เครื่องมือวิทยาศาสตร

47

บทที่ 3 : กลองจุลทรรศน

(MICROSCOPE)

กลองจุลทรรศนเปนเครื่องมอืพื้นฐานที่จําเปนสําหรับ หองปฏิบัติการทางวทิยาศาสตร หองปฏิบัติการทางการแพทย และหองปฏิบัติการทางอุตสาหกรรมบางประเภท ฯลฯ. (รูปที่ 3.1) เนื่องจาก มีประโยชนในการขยายภาพของวัตถุขนาดเลก็ที่มองดวยตาเปลาไมเห็น ใชวดัขนาดของวัตถุขนาดเล็ก ใชในการทําจุลศัลยกรรม(microsurgery) ใชศึกษาคุณสมบัติทางแสง(การหักเหและการเปลงแสง) ของวัตถุตาง ๆ เปนตน

(ก) (ข) (ค) รูปท่ี 3.1 กลองจุลทรรศนแบบธรรมดา(ก,ข) และแบบตดิตัง้อุปกรณถายภาพ(ค)

กลองจุลทรรศนไดรับการพฒันาปรับปรุงอยูตลอดเวลา เพื่อเพิ่มขีดความสามารถในการขยายภาพและมีความสะดวกสบายในการใชงานมากขึ้น ตัวอยางเชน สามารถขยายภาพของวัตถุไดมากขึ้นเปนลาน ๆ เทา มีอุปกรณการสงภาพไปตามสายไฟเบอรออฟติก(optical fiber) มีอุปกรณรับสัญญาณภาพจากกลองฉายออกมาที่จอโทรทัศน หรือสงสัญญาณภาพเขาเครื่องคอมพิวเตอรเพื่อใหสะดวกตอการดูภาพ รวมทั้งสามารถควบคุมการทํางานของกลองผานทางอินเตอรเน็ตเปนตน

การพัฒนาเหลานี้ลวนเพิ่มประสิทธิภาพ และความสะดวกสบายในการใชงานใหมากขึ้นตามลําดับ แตเนื่องจากกลองจุลทรรศนและอุปกรณประกอบตาง ๆ มรีาคาคอนขางสูง ผูใชจึงตองระมัดวังในการใชงาน ควรมคีวามรอบรูในการใช การประยุกตใชและการบํารุงรักษากลองจุลทรรศนอยางถูกวิธี ในที่นี้จะกลาวถึงเฉพาะกลองจุลทรรศนที่พบและใชมากในหองปฏบิัติการทั่ว ๆ ไป คือ

กลองจุลทรรศน

48

กลองจุลทรรศนพื้นหลังสวาง(bright field microscope) กลองจลุทรรศนพื้นหลังมืด(dark field microscope) กลองจุลทรรศนฟลูออเรสเซนซ(fluorescence microscope) และกลองจุลทรรศนเฟสคอนทราสท (phase contrast microscope) เทานั้น สวนกลองจุลทรรศนชนิดอื่นมกีารใชงานคอนขางนอย มีความสลับซับซอนในการใชงานที่แตกตางกัน ซ่ึงผูใชกลองจุลทรรศนควรศึกษาและฝกอบรมการใชงานเปนกรณีเฉพาะ

หลักการขยายภาพ โดยปกติตาของคนมองเห็นวตัถุที่อยูไกลมขีนาดเล็กกวาวัตถุที่อยูใกล แมวาวัตถุนั้นจะมีขนาดเทากนั (รูปที่ 3.2 ก) เนื่องจากมุมมอง (visual angle) แคบกวา (α < β) ทําใหภาพที่ตกบนเรตินา (retina)เล็กกวา(I1<I2) และในขณะเดยีวกันกไ็มสามารถมองเห็นรายละเอียดของวัตถุที่อยูไกลได เพราะตาจะเหน็รายละเอยีดไดดี เมื่อแสงจากรายละเอียดนั้น ๆ ไมตกกระทบบนเซลลรับภาพ(cone cell) เซลลเดียวกัน

เมื่อวัตถุเคลื่อนใกลตาเขามาจะมองเห็นรายละเอียดมากขึ้นเรื่อย ๆ จนเลยระยะชดัที่ใกลที่สุดของตา(nearest distance of distinct vision) คือระยะทีห่างจากตาประมาณ 25 ซม. ลูกตาไมสามารถมองเห็นรายละเอียดเหลานัน้ไดอีก เนื่องจากเลนสตาไมสามารถปรับภาพใหชัดได

กลองจุลทรรศนเชิงเดยีว(simple microscope) ซ่ึงใชเลนสนูน(convex lens) เพียง 1 อัน ทําใหตาสามารถมองเห็นวัตถุที่อยูใกลกวาระยะชดัที่ใกลที่สุดของตาได(วัตถุอยูที่ความยาวโฟกัสของเลนส) โดยการเพิ่มมุมของเลนสตา เปนผลใหมองเห็นภาพขยายของวัตถุในระยะอนนัต(infinity) (รูปที่ 3.2 ข) แตเมื่อเล่ือนวตัถุใกลเขามาอีก ภาพของวตัถุจะถูกขยายใหญขึ้นและปรากฏอยูที่ระยะชัดที่ใกลที่สุดของตา(I3) รูปที่ 3.2 ค) การขยายภาพโดยใชเลนสเพียงอันเดียวมกัจะขยายไดไมเกิน 25 เทา กลองจุลทรรศนเชิงประกอบ(compound microscope) ซ่ึงนิยมใชมากในปจจุบัน ใชเลนส 2 ชุด ทํางานรวมกัน เลนสชุดแรกเปนเลนสใกลวัตถุ(objective lens) ขยายวัตถุใหมีขนาดใหญขึ้นปรากฏเปนภาพจริงหวักลับ(I1) ที่ดานหลัง เลนสบริเวณระนาบภาพปฐมภูม(ิprimary image plane, PIP) ซ่ึงเปนระยะโฟกัสของเลนสชุดที่สองคือเลนสใกลตา(eyepiece lens) จะทําใหมองเห็นภาพขนาดใหญกลับดาน(invert) กับวัตถุ(I3) (รูปที่ 3.2 ง)

องคประกอบและคุณสมบัติ กลองจุลทรรศนมีองคประกอบหลักที่คลายคลึงกัน คือประกอบดวยระบบกล(mechanical system) ระบบมองภาพ(optic system) และระบบค้ําจุน(supporting system) (รูปที่ 3.3) โดยระบบกล ไดแกกลไกการปรับโฟกัสของคอนเดนเซอร(condenser) และของเลนส กลไกการเลื่อนสไลด กลไกการปรับไดอะแฟรม(diaphragm) ระบบมองภาพประกอบดวย ระบบสองสวาง เลนส และกระจกตาง ๆ สวนระบบค้ําจุนไดแกตวักลองซึ่งใชเปนที่ติดตั้งอุปกรณของระบบอื่น ๆ ตลอดจนใชเปนที่จบัถือในการเคลื่อนยายกลองจุลทรรศน

เครื่องมือวิทยาศาสตร

49

รูปท่ี 3.2 แผนผังการเกิดภาพบนเรตินาเมือ่ไมไดใชเลนส (ก) ใชเลนส 1 อัน (ข,ค) และใชเลนส 2 อัน (ง)

กลองจุลทรรศน

50

รูปท่ี 3.3 องคประกอบของกลองจุลทรรศนชนดิพื้นหลงัสวาง และใชระบบแสงแบบ โคทเลอ

1. ตัวกลอง(body) โดยทัว่ไปทําดวยโลหะผสมที่ทนสนิม นยิมใชสีดําเพื่อลดการสะทอนของแสงภายนอกที่อาจรบกวนระบบมองภาพของกลองจุลทรรศน แตถาใชสีอ่ืนเพื่อความสวยงามนิยมใชสียน เพื่อทําใหผิวโลหะไมเรียบซึ่งชวยลดการสะทอนของแสงรบกวนตาง ๆ ดานลางตัวกลองเปนฐาน(base) ที่มีขนาดใหญและมีน้ําหนกัมาก เพื่อทําใหกลองจุลทรรศนตั้งไดอยางมัน่คงและไดรับอิทธิพลจากแรงสั่นสะเทือนภายนอกนอยลง ซ่ึงชวยใหภาพมีเสถยีรภาพ(stability) ดีขึ้น แขนของกลองจุลทรรศน(limb) นอกจากจะเปนที่จับยดึอุปกรณอ่ืน ๆ แลวยังมีประโยชนในการเคลื่อนยายกลองจุลทรรศน โดยใชมือขางหนึ่งจับทีแ่ขนของกลองจุลทรรศน สวนมืออีกขางหนึ่งรองใตฐานกลองจลุทรรศน การถอดหรือประกอบชิ้นสวนตาง ๆ กับตัวกลองควรระมัดระวัง ในเรื่องความสะอาด ความพอดีของสลักหรือรองตาง ๆ ตําแหนงและทิศทางของอุปกรณนั้น ๆ และความแรงในการหมนุเกลียวตาง ๆ เพือ่ปองกันความเสียหายอยางถาวรที่อาจเกิดขึ้นกับตัวกลอง และอุปกรณ

เครื่องมือวิทยาศาสตร

51

เหลานั้น

2. ทอมองภาพ(observation tube) เปนทอที่อยูระหวางเลนสใกลตา และเลนสใกลวัตถุมีหนาที่จับยึดระบบเลนสทั้งสองใหอยูในตาํแหนงที่ถูกตองเหมาะสมตลอดเวลา ดานบนของทอมองภาพ เปนชองใสกระบอกเลนสใกลตาซึ่งมักมีขนาดมาตรฐาน ทําใหสามารถนําเลนสใกลตาของกลองยี่หอตาง ๆ ใสแทนกันได ชองใสเลนสใกลตาที่มีเพียง 1 ชองเรียกวา “monocular tube” ถามี 2 ชองเรียกวา “binocular tube” ถามี 3 ชองเรียกวา “trinoculor tube” โดยชองที่สามใชสําหรับติดตั้งอุปกรณถายภาพ

ความยาวมาตรฐานของทอมองภาพเทากับ 160 มม. แตในการปรับภาพบางอยางใหชัดอาจเพิ่มความยาวมาตรฐานของทอมองภาพไดอีกเล็กนอย โดยการเลื่อนกระบอกเลนสใกลตา ดานลางของทอมองภาพเปนจานหมนุ(revolving nosepiece) สําหรับยึดกระบอกเลนสใกลวตัถุ ที่มีกําลังขยายขนาดตาง ๆ 4-5 อัน เพื่อความสะดวกรวดเร็วในการเปลี่ยนกําลังขยายของเลนสใกลวัตถุ 3. แทนวาง(stage) ใชสําหรับวางสไลดหรือตัวอยางทีต่องการตรวจดู แทนวางสวนใหญเปนรูปสี่เหล่ียมผืนผาขนาดประมาณ 18 x 14 ซม. หรือส่ีเหล่ียมจตุรัส ขนาด 12 x 12 ซม. แทนวางที่มีอุปกรณชวยเคลื่อนยายสไลดในแนวซาย-ขวา หรือหนา-หลัง เปนแทนกล(mechanical stage) ซ่ึงชวยเพิ่มความสะดวกในการเลื่อนดูภาพมากกวาแทนวางแบบเกา ซ่ึงตองใชมือเล่ือนสไลดโดยตรง(glide slide) แทนกลบางแบบมีสเกลแสดงระยะที่สไลดเคลื่อนที่ในทิศทางทั้งสอง(graduate stage) สเกลมีความละเอียดถึง 0.1 มม. ทําใหสามารถหาตําแหนงของวัตถุที่ตองการดูซํ้าใหมไดงายและรวดเรว็โดยดูตําแหนงจากสเกลวัดระยะทาง 4. ปุมปรับความชัดของภาพ(focusing knob) ปรับภาพใหชัดโดยการเลื่อนทอมองภาพขึ้นลง หรือเล่ือนแทนวางขึ้นลงในแนวดิ่ง ซ่ึงขึ้นอยูกับยี่หอของกลอง แตสวนใหญนิยมเล่ือนแทนขึน้ลงมากกวา ฟนเฟองที่ถูกควบคุมโดยปุมปรับความชัดควรทนทานไมฝดมาก เคลื่อนที่ไดอยางละเอียดตอเนื่อง และไมเล่ือนไถล เพื่อใหสามารถปรับภาพไดชัดเจน(accurate focus) การหมุนปุมปรับความชัดหยาบ(coarse focusing knob) 1 รอบจะทําใหแทนวางเคลื่อนที่ประมาณ 4.7 มม. สวนปุมปรับความชัดละเอียด(fine focusing knob) ทําใหแทนวางเคลื่อนทีป่ระมาณ 0.1 มม. ตอรอบ กลองจุลทรรศนที่มีระยะทางการเคลื่อนที่ของแทนวางตอรอบต่ํากวา มีขอดีตรงที่สามารถควบคุมการเคลื่อนที่ของแทนวางไดดีกวา ทําใหปรับความชัดของภาพไดงายกวา กลองจุลทรรศนบางแบบมีปุมตรึง(lock) การเคลื่อนที่ของปุมปรับความชัดหยาบหลังจากที่ปรับภาพไดคมชัดแลว เพื่อปองกันการเคลื่อนตําแหนงของแทนวาง เนื่องจากการเคลื่อนยาย การสั่นสะทอน หรือการปรับที่ไมถูกตอง ซ่ึงมักเกิดกับกลองที่ใชสาธิตที่ผูมองภาพในกลองสาธิตมักจะใชกลองไมถูกตอง 5. ปุมปรับความสูงของคอนเดนเซอร(condenser adjustment knob) มักอยูบริเวณใตแทนวาง ใชเล่ือนคอนเดนเซอรขึ้นลงในแนวดิ่ง เพือ่ใหจุดรวมแสงตกกระทบวัตถุบนแทนวางพอดี การหมุน

กลองจุลทรรศน

52

ปุมนี้เปนผลใหวงแหวนยึดคอนเดนเซอรเคลื่อนที่ขึ้นลงในแนวดิ่ง บริเวณวงแหวนอาจพบแทงหยุดการเคลื่อนที่(condenser stop rod) ซ่ึงทําหนาที่ปองกันคอนเดนเซอรเคลื่อนที่ขึ้นสูงเกินจนกระทบกับแทนวางหรือสไลด

6. เลนสใกลวัตถุ เปนระบบเลนสหลายอัน ซ่ึงถูกออกแบบใหมีหนาทีห่ลัก 3 ประการคือ ประการแรก รวบรวมแสงจากวัตถุแลวสงตอใหเลนสใกลตา ประการที่สอง ขยายภาพใหใหญขึ้นและประการสดุทาย ทําใหภาพมีรายละเอียดดีขึ้น แตการออกแบบและการผลิตเลนส ตลอดจนธรรมชาติของแสง ทําใหภาพเพี้ยนไปจากความจริง ซ่ึงผูผลิตกลองจุลทรรศนไดพยายาม ควบคุม แกไข เพราะความเพี้ยนของภาพสะทอนถึงคุณภาพของกลองจุลทรรศนมากกวาองคประกอบอืน่ ๆ ของกลองจุลทรรศน 6.1 ความเพีย้นของภาพเนือ่งจากเลนส(lens aberration) ภาพที่เกดิจากเลนสอาจมีความเพี้ยนไปจากความจริงไดหลายลักษณะดังนี้ 6.1.1 ความเพีย้นแบบ axial chromatic aberration เกิดขึน้เนื่องจากแสงที่มีความยาวคล่ืนตางกัน เมื่อตกกระทบเนื้อแกวเกิดการกระจาย(dispersion) ในทิศทางแตกตางกันทําใหเกดิจุดรวมแสง(focus) หลายจดุบนแกนมุขสําคัญ(principal axis) ของเลนส ตัวอยางเชน แสงสีน้ําเงินมีจุดรวมแสงใกลกวาแสงสีเขียวและแสงสีแดงตามลําดับ (รูปที่ 3.4 ก)

ในทางทฤษฎ ี สามารถแกความเพี้ยนของภาพโดยใชเลนสนูนที่มกีารกระจายแสงต่ํา(low dispersion) ประกบกบัเลนสเวาที่มกีารกระจายของแสงสูงกวา(higher dispersion) แตในทางปฏิบัติการแกความเพีย้นอาจไมสมบูรณขึน้อยูกับระบบของเลนส ตัวอยางเชน เลนสใกลวัตถุชนดิอะโครมาติก(achromatic objective) สามารถรวมแสงสีแดงและแสงมีน้ําเงินใหตกบนจุดรวมแสงของเลนสได เมื่อมองดูภาพจึงมองเห็นแสงสีเขียวลอมรอบภาพอยู สวนเลนสใกลวตัถุชนิดอะโปโครมาติก (apochromatic objective) สามารถรวมแสงทุกสีใหตกบนจุดรวมแสงของเลนสได ดังนั้นจงึไมมีสีตาง ๆ ของแสงเหลือออกมารบกวนสีของภาพ (รูปที่ 3.4 ข) 6.1.2 ความเพี้ยนแบบ lateral chromatic aberration เกิดจากแสงที่มคีวามยาวคลื่นตางกัน เมื่อเดนิทางผานเนื้อเลนสที่มีความหนาตางกนั จะเกิดการหกัเหของแสงไมเทากัน ทําใหเกิดการรวมแสงทีร่ะนาบเดยีวกนันอกเสนแกนมุขสําคัญ แตภาพสีน้ําเงนิ(ความยาวคลื่นสั้น) มีขนาดโตกวาภาพสีเขียวและภาพสีแดง (ความยาวคลื่นมาดกวา) ตามลําดับ(รูปที่ 3.4 ค) ทําใหมองเห็นภาพสีตาง ๆ ซอนกันอยู การใชเลนสใกลตาชนิดชดเชย(compensating eyepiece) ซ่ึงทําใหเกดิความเพี้ยนของภาพแบบนี้เทากนัแตเกิดในทิศทางตรงกันขามจึงสามารถแกความเพีย้นของภาพแบบนี้ได 6.1.3 ความเพีย้นแบบ axial spherical หรือ longitudinal aberration เกดิขึ้นเนื่องจากความโคงของเลนส กลาวคอืแสงที่ผานจดุศูนยกลางเลนส(axial ray) มีการหกัเหนอยมาก แตแสงที่ผานเลนสบริเวณตรงกลางระหวางจุดศนูยกลางและขอบเลนส(medial ray) มีการหกัเหมากขึ้น และ

เครื่องมือวิทยาศาสตร

53

ยิ่งมากขึ้นสําหรับแสงที่ผานขอบเลนส(peripheral ray) ปรากฏการณดังกลาวทําใหเกิดจุดรวมแสงบน

กลองจุลทรรศน

54

รูปท่ี 3.4 แผนผังการเกิด chromatic aberration แบบ axial (ก,ข) และแบบ lateral (ค)

เครื่องมือวิทยาศาสตร

55

เสนแกนมุขสาํคัญหลายจุด เปนผลใหเกดิจุดรวมแสงที่กวาง(zone of confusion) ทําใหภาพไมคอยชัดเจน(รูปที่ 3.5) ผูผลิตไดพยายามแกไขหลายวิธี ตัวอยางเชน ลดความโคงของเลนส การใชเลนสนูนแกมระนาบ(planoconvex lens) แทนเลนสนูนสองดาน(biconvex lens) การหันดานเรียบของเลนสเขาหาวัตถุ และการใชเลนสนูนรวมกับเลนสเวา เพื่อทําใหเกดิความเพีย้นแบบเดียวกันในทิศทางตรง กันขาม กลาวคือลําแสงที่ผานจุดศูนยกลางเลนสมีจุดรวมแสงใกลกวาจดุรวมแสงของแสงที่มาจากขอบเลนส สําหรับผูใชสามารถลดความเพี้ยนโดยลดรแูสง(aperture)ของคอนเดนเซอร เพื่อใหลําแสงผานเฉพาะบริเวณตรงกลางเลนส แตการแกไขวิธีนีจ้ะทําใหรายละเอียดของภาพลดลงเล็กนอย 6.1.4 ความเพี้ยนแบบ lateral(transverse)spherical aberration หมายถึงความสูงเหนือและใตเสนแกนมุขสําคัญของเลนส เกิดขึ้นเนือ่งจากแสงที่ผานขอบเลนสตัดระนาบซึ่งเปนจุดรวมแสงของลําแสงที่ผานจุดศูนยกลางเลนส (รูปที่ 3.5) ความเพีย้นแบบนี้ทําใหภาพพรามัว

รูปท่ี 3.5 การเกิด spherical aberration เนื่องจากความโคงของผิวเลนส

6.1.5 ความเพี้ยนแบบโคม(coma) เกิดขึ้นเนื่องจากวตัถุมีขนาดใหญทําใหแสงตกกระทบเลนสในมุมที่ตางกันทั่วทั้งเลนส เปนผลใหเกดิจดุรวมแสง ณ ที่จุดตาง ๆ นอกเสนแกนมุขสําคัญของเลนส(รูปที่ 3.6) จดุรวมแสงเหลานี้อยูในระนาบเดียวกันแตเอียงทํามุมกับสายตา โดยภาพที่จุดรวมแสง X มีขนาดเล็กกวาและเขมกวาภาพที่จดุรวมแสง Y และ Z ตามลําดับ และเมื่อรวมมมุแสงตกกระทบในทุก ๆ มุมจึงเกดิเปนกรวยแสง(cone of light) ซ่ึงทําใหมองเห็นภาพชัดและเขมตรงกลาง

กลองจุลทรรศน

56

ลอมรอบดวยภาพจาง ๆ ขนาดใหญกวารอบ ๆ บริเวณ คลายหางของดาวหาง(comet blur) ความเพี้ยนแบบนี้สามารถแกไขไดโดยการใชเลนสทีม่ีรัศมีความโคงที่เหมาะสม

รูปท่ี 3.6 แผนผังการเกิดความเพี้ยนของภาพแบบโคมา

6.1.6 ความโคงของภาพ(curvature of field) เกิดขึ้นเนื่องจากการฉายภาพของวัตถุ

ผานเลนสที่มีความโคงทําใหภาพที่ปรากฏมีความโคง โดยมีรัศมีความโคงใกลเคียงกับความยาวโฟกัสของเลนส(รูปที่ 3.7) ดังนั้นเลนสที่มีระยะโฟกสัสั้น หรือมีบริเวณรับแสงมาก ยิ่งทําภาพโคงมาก ความโคงของภาพทําใหไมสามารถปรับความชัดของภาพบริเวณตรงกลางและบริเวณขอบ ๆ ใหชัดพรอมกันได ตองปรับความชัดในแตละบริเวณทีละครั้ง การแกไขอาจใชเลนสใกลตาชนิดเนกาทิฟ(negative eyepiece) หรือใชเลนสใกลวัตถุชนิดแฟลทฟลด(flat field หรือ plano objective)

เครื่องมือวิทยาศาสตร

57

รูปท่ี 3.7 แสดงความโคงของภาพเนื่องจากเลนสมีความโคง

6.1.7 ความบิดเบีย้วของภาพ(distortion) เกิดขึน้เนื่องจากเลนสมีความหนาไมเทา กันทําใหสวนตาง ๆ ของเลนสขยายภาพไดไมเทากนั ถาบริเวณตรงกลางเลนสมีการขยายภาพมากกวาบริเวณตรงขอบเลนสภาพจะบวมออก(barrel distortion) แตการขยายภาพในทางกลับกนัจะไดภาพที่หดเขา(pincushion distortion) (รูปที่ 3.8)

รูปท่ี 3.8 ความบิดเบี้ยวของภาพเนื่องจากเลนสหนาไมเทากัน 6.1.8 ความเพี้ยนแบบ oblique astigmatism เกิดขึ้นเนื่องจากกรวยแสงผานเลนสในแนวที่เอยีงทํามุมกบัเสนแกนมุขสําคัญของเลนส หลังจากผานเลนสกรวยแสงจะคอย ๆ กลายเปนวงรี(ellipse) เกิดการรวมแสงที่บริเวณใกลเลนส(tangential focus) หลังจากนั้นกรวยแสงจะหมุนไปจากเดิม 90 องศา ณ ที่จุดรวมแสงที่อยูไกลจากเลนสออกไป(radial focus) ทําใหภาพที่จุดรวมแสงทั้งสองทํามุมฉากซึ่งกันและกัน

ดังนั้นเมื่อมองภาพของวัตถุที่เปนจุดที่ tangential focus จะเหน็ภาพเปนเสนในแนวนอน(horizontal line) และเห็นภาพเปนเสนในแนวตั้ง(vertical line) ที่ radial focus เพราะภาพที่เห็นเปนภาพซอนที่เกดิจากจดุรวมแสงอยูคนละระนาบในทางลึก และทํามุมฉากซึ่งกันและกนั (รูปที่ 3.9)

6.2 ชนิดของเลนสใกลวัตถุ แบงออกไดเปน 3 ชนดิ ตามความสามารถในการแกความเพีย้นของภาพ ดังนี ้ 6.2.1 เลนสชนิดอะโครมาตกิ(achromatic objective lens) เปนระบบเลนสที่ออกแบบใหสามารถแกความเพีย้นของภาพแบบ spherical aberration ได แตแกความเพี้ยนแบบchromatic

กลองจุลทรรศน

58

aberration ไดไมหมด ยังคงมีแสงสีเขียวรบกวนภาพอยู แตอยางไรก็ตามเนื่องจากมีราคาถูกและใชงานไดดใีนงานของหองปฏิบัติการทั่ว ๆ ไป จึงนิยมใชมากกวาเลนสใกลวัตถุชนิดอืน่ ๆ

รูปท่ี 3.9 แผนผังการเกิดความเพี้ยนของภาพแบบ oblique astigmatism

6.2.2 เลนสชนิดฟลูออกไรท(fluorite หรือ semi-apochromatic objective lens) เปนเลนสใกลวัตถุที่เติมแรฟลูออสปาร(fluorspar) ลงในเนื้อแกวของเลนส ทําใหสามารถแก chromatic aberration ไดเกือบหมด และสามารถผลิตเลนสที่มีรูรับแสงใหญกวาเลนสใกลวัตถุชนิดอะโครมาติกทําใหไดภาพที่สวางกวา มคีวามเปรียบตาง(contrast) มากกวา และภาพมีรายละเอยีดมากกวา 6.2.3 เลนสชนิดอะโปโครมาติก(apochromatic objective lens) เปนระบบเลนสใกลวัถตุที่มีองคประกอบซับซอนมาก เนื่องจากใชเลนสหลายอันเพื่อแกไขความเพี้ยนของภาพ จึงทําใหเลนสใกลวตัถุชนิดนี้มีราคาแพง เลนสใกลวัตถุแบบอะโปโครมาติกสามารถแกความเพี้ยนแบบ chromatic aberration ไดเกือบสมบูรณ(มากกวาเลนสชนิดอะโครมาติกและชนิดฟลูออกไรท) จึงเหมาะสําหรับการถายภาพผานกลองจุลทรรศน แตการแก spherical aberration ยังไมสมบูรณ เลนสชนิดนี้สามารถแกไขความเพี้ยนของภาพไดมากกวาจึงผลิตใหรูรับแสงของเลนสมีขนาดใหญได ซ่ึงเปนผลใหไดภาพที่มีรายละเอียดและมีความเปรียบตางดมีาก ความเพี้ยนของภาพแบบ lateral chromatic aberration ที่ยังคงมีอยูควรแกไขโดยใชเลนสใกลตาชนิดชดเชย เลนสใกลวัตถุชนดินี้ใหภาพที่มีความโคงมากกกวาเลนสใกลวัตถุชนิดอื่น ๆ แตสามารถแกไขโดยใชระบบเลนสใกลวัตถุที่ทําใหภาพแบบราบ(planapochromatic objective) การใชงานควรระวังเลนสใกลวัตถุชนิดนีเ้สียหายเนื่องมาจากการกระแทกกับสไลดหรือตัวอยางเพราะมีระยะชัด(working distance) ส้ันมาก

เครื่องมือวิทยาศาสตร

59

6.3 ตัวกลาง(medium) ระหวางวัตถุและเลนสใกลวัตถุ หรือระหวางสไลดกับคอนเดนเซอร แบงออกไดเปน 2 ชนิดคือ อากาศและของเหลว 6.3.1 อากาศ มีดรรชนีหักเห(refractive index, R.I.) เทากับ 1.00 ใชขยายภาพไดดีเมื่อใชเลนสใกลวัตถุที่มีกําลังขยายต่ํา หรือกําลังขยายปานกลาง และมีความกวางของรรัูบแสง (numerical aperture, N.A.) ไมเกิน 0.75 แตถาใชกับเลนสใกลวัตถุที่มกีําลังขยายสูง(มีคา N.A. สูง) จะทําใหเกดิผลเสีย กลาวคือเลนสจะกระทบกับกระจกปดสไลด(coverslip) ไดงาย เพราะระยะชดัสั้น ภาพไมชัดเพราะเกิด spherical aberration โดย spherical aberration นี้เกิดขึ้นไดงายถาใชกระจกปดสไลดที่มีความหนาแตกตางไปจากความหนามาตรฐาน(0.17 มม.) หรือมีดรรชนีหักเหแตกตางจากสไลด 6.3.2 ของเหลว สามารถแกขอเสียของตัวกลางที่เปนอากาศได โดยการเลือกใชของเหลวที่มีดรรชนีหักเหใกลเคียงกับแกว(R.I. = 1.474) น้ํามัน(1.515) ฯลฯ. การลดการหักเหของแสงเมื่อเดินทางผานตัวกลางที่มีดรรชนีหกัเหตางกันทําใหเกดิผลดีอยางนอย 2 ประการคือ ประการแรก กรวยแสงจากวัตถุที่พุงเขาสูเลนสกวางขึ้นเปนผลใหภาพมีความสวางและมีรายละเอียดดี(รูปที่ 3.10) ประการที่สอง ลดแสงสะทอนกลับ ซ่ึงเกิดจากกระจกปดสไลดทําใหภาพมีความเปรียบตางดีขึ้น ถึงแมวาจะใชแผนสไลดที่มีความหนาตางกัน

6.4 กําลังขยาย(magnifying power) เลนสใกลวัตถุมีหนาที่ขยายวัตถุใหเปนภาพจริงหวักลับที่ระนาบภาพปฐมภมูิในขนาด 2.5, 10, 16, 25, 40, 63 หรือ 100 เทา กําลังขยายเหลานี้คํานวณจากความยาวของทอมองภาพที่มีคามาตรฐาน(160 มม.) แตถาความยาวของทอมองภาพเปลี่ยนไปเปน 170 มม. กําลังขยายใหมของเลนสที่มีกําลังขยาย 25 เทา จะเปลี่ยนไปเปน 26.56 เทา (25 x 170/160)

6.5 ความกวางของรูรับแสง(numerical aperture, N.A.) ของเลนสใกลวัตถุคํานวณจาก N.A.

= n sin α(รูปที่ 3.10) โดย n เทากับดรรชนีหักเหของตัวกลาง สวน sin α มีคาสูงสุดไมเกิน 1

รูปท่ี 3.10 มุมรับแสงของเลนสท่ีกวางขึน้ (α’>α) เม่ือใชตัวกลางท่ีเปนของเหลว

กลองจุลทรรศน

60

ถาตัวกลางเปนอากาศคา N.A. ของเลนสมีคาไมเกิน 1 แตถาตัวกลางเปนของเหลว N.A. อาจมีคามากกวา 1 เลนสที่มีรูรับแสงกวาง(N.A. มาก) สามารถรับแสงจากวัตถุที่ปลอยออกมาในทกุทศิทางไดมากกวา ดงันั้นจึงเก็บรายละเอียดของวัตถุไดมากกวา ทําใหภาพมรีายละเอียดมาก(high resolution) จากรูปที่ 3.11 แสดงใหเห็นวาถาใชเลนสที่มีกําลังขยายเทากัน แตคา N.A. ตางกันจะมองเห็นภาพที่มีลักษณะตางกนั

รูปท่ี 3.11 รายละเอียดของภาพที่เพิ่มขึ้นเมื่อรูรับแสงของเลนส (คา N.A.) เพิ่มขึ้น ในขณะที่ใชกําลังขยายเทากัน

กําลังแยกรายละเอียด (resolving power, r) ของเลนสสามารถคํานวณไดจากสูตร

r = 0.61λ/NA

ตัวอยางเชน ถาใชแสงสีเขียวที่มีความยาวคลื่น(λ) 160 นาโนเมตรและใชเลนสใกลวัตถุที่มีคา N.A. = 1.31 คา r จะเทากับ 284 นาโนเมตร ซ่ึงหมายความวาเราสามารถมองเห็นวัตถุที่อยูหางกันตั้งแต 284 นาโนเมตรแยกออกจากกัน แตถาวัตถุอยูหางกันนอยกวา 284 นาโมเมตร จะมองเหน็ภาพวตัถุติดกนั

6.6 ความสวาง(brightness) ของเลนสขึ้นอยูกับคา N.A. และกําลังขยาย ดังนี้

ความสวาง = N.A.2 /กําลังขยาย

ดังนั้นในงานบางอยาง เชน การตรวจหาเบื้องตน(screening test) ดวยกลองจุลทรรศนฟลูออเรสเซนซ จึงนิยมใชเลนสใกลวัตถุที่มีกําลังขยายต่ําเพื่อความรวดเรว็ในการปฏิบัติงาน และยังนยิมใชเลนสใกลวัตถุชนิดที่ใชกับตวักลางที่เปนของเหลว เพื่อเพิ่มความสวางของภาพใหมากขึ้นอีก

เครื่องมือวิทยาศาสตร

61

6.7 ระยะชัด หมายถึงระยะระหวางเลนสใกลวัตถุอันลางกับผิวหนาของตัวอยาง(specimen) เมื่อภาพของตวัอยางปรากฏชัดเจน โดยปกติระยะชัดของเลนสที่มีกําลังขยายสูงกวาจะมีระยะชัดนอยกวา แตอยางไรก็ตามระยะชัดมีความสมัพันธกับขนาดของเลนส ขนาดของรูรับแสง รายละเอียดของภาพ และกําลังขยาย จากตารางที่ 3.1 จะเห็นไดวาเลนสที่มีขนาดเสนผาศูนยกลางมาก และมีระยะชดัสั้นจะใหภาพที่มีรายละเอียดสูงมากที่กําลังขยายที่มีประโยชน(useful magnification) ตารางที่ 3.1 ความสัมพันธของระยะชัดกับรายละเอียดของภาพ

ระยะชัด

เสนผาศูนยกลางของเลนส

N.A.

รายละเอียดของภาพ

กําลังขยายที่มีประโยชน

ยาว นอย ต่ํามาก ต่ํามาก ต่ํามาก ส้ัน นอย ต่ํา ต่ํา ต่ํา ยาว มาก สูง สูง สูง ส้ัน มาก สูงมาก สูงมาก สูง

6.8 ความลึกของระยะชดั(dept of focus) หมายถึง ความหนาของตัวอยางที่เลนสสามารถปรับความชัดได เลนสที่มีกําลังขยายสูงกวามักจะมีความลึกของระยะชัดนอยกวาเลนสที่มีกําลังขยายต่ํากวา ผูใชสามารถทดสอบความลึกของระยะชัดไดจากการหมนุปุมปรับความชัดละเอียดเพียงเล็กนอย ความชัดของภาพเมื่อใชเลนสที่มีกําลังขยายสงู(100 เทา) จะเปลี่ยนไปทันที ในขณะที่เลนสที่มีกําลังขยายต่าํกวา(10 เทา) ความคมชัดของภาพยังดีอยู

ในตารางที่ 3.2 แสดงความสมัพันธของคุณสมบัติบางประการของเลนสใกลวัตถุชนดิตาง ๆ

ตารางที่ 3.2 คุณสมบัติบางประการของเลนสใกลวัตถุชนิดตาง ๆ

ชนิด

กําลังขยาย

ความยาวโฟกัส (มม.)

N.A.

ระยะชัด (มม.)

กําลังแยก (ไมโครเมตร)

Achromat 4 32 0.16 24 2.5 Achromat (oil) 63 2.9 0.85 0.24 0.32 Apochromat 40 4.6 0.95 0.09 0.30 Planachromat 10 16 0.25 0.6 1.1 Planachromat 40 4 0.65 0.15 0.42 Planachromat (oil) 100 1.7 1.3 0.26 0.21 Planapo 40 4 0.75 0.44 0.37

กลองจุลทรรศน

62

Planapo (oil) 100 2.4 1.32 0.24 0.20 Plano 1 33 0.04 30 7 Plano 1 56 0.08 11 3.4

จะเห็นไดวาคา N.A. และกาํลังขยายแปรผกผันกับระยะชัดและความยาวโฟกัสของเลนส เลนสใกลวัตถุแตละชนดิมักจะมีคุณสมบัติที่แตกตางกัน ตัวอยางเชน ชนิดของเลนส กําลังขยาย ความยาวของทอมองภาพ ชนิดของตัวกลางที่ใช อุปกรณประกอบอืน่ ๆ ตัวอยางเชน สปริง หรือไดอะแฟรมเปนตน

ผูใชควรศึกษาคุณสมบัติจากคูมือการใชงาน หรือดจูากอักษรยอตาง ๆ ที่ปรากฏอยูบนตัวกระบอกเลนสใกลวัตถุดังนี้ อักษร ความหมาย

Fl. Fluotar, Neofluar ระบบเลนสชนิดฟลูออไรท Apo ระบบเลนสชนิดอะโปโครมาติก Plan, Plano, PI ระบบเลนสชนิดแฟลทฟลด N หรือ ไมกําหนด ระบบเลนสชนิดอะโครมาตกิ 4 / 0.65 กําลังขยาย / คา N.A. 160 หรือ 170/0.17 ความยาวของทอมองภาพ/ ความหนาของกระจก ปดสไลดที่ควรใช (ถาไมกําหนดแสดงวาความหนา

ของกระจกปดสไลดไมสําคัญมากนัก) W.I. ใชน้ําเปนตวักลาง Gly Z ใชกลีเซอรีนเปนตัวกลาง Oil, Oil imm, Oel. HI, I ใชน้ํามันเปนตวักลาง N หรือไมกําหนด ใชอากาศเปนตัวกลาง Ph ใชกับกลองจุลทรรศนเฟสคอนทราสท Iris มีไอริสไดอะแฟรม S มีสปริง

7. เลนสใกลตา(eyepiece หรือ ocular lens) มีหนาที่ขยายภาพจากเลนสใกลวัตถุ ใชแกความ

เพี้ยนทีเ่กิดขึน้จากเลนสใกลวัตถุบางชนิด ใชติดตั้งเข็มชี้ภาพ(pointer) ใชติดตั้งสเกลวัดขนาดของวัตถุ และใชตดิตั้งอุปกรณถายภาพชนิดตาง ๆ

เครื่องมือวิทยาศาสตร

63

7.1 ชนิดของเลนสใกลตา เลนสใกลตาโดยทั่วไปมีเลนสอยู 2 อันคือ เลนสอันบน(top lens) และเลนสอันลาง(field lens) เลนสอันลางมีหนาที่ยอภาพจากเลนสใกลวัตถุใหมีขนาดเลก็ลง สวนเลนสอันบนมีหนาที่รวมแสงของภาพใหออกมาตดักันเหนือเลนสอันบนเล็กนอย(exit pupil)(รูปที่ 3.12 ก) ถาพิวพิลของลูกตาอยูที่ตําแหนงนี้จะมองเหน็จอภาพที่เต็ม แตถาระยะหางกวานี้แสงบาง สวนไมตกกระทบพิวพิลของลูกตาซึ่งมีขนาดโตไมเกิน 3 มม. จะทําใหมองเห็นภาพไมเตม็จอ ตําแหนงการวางเลนสและเนือ้เลนสทําใหแบงเลนสใกลตาออกไดเปนหลายชนิด คือ

กลองจุลทรรศน

64

รูปท่ี 3.12 ทางเดินของแสงในกระบอกเลนสใกลตา (ก) และโครงสรางของเลนส ใกลตาชนิดฮุยเจนเนียน (ข) ชนดิแรมสเดน (ค) และชนิดเคลลเนอ (ง)

7.1.1 ชนิดฮุยเจนเนียน (huygenian type) เปนระบบเลนสใกลตาแบบธรรมดาซึ่ง นิยมใชทัว่ไปกับเลนสใกลวตัถุชนิดอะโครมาติก เลนสอันบนวางหางจากเลนสอันลางในระยะหางเทากับ 2 เทาของความยาวโฟกัสของเลนสอันบน เลนสอันลางมีความยาวโฟกัสเปน 3 เทาของเลนสอันบน(รูปที่ 3.12 ข)

เลนสชนิดนี้มขีอเสียตรงที่ มีระยะหางระหวางชองแสงออกของเลนสใกลตากับพวิพิลของลูกตาที่สามารถเห็นภาพไดชัดสั้น(ระยะ eye point) ทําใหคนที่สวมแวนตาไมสามารถมองเห็นภาพที่สมบูรณ นอกจากนีย้ังติดตัง้สเกลวัดขนาดของวัตถุไดยาก เนื่องจากกระนาบภาพปฐมภูมิอยูระหวางเลนสทั้งสอง

7.1.2 ชนิดแรมสเดน(Ramsden type) ใชเลนสนูนแกมระนาบ(planoconvex lens) เหมือนชนดิฮยุเจนเนยีนแตเลนสอันลาง วางดานนูนเขาหาลูกตา(รูปที่ 3.12 ค) เลนสอันลางมีความยาวโฟกัสเทากับเลนสอันบนและหางจากเลนสอันบนเทากับความยาวโฟกัส เลนสใกลตาชนิดนี้มีขอดีตรงที่สามารถติดตั้งสเกลวัดขนาดของวัตถุ หรือเข็มชี้ไดงาย เพราะระนาบภาพปฐมภูมิอยูใตเลนสอันลาง 7.1.3 ชนิดเคลลเนอ(Kellner type) มีโครงสรางคลายกับชนิดแรมสเดน แตระยะระหวางเลนสทั้งสองสั้นกวาทําใหมองภาพสุดทาย(final image) ที่เต็มจอภาพไดงายขึ้น เลนสอันบนทําดวยแกวที่ผสมตะกั่ว(flint glass) และแกวที่ไมผสมตะกั่ว(corwn glass) เพื่อแกความเพี้ยนของภาพทั้งแบบ chromatic aberration และแบบ spherical aberration ที่เกิดขึ้น เนื่องจากเลนสทั้งสองมีระยะใกลกนัมาก(รูปที่ 3.12 ง)

7.1.4 ชนิดชดเชย (compensating type) ใชสําหรับแกความเพี้ยนของภาพแบบ chromatic aberration ที่เกิดเนื่องจากการใชเลนสใกลวัตถุชนิดฟลูออไรท หรือชนิดอะโปโครมาติกควรใชเลนสใกลตาชนิดชดเชยกับเลนสใกลวัตถุของผูผลิตรายเดยีวกัน เพื่อคุณภาพที่ดีที่สุดของภาพ เพราะระบบเลนสคอนขางซับซอน

7.1.5 ชนิดจอกวาง(wide field type) ใชไดกับเลนสใกลวัตถุทกุชนิดสามารถขยาย จอภาพไดมากกวาปกติถึง 40 เปอรเซ็นต ดังนั้นจึงเหมาะสําหรับงานตรวจหาเบื้องตน(screening) ที่ตองการความรวดเร็ว จอภาพมีขนาดโตขึ้นเพราะการเพิ่มเลนสระหวางเลนสอันบนและเลนสอันลาง ทําใหลดขนาดของภาพปฐมภูมิ แลวใชเลนสตวับนที่มีกําลังขยายสูงขึ้นกวาปกติขยายภาพอีกครั้งหนึ่ง

7.2 กําลังขยายของเลนสใกลตา มีหลายขนาด ตัวอยางเชน 2, 4, 6, 7, 10, 15, 20, 25 เทา

เครื่องมือวิทยาศาสตร

65

โดยทั่วไปนิยมใชกําลังขยายต่ํา เพราะสามารถมองเห็นภาพที่คมชัดกวา สวางกวา และภาพปฐมภูมิมีเสนผาศูนยกลางมากกวา เสนผาศูนยกลางของจอภาพนยิมแทนดวยคา “field of view number, S” ซ่ึงคํานวณไดดังนี้ S = 2 Ftan ½ A แทนคา F = 250/Mep ดังนั้น S = ( 500/Mep) tan ½ A โดย S = Field of view number (มม.) F = ความยาวโฟกัสของเลนสใกลตา (มม.) A = มุมมอง (view angle) ซ่ึงมีคา 25-30 องศา สําหรับเลนสใกล

ตาชนิดฮุยเจนเนยีน และมีคา 45-50 องศา สําหรับเลนสใกล ตาชนิดจอกวาง

Mep = กาํลังขยายของเลนสใกลตา คา S ที่คํานวณไดสามารถนําไปคํานวณหาพื้นทีว่ัตถุ(objective field) ที่ถูกมองได จากสูตร S/Mob (Mob = กําลังขยายของเลนสใกลวัตถุ) กําลังขยายรวม(total magnifying power) ของกลองจุลทรรศน คือคาผลคูณระหวาง Mob และ Mep

ในทางปฏิบัตถิาตองการกําลังขยายรวม 400 เทา ควรใช Mob = 40 และ Mep = 10 มากกวาการใช Mob = 20 และ Mep = 20 เพราะจะมองเห็นภาพที่มีรายละเอียดมากกวา เนื่องจากคา N.A. ของเลนสใกลวัตถุมีมากกวา และไมควรใชกําลังขยายรวมเกนิคาของ 100 x N.A. เพราะเลนสตาไมสามารถโฟกัสภาพที่ชัดเจนได กําลังขยายที่เกินคา 100 x N.A. จึงเปนกําลังขยายทีเ่ปลาประโยชนที่เรียกวา “empty magnification” กระบอกเลนสใกลตาอาจมีอักษรยอ ซ่ึงมีความหมายที่ควรทราบดังนี้ อักษรยอ ความหมาย Bi, Bip Binocular FK Photographic eyepiece WF Wide field H ชนิดฮุยเจนเนยีน HEP High eyepoint (สําหรับผูสวมแวนตา) K ชดเชยความเพีย้นแบบchromatic aberration และ

กลองจุลทรรศน

66

ความบิดเบีย้วของภาพแตใชกับเลนสใกลวตัถุชนิด ฟลูออไรท หรือเลนสใกลวัตถุกําลังขยายสูง P เหมือน K แตใชกับเลนสใกลวัตถุชนิดอื่น ๆ

8. คอนเดนเซอร(condenser) กลองจุลทรรศนสวนมากมีคอนเดนเซอรอยูใตแทนวาง จึงอาจเรียกวา “substage condense” คอนเดนเซอรมีหนาที่รวมแสงใหตกกระทบวัตถุโดยมคีวามเขมของแสงสม่ําเสมอทั่วพื้นที่สองสวาง(illuminating field) ควบคุมกรวยแสง(illuminating cone) ใหพอดีกับรูรับแสงของเลนสใกลวัตถุ และชวยทําใหจอภาพมืดในกลองจุลทรรศนชนิดพื้นหลังมืด

8.1 ชนิดของคอนเดนเซอร คอนเดนเซอรที่นิยมใชกันอยูมี 3 ชนิด คือ 8.1.1 ชนิดอับเบ(Abbe type) เปนชนิดที่มีราคาถูก ใชกับกลองจุลทรรศนพื้นหลัง

สวางทั่ว ๆ ไป ไมมีการแกความเพี้ยนของภาพทั้งแบบ chromatic aberration และ spherical aberration ดังนั้นจึงไมเหมาะสมที่จะใชกับเลนสใกลวัตถุคุณภาพสูง คอนเดนเซอรชนิดนี้ประกอบดวยเลนสเพียง 2 อัน (รูปที่ 3.13ก) มีคา N.A. สูงสุดประมาณ 1.25 8.1.2 ชนิดอะพลานาติก(aplanatic type) แตกตางจากชนดิอับเบโดยการเพิ่มเลนสอีก 1 อัน เพื่อแกความเพีย้นของภาพแบบโคมาและ chromatic aberration จึงเหมาะสําหรับการถายภาพสีจากกลองจุลทรรศน มีคา N.A. ประมาณ 1.2 (รูปที่ 3.13 ข) 8.1.3 ชนิดอะพลานาติก/อะโครมาติก(aplanatic/achromatic type) ใชแกวผสมตะกัว่ชวยแกความเพี้ยนของภาพแบบ chromatic aberration และความโคงของภาพ (รูปที่ 3.13 ค) มีคา N.A. สูงถึง 1.4 จึงสามารถใหรายละเอียดของภาพไดดี และเหมาะสมสําหรับการถายภาพสีจากกลองจุลทรรศน นิยมใชกับเลนสใกลวัตถุคุณภาพสูง ตัวอยางเชน ชนิดอะโปโครมาติก เปนตน

รูปท่ี 3.13 โครงสรางเลนสของคอนเดนเซอรชนิดอับเบ (ก) ชนิดอะพลานาติก(ข) และชนิดอะพลานาติก/อะโครมาติก (ค)

เครื่องมือวิทยาศาสตร

67

8.1.4 ชนดิพืน้หลังดํา(dark ground type) เปนคอนเดนเซอรที่ออกแบบมาเพื่อลดความสวางของพื้นหลัง ทําใหวตัถุที่ไมมสีีมีความแตกตางจากสีดําของพื้นหลังมากขึ้น สําหรับเลนสใกลวัตถุกําลังขยายต่ําที่มีคา N.A. ไมเกนิ 0.65 อาจทําใหพืน้ดําไดโดยใชแผนบังแสง(patch stop) ขนาดที่เหมาะสมปดทางเดินแสงที่ระนาบรวมแสงหลังเลนสใกลวัตถุ(back focal plan of objective) หรือที่ระนาบรวมแสงหนาคอนเดนเซอร(front focal plan of condenser) ทําใหกรวยแสงจากแหลงกําเนิดแสงตกกระทบวัตถุเปนมุมแลวเกดิการหักเหเปนมุมที่กวางกวา 180 องศา(รูปที่ 3.14 ก) จึงไม

กลองจุลทรรศน

68

รูปท่ี 3.14 การทําใหพื้นหลังวัตถุมืดโดยใชแผนบังแสง (ก) คอนเดนเซอร ชนดิพาราโบลอยด (ข) และคอนเดนเซอรชนดิคารไดออยด (ค)

มีแสงเขารูรับแสงของเลนสใกลวัตถุ เวนแตแสงสะทอนจากวัตถุ จึงทําใหมองเห็นวัตถุสวางในจอภาพที่มดื แตเมื่อใชเลนสใกลวัตถุที่มีคา N.A. สูงขึ้น(กําลังขยายมากขึ้น) จําเปนตองใชคอนเดนเซอรชนิดพื้นหลังดาํโดยเฉพาะ คอนเดนเซอรชนิดพื้นหลังดําอาจจําแนกเปนชนดิยอยไดเปน 8.1.4.1 ชนดิพาราโบลอยด(paraboloidal type) อาศัยแผนปด(central stop) บังแสงตรงกลาง(axial ray) แลวปลอยลําแสงสวนที่เหลือรอบ ๆ ใหสะทอนกบัผิวโคง(paraboloidal surface) แลวพุงกระทบวัตถุในมุมทีก่วางขึ้น และเพื่อลดการหักเหที่ไมจําเปน ควรใสน้ํามันไวตรงกลางระหวางคอนเดนเซอรกับสไลด(รูปที่ 3.14 ข) คอนเดนเซอรชนิดนี้สามารถใชไดกับเลนสใกลวัตถุท่ีมีกําลังขยายสูง เมื่อใชตัวกลางที่เปนของเหลวระหวางวัตถุและเลนสใกลวัตถุควรลดขนาดชองแสงของคอนเดนเซอรเล็กนอย เพื่อใหพืน้หลังมืดมากขึ้น 8.1.4.2 ชนิดคารไดออยด(cardioidal type) ใชผิวโคงทึบแสงบังแสงตรงกลางและใหแสงรอบ ๆ สะทอนไปยังผิวโคงดานบน(cardioidal surface) แลวตกกระทบวัตถุในมุมกวาง(รูปที่ 3.14 ค) มีคุณสมบัติในการใชงานเชนเดยีวกับชนิดพาราโบลอยด 8.2 ไดอะแฟรมปดชองแสงของคอนเดนเซอร(aperture iris diaphragm) เปนโลหะบาง ๆ เรียงซอนกันเปนวงกลมติดตั้งอยูใตเลนสอันลางของคอนเดนเซอร มีหนาปรับความกวางของลาํแสงที่เขาและออกจากคอนเดนเซอร การปรับภาพใหมีรายละเอียดมากทีสุ่ด ควรปรับคา N.A. ของคอนเดนเซอร(N.A.cond)ใหเทากับคา N.A. ของเลนสใกลวัตถุ(N.A.ob) เนือ่งจากกําลังแยกมีความสัมพันธกับคา N.A. ทั้งสองดังสูตร

r = 0.61 λ (N.A.ob + N.A. cond)/2 สูตรดังกลาวจะใชไดตอเมื่อ N.A.ob มีคามากกวาหรือเทากับ N.A. cond ในการใชงานถาปรับให N.A. ob นอยกวา N.A. cond รายละเอียดของภาพจะลดลง เพราะแสงจากวัตถุบางสวนไมผานเลนสใกลวัตถุ

เครื่องมือวิทยาศาสตร

69

8.3 ตัวกรองแสง(light filter) โดยทั่วไปจะอยูใตคอนเดนเซอร นิยมทําดวยแกววงกลมขนาดเสนผาศูนยกลาง 30-45 ซม. มีหนาที่ลดความเขมของแสงจากแหลงกําเนิดแสง(neutral density filter) ทําใหแสงจากแหลงกําเนิดแสงมีความขาวมากขึ้น ซ่ึงชวยใหภาพมีรายละเอียดมากขึ้น มีความเปรียบตางกับพื้นหลังมากขึ้น(blue filter) และชวยปองกันความรอนจากแหลงกําเนิดแสง(heat filter) ในกลองฟลูออเรสเซนซยังมีตัวกรองแสงที่มองเห็น(barrier filter) เปนองคประกอบเพิม่เติม

9. ระบบสองสวาง(illuminating system) ประกอบดวยแหลงกําเนิดแสง(light source) และเลนสตาง ๆ เพื่อกําหนดทิศทางเดินแสง และความเขมของแสง ดังนี้ 9.1 แหลงกําเนิดแสง มีหลายชนิดคือ

9.1.1 แสงธรรมชาติ ใชกระจกเงา 2 หนาสองแสงเขาสูคอนเดนเซอร โดยใชดาน เวากับเลนสทีม่ี N.A. ต่ํา และไมใชคอนเดนเซอร ใชดานเรียบใชงานทั่วไป ในที่มีแสงสวางพอเพยีง 9.1.2 หลอดทังสเตน ใชพลังงานจากไฟฟากระแสสลับแปลงใหเปนกระแสไฟฟาตรงโวลตต่ํา (6 หรือ 12 โวลต ขนาด 10-20 วัตต) ถูกควบคุมความสวางโดยการปรับปริมาณกระแสไฟฟา โดยใชตวัตานทานปรับคาได(rheostat) หรือใชระบบอิเล็กทรอนิกสควบคุม แตเมื่อโวลตลดลงแสงที่เปลงออกมาจะมีสีแดงมากขึ้น ซ่ึงไมเหมาะสําหรับการถายภาพ ถาตองการลดความสวางโดยสีไมเปลี่ยนควรใช neutral density filter แทนการลดโวลตของกระแสไฟฟา 9.1.3 หลอดฮาโลเจน(halogen lamp) เปนหลอดที่มีขนาดเล็กกวา แตมคีวามสามารถในการสองสวางมากกวา เพราะกระเปาะแกวทําดวยควอทช(quartz) ทําใหสามารถเพิ่มกําลังสองสวางถึง 100 วัตต(12 โวลต) หลอดชนิดนี้มีขอดีตรงที่แสงที่เปลงออกมามีความสวางมาก คงที่ สม่ําเสมอ และความเขมของแสงไมลดลงตามอายุการใชงานเหมือนหลอดทังสเตน นอกเหนอืจากการใชงานในกลองทั่ว ๆ ไป หลอดชนดินี้ยังใชกับกลองจุลทรรศนฟลูออเรสเซนซได เพราะสามารถปลอยแสงที่ความยาวคลื่น 440 นาโนเมตร 9.14 หลอดเมอคิวรี(mercury lamp) เปนหลอดไฟที่มีกาํลังสองสวางสูง ราคาแพง ปลอยแสงที่มีความเขมมากที่ความยาวคลื่น 365, 436 และ 546 นาโมเมตร จึงนิยมใชในกลองจุลทรรศนฟลูออเรสเซนซ กอนใชงานควรเปดไฟอุนหลอดนานประมาณ 20 นาที เพื่อใหความเขมของแสงคงที่ และเมื่อปดหลอดไฟแลวควรรอใหหลอดไฟเย็นกอนเปดใชใหมอีกครั้ง เพื่อปองกันไสหลอดไฟขาดไดงาย 9.2 ระบบทางเดินแสง ในกลองรุนเกานยิมใชระบบวิกฤต(critical system) ใชแหลงกําเนิดแสงจากภายนอกกลอง สวนกลองรุนใหมในปจจุบนัใชระบบโคทเลอ(kohler system) ติดตั้งประจําอยูที่ฐานกลอง ซ่ึงชวยเพิ่มความสะดวกสบายในการใช และใหภาพทีส่วางกวา 9.2.1 ระบบวิกฤต อาจเรียกวา “source focus” หรือ “Nelsonian” รูปที่ 3.15 ก แสดงใหเห็นวาแสงจากหลอดไฟผิวขุน(frost surface) ขนาดใหญจะสองผานชองแสงของคอนเดนเซอร (aperture iris diaphragm) ซ่ึงรวมแสงใหตกกระทบวัตถุพอดี หลังจากนั้นภาพถูกขยายโดยเลนสใกล

กลองจุลทรรศน

70

วัตถุ ปรากฏภาพที่ระนาบปฐมภูม(ิprimary image plane) แลวถูกขยายตอโดยเลนสใกลตาจนปรากฏภาพที่เรตินา 9.2.2 ระบบโคทเลอ ใชหลอดทังสเตนหรือหลอดฮาโลเจนที่ใสและมีความสวางมากแทนหลอดขุน ใชเลนสรวมแสงของไสหลอดไฟใหรวมที่ระนาบรวมแสงหนาคอนเดนเซอร (front focal plane of condenser) ซ่ึงเปนที่ตั้งของแผนไดอะแฟรม หลังจากนัน้ภาพของไสหลอดไฟจะไปปรากฏชดัที่ระนาบรวมแสงหลังเลนสใกลวัตถุ(back focal plane of objective) และชองแสงออก (exit pupil) ของเลนสใกลตา ซ่ึงเปนตําแหนงของพิวพิลของลูกตา ดังนั้นจึงไมสามารถมองเห็น

เครื่องมือวิทยาศาสตร

71

รูปท่ี 3.15 ทางเดินของแสงและการเกิดภาพในระบบวิกฤติ (ก) และระบาดโคทเลอ (ข,ค)

ไสของหลอดไฟจากเลนสใกลตาได(รูปที ่ 3.15ข) สวนเลนสรวมแสงหนาหลอดไฟทําหนาทีเ่สมือนแหลงกําเนิดแสงที่มีความเขมของแสงสม่ําเสมอ(homogeneous light source) แสงจะถูกรวมใหตกกระทบวัตถุพอดีเชนเดยีวกบัระบบวิกฤติ

จะเห็นไดวาระบบโคทเลอมีระนาบของทางเดินแสง ซ่ึงประกอบดวยระนาบไสหลอดไฟ (lamp filament plane) ระนาบรวมแสงหนาคอนเดนเซอรหรือแอพเพอเชอรไอริสไดอะแฟรม ระนาบรวมแสงหลังเลนสใกลวัตถุ และชองแสงออกของเลนสใกลตา (exit pupil of eyepiece) สวนระนาบ

กลองจุลทรรศน

72

ของการเกิดภาพประกอบดวย ระนาบของฟลดไอริสไดอะแฟรม ระนาบตัวอยางหรือวัตถุ(specimen plane) ระนาบภาพปฐมภูม(ิprimary image plane) และระนาบของเรตินาของลูกตา(รูปที่ 3.15 ค) ระนาบเหลานีจ้ะซอนกนัอยู ภาพในระนาบของทางเดินแสงจะไมปรากฏในระนาบของการเกิดภาพ แตภาพเหลานัน้จะปรากฏชดัในทุกระนาบของระนาบทางเดินแสงหรือระนาบการเกิดภาพเทานัน้

หลักการทํางานของกลองจุลทรรศน กลองจุลทรรศนเกือบทุกชนดิมีระนาบของการเกิดภาพ และระนาบของทางเดินแสงเหมือนกนั การบังระนาบบางระนาบ การเปลี่ยนคอนเดนเซอร การเปลี่ยนแหลงกาํเนิดแสง ทําใหกลองจุลทรรศนทํางานเปลี่ยนลักษณะไป ดังนั้นกลองจลุทรรศนเพียงหนึ่งตวั จึงสามารถทํางานไดหลายลักษณะ เมื่อมีการปรับแตง หรือถอดเปลี่ยนอุปกรณ

1. กลองจุลทรรศนพื้นหลังสวาง เปนกลองจุลทรรศนชนิดที่ทําใหเกดิภาพ โดยการใชคอนเดนเซอร รวมแสงจากแหลงกําเนิดแสงใหรวมกันทีว่ัตถุหรือตัวอยางที่ตองการตรวจดู ทําใหวัตถุดูเสมือนวาสามารถเปลงแสงเองได(self luminous object) แลวใชเลนสใกลวัตถุขยายภาพใหโตขึน้ ณ ที่ตําแหนงระนาบภาพปฐมภูมิ หลังจากนั้นใชเลนสใกลตาขยายภาพจากระนาบดงักลาวใหโตขึ้นอีก (รูปที่ 3.15 ค) วิธีการดังกลาวทําใหมองเห็นพืน้หลังของวัตถุที่มี ความทึบ มีสี หรือดรรชนีหกัเห มากกวา ดงันั้นจึงนยิมใชในงานทั่ว ๆ ไปในหองปฏิบตัิการวิทยาศาสตรและหองปฏิบัติการทางการแพทย 2. กลองจุลทรรศนพื้นหลังมืด เปนกลองจุลทรรศนชนิดที่ทําใหเกดิภาพโดยการบังลําแสงตรงกลางที่กระทบวัตถุในแนวดิ่ง หลังจากนั้นปลอยใหแสงรอบ ๆ สวนที่เหลือพุงกระทบวตัถุในแนวเฉียง ซ่ึงจะกอใหเกดิการหักเหในมุมที่กวางมากกวารูรับแสงของเลนสใกลวตัถุ แตแสงที่สะทอนจากวตัถุพุงเขาสูรูรับแสงของเลนสใกลวัตถุได จึงมองเหน็ภาพวัตถุเปนจุดสวางบนพื้นหลังดํา คลายกับการมองเห็นดวงดาวในทองฟาที่มืด(ดูรายละเอียดในหวัขอคอนเดนเซอรชนิดพื้นหลังดําประกอบ) เหตุผลดังกลาวจึงเหมาะสมสําหรับใชดูการเคลื่อนไหวของจุลินทรียทีม่ีชีวิตตัวอยางเชน เชื้อ Treponema pallidum, Leptospires, Borreliar ฯลฯ. เพราะถายอมสีจะทําใหจุลินทรียตาย 3. กลองจุลทรรศนเฟสคอนทราสท เปนกลองจุลทรรศนชนิดที่ใชอุปกรณพิเศษ 2 อยาง คือ วงแหวนไดอะแฟรม(annular diaphragm) และแผนเปลี่ยนเฟส(annular phase plate) ทําใหแสงจากพืน้หลัง และจากวัตถุมีการเปลี่ยนความยาวคลื่น(เฟส) ทําใหคล่ืนแสงเกิดการเสริมกัน(constructive) เปนผลใหความสวางลดลง ทําใหวตัถุและพืน้หลังมีความสวางแตกตางกันมากขึ้นคลาย ๆ กับกลองจุลทรรศนชนิดพื้นหลังดํา แผนเปลี่ยนเฟสเปนแผนแกวกลมเนื้อแกวถูกกัดเปนรองวงแหวนหรือวงแหวนนูน ซ่ึง

คํานวณใหแสงที่ผานวงแหวนนี้มีความยาวคลื่นเพิ่มขึ้น(เปนรอง) หรือลดลง(นูน) 0.25λ เมื่อเทียบกับความยาวคลื่นแสงที่ผานบริเวณอื่นของแผนแปลี่ยนเฟส ตรงกลางแผนเคลือบดวยสารซึ่งสามารถดูดกลืนแสงตรง(direct ray) จากวัตถุไดประประมาณรอยละ 75 เพื่อใหแสงที่กระเจงิ(scatter ray) จาก

เครื่องมือวิทยาศาสตร

73

วัตถุดูเสมือนมีมากขึ้น แผนเปลี่ยนเฟสดังกลาวถูกวางไวที่ระนาบรวมแสงหลังเลนสใกลวัตถุ และไปซอนทบักับวงแหวนของแผนเปลี่ยนเฟสพอดี ดังนั้นแสงตรงจากแหลงกาํเนิดแสงหลังจาก

ผานวงแหวนเปลี่ยนเฟส จึงมีความยาวคลื่นเปลี่ยนไป 0.25 λ (รูปที่ 3.16) สวนวัตถุเมื่อมีแสงตรงตก

รูปท่ี 3.16 ทางเดินของแสงในกลองจุลทรรศนเฟสคอนทราสท

กระทบจะเกดิการกระเจิงแสงออกมาในทุกทิศทาง โดยแสงที่มีการหักเหมีความยาวคลื่นนอยกวาคลื่น

แสงที่ไมหักเห (ลําแสงตรง) 0.125-0.25λ ขึ้นอยูกับดรรชนีหักเหขององคประกอบตาง ๆ ของวัตถุ สวนที่ทึบหรือมีดรรชนีหักเหมาก ความยาวคลื่นจะเปลี่ยนมาก ดังนั้นลําแสงตรงหลังผานแผน

เปลี่ยนเฟส จึงมีความยาวคลื่นตางจากลําแสงกระจายอยูในชวง 0.375-0.5λ เนื่องจากคลื่นแสงที่มี

กลองจุลทรรศน

74

ความยาวคลื่นตางกัน 0.5λ จะเกิดการหักลางสูงสุด(maximum destruction) ทําใหมองเห็นสวนประกอบของวัตถุที่มีดรรชนีหักเหมากมืดมากกวาสวนอื่น ๆ ทีม่ีดรรชนีหักเหนอยกวาลดหลั่นกันไป เรียกการสรางภาพแบบนี้วา “positive phase contrast”

ในทางตรงกันขามถาวงแหวนของแผนเปลีย่นเฟสนนู แสงตรงจะมีความยาวคลื่นลดลง

0.25λ ทําใหเกิดการเสริมเฟสกับลําแสงกระเจิง ฉะนั้นจึงทําใหมองเห็นองคประกอบของวัตถุที่มีดรรชนีหักเหมากกวา สวางกวาสวนที่มดีรรชนีหักเหนอยกวาตามลาํดับ เรียกวธีิการทําใหเกดิภาพแบบนี้วา “negative phase contrast” กลองจุลทรรศนเฟสคอนทราสทใชสําหรับดูส่ิงที่มีชีวิตขนาดเล็ก ๆ ไดดีเชนเดยีวกับกลองจุลทรรศนพื้นหลังมืด แตมขีอเสียตรงที่รายละเอียดของภาพลดลงเล็กนอย และการดูโครงสรางของ วัตถุตาง ๆ อาจผิดพลาดไดเพราะภาพมักจะมีเงารอบ ๆ 4. กลองจุลทรรศนฟลูออเรสเซนซ เปนกลองจุลทรรศนชนิดที่เหน็ภาพวัตถุเปลงแสงซึ่งอาจทําใหวตัถุเปลงแสงออกมาเอง(primary fluorescence) หรือโดยการใชสียอมเปลงแสง(secondary fluorescence) เมื่อใชแสงคลื่นสั้น(อัลตราไวโอเลต) สองกระทบวัตถุ

กลองชนิดนี้ตองมีอุปกรณเพิ่มเติมที่จําเปนในการเกิดภาพที่ดี กลาวคอื ตองใชคอนเดนเซอรชนิดพื้นหลังดาํ เลนสใกลวตัถุควรเปนชนดิที่ไมเปลงแสง(non fluorescence) และควรหรี่แสงได ใชตัวกลางที่ไมเปลงแสง หลอดไฟกาํเนดิแสงควรเปนชนิดเมอคิวรีหรือฮาโลเจน ตัวกรองความรอน (heat filter) ตัวกรองแสงทีม่องเห็นได ตัวกรองแสงอลัตราไวโอเลต นอกจากอุปกรณตาง ๆ แลว สียอมนับวามสีวนสําคัญในการทําใหมองเห็นวัตถุ เปนสีตาง ๆ เชน สีเหลือง สีแดง สีน้ําเงิน สีเขียว ฯลฯ. แตสีที่นยิมใชกนัมากที่สุดไดแก fluorescin isothiocyanate(FITC) ซ่ึงเปลงแสงสีเขียว รูปที่ 3.17 แสดงแผนผังการทํางานของกลองจุลทรรศนฟลูออเรสเซนซแบบแสงสองผาน (transmitted illumination) และแบบแสงตกกระทบ(incident illumination) จะเห็นไดวาแบบแสงตกกระทบมีแสงอัลตราไวโอเลตผานเขาสูตานอยกวาและใหพื้นหลังที่มืดกวา เพราะแสงอัลตราไวโอเลตไมสองทะลุผานพื้นหลังวัตถุขึ้นมาเหมือนแบบแสงสองผาน จึงทําใหเกิดภาพเปลงแสงที่ชัดเจนกวา กลองชนิดนี้นยิมใชดกูารเปลงแสงในปฏิกิริยาของการทดสอบทางภมูิคุมกันวิทยา โดยการตดิสารเปลงแสงกับแอนติเจน(antigen) หรือแอนติบอดี(antibody)

ในระยะหลังไดมีการพัฒนากลองฟลูออเรสเซนซชนิด confocal microscope เพื่อใหสามารถดูภาพ 3 มิติไดละเอียดมากขีน้โดยใชลําแสงเลเซอรสีน้ําเงินยิงไปทีก่ระจกซึ่งเคลื่อนที่ไดเพื่อสะทอนไปที่ตัวอยางแตละจุด ทําใหสีที่ยอมตัวอยางเปลงแสงฟลูออเรสเซนซออกมา แลวจึงใชกระจกสะทอนแสงที่เปลงออกมาใหไปรวมกัน(โฟกัส)ที่รูขนาดเล็ก(pinhole) ของฉากซึ่งจะบังแสงที่เกิดจากตัวอยางสวนอื่น ๆ ทีย่ังไมถูกแสงเลเซอรไว แตจะปลอยใหลําแสงฟลูออเรสเซนซผานรูขนาดเล็กพุงตรงไปยังตัวไวแสง ซ่ึงจะทําหนาที่รวบรวมสัญญาณภาพแตละจุดสงไปยังเครื่องคอมพิวเตอรเพื่อสรางภาพ 3 มิติที่มีความละเอียดสูงถึง 0.2 ไมครอน

เครื่องมือวิทยาศาสตร

75

รูปท่ี 3.17 ทางเดินของแสงในกลองจุลทรรศนฟลูออเรสเซนซแบบแสงสองผาน (ก) และแบบแสงตกกระทบ (ข)

วิธีใชกลองจุลทรรศน กลองจุลทรรศนมีวิธีการปรบัเพื่อใหภาพคมชัดเจนคลายกันคือ การปรับแหลงกําเนิดแสง การปรับแสงใหรวมกนัที่วัตถุพอดี การปรับภาพของวัตถุใหรวมกนัที่เรตินา สวนรายละเอียดของการใชกลองแตละยี่หออาจแตกตางกันเล็กนอยซ่ึงผูใชควรศึกษาจากคูมอืการใชงานประกอบดวย

กลองจุลทรรศน

76

วิธีใชกลองจุลทรรศนที่จะกลาวถึงตอไปนี ้ เปนวิธีการใชพื้นฐานของกลองจุลทรรศนแตละชนิด เพื่อใหไดภาพที่คมชัดและมรีายละเอียดสูง

1. กลองจุลทรรศนชนิดพื้นหลังสวางมีวิธีการใชดังนี ้ 1.1 วางกลองจุลทรรศนในตําแหนงทีเ่หมาะสม ตัวอยางเชน วางบนโตะทีไ่มมีการส่ันสะเทือน วางในที่ที่ไมมีแสงจากภายนอกมารบกวนระบบแสงของกลอง วางบนโตะที่สูงพอดี ฯลฯ.

1.2 ปรับตาํแหนงและระดับการนั่งใหเหมาะสม เพื่อใหสามารถมองดูภาพไดอยางสบาย โดยไมตองงอหลัง หรือยืดคอมาก และควรมีที่วางแขนเพื่อลดการเมื่อลา

1.3 วางสไลดบนแทนวาง เปดไฟ ใชเลนสใกลวัตถุกําลังขยาย 10 เทา 1.4 ปรับระยะหางของกระบอกเลนสใกลตา (ระยะของคนปกติประมาณ 65 มม.) 1.5 ปรับภาพใหชัดโดยการหมนุปุมปรับความชัดหยาบและปุมปรับความชัดละเอียด (เลนส

ใกลวัตถุอยูหางจากสไลดประมาณ 5 มม.) 1.6. ปรับกระบอกเลนสใกลตาทั้งสองขางใหเห็นภาพชัดเจนเทากัน 1.7. เปดชองแสงของคอนเดนเซอรใหกวางที่สุด 1.8. กลองที่สามารถปรับจุดรวมแสงของไสหลอดไฟได(ระบบแสงแบบโคทเลอ) ควรปรับ

จุดรวมแสงของไสหลอดไฟกอน โดยเลื่อนคอนเดนเซอรขึ้นในตําแหนงสูงสุด ปดชองแสงของคอนเดนเซอร เปดชองแสงของหลอดไฟใหกวางที่สุด คลายสกรยูึดหลอดไฟ เล่ือนหลอดไฟจนปรากฏภาพไสหลอดไฟชัดเจนที่แผนไดอะแฟรมปดชองแสงของคอนเดนเซอร (อาจใชกระจกเงาเล็ก ๆ สองดูภาพ) ยึดตําแหนงหลอดไฟ อาจตองปรับตําแหนงกึ่งกลางของไสหลอดไฟโดยปรับสกรู (lamp centring screw) เปดชองแสงของคอนเดนเซอรใหกวางที่สุด 1.9 ปรับความสูงของคอนเดนเซอร เพื่อใหแสงจากหลอดไฟตกกระทบวัตถุพอดี โดยการปดชองแสงของหลอดไฟ เล่ือนคอนเดนเซอรขึ้นลงจนมองเห็นภาพของแผนไดอะแฟรม เปดชองแสงของหลอดไฟจนรูแสงสวางเต็มจอภาพ ในกรณีทีห่ลอดไฟไมมีแผนไดอะแฟรมปด อาจถือปลายดินสอใหตดิหนาหลอดไฟ แลวจึงปรับความสูงของคอนเซอรจนเห็นปลายดินสอชัดเจน 1.10 ปรับความกวางของชองแสงของคอนเดนเซอร ใหเทากบัความกวางของรูรับแสงของเลนสใกลวัตถุ โดยถอดกระบอกเลนสใกลตาออก มองไปที่ระนาบรวมแสงหลังเลนสใกลวัตถุ คอย ๆ เปดชองแสงของคอนเดนเซอร หยุดเปดเมื่อชองแสงเทากับรูรับแสงของเลนสใกลวัตถุ แตในทางปฏิบัตินิยมใหชองแสงของคอนเดนเซอรแคบกวาเล็กนอย(8 ใน 10 สวน) เพื่อเพิม่ความเปรียบตางของภาพ ในขณะที่เสยีรายละเอียดของภาพไปเล็กนอย หลังจากนัน้ใสกระบอกเลนสใกลตาเขาที่เดิม 1.11 ปรับความสวางของหลอดไฟ โดยการปรับโวลตของกระแสไฟฟา ความกวางของชองแสงของหลอดไฟ หรือใช neutral density filter เพื่อใหภาพมีความสวางพอดี และมคีวามเปรียบตาง

เครื่องมือวิทยาศาสตร

77

ที่เหมาะสม เมื่อถึงขั้นตอนนี้กลองจุลทรรศนอยูในสภาพพรอมใชงานดวยเลนสใกลวัตถุกําลังขยาย 10 เทา 1.12 ในกรณทีี่ใชเลนสใกลวัตถุที่มีกําลังขยายมากขึ้น(40 x หรือ 100 x) ตองปรับขนาดของชองแสงของคอนเดนเซอรและความสวางของหลอดไฟใหม(ขอ 1.10 และ ขอ 1.11) สวนการปรับความชัดของภาพกระทําไดโดยการหมุนปุมปรับความชัดละเอียด 2. กลองจุลทรรศนพื้นหลังมืด มีขอควรระวังในการใชหลายประการคือ สไลดที่ใชตองสะอาดและไมมรีอยกระเทาะ ไมควรใหมฟีองอากาศอยูระหวางวัตถุกับคอนเดนเซอร หรือระหวางวัตถุกับเลนสใกลวัตถุ เพราะสิ่งเหลานี้จะทําใหแสงเดินทางผิดทิศทาง ทําใหความเปรยีบตางของภาพลดลง นอกจากนี้ไมควรใชสไลดทีม่ีความหนามากกวา 1 มม. เพราะระยะใชงานของคอนเดนเซอรส้ันมาก

2.1 การใชคอนเดนเซอรพื้นหลังดํามีวิธีดังนี้ 2.1.1 ถอดคอนเดนเซอรอันเดิมออก ใสคอนเดนเซอรพื้นหลังดําแทน 2.1.2 เล่ือนคอนเดนเซอรขึ้นจนอยูในระดับเกือบเทาผิวบนของแทนวาง 2.1.3 วางสไลดบนแทนวาง 2.1.4 เปดไฟ ปรับภาพวัตถุใหชัดดวยเลนสใกลวัตถุกําลังขยาย 10 เทา (อาจมองเห็น

วงแหวนแสงเล็ก ๆ ) 2.1.5 เล่ือนคอนเดนเซอรขึ้นลงจนมองเห็นวงแหวนแสงเล็กลงกลายเปนจุด 2.1.6 เมื่อใชเลนสใกลวัตถุกําลังขยาย 40 เทา หรือ 100 เทา ตองปรับความชัด และ

คอนเดนเซอรเล็กนอย 2.2 การใชแผนบังแสง(stop patch) สามารถทําใหกลองจุลทรรศนพื้นหลังสวางกลายเปนกลองจุลทรรศนพื้นหลังมืดได โดยใชแผนบังแสงเพยีงแผนเดยีว แตใชไดผลดีเฉพาะเมื่อใชเลนสใกลวัตถุที่มีกําลังขยายไมเกนิ 40 เทา สวนวิธีการทํามีดังนี้ 2.2.1 วดัขนาดชองรับแสงของเลนสใกลวัตถุที่มกีําลังขยาย 10 เทา หรือ 40 เทา โดยการถอดกระบอกเลนสใกลตาออกจะมองเห็นรูรับแสงทีร่ะนาบรวมแสงหลังเลนสใกลวัตถุ 2.2.2 ตัดกระดาษ พลาสติก หรือแผนตะกั่วทีแ่สงไมทะลุผานเปนวงกลมใหมีขนาดใหญกวาชองรับแสงของเลนสใกลวัตถุเล็กนอย(ประมาณ 10%) ถามีขนาดใหญเกิน จะทําใหแสงตกกระทบวัตถุนอยลง ภาพจะไมสวาง(อาการเหมือนหลอดไฟไมสวาง) ถามีขนาดเล็กเกินไปความเปรียบตางจะลดลง เพราะพื้นหลังสวางมากขึ้น

2.2.3 ปรับจุดรวมแสงของไสหลอดไฟ และปรับตําแหนงใหอยูกึ่งกลางจอภาพ 2.2.4 เล่ือนคอนเดนเซอรขึ้นเกือบสูงสุด 2.2.5 วางสไลดตัวอยางบนแทนวาง 2.2.6 ปรับภาพของวัตถุใหชัดดวยเลนสใกลวัตถุกําลังขยาย 10 เทา ควรหร่ีชองแสง

กลองจุลทรรศน

78

ของคอนเดนเซอรขณะปรับ 2.2.7 เปดชองแสงของคอนเดนเซอรใหกวางที่สุด 2.2.8 ใสตัวกรองใส(clear filter) ที่มีแผนบังแสงติดอยูตรงกลางแทนตัวกรองแสง

สีน้ําเงิน(blue filter) ซ่ึงมักจะติดมากับกลองเปนอุปกรณมาตรฐาน จะมองเห็นวตัถุสวางบนพื้นหลังที่ที่มืด การปรับแบบเดียวกนันี้ใชกับเลนสใกลวัตถุที่มกีําลังขยายสูงกวา(40 เทา) ดวย 3. กลองจุลทรรศนเฟสคอนทราสท มีวิธีการใชดังนี้

3.1 วางสไลดตัวอยางบนแทนวาง เลือกขนาดของเลนสใกลวัตถุ 3.2 ปรับภาพใหชัด และปรับจดุรวมแสงของคอนเดนเซอร เหมือนวิธีการปรับในกลอง

จุลทรรศนพื้นหลังสวาง 3.3 ถอดกระบอกเลนสใกลตาออก ใสเทเลสโคป(telescope) แทน

3.4 ปรับจุดรวมแสงของเทเลสโคป จนมองเห็นวงแหวนมดื(dark ring) ของแผนเปลี่ยนเฟสซึ่งอยูในกระบอกเลนสใกลวัตถุ

3.5 เลือกขนาดของวงแหวนสวาง (เลือก annular stop ที่คอนเดนเซอร) ใหมีขนาดเทากับวง แหวนมืด

3.6 ปรับสกรู(centring screw) ที่คอนเดนเซอร ใหวงแหวนสวางซอนทับวงแหวนมืดพอด ี3.7 ถอดเทเลสโคปออก ใสกระบอกเลนสใกลตาแทน กลองจะอยูในสภาพพรอมใชงาน

อาจปรับความชัดและจดุรวมแสงของคอนเดนเซอรเพียงเล็กนอย เพือ่ใหภาพมีความเปรียบตางมากที่สุด

4. กลองจุลทรรศนฟลูออเรสเซนซ มีวิธีการใชดังนี้ 4.1 ตั้งกลองในทีม่ีแสงสวางนอย เพื่อปองกนัแสงจากภายนอกรบกวนสายตา เพราะ

แสงฟลูออเรสเซนซมีความเขมนอย ถาไมมีที่มืดอาจใชฉากบังตา(eye screen) แทน 4.2 ในกรณีที่ใชหลอดฮาโลเจน ควรปรับตําแหนงของหลอดไฟเพื่อใหไดความสวางมากที่สุด 4.3 ในกรณีใชหลอดเมอคิวรีซ่ึงมีแสงสวางมาก ควรใชตัวกรองความรอน และไมจําเปนตองใสน้ํามันระหวางคอนเดนเซอรกับสไลด นอกจากนีก้ารควบคุมความสวางตองใช neutral density filter 4.4 ใสคอนเซอรชนิดพื้นหลังดํา ใสพาราฟนหรือน้ํามัน ระหวางสไลดกับผิวคอนเดนเซอร ดานบน 4.5 ปรับจุดรวมแสงและตําแหนงของคอนเดนเซอร ตามวิธีการที่กลาวไวในการปรับกลองจุลทรรศนพื้นหลังมืด 4.6 ใสตัวกรองแสงที่มองเห็นได(exiter filter, primary filter หรือ blue filter) ระหวางหลอดไฟและคอนเดนเซอร

เครื่องมือวิทยาศาสตร

79

4.7 ใสตัวกรองแสงอัลตราไวโอเลต(barrier filter หรือ secondary filter) ระหวางเลนสใกลวัตถุกับเลนสใกลตา

4.8 เพิ่มความเขมของแสงสวางจากหลอดไฟใหมากที่สุด 4.9 วางสไลดตัวอยางบนแทนวาง ปรับความชัดของภาพ ในกรณีที่ตองการหาตําแหนง

ของวัตถุอาจถอดตัวกรองแสงที่มองเห็นไดออกแลว หาตําแหนงและปรับความชัดเชนเดียวกับกลองจุลทรรศนพื้นหลังสวาง เมื่อไดตําแหนงที่ตองการดูจึงใสตัวกรองแสงที่ถอดออก แลวจงึดูการเปลงแสงของวัตถุตอไป

การวัดขนาดของวัตถุจากกลองจลุทรรศน มีงานหลายชนดิที่ตองการทราบขนาดของวตัถุที่มองเห็นในกลองจุลทรรศน ตัวอยางเชน การวัดขนาดของไขพยาธิ ตวัพยาธิ แบคทีเรีย เชื้อรา ฯลฯ. การวดัอาศัยการเปรยีบเทียบกับสเกล (micrometer) โดยการเปรียบเทียบกับความยาวมาตรฐานที่ปรากฏอยูบนสไลด(stage graticule) งานทางปาราสิตวิทยานิยมปรับความถูกตองของสเกลเมื่อใชเลนสใกลวัตถุกําลังขยาย 40 เทา สวนงานทางโลหิตวิทยานิยมปรับความถูกตองของสเกลเมื่อใชเลนสใกลวัตถุทีม่ีกําลังขยาย 100 เทา ขั้นตอนการปรับความถูกตองของสเกลมีดังนี้ 1. ใสแผนสเกลลงในกระบอกเลนสใกลตาชนิดฮุยเจนเนียน หรือตดิตั้งใตเลนสอันลางของกระบอกเลนสใกลตาชนิดเคลลเนอ หรือแรมสเดนที่มีกําลังขยาย 10 เทา โดยหนัดานที่เปนรองลงสูดานหลัง (แผนสเกลแบงออกเปน 50 ชองเล็ก ๆ ที่มีขนาดเทากัน) 2. วางสไลดที่มีความยาวมาตรฐานปรากฏอยูบนแทนวาง (ความยาวของสเกลทั้งหมด 2 มม. และแบงออกเปนชองเล็ก ๆ ชองละ 10 ไมครอน) 3. ปรับกลองจนมองเหน็สเกลบนสไลดชัดเจน สวนสเกลของเลนสใกลตาอาจปรับใหชัดโดยการเลื่อนกระบอกเลนสใกลตาออกเลก็นอย

4. เล่ือนขีด 0 ของสเกลทั้งสองใหตรงกนัพอดี 5. ตรวจดูขีดของสเกลของเลนสใกลตาที่ซอนทับกับขีดของสเกลบนสไลดพอดี สมมตุิวา

ขีดที่ 20 ของสเกลของเลนสใกลตาซอนทับกับขีดที่ 50 ของสเกลบนสไลดพอดี ดังนั้น 1 ชองของสเกลของเลนสใกลตาจึงเทากับกับความยาว 25 ไมครอน

ขอควรปฏิบัติในการใชกลองจุลทรรศน 1. ใชสไลดและกระจกปดสไลดที่สะอาดและมีความหนาตามความหนามาตรฐาน 2. ไมควรใชน้ํามนัที่มี polychlorinated biphenyls (PCB) หรือสารเคมีที่เปนพิษอื่น ๆ ผสม

อยู 3. ไมควรใชน้ํามนัแร (mineral oil) หรือน้ํามันไมซีดา (ceda wood oil) เพราะมีความหนืด

ต่ําอาจซึมเขาสูภายในกระบอกเลนสใกลวตัถุไดงาย

กลองจุลทรรศน

80

4. เลนสใกลวัตถุที่จําเปนตองใชน้ํามัน ไมควรใสน้ํามันมากเกิน 1 หยด เพราะจะทําใหวัตถุ จะเลื่อนไหลและปรับโฟกัสยาก

5. ปรับความกวางของชองแสงของคอนเดนเซอรใหเทากับรูรับแสงของเลนสใกลวัตถุที่ใช เสมอ

6. ถามีแสงสะทอนไปมาระหวางกระจกปดสไลดกับเลนส หรือระหวางกระจกปดสไลด กับสไลดมาก(mounting glare) ควรปดชองแสงของดอนเดนเซอรใหแคบลงอีก เพื่อลดแสงรบกวนซึ่งจะทําใหภาพทีม่องเห็นจะมีความเปรียบตางเพิ่มขึ้นแตรายละเอียดของภาพลดลง 7. หลังจากใชงานเสร็จควรลดความสวางของหลอดไฟใหนอยที่สุด ลดระดับแทนวางใหต่ําสุด เอาสไลดออกจากแทนวาง ทําความสะอาดแทนวางและเลนสใกลวัตถุ คลุมกลองดวยถุงคลุม แตถากลองเปยก หรืออากาศมีความชื้นมาก ยังไมควรคลุมกลองจุลทรรศน เพราะอาจเกิดการกลัน่ตัวของไอน้ําในถงุคลุมไดงาย 8. หลังจากใชงานประจําวัน ถาไมเก็บในถุงคลุม อาจเก็บในตูเก็บกลองซึ่งปดสนิทโดยมีซิลิกาเจล(silica gel) สําหรับดูดความชื้นอยูภายใน ซ่ึงซิลิกาเจลที่แหงจะมสีีฟา สวนซิลิกาเจลที่ดูดน้ําเขาไปจะมีสีชมพู ตองนําไปอบไลน้ําออกที่ 100 0ซ. นาน 24 ช่ัวโมง 9. การเก็บกลองจุลทรรศนไวเปนเวลานาน ๆ ถาใชตูปดสนิทตองใชซิลิกาเจลจํานวนมาก วิธีที่ดีที่สุดคือ สรางตูเก็บดวยวัสดุทนไฟ ภายในมหีลอดไฟฟาเพื่อสรางความรอนในตูเก็บใหอยูในชวง 40-50 องศาเซลเซียส ที่ประตูตูมชีองหมุนเวียนอาการที่ปลอยใหอากาศเย็นภายนอกไหลเขาสวนอากาศรอนภายในไหลออกดานบนตวัตู เพราะการหมุนเวยีนของอากาศชวยปองกันการกลัน่ตัวของไอน้ํา และที่ชองหมุนเวยีนอาการควรติดตั้งตะแกรงกรองฝุนละอองดวย

การบํารุงรักษากลองจลุทรรศน กลองจุลทรรศนเปนเครื่องมอืที่ไมตองการการบํารุงรักษาบอยนัก ถามีการใชและเก็บกลองอยางถูกวิธี หลีกเลี่ยงการโดนฝุน ความชืน้และไอสารเคมี การบํารุงรักษาสวนใหญจึงเปนเรื่องของการทําความสะอาดและการหลอล่ืนกลไกตาง ๆ 1. การหลอล่ืนกลไกที่มกีารเคลื่อนไหว เชน ฟนเฟองของปุมปรับความชัดละเอยีด ปุมปรับความชัดหยาบ ปุมเลื่อนแทนวาง ฯลฯ. ถาไขหลอล่ืน(paraffin wax หรือ candle grease) สกปรกหรอืแหงจะทําใหเกิดความฝดและการเคลื่อนทีไ่มตอเนื่องราบเรียบ ควรใชไซลีน(xylene) เช็ดเอาไขหลอล่ืนเกาออก แลวจึงทาไขหลอล่ืนใหม ไมควรใชน้ํามนัเพราะมีความใสเกินไป

สวนกลไกที่ควบคุมการเคลื่อนที่ของแผนไดอะแฟรม ควรใชน้ํามันชนิดใส แตตองระวังไมใหเปยกแผนไดอะแฟรม เพราะแผนไดอะแฟรมจะตดิกันทําใหเคลือ่นที่ไมสะดวก 2. การทําความสะอาดแทนวางและตวักลอง ถาเปอนน้ํามันควรใชผาชบุแอลกอฮอลเชด็ แตถาเปอนฝุนควรใชผาสะอาดชุบน้ําเล็กนอยเช็ด

เครื่องมือวิทยาศาสตร

81

3. การทําความสะอาดเลนส เปนสิ่งที่สําคัญมากเพราะสิ่งสกปรกและไขมันบนผวิเลนสเปนอาหารที่ทําใหสปอรของเชื้อราที่ปลิวมาตกบนผิวเลนสเจริญเติบโต ซ่ึงการเจริญเติบโตของเชื้อรามีการปลอยกรดออกมาทําลายผิวเลนส ถึงแมวาผูผลิตบางรายจะเคลือบยาฆาเชื้อราไวที่ผิวเลนสแลวก็ตาม ยังไมสามารถแกปญหาดังกลาวไดโดยส้ินเชิง การทําความสะอาดเลนสทั่ว ๆ ไป ทําไดหลายวิธีคือ

3.1 ใชแปรงขนออนปดฝุน และใชลูกยางชวยเปาไลฝุนออก 3.2 ใชกระดาษเชด็เลนสชุบน้ํากลั่นเช็ดฝุนและรอยเปอนอืน่ ๆที่ไมไดเกดิจากไขมนัออก 3.3 ใชโฟมชนิดออนที่สะอาดเชด็ไขหลอล่ืนออกจากผิวเลนส 3.4 ใชกระดาษเชด็เลนสชุบสารละลาย absolute ethanol / ether = 3/7 โดยปริมาตร เช็ด

น้ํามันออกจากเลนส 4. การทําความสะอาดเลนสใกลตา ส่ิงสกปรกที่เลนสใกลตาสังเกตไดจากการมองเหน็สิ่ง

สกปรกเคลื่อนที่ตามการหมุนของกระบอกเลนสใกลตา ควรใชกระดาษเชด็เลนสชุบน้ํายาทําความสะอาดเช็ดเลนส แลวใหกระดาษเชด็เลนสอีกแผนหนึ่งเช็ดใหแหง

แตถาเลนสอันลางสกปรกตองถอดกระบอกเลนสใกลตาออกมา แลวจึงทําความสะอาดตามวิธีการเดยีวกนั ขณะถอดกระบอกเลนสใกลตาออกควรใชกระดาษเชด็เลนสปดชองใสกระบอกเลนสใกลตาไว เพือ่กันสิ่งสกปรกตกลงไปภายในกลอง นอกจากนี้ควรระมัดระวังการใสกระบอกเลนสใกลตาเขาที่ชองใสอันเดิมหลังจากทําความสะอาดเสร็จ

5. การทําความสะอาดเลนสใกลวัตถุ เลนสใกลวัตถุสวนใหญจะเปอนตวัอยางที่นํามาสอง ด ู เปอนรอยนิ้วมือ และตวักลางที่เปนน้าํมัน ควรเช็ดออกดวยไซลีน หรือ absolute ethanol/ether โดยไมจําเปนตองถอดกระบอกเลนสใกลวัตถุออกจากจานยึด แตเนือ่งจาก ไซลีน อีเธอร และแอลกอฮอล เปนอันตรายตอสุขภาพจึงควรใชแตเพยีงเลก็นอย

6. การทําความสะอาดคอนเดนเซอร ถาเลนสของคอนเดนเซอรสกปรกใหทําความสะอาด ตามวิธีการทําความสะอาดเลนสดังกลาวแลวขางตน 7. การทําความสะอาดหลอดไฟ ควรใชแปรงขนออนปดฝุนออกจากกระเปาะหลอดไฟ แตถาสกปรกมากอาจใชผาสะอาดชุบน้ํากลั่นเช็ด แตไมควรทําความสะอาดขณะทีห่ลอดไฟรอน เพราะไสหลอดจะขาดงาย

การเลือก ในปจจุบนัเทคโนโลยีการผลิตและการควบคุมคุณภาพในการผลิตของผูผลิตสวนใหญมีมาตรฐานสูง ทําใหกลองจลุทรรศนมีคุณภาพและมาตรฐานที่ไมแตกตางกันมากนัก ดังนั้นราคาของกลองจุลทรรศนและอุปกรณประกอบตาง ๆ ตลอดจนชื่อเสียงของผูผลิตจึงมีสวนสําคัญในการเลือกใชกลองจุลทรรศนคอนขางมาก

กลองจุลทรรศน

82

แตอยางไรก็ตามผูใชอาจพิจารณาเลือกกลองจุลทรรศนตามความเหมาะสม โดยพิจารณาถึงคุณสมบัติ และปจจยัตาง ๆ ดังนี้ 1. ประสิทธิภาพของระบบแสง ตัวอยางเชน ความเขมของแสง ความละเอียดในการควบคุมความสวาง สามารถใชตัวกรองแสงความยาวคลื่นตาง ๆ ได 2. ประสิทธิภาพของระบบเกิดภาพ ตวัอยางเชน กําลังขยายรวม รายละเอียดของภาพ (อาจทดสอบโดยดภูาพโครงสรางภายในของไดอะตอม) ความเปรียบตางของภาพ ความลึกของระยะชัด และความเพี้ยนของภาพ เปนตน 3. ประสิทธิภาพของระบบกล ตัวอยางเชน ควรมคีวามฝดพอดี มีความละเอยีดของการเคลื่อนที่สูง ตองการการบํารุงรักษานอย 4. สามารถติดตั้งอุปกรณพเิศษตาง ๆ เพื่อเพิ่มประสิทธิภาพของกลองจุลทรรศนทั้งในปจจุบัน และในอนาคต ตวัอยางเชน อุปกรณถายภาพ คอนเดนเซอรชนิดพิเศษ เลนสใกลวัตถุคุณภาพสูงชนดิอื่น ๆ ตัวกรองแสง ฯลฯ. 5. ความสามารถในการใหบริการ ซอมแซมและบํารุงรักษา ของผูผลิตหรือผูจําหนาย

ปญหาและสาเหตุ ปกติถาใชและปรับกลองอยางถูกวิธีจะมองเห็นภาพที่ชัดเจน และมีรายละเอียดดีเสมอ แตถาคุณภาพของภาพไมดีอาจเกดิจากเทคนิคการใชกลองไมถูกตอง กลองมีความผิดปกติ หรือสกปรก ซ่ึงตองตรวจหาสาเหตุเพื่อการแกไขตอไปดังตารางที่ 3.3 ตารางที่ 3.3 ปญหาและสาเหตุของความผิดปกติของกลองจุลทรรศน

ปญหา

สาเหตุ

มองเห็นภาพชดัเจนไมพรอมกันทั้งสองตา - ระยะหางของกระบอกเลนสใกลตาไมถูกตอง - ความยาวของกระบอกเลนสใกลตาไมเทากัน

จอภาพไมเต็มหรือเปนรูปไข - จานยึดเลนสใกลวัตถุหมนุไมเขาที่พอด ีจอภาพสกปรก - เลนสใกลตาสกปรก

- เลนสใกลวตัถุสกปรก - เลนสของคอนเดนเซอรสกปรก

จอภาพมดืหรือสวางนอย - ไมไดเปดชองแสงของคอนเดนเซอร - คอนเดนเซอรอยูต่ําเกินไป - ชองแสงของหลอดไฟเล็กเกินไป

ภาพชัดเฉพาะตรงกลางหรือตรงขอบจอภาพ - เกิดจากระนาบมีความสูง

เครื่องมือวิทยาศาสตร

83

(ควรใชเลนสใกลวัตถุชนดิแฟลทฟลด) มีสีรอบ ๆ วัตถุโดยเฉพาะสวนที่อยูใกล ๆ ขอบภาพ

- เกิดจากความเพี้ยนแบบโครมาติก (ควรแกโดยใชเลนสใกลวัตถุคุณภาพสูงขึน้)

ตารางที่ 3.3 ปญหาและสาเหตุของความผิดปกติของกลองจุลทรรศน(ตอ)

ปญหา

สาเหตุ

ภาพขาดรายละเอียด (poor resolution) - เลนสอันลางหรืออันบนของเลนสใกลวตัถุสกปรก - เลนสใกลวตัถุมีรูรับแสงแคบ - มีฟองอากาศหรือส่ิงสกปรกในตวักลางที่เปนน้ํามัน - ใชกระจกปดสไลดที่หนาเกิน - วางสไลดตวัอยางกลับดาน - เลนสใกลตามีกําลังขยายสงูหรือต่ําเกินไป

ภาพไมคมชัด - วางสไลดตวัอยางกลับดาน - ตัวอยางหนาเกินไป -ใชน้ํามันกับเลนสใกลวัตถุกําลังขยาย 40 เทา -ไมใชตวักลางที่เปนน้ํามันเมื่อใชเลนสใกลวัตถุที่มี กําลังขยาย 100 เทา -มีตัวกลางที่เปนน้ํามันน้ํามนัแหงตดิเลนสใกลวัตถุ

ความชัดของภาพเปลี่ยนแปลง - กลไกในการปรับความชัดเสีย หรือล่ืนมากเกินไป - ของเหลวใตกระจกปดสไลด (mountant liquid) มีการไหลไปมา

ความเปรียบตางของภาพนอย (low contrast)

- ตัวอยางใส - หลอดไฟสวางเกินไป - ชองแสงของคอนเดนเซอรใหญเกิน - ใชตัวกรองไมถูกตอง ในกรณีที่ตัวอยางมสีี - ผิวเลนสสกปรก - ของเหลวใตกระจกปดสไลด มีดรรชนีหักเหใกล เคียงกับตวัอยาง

ความเปรียบตางของภาพมากเกินไป (high contrast)

- ชองแสงของคอนเดนเซอรแคบเกินไป - คอนเดนเซอรอยูต่ําเกินไป

กลองจุลทรรศน

84

ความสวางของภาพเปลี่ยนแปลงเสมอ - หลอดไฟเสื่อมสภาพ - ขั้วตอหลอดไฟไมแนน - โวลตของกระแสไฟฟาไมคงที่

กลองจุลทรรศนเปนเครื่องมอืท่ีบอบบาง มีความไวตอความสั่นสะเทือนและสิ่งสกปรกตาง ๆ

มาก ผูจึงจงึควรใหการทนุถนอม และบํารุงรักษาอยางสม่ําเสมอตลอดเวลา การเรียนรูถึงโครงสราง

การทํางาน การใชงาน และการบํารุงรกัษากลองจุลทรรศน จะเปนแนวทางที่ทําใหเกิดการใชและ

บํารุงรักษากลองจุลทรรศนอยางถูกวิธี เพื่อใหเคร่ืองมือท่ีมีราคาแพงชิ้นนี้มีอายุการใชงานที่ยาวนาน

และสามารถแสดงประสิทธิภาพในการเกิดภาพไดสงูท่ีสุดตามที่กลองแตละชนิดมอียู

บรรณานุกรม

1. Addison LA, Fisher PM. The office laboratory. 2nd ed. Nor Walk : Appleton & Long, 1990.

2. Brenner M. Selecting a microscope. Inter lab 1984;4:25-37. 3. Buckley T, Keats NG, Roberts J, Wolfenden J, Woolsey GA. Instrument maintenance

and operation for laboratory assistants. Canberra : International Development Program of Australian Universities and Colleges Limited, 1985.

4. Cheesbrough M. Medical laboratory manual for tropical countries. 2nd ed. Butterworth : Tropical Health Technology, 1987.

5. Dunegan MP. Back in the lab. Telecommunications 2000;34:130-4. 6. Karet G. Is a confocal microscope right for you? R&D 2000;42:22-6. 7. King M. A medical laboratory for developing countries. Delhi : Oxford University Press,

1973. 8. Kunath-Fandrel G, Jena CZ. Collect 3D image without sample preparation R&D

1999;41:39. 9. Meyer-Arendt J. Introduction to classical and modern optics. 2nd ed. New Jersey :

Prentice-Hall Inc, 1984.

เครื่องมือวิทยาศาสตร

85

10. Spencer M. Fundamentals of light microscopy. Cambridge : Cambridge University Press, 1982.