okozzák. Ennek magyarázata a genetikai kód „lötyögése” és a D1 fehérje fontos szerepe

a fotoszintézisben, amit csak a megfelelő fehérje-szerkezettel tud ellátni.

53

7. táblázat: A parlagfű psbA génjének az összehasonlítása több növényfaj psbA

génjével.

psbA ORF Promóter 5’UTRNukleotidok Aminosavak Nukleotidok Nukleotidok

Ls 10 0 9 1So 46 0 11 22Nt 41 0 13 20Ms 60 4 22 14At 52 1 27 13Bn 48 2 27 24Gm 74 2 27 20Hv 77 6 27 26Os 90 4 29 22

A számok az eltérő nukleotidokat és aminosavakat jelzik az A. artemisiifolia L.

szekvenciájától. ORF: open reading frame; 5’UTR: 5’-untranslated region. Ls: Lactuca

sativa, So: Spinacea oleracea, Nt: Nicotiana tabacum, Ms: Medicago sativa, At:

Arabidopsis thaliana, Bn: Brassica napus, Gm: Glycine maxima, Hv: Hordeum

vulgare, Os: Oryza sativa.

Az Ambrosia artemisiifolia promótere is tartalmazza a ”-10” és a “-35” konzervált

elemeket, valamint ezek között megtalálható a prokariótákra jellemző TGn motívum és

az eukariótákra jellemző TATA box (9a ábra). A promóter központi részén kívüli regió

kevésbé konzervált.

54

9. ábra: A parlagfű psbA génjének promóter (a) és 5’UTR (b) szekvenciájának az

összehasonlítása más növényfajokéval. Szürkével az azonos nukleotidokat jelöltük. A “-

10” és a “-35” konzervált elemeket a promóterben és a riboszóma kötődési helyeket az

5’UTR-ben aláhúzással jelöltük. A növényfajok jelölése azonos az 7. táblázattal.

A psbA gén 5’UTR-e a parlagfűben 75 nukleotid hosszú. A szekvenciában számos

eltérés felfedezhető a többi magasabb rendű növényhez képest is (9b ábra). A

homológia körülbelül 70%-os, de a saláta (Lactuca sativa) 5’UTR szekvenciája

mindössze egyetlen nukleotidban különbözik. A három riboszóma-kötődési helyben

nem tér el az Ambrosia artemisiifolia 5’UTR-e sem a többi vizsgált növényétől.

4.2.1.1 A psbA gén rezisztens és fogékony alléljának kimutatása

A heteroplazmásság vizsgálatánál a BstXI és a MaeI restrikciós enzimeket

alkalmaztuk. A psbA gén belső 277 bp méretű fragmentumát a rezisztens egyedekben a

BstXI enzim a pontmutációnál elvágja, és egy 87 bp és egy 190 bp méretű terméket

eredményez (10. ábra).

55

10. ábra: A psbA gén belső 277 bp nagyságú fragmentuma, a BstXI enzimmel történt

emésztés után. Az első 6 minta rezisztens egyedből származik, a többi 18 minta

szenzitívből. M: 50 bp-os súlymarker.

A fogékony egyedekben nem vág a BstXI enzim. A szekvencia adatok azt mutatták,

hogy a MaeI-es enzimnek két vágási helye van a fogékony egyedekben. Az első

független a rezisztenciától, míg a második a rezisztenciát okozó mutáció helyén

található. Ezért ezzel az enzimmel a szenzitív típusban három darab restrikciós

fragmentumot (154 bp, 88 bp, 35 bp) kapunk, a rezisztens egyedekben pedig csak kettőt

(154 bp, 123 bp) ( 11. ábra).

11. ábra: A 277 bp méretű fragmentum sematikus emésztési képe a szenzitív és a

rezisztens genotípusban a MaeI és a BstXI enzimekkel. A számok a restrikciós

fragmentumok méretét jelölik bázispárban.

Az emésztések elvégzése után (12. ábra) azt tapasztaltuk, hogy a rezisztens egyedeknél

a BstXI-es emésztés után mindig marad emésztetlen 277 bp méretű termék. Ez a

jelenség független volt a restrikciós enzim koncentrációjától.

56

12. ábra: Hat szenzitív és hat rezisztens növény restrikciós emésztési képe BstXI-es (A

szenzitív egyedekben nincs vágási hely, a rezisztensekben egy 190 bp és egy 87 bp

nagyságú termék látható.) és MaeI-es enzimekkel (A szenzitívekben 154 bp, 88bp és 35

bp a rezisztensekben 154 és 123bp méretű termék látható) . A kép jobb szélén 50 bp-os

marker (M) látható.

Az emésztés után megmaradt 277 bp méretű terméket kivágtuk és visszatisztítottuk a

gélből. Ezt a DNS-t használva templátként megismételtük a PCR reakciót a f277+r277

primerekkel. A kapott terméket a MaeI-es enzimmel emésztve érdekes módon

megkaptuk a szenzitív és a rezisztens szekvenciákra jellemző méretű restrikciós

fragmentumokat és egy 189 bp méretű fragmentumot is (13. ábra).

57

13. ábra: A heteroplazmásság kimutatása hat atrazin rezisztens mintán. A BstXI

enzimes emésztés után az emésztetlen 277 bp méretű terméket kivágtuk a gélből és

visszatisztítottuk a DNS-t, a PCR után MaeI-el emésztettük a termékeket. Egyszerre

látható az atrazin rezisztens típusra jellemző fragmentum (123 bp) és a szenzitív

növényekre jellemző fragmentumok (154 bp, 88 bp és 35 bp). A kép bal szélén egy

emésztés előtti 277-es fragmentum, a jobb szélén az 50 bp-os marker látható.

Ebből az eredményből arra következtetünk, hogy a psbA gén triazin rezisztenciát okozó

változata heteroplazmásan van jelen az általunk vizsgált rezisztens egyedekben, azaz

egy növényben a psbA génre nézve többféle kloroplasztisz genotípus található. A 189

bp (154 bp + 35 bp) méretű termék megjelenése az első MaeI vágási hely hiányának

köszönhető, mely kloroplasztisz genotípus nyomokban (heteroplazmásan) fordul elő a

vizsgált rezisztens parlagfű mintákban. A fogékony egyedekben is megpróbáltuk

kimutatni a psbA gén rezisztens változatát, de ezek a próbálkozásaink nem hoztak

egyértelmű eredményt, valószínűleg a nagyon kis kópiaszám miatt (az adatokat nem

közöltük).

A rezisztenciát okozó pontmutációt tartalmazó régióra bi-PASA primereket

terveztünk (14. ábra). A BPMMF és BPMMR primerek szekvenciájának

megtervezésekor mindkét primerben egy-egy nukleotid cserét (MisMatch)

alkalmaztunk, a reakció specifikusságának növelése érdekében. Ezekkel a primerekkel

egy PCR reakcióban lehetséges a fogékony és a rezisztens genotípusra jellemző

fragmentum felszaporítása. Kimutatható, ha egy mintában jelen van a rezisztens és a

szenzitív genotípus is.

58

5’ATGAAGGTTACAGATTCGGTCAAGAAGAAGAAACTTATAATATCGTAGCCGCTCATGGTT

ATTTTGGCCGATTGATCTTCCAATATGCTA/GGTTTCAACAACTCTCGTTCTTTACATTTCTTC

CTAGCTGCTTGGCCTGTAGTAGGTATCTGGTTCACTGCTTTAGGTATCAGTACTATGGCTTTC

AACCTAAATGGTTTCAATTTCAACCAATCAGTAGTTGATAGTCAAGGCCGTGTTATTAACAC

TTGGGCTGATATCATTAACCGTGCTAACCTT3’

PsbaF: 5’-ATGAAGGTTACAGATTCGGTC-3’ - sötétszürke

PsbaR 5’-AAGGTTAGCACGGTTAATGATA-3’- sötétszürke

BPMMF: 5’-ATTGATCTTCCAATATACTA-3’- szürke

BPMMR: 5’-GAATGAGAGTTGTTGAAACC-3’- szürke

14. ábra: A bi-PASA primerek tervezéséhez felhasznált parlagfű psbA gén szekvencia

részlet és a megtervezett primerek szekvenciái. Vastagbetűvel a rezisztenciáért felelős

nukleotidot és a primerekben alkalmazott MisMatch-et (nukleotid cserét) jelöltük.

A PCR-es kísérletet elvégeztük 6 rezisztens és 6 szenzitív egyeden és az

elektroforézis után azt az eredményt kaptuk, hogy a rezisztens egyedek tartalmazzák a

szenzitív genotípust is (15. ábra). A rezisztens és szenzitív egyedekben is megjelent a

278 bp nagyságú termék, amely a PsbaF és PsbaR primerekkel szaporodott fel. A

rezisztens genotípusra jellemző 109 bp nagyságú fragmentum, amely szintézisének a

PsbaF és BPMMR primerek az indító szekvenciái, csak a rezisztens egyedekben

amplifikálódott. A szenzitív kloroplasztisz genotípusokban a PsbaR és BPMMF

primerektől kiindulva 208 bp nagyságú termék szaporodik fel, melyet a rezisztens és a

szenzitív fenotípusú egyedekben is ki tudtunk mutatni. A bi-PASA PCR eredményei azt

mutatják, hogy a triazin rezisztens parlagfüvekben a psbA gén rezisztens és szenzitív

változata is megtalálható.

59

15. ábra: A bi-PASA primerekkel elvégzett PCR reakció termékeinek az

elektroforetogrammja. Az első hat minta rezisztens, ezekben amplifikálódott a várt 278

bp-os régió és a rezisztens genotípusra specifikus 109 bp-os termék és a szenzitív

genotípusra jellemző 208 bp-os fragmentum is. A második hat minta szenzitív

fenotípusú és csak a 278 bp-os régió és a fogékony genotípusra specifikus 208 bp mértű

termék szaporodott fel.

4.2.2 Az ALS-gátlókkal szembeni rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálata

Az ALS gén vizsgálatához az ALS-A régiót felszaporítottuk a Patzoldt és mtsai

(2001) által közölt primerekkel és közvetlenül szekvenáltuk. Ez a régió tartalmaz az öt

toleranciáért felelős mutáció közül hármat (Ala122/Thr, Pro197/Ser, Ala205/ Val). Az

általunk vizsgált hat magyarországi, és egy kanadai parlagfű, valamint viszonyítási

alapként használt egy napraforgó minta ALS-A szekvenciáját a 16. ábrán közöljük.

60

16. ábra: Az ALS-A regió 264 nukleotid méretű szakasza, amely tartalmaz három ALS-

gátló rezisztenciáért felelős pontmutációt.

Az aminosav szekvenciában a három rezisztenciát okozó mutációt fekete színnel jelöltük

(Ala122/Thr, Pro197/Ser, Ala205/Val). A hódmezővásárhelyi 2. sz. minta aminosav

sorrendjében a detektált mutációt beszürkítettük (Ile192/Asp192). A nukleotid szintű

polimorfizmusokat beszürkítettük. A polimorf nukleotidok jelentése a konszenzus

szekvenciában: W=A/T, Y=C/T.

61

Egyik minta sem tartalmazta a rezisztenciáért felelős mutációkat, de a

hódmezővásárhelyi 2-es parlagfűben a 224-es nukleotidnál egy timin/adenin csere

következett be, ami izoleucin/aszparaginsav aminosav cserét eredményez.

Tranel és mtsai (2004) 24 amerikai parlagfű egyed ALS-A szekvenciáját közölték,

ahol 24 mintán összesen 32 nukleotid polimorfizmust detektáltak. Ezekkel az adatokkal

hasonlítottuk össze az általunk vizsgált hat magyarországi és egy kanadai parlagfű

minta, valamint egy napraforgó szekvenciáját (8. táblázat).

8. táblázat: Polimorfizmusok az ALS-A régió 264 nukleotidja alapján.

Faj Gyűjtési hely Növények

száma

Polimorf

nukleotidok

Polimorf

nukleotid/növényNapraforgó

(Nova)

- 1 5 5

Parlagfű Illinois

(Tranel és mtsai 2004)

8 18 2,25

Minnesota


8 34 4,25

Ohio


8 32 4

USA


24 36 1,5

Kanada, Montreál 1 4 4Hódmezővásárhely 2 12 6Keszthely 4 15 3,75Magyarország 6 19 3,17

A magyarországi mintákban 19 különböző pontmutációt mutattunk ki a 264 bp

méretű régióban. A két hódmezővásárhelyi mintában összesen öt egyedi polimorfizmust

találtunk, míg a többi hazai mintában található nukleotid cserék az amerikai mintákban

is előfordultak.

Az ALS-B régiókat PCR-el felszaporítottuk, majd klónoztuk és a teljes régió

szekvenciáját meghatároztuk a napraforgó és a négy parlagfű mintában. A szekvenálás

eredménye 17. ábrán látható. Ebben a régióban két ALS-gátlókra rezisztenciát okozó

mutáció lehetséges (Trp574/Leu, Ser653/Thr), melyek közül egyik sem volt megtalálható

az ALS-B szekvenciákban. A Ser653/Ala aminosav cserét minden vizsgált egyedben

kimutattuk, melyet Patzoldt és mtsai (2001) is felfedeztek amerikai parlagfüvekben, de

ez nem okozott rezisztenciát az ALS-gátló herbicidekkel szemben.

62

17. ábra: Az ALS-B regió 365 nukleotidja, amely tartalmazza a két ALS-gátló

rezisztenciáért felelős pontmutációt. Az aminosav szekvenciában a két rezisztenciáért

felelős mutációt fekete színnel jelöltük (Trp574/Leu574, Ser653/Thr653). A keszthelyi 2. sz.

minta aminosav sorrendjében a detektált két mutációt beszürkítettük ( Ala624/Val624,

Ile640/Val640). A nukleotid polimorfizmusokat beszürkítettük. A polimorf nukleotidok

jelentése a konszenzus szekvenciában: R=A/G, Y=C/T. A régió felszaporításához

alkalmazott primereket sötétszürke szín jelöli.

63

A keszthelyi 2-es számú mintában a 245-ödik és a 292-edik nukleotidnál

bekövetkezett pontmutációk aminosav cserét is eredményeztek. Így az aminosav

sorrendben alanin/valin és izoleucin/valin váltás következett be (16. ábra). Az ALS-A és

ALS-B régióban az egy parlagfűre eső polimorf nukleotidok száma nagyságrendileg

azonos volt. A napraforgó ALS-B szekvenciában 21 nukleotid eltérés volt a parlagfű

szekvenciákhoz képest (8. és 9. táblázat), ez négyszer annyi, mint az ALS-A régió

esetében.

9. táblázat: Polimorfizmusok az ALS-B régió 365 nukleotidja alapján.

Faj Gyűjtési hely Növények

száma

Polimorf

nukleotidok

Polimorf

nukleotid/növényNapraforgó

Nova

- 1 21 21

Parlagfű Hódmezővásárhely 1 5 5Keszthely 3 11 3,66Magyarország 4 12 3

4.3 A parlagfűpollen fő allergénjét kódoló Amb a I géncsalád vizsgálata

szekvencia specifikus primerekkelA Rafnar és mtsai (1991) meghatározták az Amb a I gén cDNS szekvenciáját és

három génváltozatot írtak le. Ezt a gént ill. változatait kívántuk kimutatni

magyarországi parlagfüvekben. A vizsgálatokat Rafnar és mtsai (1991) által a gén

elejére, közepére és végére tervezett specifikus primerekkel kezdtük el. A gén első felét

valószínűleg sikerült amplifikálnunk 5 magyarországi parlagfűből az RW38 és RW45

primerekkel (18. ábra), de a kódoló cDNS szekvenciától eltérően nem 530 bp méretű

terméket kaptunk, hanem egy 630 bp-osat. Nagy valószínűséggel 100 bp méretű intron

található a gén első felében, vagy más genomi régióból történt az amplifikáció. A gén

egészének felszaporítása nem sikerült az RW38 és RW32.1, RW32.2 és RW32.3

primer-kombinációkkal sem.

64

18. ábra: Az Amb a I gén cDNS szekvenciájának első felére tervezett primerekkel

(RW38+RW45: Rafnar és mtsai 1991) felszaporított termék elektroforetogrammja.

Az Amb a I gén három változatára specifikus primerek (Amba1-2E+Amba1K,

Amba1-2E+Amba2K, Amba3E+Amba3K), amiket a PrimerSelect programmal

terveztünk a gén ugyanazon részét amplifikálják, mint az RW38+RW45 primerpár. A

cDNS szekvencia alapján várt fragmentum 532 bp méretű volt. A PCR reakciók

elvégzése után azt tapasztaltuk, hogy mind a három primer kombináció számos nem

specifikus termék mellett felszaporított egy kb. 630 bp méretű főterméket is, hasonlóan

az RW38+RW45 primerpárhoz (19. ábra). Az Amba1-2E+Amba2K és

Amba3E+Amba3K primer párokkal kapott termékek 20-30 bp-ral nagyobbak voltak a

630 bp-nál.

A Primer3 programmal tervezett specifikus primerek tesztelésénél sem kaptunk

egyértelmű eredményeket. Az Amba1P530+Amba1P1172 primer párral, mely a cDNS

szekvencia alapján az 1-es génváltozat végéről amplifikálna egy 643 bp méretű

terméket, 50 bp-tól 1200 bp-ig változatos méretű PCR termékeket kaptunk. A

Amba1P298+Amba 1P968 primer párral egy 900 bp méretű főtermék mellett számos

kisebb fragmentum is amplifikálódott (19. ábra). Ez a primer pár a gén Amb a I.1-es

változatának a közepéről, egy 671 bp nagyságú specifikus fragmentum

felszaporításához lett tervezve. Az Amba1-2P224+Amba1-2P891 primer pár, amelyet

az Amb a I gén egyes és kettes változatának középső régiójából egy 668 bp méretű

65

termék felszaporítására terveztünk, nem amplifikált specifikus terméket a vizsgált

mintákban (19. ábra). Az Amba3P232+Amba3P899 primerpárt a gén harmadik

változatának középső 668 bp méretű régiójának amplifikálására terveztük. A PCR

reakciókban specifikus terméket nem szaporított fel.

19. ábra: Az Amb a I gén három változatára specifikus a gén első felére tervezett

primerekkel (Amba1-2E+Amba1K, Amba1-2E+Amba2K, Amba3E+Amba 3K) és a

génváltozatokra specifikus primerekkel (Amba1P298+Amba1P968, Amba1-

2P224+Amba1-2P891) végzett PCR reakciók amplifikációs mintázata.

66

5. Következtetések és javaslatok5.1 Parlagfű populációk genetikai összehasonlításaA kutatómunka kezdetekor célul tűztük ki, hogy a parlagfűről minél több molekuláris

genetikai információt gyűjtsünk, melyek felhasználhatóak további kutatásokhoz,

populációgenetikai összehasonlításokhoz, a magyarországi parlagfű származásának

megállapításához és a terjedésének követéséhez az európai kontinensen.

Hasonló tárgyú kutatást végezték Franciaországban Genton és munkatársai (2005),

mikroszatellit markereket fejlesztettek, majd ezekkel hasonlítottak össze észak-amerikai

és franciaországi parlagfű populációkat. A franciaországi populációkban nagyobb

genetikai változékonyságot találtak, mint az amerikai minták között. Ebből az

eredményből arra következtetnek, hogy több forrásból történthetett a parlagfű inváziója.

A parlagfű nukleáris genomjának diverzitás vizsgálatával a szerző már foglalkozott

(Cseh 2004). Az egy parcelláról származó 24 egyed RAPD (Random Amplified

Polymorphic DNA) vizsgálata során a polimorf fragmentumok aránya meghaladta a

70%-ot, ami kiugróan magasnak mondható. Ez a rendkívül nagyfokú heterozigótaság

valószínűleg az alapja az ürömlevelű parlagfűre, mint fajra jellemző életképességnek.

Nagyon meglepő ez a nagyfokú diverzitás, annak ellenére, hogy a parlagfű magjai a

talajban évtizedekig megőrzik csíraképességüket, ezért elképzelhető, hogy különböző

generációk tucatjai élnek egyidejűleg egymás mellett, és kereszteződnek egymással, a

gének legváltozatosabb kombinációit hozva így létre. Ugyanakkor nem zárható ki, hogy

a DNS szintű változékonyság mobilis genetikai elemek, transzpozonok aktivitásának,

vagy más molekuláris genetikai esemény, például túlzott rekombináz aktivitás

eredménye is egyben. A parlagfű pollenje akár több száz kilométerre is képes eljutni, és

amennyiben e nagy távolságra eljutó pollen megőrzi termékenyítőképességét, úgy nem

beszélhetünk térbeli izoláltságról, és a sejtmagi gének gyakorlatilag szabadon

terjedhetnek az ország szinte bármely növényéről a másikra.

A kitűzött céljaink eléréséhez az organellum genomok vizsgálatát találtuk

megfelelőnek, mivel ezek anyai öröklésűek, tehát a pollennel nem terjednek és PCR-

RFLP módszerrel egyszerűbben és megbízhatóbban jellemezhetőek, mint a nukleáris

genom. A markerek fejlesztését Al-Janabi és mtsai (1994), Demesure és mtsai (1995),

Dumolin-Lapegue és mtsai (1996), Hiratsuka és mtsai (1989), Petit és mtsai (1998) és

Wu és mtsai (1998) által publikált primerek tesztelésével kezdtük el, mert ezek a

kloroplasztisz és a mitokondrium genomjából nem kódoló régiókat szaporítanak fel

67

PCR reakció segítségével. Ezekben a nem kódoló régiókban sokkal több polimorfizmus

várható, ezért jóval informatívabbak filogenetikai szempontból.

A parlagfű cpDNS-ében a vizsgált 12 univerzálisnak mondott primerpár közül 4

terméke bizonyult alkalmasnak az RFLP vizsgálatokra, a mtDNS esetében 12

primerpárból 5 volt jól használható. Ezeket a termékeket emésztettük a Taq I, BstU I,

Aci I, Dde I, EcoR I, Hae III, Hha I, Mse I és az Rsa I-es restrikciós endonukleázokkal.

Az RFLP eredményeként cpDNS fragmentumokból összesen 213 restrikciós terméket

kaptunk, ezekből 134 volt parlagfű és 79 napraforgó specifikus. A 134 parlagfű

fragmentumból 11,7% bizonyult polimorfnak, ezek szolgálhatnak genetikai

információval a gyűjtés helyéről. A mtDNS szekvenciák emésztésével 224 restrikciós

fragmentum keletkezett, ebből 15 csak a napraforgó mintákban fordult elő. A 173

parlagfű specifikus termék közül 18,5% volt polimorf.

A genetikai távolságmátrix alapján szerkesztett dendogram (6. ábra) kiértékelésénél

azt tapasztaltuk, hogy a referenciaként használt napraforgók egy távoli csoportot

alkottak, tehát a módszer helyes eredményre vezetett. Az USA-ból származó négy

parlagfű egymással szoros kapcsolatot mutatott, de a többi egyedtől elkülönültek. A

hármas és négyes számú Hódmezővásárhely környéki parlagfű két kanadai mintához

állt a legközelebb. A többi minta viszonylag kis genetikai távolságra volt egymástól, de

a gyűjtési helyük szerint párokat alkottak. Ezek alapján azt feltételezzük, hogy

Magyarországra Kanadából is érkeztek parlagfűmagok. Nagyon valószínű azonban az

is, hogy az amerikai kontinensről több forrásból történt a fertőzés.

A magyarországi parlagfű populáció származásának pontosabb felméréséhez

szükségesnek látjuk, hogy több populációt is megvizsgáljunk Észak-Amerikából és

Európából. Anyagi okok azonban, nem tették lehetővé ezt a nagyobb szabású kutatást.

A populációgenetikai vizsgálatokban a rokon fajok közötti és fajon belüli genetikai

távolságok elemzésére az organellum-genom felhasználása széleskörű. A parlagfű

organellum-DNS jellemzéséhez egy viszonylag egyszerű és költség hatékony módszert,

a PCR-RFLP-t adaptáltuk. Meghatároztuk azokat a nem kódoló kloroplasztisz és

mitokondrium régiókat, amelyek megbízhatóan amplifikálhatóak. Bizonyítottuk, hogy

ezekben a szekvenciákban restrikciós enzimekkel polimorf nukleotidokat lehet

kimutatni. Ezek az SNP-k utalhatnak az adott növény származására, mivel ezek a

markerek anyai öröklést mutatnak és a pollennel nem terjednek. A módszer további

előnye, hogy jól ismételhető és több labor eredményei is összevethetőek. A parlagfű

populáció genetikai vizsgálatához, szükség lenne egy nemzetközi összefogásban

68

elvégzett kutatásra, amely vizsgálná Amerika és Európa fertőzött területeit, így

kirajzolódhatna az ürömlevelű parlagfű származásának és terjedésének genetikai

térképe.

5.2 A parlagfű triazin-rezisztenciájának molekuláris genetikai háttereMivel a gyomnövények közül az Amaranthus fajok (Hirschberg és McIntosh 1983),

a Solanum nigrum (Goloubinoff és Edelmann 1984) és a Poa annua (Barros és Dyer

1988), triazin rezisztenciája is a psbA gén 264-es kódonján bekövetkezett egyetlen

pontmutáció eredménye és Bottermann és Leemans (1988), majd Holt (1993) is felhívta

a figyelmet e tulajdonság konzervált változékonyságára, ezért arra következtettünk,

hogy a parlagfűben is ennek a génnek a mutációja okozhatja a triazin-rezisztenciát.

A gén vizsgálatát az atrazin rezisztencia tesztek után 12 rezisztens és 36 fogékony

fenotípusú parlagfüvön kezdtük el. A psbA gén szekvenálása során bebizonyosodott,

hogy a parlagfűben csak egyetlen pontmutáció felelős a rezisztencia kialakulásáért a

többi gyomnövényhez hasonlóan.

A rezisztens és szenzitív génváltozatokat hordozó egyedek elkülönítésére a

szekvenálásnál gyorsabb és egyszerűbb módszert is alkalmaztunk. A mutációra

specifikus restrikciós enzimek segítségével megállapítható az egyed rezisztenciája. A

BstX I-es enzim csak a rezisztens biotípusra jellemző génváltozatot vágja ketté, a Mae I-

es enzim pedig csak a szenzitív allél változatot tudja hasítani. A restrikciós enzimek

segítségével arra is tudtunk következtetni, hogy a rezisztens egyedekben a psbA gén

heteroplazmásan van jelen.

A még gyorsabb és nagy mintaszámban elvégezhető rezisztencia teszt kifejlesztése

érdekében, a mutációra specifikus bi-PASA primereket terveztünk. A PCR reakciók

egyértelműen mutatták a rezisztens és a szenzitív allélok jelenlétét. A bi-PASA

kísérletek is alátámasztották a restrikciós emésztések eredményeit. A rezisztens

egyedekben a szenzitív genotípusra jellemző fragmentum is amplifikálódott. Ezzel a

módszerrel a rezisztencia megállapítása maximum két napot vesz igénybe és a vizsgálat

bármely növényi részből elvégezhető. A psbA gén szekvenciája nagyon konzervatívnak

mondható a növények között, így az álltalunk kifejlesztett bi-PASA primerek a

gyomnövények nagy részében változtatás nélkül használhatóak lennének a rezisztencia

teszt elvégzésére. Az így kapott gyors és pontos eredmények a gyomirtási tanácsadásnál

is felhasználhatóak , akár parcella szinten is kimutatható a rezisztens gyomok jelenléte.

69

5.3 A parlagfű ALS-gátló herbicidekkel szembeni rezisztenciájaIrodalmi adatokból tudjuk, hogy az USA-ban már kialakultak ALS-gátló

herbicidekkel szemben rezisztens parlagfű biotípusok. Nagy a valószínűsége, hogy a

Magyarországon is termesztett ALS inhibitorokkal szemben rezisztens napraforgó

fajták termesztése során vagy az egyoldalú szerhasználat miatt, hazánkban is kialakul a

rezisztens biotípus. Az ALS-gátlókkal szembeni rezisztencia molekuláris genetikai

hátterét ismerjük, az ALS génben következhet be öt olyan pontmutáció, amelyek a

rezisztencia kialakulásához vezető aminosav cserével járnak. A különböző növényekben

a rezisztenciát okozó aminosav cserék az ALS-A régióban a következők voltak:

Ala122/Thr122, Pro197/Ser197, Ala205/Val205 az ALS-B régióban: Trp574/Leu574, Ser653/Thr653

(McNaughtona és mtsai 2005). Patzoldt és mtsai (2001) négy fogékony és két rezisztens

parlagfüvet hasonlítottak össze az ALS-A és ALS-B szekvencia alapján. Arra a

következtetésre jutottak, hogy a rezisztenciát ebben a populációban a Trp574-es

aminosav (triptofán) leucinra cserélődése okozza. Zheng és mtsai (2005) szerint is a

parlagfű ALS rezisztenciájának meghatározó oka a Trp574/Leu574 aminosav csere és a

rezisztencia mértékét az is befolyásolja, hogy a mutáció heterozigóta vagy homozigóta

formában van jelen az adott növényben.

A rezisztenciát kiváltó mutáció kimutatásához szükséges az ALS-A és ALS-B régió

szekvenciájának ismerete. A parlagfűben az ALS-A régió szekvenciáját Tranel és mtsai

2004-ben közölték, azonban az ALS-B régió teljes szekvenciáját a parlagfűben még nem

publikálták.

Célunk volt a magyarországi parlagfű minták ALS-A és ALS-B régióinak

szekvenálása. A kísérletekbe referenciaként szintén bevontunk egy napraforgó fajtát és

az ALS-A szekvenciát sikerült meghatároznunk egy kanadai mintából is. Tranel és mtsai

(2004) az ALS-A szekvencia változékonyságát vizsgálták az USA három államában 24

db parlagfűben, 24 db bojtorján szerbtövisben és 10-10 db Amaranthus fajban

(Amaranthus hybridus, Amaranthus tuberculatus). A legtöbb polimorfizmust a

parlagfűben találták, a 24 egyedben 48 db SNP-t detektáltak. A két Amaranthus faj húsz

egyedében összesen 7 polimorf nukleotid volt, a szerbtövisben nem fedeztek fel eltérést

az egyedek között. Ez az eredmény is rámutat a parlagfű óriási genetikai

változékonyságára, amelynek pontos okait még nem ismerjük.

A hat magyarországi parlagfűben 19 különböző pontmutációt mutattunk ki a 264 bp

nagyságú ALS-A szekvenciában. A két hódmezővásárhelyi mintában összesen öt egyedi

polimorfizmust találtunk, míg a többi hazai mintában található nukleotid cserék az

70

amerikai mintákban is előfordultak. Az egyetlen aminosav cserét okozó mutáció a 2-es

számú hódmezővásárhelyi parlagfűben alakult ki, ami a 192. aminosavat érintette. A

napraforgó mintában 5 olyan SNP volt, amit a parlagfüvekben nem tudtunk kimutatni.

Az ALS-B régiót négy Magyarországi parlagfűből és egy napraforgóból klónoztuk,

majd szekvenáltuk. A parlagfű ALS-B régióját Amerikában már vizsgálták, azonban a

teljes régió szekvenciáját ebben a dolgozatban közöljük először. Ebben a régióban két

ALS-gátlókra rezisztenciát okozó mutáció lehetséges (Trp574/Leu, Ser653/Thr), melyek

közül egyik sem volt megtalálható az ALS-B szekvenciákban. A Ser653/Ala aminosav

cserét minden vizsgált egyedben kimutattuk, melyet Patzoldt és mtsai (2001) is

felfedeztek amerikai parlagfüvekben, de ez nem okozott rezisztenciát a vizsgálataik

szerint. A keszthelyi 2-es számú mintában a 245-ödik és a 292-edik nukleotidnál

bekövetkezett pontmutációk az aminosav sorrend megváltozását is eredményezték.

Az egy növényre eső polimorf nukleotidok száma az ALS-A és ALS-B régiókban

közel azonos volt, tehát a mutációk valószínűsége nem tér el a két szekvenciában. A

napraforgó esetében azt tapasztaltuk, hogy az ALS-B régió nagyobb eltérést mutat a

parlagfű szekvenciáktól. Négyszer több polimorf nukleotid volt az ALS-B, mint az ALS-

A régióban.

A szekvencia adatok ismeretében, már lehetséges az öt kulcsfontosságú mutációra

bi-PASA primereket tervezni és így lerövidíteni a rezisztencia megállapításának idejét.

Ezt a következő lépést az is megvalósíthatóvá teszi, hogy a szekvencia adatokból

kiderült a rezisztenciáért felelős mutációk környékén konzervatív nukleotid sorrendű

szakaszok találhatók. Ezekre a szekvenciákra nagy biztonsággal tervezhetőek az allél

specifikus primerek. A módszerből fakadó további előny lenne, hogy egyetlen

vizsgálattal megállapítható az, hogy a rezisztenciáért felelős mutáció heterozigóta vagy

homozigóta formában van-e jelen. Ez befolyásolja a rezisztenca mértékét, így például

egy rezisztens heterozigóta populációban még szerkombinációban érdemes lenne

kijuttatni az ALS-gátló herbicideket, de egy homozigóta populációnál már teljesen

felesleges és káros. A genetikai információkra alapozott gyomirtási tanácsadás a

jövőben új, ígéretes iránya lehet a növényvédelemnek.

A dolgozatban közölt eredmények és vizsgálati módszerek lehetővé teszik, a

Magyarország területén megjelenő, ALS-gátló herbicidekkel szemben rezisztens

parlagfű biotípus, gyors azonosítását és a rezisztencia genetikai okainak feltárását. Ez az

időben történő detektálás jelentősen hozzájárulhat az ALS inhibitorokkal szemben

rezisztens biotípus terjedésének a csökkentéséhez.

71

5.4 Az Amb a I géncsalád molekuláris genetikai vizsgálata szekvencia

specifikus primerekkelA parlagfű pollenallergia jelentős humán egészségügyi és ezzel gazdasági károkat

okoz Magyarországon és a világban. Az allergia kialakulásáért 90%-ban az Amb a I

fehérje felelős (Lockey és Ledford 2008). Ezt a 38 kDa nagyságú fehérjét az Amb a I

géncsalád kódolja és eddig a génnek négy változatát írták le cDNS szinten.

A gén pontosabb megismeréséhez és a gén magyarországi változatainak

feltérképezéséhez végeztünk vizsgálatokat szekvenci specifikus primerekkel. Rafnar és

mtsai (1991) által a gén kódoló szekvenciájára tervezett primerekkel (RW38, RW45)

valószínűleg sikerült a gén első felének a felszaporítása a magyarországi mintákból. A

primerek által közrefogott régió mérete a cDNS szekvenciában 530 bp, de

kísérleteinkben 630 bp méretű termék keletkezett. Azt feltételezzük, hogy ebben a

régióbn egy 100 bp méretű intron lehet, a genomi DNS szekvenciában. A feltevésünk

igazolására szükségesnek látjuk ennek a 630 bp méretű terméknek a szekvenálását, erre

azonban a dolgozat elkészültéig nem volt módunk. A teljes Amb a I gén amplifikálása

nem sikerült a genomi DNS-ből az RW38+RW32.1, RW38+RW32.2 és

RW38+RW32.3 primer-kombinációkkal sem. Ennek okát abban látjuk, amire Rafnar és

mtsai (1991) is felhívták a figyelmet a Southern-blot analízis eredményeiből

következtetve, hogy az Amb a I géncsalád valószínűleg több helyen szétszórva van

kódolva a parlagfű genomban.

A magyarországi génváltozatok feltérképezéséhez megpróbáltunk az Amb a I gén

első felének három változatára specifikus primereket tervezni a PrimerSelect

programmal. Az Amba1-2E+Amba1K, Amba1-2E+Amba2K és Amba3E+Amba 3K

primer párok valószínűleg a gén első felét amplifikálják, hasonlóan az RW38+RW45

primerekhez. A tervezett primerek nem bizonyultak specifikusnak az Amb a I.1, Amb a

I.2 és Amb a I.3 génváltozatokra és több termék is keletkezett a várt 630 bp méretű

mellett. A parlagfű genetikai változékonysága itt is megnehezítette a munkánkat. A

keletkezett termékek klónozása és szekvenálása adhatna csak pontos választ a

kísérletekben kapott eredményekre.

A Primer3 programmal tervezett specifikus primerek tesztelésénél sem kaptunk

egyértelmű eredményeket. Az Amba1P530+Amba1P1172 primer pár az Amb a I.1 gén

második felének cDNS szekvenciájára specifikus. A vizsgált parlagfű mintákban RAPD

jellegű mintázatot kaptunk ezzel a primer kombinációval. Ugyanezt az eredményt

72

mutatták az Amb a I.1 génváltozat közepére tervezett Amba1P298+Amba 1P968

primerek is. Az Amba1-2P224+Amba1-2P891 és Amba3P232+Amba3P899

primerpárok, amiket az Amb a I.2 és Amb a I.3 génváltozatok közepének a

felszaporításához terveztünk nem amplifikáltak specifikus terméket.

Az új generációs szekvenálási eljárásokkal a parlagfű teljes genomja pár hét alatt

megismerhető lenne. A teljes parlagfű DNS szekvencia ismeretében az egészségügyi

(Amb a I, Amb 2 - Amb 9) és gyomirtási szempontból fontos gének egyszerűen

izolálhatóak lennének. Új herbicid rezisztens biotípusok megjelenésekor, más fajokból

ismert herbicid rezisztencia gén szekvenciák alapján, a gén parlagfű homológja gyorsan

azonosítható lenne és a DNS szintű rezisztencia tesztek kidolgozása is megvalósulhatna.

73

7. ÖsszefoglalásA parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.) a legveszélyesebb allergén és legelterjedtebb

gyomnövényünk. Az utóbbi években kifejlesztett molekuláris genetikai módszerek

lehetővé teszik, hogy olyan parlagfű-specifikus ismereteket szerezzünk, melyek a

védekezés új eljárásainak kifejlesztését teszik lehetővé. A rengeteg, orvos-biológiai

vonatkozású kutatás mellett, az allergiát kiváltó növény molekuláris genetikai

megismerésére nemcsak hazai, de világviszonylatban sem fordítanak kellő hangsúlyt.

Ilyen értelemben a jelen munka úttörő jellegű. Egy átfogóbb kutatási program részeként

a célunk volt, hogy a parlagfűről minél több molekuláris genetikai információt

gyűjtsünk, amelyek felhasználhatóak gyombiológiai vizsgálatokhoz, így parlagfű

populációk filogenetikai összehasonlításához, a triazinokkal és az ALS-gátló

herbicidekkel szembeni rezisztencia gyors DNS szintű meghatározásához és az Amb a I

géncsalád pontosabb megismeréséhez.

A parlagfű amerikai, kanadai, Kelet- és Nyugat-magyarországi populációinak

molekuláris genetikai vizsgálata során anyai öröklésű markereket fejlesztettünk PCR-

RFLP módszerrel. A kloroplasztisz és a mitokondrium DNS-éből nem kódoló régiókat

szaporítottunk fel univerzális primerekkel és ezeket a szekvenciákat restrikciós

enzimekkel emésztettük. Az így kapott markerek utalhatnak az adott növény

származására, mivel ezek a markerek anyai öröklést mutatnak és a pollennel nem

terjednek. A genetikai távolságmátrix alapján az USA-ból származó négy parlagfű

egymással szoros genetikai kapcsolatot mutatott, de a többi egyedtől különálló csoportot

alkottak. Genetikai értelemben két kanadai és két Hódmezővásárhely környéki parlagfű

is közel állt egymáshoz. A többi minta viszonylag kis genetikai távolságra volt

egymástól, de a gyűjtési helyük szerint párokat alkottak. Ezek alapján azt feltételezzük,

hogy Magyarországra Kanadából is érkeztek parlagfűmagok. Nagyon valószínű

azonban az is, hogy az amerikai kontinensről több forrásból történt a fertőzés.

Két fontos herbicidcsoport; a triazinok és az ALS-gátlók célgénjét jellemeztük a

parlagfűben. Bizonyítottuk, hogy az atrazin rezisztencia oka a parlagfűben - más

gyomnövényekhez hasonlóan - a psbA gén egyetlen pontmutációja. A rezisztens és

szenzitív génváltozatokat BstX I-es és Mae I-es restrikciós enzimekkel el tudtuk

különíteni és kimutattuk, hogy a rezisztens növényekben a psbA gén heteroplazmásan

van jelen. Gyors és nagy mintaszámban végezhető rezisztencia teszt kifejlesztése

74

érdekében a mutációra specifikus bi-PASA primereket terveztünk. A PCR reakciók

egyértelműen mutatták a rezisztens és a szenzitív allélok jelenlétét.

Az ALS gén A és B régióját szekvenáltuk magyarországi parlagfüvekből és a Nova

napraforgó fajtából. Meghatároztuk a nukleotid és aminosav szintű polimorfizmusokat a

parlagfüvek között és a napraforgó és parlagfű minták között is. Megállapítottuk, hogy

a szekvenciákban nem találhatóak meg azok a nukleotid polimorfizmusok (SNP),

amelyek a rezisztenciát okozó aminosav cseréket okozták a különböző

gyomnövényekben. Ezeknek a szekvenciáknak az ismeretében az ALS-gátlókra

rezisztens parlagfű biotípus magyarországi megjelenése előtt, lehetőségünk van az öt

kulcsfontosságú pontmutációra bi-PASA primereket tervezni és így lerövidíteni a

rezisztencia megállapításának az idejét.

A parlagfű pollenallergia legfőbb kiváltója az Amb a I fehérje, ezt a fehérjét az Amb

a I gén kódolja. A gén kódoló cDNS szekvenciáját, már meghatározták és eddig négy

változatát írták le (Rafnar és mtsai 1991,Griffitha és mtsai 1991). Az Amb a I gén

magyarországi génváltozatait kívántuk meghatározni. A magyarországi mintákból a gén

első felének felszaporítása valószínűleg sikerült a cDNS szekvencia specifikus

primerekkel. A génváltozatokra specifikus primerekkel nem kaptunk egyértelmű

eredményeket. Ez magyarázható a géncsalád nagy genetikai változékonyságával és

azzal, hogy a parlagfű genomban több helyen és több részletben lehet kódolva az Amb a

I fehérje.

75

7. Irodalomjegyzék Al-Janabi S.M., McClelland M., Petersen C., Sobral B.W.S. (1994) Phylogenetic

analysis of organellar DNA sequences in the Andropogoneae: Saccharinea. Theor.

Appl. Genet. 88: 933-944.

Altschul S. F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D. J. (1990) "Basic local

alignment search tool." J. Mol. Biol. 215: 403-410.

Barros M. és Dyer T. (1988) Atrazine rezistance in the grass Poa annua is due to a

single base change in the chloroplast gene for the D1 protein of photosystem II.

Theor. Appl.Genet. 75: 610-616.

Basset I. J. és Crompton C. W. (1971) The biology of Canadian weeds. Ambrosia

artemisiifolia L. and A. psilostachya. DC. Can. J. Plant Sci. 55: 463-476.

Berzsenyi Z. (2000) Rezisztencia a különböző herbicid csoportokkal szemben. In:

Hunyadi K., Béres I., Kazinczi G. Gyomnövények, gyomirtás, gyombiológia

Mezőgazda Kiadó, Budapest

Béres I. (1981) A parlagfű (Ambrosia artemisiaefolia L.) hazai elterjedése, biológiája és

a védekezés lehetőségei. Kandidátusi értekezés, Keszthely

Béres I. és Hunyadi K. 1980. A parlagfű biológiája. Növényvédelem 16: 109-116.

Béres I., Novák R., Hoffmanné Pathy Zs., Kazinczi G. (2005) Az ürömlevelű parlagfű

(Ambrosia artemisiaefolia L.) elterjedése, morfológiája, biológiája, jelentősége éa a

védekezés lehetőségei. Gyomnövények, Gyomirtás VI.1: 1-47

Bíró E. (2003) A fővárosi parlagfűprogram bemutatása. 48. Növényvédelmi

Tudományos Napok, Budapest, 128.

Bohár Gy., Vajna L., Kiss L. (2001) Egy Phyllachora faj okozta járvány a parlagfüvön

Magyarországon. Agrofórum. 11: 24-26.

Bock R. és Hagemann R. (2000) Extracellular inheritance: plastid genomics:

manipulation of plastid genomes and biotechnology apparatus. Prog. Bot. 6: 76–90.

Botterman J. és Leemans J. (1988) Engineering of herbicide resistance in plants.

Biotech Gen Eng Rev 6: 321-340.

Botstein D., White R. L., Skolnick M., Davis R. W. (1980) Construction of a genetic

linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum.

Genet. 32: 314–331

Cheung W., Cote J., Benoit D., Landry B. (1993) A rapid assay for chloroplast-encoded

triazine resistance in higher plants. Plant. Mol. Biol. Rep. 11: 142-155

76

Clegg M.T., Rawson J. R. Y., K. Thomas (1984) [Pennisetum americum] Chloroplast

DNA variation in pearl millet and related species. Genetics 106: 449–461.

Cipriani G., R. Testolin, R. Gardner. 1998. Restriction-size variation of PCR-amplified

chloroplastDNA regions and its implication for the evolution and taxonomy of

Actinidia. Theor. Appl. Genet. 96: 389–396.

Crocker W. (1916) Mechanism of dormancy in seeds. Amer. J. Bot., 3: 99-103.

Cseh A. (2004) A parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.) molekuláris genetikai

vizsgálata. Diplomadolgozat, Keszthely

Cserháti E. (2006) Gyermekkori allergiás (atópiás) megbetegedések. Hippocrates VIII.

1: 28-35.

Demesure B. N., Sodzi R. J., Petit R. (1995) A set of universal primers for amplification

of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants.

Molecular Ecology 4: 129-131.

Dickerson C. T. (1968) Studies on the germination, growth, development and controll

of common ragweed (Ambrosia altemisiifolia L.) Univ. Microfilms Inc. Ann. Arbor.

Mich. 162.

Dickerson C. T. és Sweet R. D. (1971) Common ragweed ecotyp Weed Sci. 19: 64-66.

Dumolin-Lapegue S., Bodenes C., Petit R. J. (1996) Detection of rare polymorphisms in

mitochondrial DNA of oaks with PCRRFLP combined with SSCP analysis. For.

Genet. 3: 227-230.

Felsenstein J. (2007) PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.6. Manual

Distributed by the author. Department of Genome Sciences, University of

Washington, Seattle

Frey J.E., Müller-Schärer H., Frey B., Frei D. (1999) Complex relation between

triazine-susceptible phenotype and genotype in the weed Senecio vulgaris may be

caused by chloroplast DNA polymorphism. Theor. Appl. Genet. 99: 578-586.

Gaudet M., Fara A-G., Sabatti M., Kuzminsky E., Mugnozza G. M. (2007) Single-

reaction for SNP Genotyping on Agarose Gel by Allele-specific PCR in Black Poplar

(Populus nigra L.) Plant Mol. Biol. Rep. 25: 1–9.

Gebben A. I. (1965) The ecology of common ragweed (Ambrosia altemisiifolia L.) in

Southeastern Michigan, Univ. Microfilms Inc. 234.

Genton B. J., Shykoff J . A., Giraud T. (2005): High genetic diversity in French

invasive populations of common ragweed, Ambrosia artemisiifolia, as a result of

multiple sources of introduction. Molecular Ecology 14: 4275-4285.

77

Goeden R. D., Kovalev O. V., Ricker D. W. (1974) Arthropods exported from

California to the U.S.S.R. for ragweed control. Weed Sci. 22: 156-158.

Goloubinoff P. és Edelman M. (1984) Chloroplast-encoded atrazine resistance in

Solanum nigrum: psbA loci from susceptible and resistant biozypes are isogenic

except for a single codon change. Nucleic Acids Res. 12: 9489-9496.

Gray M. W. (1989) The evolutionary origins of organelles. Trends Genet 5: 294–299.

Griffitha I. J., Pollocka J., Klapperb D. G., Rogersa B. L., Naulta A.K. (1991)

Sequence Polymorphism of Amb a I and Amb a II, the Major Allergens in Ambrosia

artemisiifolia (Short Ragweed). Int. Arch. Allergy. Immunol. 96: 296-304.

Gutteri M. J., Eberlein C. V., Mallory-Smith C. A., Thill D. C. (1996) Molecular

genetics of target-site resistance to acetolactate synthase inhibiting herbicides.

Molecular Genetics and Evolution of Pesticide Resistance, Washington, 10-16.

Hartmann F., Hoffmanné P. Zs., Tóth Csantavéri Sz. (2003) A parlagfű (Ambrosis

artemisiifolia L.) atrazinrezisztens biotípusának országos elterjedése. Növényvédelem

39: 313-318.

Hayashi K., Shiina T., Ishii N., Iwai K., Ishizaki Y., Morikawa K., Toyoshima Y.

(2003) A role of the –35 element in the initiation of transcription at psbA promoter in

tobacco plastids. Plant Cell Physiol. 44(3): 334-341.

Hegi G. (1960) Illustrierte Flora von Mittel-Europa. 6., Lehmanns Verlag, München.

496-498.

Heifetz P. (2000) Genetic engineering of chloroplast. Biochemie 82: 655–666.

Hiratsuka J., Shimada H., Whittier R., Ishibashi T., Sakamoto M., Mori M., Kondo C.,

Honji Y., Sun C-R., Meng B-Y., Li Y-Q., Kanno A., Nishizawa Y., Hirai A.,

Shinozaki K., Sugiura M. (1989) The complete sequence of the rice (Oryza sativa)

chloroplast genome: Intermolecular recombination between distinct tRNA genes

accounts for a major plastid DNA inversion during the evolution of the cereals.

Molecular and General Genetics 217: 185-194.

Holt J. S., Powels S.B., Holtum A. M. (1993) Mechanisms and agronomic aspects of

herbicide resistance. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 44: 203-229.

Heszky L., Fésüs L., Hornok L. (2005) Mezőgazdasági biotechnológia. Agroinform,

Budapest

Hultquist S. J., Vogel K. P., Lee D. J., Arumuganathan K., Kaepwithin S. (1997) DNA

content and chloroplast DNA polymorphisms among switchgrasses from remnant

midwestern prairies. Crop Sci. 37: 595–598.

78

Hunyadi K. (1988) Szántóföldi gyomnövények és biológiájuk. Mezőgazdasági Kiadó,

Budapest.

Igloi G. L. és Kössel H. (1992) The transcriptional apparatus of chloroplasts. Crit Rev

Plant Sci 10: 525-558.

Igrc J., Deloach C. J., Zlof V. (1995) Release and establishment of Zygogramma

saturalis F. (Coleoptera: Chrysomelidae) in Croatia for control of common ragweed

(Ambrosia artemisiifolia L.). Biological control 5: 203-208.

Juhász M. és Juhász I. E. (2002) A hazai gyomnövények aeropollinológiai jelentősége.

Környezeti ártalmak és a Légzőrendszer XII., Hévíz 149-160.

Jensen K. I. N. és Bandeen J. D. (1979) Triazine resistance in annual weeds. Ciba-

Geigy Agrochem. Monogr. 55–57.

Kazinczi G. (2004) Vírusok alternatív gazdái: gyomnövények. Akadémiai doktori

értekezés, Keszthely.

Kazinczi G., Béres I., Novák R., Karamán J. (2009) Újra fókuszban az ürömlevelű

parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.) Növényvédelem 8: 389-403.

Kádár A. (2001) Vegyszeres gyomirtás és termékszabályozás. Factum Bt. Kiadó,

Budapest

Kim J. M., Christopher D. A., Mullet J. E. (1993) Direct evidence for selective

modulation of psbA, rpoA, rblC and 16S RNA stability during barley chloroplast

development. Plant Mol. Biol. 22: 447-463.

Kiss E. 1999. Növényi Molekuláris Genetika I. Egyetemi Jegyzet, Gödöllő 88-92.

Kiss L. (2007) Is Puccinia xanthii a suitable biological control agent of Ambrosia

artemisiifolia? Biocontrol Science and Technology 17: 535-539.

Kiss L. és Béres I. (2006) Anthropogenic factors behind the recent population

expansion of common ragweed (Ambrosia artemisiifolia L.) in Eastern Europe: is

there a correlation with political transitions?, Journal of Biogeography, 33, 12: 2154-

2157.

Kiss L., Vajna L., Bohár GY. (2001) A parlagfű rejtélyes betegsége. Élet és tudomány

32: 1012-1014.

Kiss L., Vajna L., Bohár GY. (2003) A parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.) elleni

biológiai védekezés lehetőségei. Növényvédelem 39: 319-331.

Kosikova P. G. (1960) Germination of seeds of several species of several of several

species of weeds and ruderal plants after treatment with solutions of gibberellic acid

of various concentrations. Doklady Akad. Nauk. SSSR. Bot. Sci. Sect., Amer. Inst.

79

Biol. Sci. 13: 45-47.

Lengyel G. (1923) Az Ambrosia artemisiifolia előfordulása Magyarországon. Botanikai

Közlemények 21: 100.

Liu Q., Thorland E. C., Heit J. A., Sommer S. S. (1997) Overlapping PCR for

Bidirectional PCR Amplification of Specific Alleles: A Rapid One-Tube Method for

Simultaneously Differentiating Homozygotes and Heterozygotes Genome Research 7:

389-398.

Lockey R. F., Ledford D. K. (2008) Allergens and allergen immunotherapy, fourth

edition (Clinical Allergy And Immunology) Book: 131-132.

Maguire J. D. és Overland A. (1959) Laboratory germination of seed of weedy and

native plants. Washington, Agr. Exp. Sta. Circ. 319: 15.

Maier R. M., Neckermann K., Igloi G. L., Kössel H. (1995) Complete Sequence of the

Maize Chloroplast Genome: Gene Content, Hotspots of Divergence and Fine Tuning

of Genetic Information by Transcript Editing Journal of Molecular Biology 251: 614-

628.

Makra L., Juhász M., Borsos E., Béczi R. (2004) Meteorological variables connected

with airborne ragweed pollen in Southern Hungary. Int J Biometeorol 49: 37–47.

Mayfield S. P., Yohn C. B., Cohen A., Danon A. (1995) Regulation of chloroplast gene

expression. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46: 147-166.

Mátyás Cs., (2002) Erdészeti-természetvédelmi genetika Mezőgazda Kiadó, Budapest

McNaughtona K. E., Letartea J., Leea E. A., Tardifb F. J. (2005) Mutations in ALS

confer herbicide resistance in redroot pigweed (Amaranthus retroflexus) and Powell

amaranth (Amaranthus powellii). Weed Science 53(1): 17-22.

Moesz G. (1926) Néhány érdekesebb növény újabb előfordulása. Botanikai

Közlemények. 23: 184-186.

Nei M. (1975) Molecular Population Genetics and Evolution. North-Holland,

Amsterdam.

Nei M. és Li W. H. (1979) Mathematical model for studying genetic variation in terms

of restriction endonucleases. Proceedings of the National Acadademy of Science USA

76: 5269-5273.

Nékám K. és Páldy A. (2008) Burden of ragweed allergy in Hungary. First Internat.

Ragweed Conf. Budapest 2008, 25.

80

Németh I. (2000). A szántóföldi, kertészeti, erdészeti és élősködő gyomfajok

jellemzése. In: Gyomnövények, gyomirtás, gyombiológia (szerk. Hunyadi K., Béres

I., Kazinczi G.), Mezőgazda Kiadó 2000, 102-104.

Novák R., Dancza I., Szentey L., Karamán J. (2009) Magyarország szántóföldjeinek

gyomnövényzete. Ötödik Országos Szántóföldi Gyomfelvételezés.

Témadokumentáció, Budapest

Parducci, L., and A.E. Szmidt. (1999) PCR-RFLP analysis of cpDNA in the genus

Abies. Theor. Appl. Genet. 98: 802–808.

Patzoldt W. L., Tranel P. J., Alexander A. L., Schmitzer P. R. (2001) A common

ragweed population resistant to cloransulam-methyl Weed Science 49: 485-490.

Perez de la Rosa, J., S.A. Harris, A. Farjon. (1995) Noncoding chloroplast DNA

variation in Mexican pines. Theor. Appl. Genet. 91: 1101–1106.

Petit R.J., Demesure B., Dumolin S. (1998) cpDNA and mtDNA primers in plants. In

Molecular tools for screening biodiversity. Edited by A. Karp, P.G Isaac, and D.S.

Ingram. Chapman and Hall, London. 256–261.

Pillay M. és Hilu K.W. (1990) Chloroplast DNA variation in diploid and polyploid

species of Bromus (Poaceae) subgenera Festucaria and Ceratochloa. Theor. Appl.

Genet. 80: 326–332.

Rafnar T., Griffiths I. J., Kuos M-c., Bonds J. F., Rogers B. L., Klapper D. G. (1991)

Cloning of Amb a I (Antigen E), the major allergen family of short ragweed pollen.

The Journal of Biological Chemistry 2: 1229-1236.

Reith M. és Straus N. (1987) Nucleotide sequence of the chloroplast gene resposible for

triazine resistance in Canola. Theor. Appl. Gen. 73: 357-363.

Reznik S. Y., Belokobylskiy S. A., Lobanov A. L. (1994) Weed and herbivorous insect

population densities at the broad spatial scale – Ambrosia artemisiifolia L. and

Zygogramma saturalis F. (Col., Chrysomelidae). Journal of Applied Entomology 118:

1-9.

Rios D. R., Saione H., Robredo C., Acevedo A., Colombo N., Prina R. A. (2003)

Isolation and molecular characterization of atrazine tolerant barley mutants. Theor.

Appl. Genet. 106: 696-702.

Rozen S. és Skaletsky J. H. (2000) Primer3 on the WWW for general users and for

biologist programmers In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and

Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, 365-386.

81

Sathasivan K., Haughn G. W., Murai N. (1990) Nucleotide sequence of a mutant

acetolactate synthetase gene from an imidazolinone – resistant Arabidopsis thaliana

var. Nucleic Acids Res. 18: 2188.

Scarabela L., Carrarob N., Sattina M., Varotto S. (2004) Molecular basis and genetic

characterisation of evolved resistance to ALS-inhibitors in Papaver rhoeas. Plant

Science 166(3): 703-709.

Schermann Sz. (1966) Magismeret I. Akadémia Kiadó, Budapest 453-454.

Schmelzer K. és Wolf I. (1977) Wirtspflanzen und ihre Viren, Virosen und

Mykoplasmosen. In: Klinkowski, M. Pflanzliche Virologie, Registerband,

Verzeicnisse und Übersichten zu den Virosen in Europa. Akademie Verlag, Berlin 53-

189.

Shen Y., Danon A., Christopher D. (2001) RNA binding-proteins interact specifically

with the Arabidopsis chloroplast psbA mRNA 5’ untranslated region in a redox-

dependent manner. Plant Cell. Physiol. 42(10): 1071-1078.

Shusei S., Nakamura Y., Kaneko T., Asamizu E., Tabata S. (1999) Complete Structure

of the Chloroplast Genome of Arabidopsis thaliana. DNA Research 6(5): 283-290.

Staub J. M. és Maliga P. (1993) Accumulation of D1 polypeptid in tobacco plastids is

regulated via the unstranlated region of the psbA mRNA. EMBO J 12: 601-606.

Steinback K., McIntos L., Bogorad L.,Arntzen C. (1981) Identification of the triazine

receptor as a chloroplast gene product. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7463-7467.

Sneath P. H. A. és Sokal R. R. (1973) Numerical Taxonomy. WH Freeman, San

Francisco

Sokal R. R. és Michener C. D. (1958) A statistical method for evaluating systematic

relationship. University of Kansas, Scientific Bulletin 38: 1409-1438.

Szentey L., Tóth Á., Dancza I. (2004) Közös érdekünk, a parlagfűmentes

Magyarország, Növény- és Talajvédelmi Központi Szolgálat 3-27.

Szigetvári Cs. és Benkő Zs. R. (2004): Ürömlevelű parlagfű (Ambrosia artemisiifolia

L.). In: Mihály B. és Botta-Dukát Z. Biológiai inváziók Magyarországon

Özönnövények. Természetbúvár Alapítvány Kiadó, Budapest 337-370.

Takács A., Bicsák B., Horváth J., Kazinczi G. (2002) A parlagfű vírusellenállóságának

vizsgálata. 12.Növényvédelmi Fórum, Keszthely 46.

Takács A., Horváth J., Kazinczi Gabriella, Pribék D. (2001) A parlagfű

vírusellenállóságának vizsgálata. 47. Növényvédelmi Tudományos Napok, Budapest

113.

82

Tímár L. (1955) Egy veszedelmes gyomkártevő előőrsei Szegeden. Délmagyarország,

Szeged 18: 4.

Thomzik J. E. és Hain R. (1988) Transfer and segregation of triazin-tolerant

chloroplasts in Brassica napus L. Theor. Appl. Genet. 76: 165-171.

Toole E. H. és Brown E. (1946) Final results of the Durvel buried seed experiment. J.

Agric. Res. 72: 201-210.

Tóth Á., Benécsné B. G., Béres I. (2001) Az allelopátia szerepe az Ambrosia

artemisiifolia és a Cirsium arvense tömeges felszaporodásában Magyarországon.

Gyomnövények, gyomirtás. 2: 21-29.

Tóth Á., Hoffmanné P. Zs., Szentey L. (2004) A parlagfű (Ambrosia elatior) helyzet

2003-ban, Magyarországon. A levegő pollenszám csökkentésének nehézségei

Növényvédelmi Tudományos Napok, Budapest, Öszefoglalók 69.

Tranel P. J., Weilu J., Patzoldt W. L., Wright T. R. (2004) Intraspecific variability of

the acetolactate synthase gene. Weed Science 52: 236-241.

Tranel P. J. és Wright T. R. (2002) Resistance of weeds to ALS-inhibiting herbicides:

what have we learned? Weed Science 50: 700–712.

Taylor J. B., Loux M. M. Harrison S. K, Regnier E. (2002) Response of ALS-resistant

common ragweed (Ambrosia artemisiifolia) and giant ragweed (Ambrosia trifida) to

ALS-inhibiting and alternative herbicides.Weed Technology 16: 815–825.

Ujvárosi M. (1957) Gyomnövények, gyomirtás Mezőgazdasági Kiadó, Budapest

Vajna L. (2002) Downy mildew epidemic on common ragweed in Hungary caused by

Plasmopara halstedii. Plant Pathology 51: 809.

Vajna L., Bohár Gy., Kiss L. (2000) First report of Phyllachora ambrosiae in Europe

causing epidemics on common ragweed. Plant Disease 84: 489.

Varga K. és Kiss L. (2003) A parlagfű járványos megbetegedését okozó Phyllachora

ambrosiae molekuláris azonosítása. 49. Növényvédelmi Tudományos Napok,

Budapest 153.

Van de Peer Y. és De Wachter R. (1994) TREECON for Windows: a software package

for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows

environment Comput. Applic. Biosci. 10: 569-570.

Velich I. (2001) Növénygenetika, Mezőgazda kiadó, BudapestWagner W. H. és Beals T. F. (1958): Perennial ragweeds (Ambrosia) in Michigan, with

the description of a new intermediate taxon. Rhodora 60: 178-204.

83

Walbot V. és Warren C. (1988) Regulation of Mu element copy number in maize lines

with an active or inactive Mutator transposable element system. Mol. Gen. Genet.

211(1): 27-34.

Warwick D. D. (1976) Plant variability in triazine resistance. Residue Rev., Springer

Verlag, New York 65: 56-63.

Willemsen R. W. és Rice E. L. (1972) Mechanism of seed dormancy in Ambrosia

altemisiifolia American Journal of Botany 59: 248-257.

Wolfe K.H., Li W. H., Sharp P. M. (1987) Rates of nucleotide substitution vary greatly

among plant mitochondrial, chloroplast, and nuclear DNAs. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 84: 9054–9058.

Wright T. R., Bascomb N. F., Sturner S. F., Penner D. (1998) Biochemical mechanism

and molecular basis for ALS-inhibiting herbicide resistance in sugarbeet (Beta

vulgaris) somatic cell selections. Weed Science 46: 13–23.

Wu J., Krutovskii K. V., Strauss S. H. (1998) Abundant mitochondrial genome

diversity, population differentiation and convergent evolution in pines. Genetics 150:

1605–1614

Yamazaki K., Imai C., Natuhara Y. (2000) Rapid population growth and food-plant

exploitation pattern in an exotic leaf beetle, Ophraella communa LeSage (Coleoptera:

Chrysomelidae), in western Japan. Applied Entomology and Zoology 35: 215-223.

Yasunari O., Isono K., Kojima T., Endo A., Hanaoka M., Shiina T., Terachi T., Utsugi

S., Murata M., Mori N., Takumi S., Ikeo K., Gojobori T., Murai R., Murai K.,

Matsuoka Y., Ohnishi Y., Tajiri H., Tsunewaki K. (2000) Chinese Spring Wheat

(Triticum aestivum L.) Chloroplast Genome: Complete Sequence and Contig Clones

Plant Molecular Biology Reporter 18: 243-253.

Zheng D., Patzoldt W. L., Tranel P. J. (2005) Association of the W574L ALS

substitution with resistance to cloransulam and imazamox in common ragweed

(Ambrosia artemisiifolia L.) Weed Science 53(4): 424-430.

Zurawski G., Bohnert H. J., Whitfeld P. R., Bottomley W. (1982) Nucleotide sequence

of the gene for the Mr. 32000 thylakoid membrane protein from Spinacea oleracea and

Nicotiana debneyi predicts a totally conserved primary translation product of Mr

38950. Proc. Natl. Acad. Sic. USA 79: 7699-7703.

84

8. Új tudományos eredmények

I. Meghatároztunk négy kloroplasztisz és öt mitokondrium nem kódoló DNS régiót,

amelyek az univerzálisnak mondott primerekkel a parlagfűben is csak egyetlen

PCR terméket amplifikálnak így alkalmazhatóak PCR-RFLP módszerrel végzett

populáció genetikai vizsgálatokban.

II. A megbízhatóan amplifikálható kloropasztisz és mitokondrium szekvenciákat

kilenc restrikciós enzimmel emésztettük, így anyai öröklésű markereket

fejlesztettünk. A markerek segítségével az Egyesült Államokból, Kanadából és

Magyarországról származó parlagfűvek között meghatároztuk a genetikai

távolságot.

III. Szekvenáltuk a parlagfű psbA kloroplasztisz génjét az atrazin rezisztens és

szenzitív egyedekből és bizonyítottuk, hogy a rezisztenciát a gén 790.

bázispárjánál bekövetkezö pontmutáció (adenin/guanin) okozza.

IV. Restrikciós emésztésekkel bizonyítottuk, hogy a psbA gén rezisztens és szenzitív

változata is megtalálható a rezisztens parlagfüvekben, tehát a két kloroplasztisz

genotípus heteroplazmásan van jelen.

V. Bi-PASA allél specifikus primereket terveztünk a psbA gén rezisztens és szenzitív

változatára, így az atrazin rezisztencia tesztek egyetlen PCR reakcióval

elvégezhetőek.

VI. Magyarországi parlagfüvekben és a Nova napraforgó hibridben szekvenáltuk és

elemeztük az ALS-gátló herbicidek célgénjének A és B régióját. A parlagfű teljes

ALS-B régió szekvenciáját ez a dolgozat közli először.

85

VII. A parlagfű pollen allergén fehérjéjét kódoló amb a I gén első felét valószínűleg

amplifikáltuk szekvencia specifikus primerekkel magyarországi parlagfüvekből.

Szekvencia specifikus primerekkel nem sikerült kimutatnunk a teljes gént, így

közvetve bizonyítottuk a gén változékonyságát és azt, hogy a parlagfű genomban

több helyen kódolt az Amb a I fehérje.

86

8. 1 New scientific results

I. Four chloroplast and mitochondrial noncoding DNA regions were defined using

universal primers which gave only one product in common ragweed, so they can

be used for PCR-RFLP analysis.

II. The reliably amplified chloroplast and mitochondrial sequences were digested

using nine restriction enzymes, thus markers with maternal inheritence were

developped. The markers were used to define the genetic distances between

American, Canadian and Hungarian ragweeds.

III. The ragweed chloroplast gene psbA was sequenced, both from atrazine resistant

and sensitive individuals, and prouved that the resistence was caused by a point

mutation at the 790th basepair (adenine/guanine).

IV. The heteroplasmy (the presence of the resistant and sensitive forms of the gene in

the resistant individuals) of the psbA gene was demonstrated.

V. Bi-PASA allele-specific primers were designed to the resistant and sensitive forms

of the psbA gene, which makes it possible to accomplish resistance tests by a

single PCR reaction.

VI. The A and B regions of the target gene of ALS inhibitor herbicides were

sequenced and analysed in hungarian ragweeds and in the maize hybrid Nova. The

complete sequence of the B region is described for the first time in the present

work.

VII. The amb a I gene encoding the major allergen protein of the ragweed pollen was

likely to be amplified using sequence specific primers from hungarian ragweeds.

Sequence specific primers were unable to detect the complete amb a I gene,

which suggested high gene variability and the presence of multiple copies of the

gene in the ragweed genome.

87

9. Köszönetnyilvánítás

Köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőmnek, Dr. Taller Jánosnak a szakmai

segítségéért, tanácsaiért, és munkám irányításáért.

Köszönöm a Pannon Egyetem, Növénytudományi és Biotechnológai Tanszék

Biotechnológia Laboratóriumban dolgozó kollégáimnak biztatásukat és segítségüket.

Végül de nem utolsó sorban hálás vagyok Családomnak támogatásukért, amely

nélkül ez a munka nem jöhetett volna létre.

88

10. Az értekezés témakörében megjelent publikációk, előadások

Idegen nyelvű cikkek:

Cseh A., Cernák I. and Taller J. (2009) Molecular characterization of atrazine resistance

in common ragweed (Ambrosia artemisiifolia L.) Journal of Applied Genetics 50(4),

321–327. Impact factor 2008: 1.351

Cseh A. and Taller J. (2008) Genetic diversity of ragweed Ambrosia artemisiifolia L. a

comparison of the maternally inherited cpDNA and mtDNA. Journal of Plant Diseases

and Protection, Special Issue XXI, 389-394. Impact Factor 2008: 0.566

Idegen nyelvű előadások:

Cseh A. and Taller J. (2007) Genetic diversity of ragweed Ambrosia artemisiifolia L. a

comparison of the maternally inherited cpDNA and mtDNA. XIV. European Weed

Research Society Symposium, Hamar, Norway 173.

Cseh A., Cernak I. and Taller J., (2006) Molecular genetic analysis of the most

dangerous invasive weed of Middle- Europe, Ambrosia artemisiifolia L. International

Symposium Intractable Weeds and Plant Invaders, Ponta Delgada, Portugal 19.

Magyar nyelvű cikkek:

Cseh András és Taller János (2008) Herbicid célgének molekuláris genetikai vizsgálata

az ürömlevelű parlagfűben (Ambrosia artemisiifolia L.) Magyar Gyomkutatás és

Technológia 9(2): 57-69.

Cseh András és Taller János (2008) A parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.) genetikai

diverzitásának vizsgálata az anyai öröklésű kloroplaszt és mitokondrium DNS-ének

elemzésével. Magyar Gyomkutatás és Technológia 9(1): 56-57.

89

Magyar nyelvű előadások:

Cseh A. és Taller J. (2008) Molekuláris genetikai vizsgálatok a parlagfűben. A Magyar

Gyomkutató Társaság és a Pécsi Akadémiai Bizottság Növényorvosi Munkabizottsága

konferenciája, Keszhely

Taller J. és Cseh A. (2006) Hogyan járulhat hozzá a molekuláris genetika a parlagfű

elleni védekezéshez? A Magyar Gyomkutató Társaság és a Pécsi Akadémiai Bizottság

Növényorvosi Munkabizottsága konferenciája "A hazai gyomnövénykutatás legújabb

eredményei", Keszthely

Más témákban megjelent publikációk, előadások

Idegen nyelvű cikkek:

Cseh A., Kruppa K., Molnár I. (2009) Incorporation of a winter barley chromosome

segment into cultivated wheat and its characterization with GISH, FISH and SSR

markers. Cereal Research Communications 37, 321-324.

Csöndes I., Kadlicskó S., Cseh A. (2007) Susceptibility of different pepper varieties to

Macrophomina phaseolina in field trials. Cereal Research Communications 35, 333-336.

Impact Factor 2007: 1.190

Cseh A., Taller J., Podmaniczky P., Kocsis L. (2006) Comparative analysis of the most

wide spread grapevine stock lines in the world, the Teleki lines, with microsatellite

markers. Cereal Research Communications 34, 773-776. Impakt Faktor 2006: 1.030

90

Idegen nyelvű előadások:

Molnár-Láng M., Szakács É., Molnár I., Kruppa K., Sepsi A., Cseh A., Dulai S., Aranyi

N., Hoffmann B. (2009) Molecular cytogenetic identification, physical mapping and

phenotyping of wheat-barley introgression lines. 8th International Symposium in the

Series, Recent advances in plant biotechnology, Szeged, Hungary

Cseh A., Kruppa K., Molnár I. (2009) Incorporation of a winter barley chromosome

segment into cultivated wheat and its Characterization with GISH, FISH and SSR

markers. VIII. Alps-Adria Scientific Workshop Neum, Bosnia-Herzegovina

Csöndes I., Kadlicskó S., Cseh A. (2007) Susceptibility of different pepper varieties to

Macrophomina phaseolina in field trials.VI. Alps-Adria Scientific Workshop,

Obervellach, Austria

Podmaniczky P., Győrffyné J. G., Cseh A., Taller J., Kocsis L. (2006) Genetic

differences among roottstokcks derived from the Teleki’s seedlings. 9 International

Conference on Grape Genetics and Breeding, Udine, Italy

Cseh A., Taller J., Podmaniczky P., Kocsis L.(2006) Comparative analysis of the most

wide spread grapevine stock lines in the world, the Teleki lines, with microsatellite

markers. V. Alps-Adria Scientific Workshop, Opatija, Croatia

Magyar nyelvű cikkek:

Kocsis L., Podmaniczky P., Cseh A., Miroslav B., Miroslav P., Cernak I., Győrffyné J.

G., Taller J. (2009) Rokonsági viszonyok a Teleki magoncokból származó alanyok

között. XV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, 252-256.

Kruppa K., Cseh A., Lángné Molnár M. (2009) Árpa kromoszómák azonosítása új búza

× árpa hibridek utódvonalaiban in situ hibridizáció és ssr-markerek segítségével.

XV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, 277-281.

91

Molnár I., Cseh A. Lángné Molnár M. (2009) Búza-Aegilops biuncialis 3M-4B

centrikus fúzió és 3M(4B) szubsztitúciós vonal előállítása és molekuláris citogenetikai

jellemzése. Hagyomány és haladás a növénynemesítésben. XV. Növénynemesítési

Tudományos Napok, Budapest, 337-341.

Magyar nyelvű előadások:

Kocsis L., Podmaniczky P., Cseh A., Miroslav B., Miroslav P., Cernak I., Győrffyné J.

G., Taller J. (2009) Rokonsági viszonyok a Teleki magoncokból származó alanyok

között. XV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest

Kruppa K., Cseh A., Lángné Molnár M. (2009) Árpa kromoszómák azonosítása új búza

× árpa hibridek utódvonalaiban in situ hibridizáció és SSR-markerek segítségével.

XV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest

Molnár I., Cseh A. Lángné Molnár M. (2009) Búza-Aegilops biuncialis 3M-4B

centrikus fúzió és 3M(4B) szubsztitúciós vonal előállítása és molekuláris citogenetikai

jellemzése. Hagyomány és haladás a növénynemesítésben. XV. Növénynemesítési

Tudományos Napok, Budapest

Cseh A., Csöndes I., Varga Zs., Taller J. és Fischl G. (2008) Genetikai vizsgálatok a

Keszthely térségi fehér fagyöngy (Viscum album L.) és a Botryosphaerostroma visci

populációiban. XIV. Növényvédelmi Tudományos Napok 2008, Budapest

Cseh A, Varga Zs, Taller J, Cernák I, Fischl G (2006) Előzetes eredmények keszthely

térségi fehér fagyöngy (Viscum album L.) populációk genetikai vizsgálatairól. XVI.

Keszthelyi Növényvédelmi Fórum, Keszthely

92

11. Mellékletek1. melléklet: Az Amb a I. gén három változatának cDNS szekvenciái (Rafnar és mtsai 1991).

Amb a I.1 (1-1202 bp)

1 aatggggatc aaacactgtt gttacatctt gtattttacc ttagcccttg tcactttgct 61 gcaacctgtt cgttctgccg aagatctcca ggaaatctta ccagttaacg aaacaaggag 121 gctgacaaca agtggagcat acaacattat agacgggtgc tggaggggca aagccgattg 181 ggcggaaaac cgaaaagcgt tagccgattg tgcccaaggt tttgggaagg gaacagtggg 241 cggaaaagat ggtgatatat acacggtcac cagtgagcta gatgatgatg ttgcaaatcc 301 aaaagaaggc acactccggt ttggtgccgc ccaaaacagg cccttgtgga tcatttttga 361 aagagatatg gtgattcgtt tggataaaga gatggtggta aacagtgaca agaccatcga 421 tggccgaggg gcgaaagttg aaatcattaa cgctggtttc acccttaatg gtgtcaagaa 481 tgtaatcatt cataacataa atatgcatga tgttaaagtg aatccaggag gcctgattaa 541 gtccaacgat ggtccagcag ctccaagagc tggtagtgat ggtgatgcta taagtatttc 601 tggtagttca caaatatgga tcgaccattg ttcgctcagt aagtctgttg atgggctggt 661 agatgccaag ctcggcacca cacgcttaac cgtttccaac agcttattca cccaacacca 721 gttttactat tattcggggc tggtgacgaa aatattgaag atagaggcat gctagcaacg 781 gtcgctttca acacgttcac tgataacgtt gaccaaagaa tgcctagatg tcgacatggg 841 tttttccaag tcgttaacaa caactatgat aaatggggat cgtatgccat cggtggtagc 901 gcgtccccaa ccatactcag ccaagggaac agattctgcg cccccgatga acgcagcaag 961 aaaaatgtcc taggaaggca tggtgaagcc gccgcagagt cgatgaagtg gaactggaga 1021 acgaataaag acgtgcttga aaatggtgct atttttgttg catccggggt cgatccagtg 1081 ctaacccctg agcaaagcgc agggatgatt ccagccgaac caggagagtc cgctctaagc 1141 ctcactagta gtgctggtgt actctcatgc caacccggag caccttgcta agcacgccaa 1201 tt

93

Amb a I.2 (1-1332 bp)

1 caatggggat caaacactgt tgttacatct tgtattttac cttagccctt gtcactttgc 61 tgcaacctgt tcgttctgca gaagatgttg aagaattctt accttcagct aacgaaacaa 121 ggaggagcct gaaagcatgt gaagcacaca acattataga caagtgctgg aggtgcaaag 181 ccgattgggc gaataaccga caagcgttag ccgattgtgc ccaaggtttt gcaaagggaa 241 cctacggtgg aaaacatggt gatgtctaca cggtcaccag tgataaagat gatgatgttg 301 caaatccaaa agaaggcaca ctccggtttg ctgctgccca aaacaggccc ttgtggatca 361 tttttaaaag aaatatggtg attcatttga atcaagagct tgtcgtaaac agcgacaaga 421 ccatcgatgg ccgaggggtg aaagttaaca tcgttaacgc cggtctcacc ctcatgaatg 481 tcaagaatat aatcattcat aacataaata tccatgatat taaagtttgt ccaggaggca 541 tgattaagtc caacgatggt ccaccaattt taagacaaca aagtgatggt gatgctataa 601 atgttgctgg tagttcacaa atatggatcg accattgctc gctcagtaag gcttccgatg 661 ggctgctcga tatcaccctc ggcagctcac acgtgaccgt ttccaactgc aaattcaccc 721 aacaccaatt tgtattattg ctcggggctg atgacaccca ttatcaagat aaaggcatgc 781 tagcaacggt agcattcaac atgttcaccg atcacgttga ccaaagaatg cctagatgta 841 gatttgggtt tttccaagtc gttaacaaca actacgacag atggggaacg tacgccatcg 901 gtggtagctc ggccccaact atactcagcc aagggaacag attcttcgcc cccgatgata 961 tcatcaagaa aaatgtctta gcgaggactg gtactggcaa cgcagagtcg atgtcgtgga 1021 actggagaac agatagagac ttgcttgaaa atggtgctat ttttctccca tccgggtctg 1081 atccagtgct aacccctgag caaaaagcag ggatgattcc agctgaacca ggagaagccg 1141 ttctaagact cactagtagt gctggtgtac tctcatgcca tcaaggagca ccttgctaag 1201 cacctggcca attcctaagc tttttataat aatcataaat acttatttta ttttattttt 1261 gatattttat atgaaaccat tacgttcaag tactctatta acatgtttta aattcataag 1321 agtttattga t

Amb a I.3 (1-1333 bp)

1 caacaatcat acaatgggga tcaaacaatg ttgttacatc ttgtatttta ccttagcact 61 tgtcgctttg ctgcaacctg ttcgttctgc cgaaggggtc ggggaaatct taccttcagt 121 taacgaaacg aggagcctgc aagcatgtga agcactcaac attatagaca agtgctggag 181 gggcaaagcc gattgggaga acaaccgaca agcgttagcc gactgtgccc aaggttttgc 241 aaagggaacc tacggcggaa aatggggtga tgtctacacg gtcaccagca atctagatga 301 tgatgttgca aatccaaaag aaggcacact ccggtttgct gccgcccaaa acaggccctt 361 gtggatcatt tttaaaaatg atatggtgat taatttgaat caagagcttg tcgtaaacag 421 cgacaagacc atcgatggcc gaggagtgaa agttgaaatc attaacggag gtctcaccct 481 catgaatgtc aagaatataa tcattcataa cataaatatc catgatgtta aagtgcttcc 541 aggaggcatg attaagtcca acgatggtcc accaatttta agacaagcaa gtgatgggga 601 tactataaat gttgctggta gttcccaaat atggatagac cattgctcac tcagcaagtc 661 tttcgatggg ctggtcgatg tcaccctcgg tagcacacac gtgaccattt ccaactgcaa 721 attcacccaa cagtcaaaag caatattgtt gggggcagat gacacccatg ttcaagataa 781 aggaatgcta gcaacggtcg ctttcaacat gttcaccgat aacgttgacc aaagaatgcc 841 tagatgtcga tttgggtttt tccaagttgt taacaacaac tacgacagat ggggaacgta 901 cgccataggt ggtagctcgg ccccaactat actctgccaa gggaacagat tcttggcccc 961 tgatgatcag atcaagaaaa atgtcctagc gaggactggt acaggcgctg ctgagtcgat 1021 ggcgtggaac tggagatctg ataaagactt gcttgaaaat ggtgctattt ttgttacatc 1081 tgggtctgat ccagtgctaa cccctgttca aagcgcaggg atgattccag ctgaaccagg 1141 agaagccgct ataaaactca ctagtagtgc tggtgtattc tcatgccgtc ctggagcacc 1201 ttgctaagca ccctgccaat tctcctaagc ttttgcaatg atcaaaaata cttttttatt 1261 ttatttttaa tattttatat gtactggaaa tgaaccatta ccttctagta ctctataaca 1321 tgttttgcat tta

94

Documents

A parlagfű gyombiológiai valamint egészségügyi szempontból