1

รศ.ดร. สมศกัดิ์ อภสิทิธิวาณชิภาควิชาพันธุศาสตร คณะวิทยาศาสตร

มหาวิทยาลัยเกษตรศาสตร

วิชาพันธุศาสตรของเซลล (Cytogenetics)416541

2

การหาตําแหนงยีนโดยวธิีทั่วไป (Conventional Mapping)

GENE LINKAGE&

CHROMOSOME MAPPING

Linkage : จํานวนยนี 2 ยีน หรือ กลุมของยีนที่อยูบนโครโมโซมเดียวกัน หรือ เชื่อมอยูดวยกันบนสวนของโครโมโซมเดียวกัน ( linked genes )

ปกติยีนที่อยูบนโครโมโซมตางแทงกันเมื่อมีการสรางเซลลสืบพันธุจะดําเนินตามกฎเมนเดลขอที่ 2

4

ตัวอยางเชน

AaBb X aabbAB Ab aB ab ab

F1 ¼ AaBb ¼ Aabb ¼ aaBb ¼ aabb

5

ถา 2 ยีนอยูติดกันบนโครโมโซมเดียวกัน และไมแยกจากกัน เมื่อมีการสรางเซลลสืบพันธุ

AaBb aabbX

(AB / ab) (ab / ab)

(AB) (ab) (ab)

½ AB / ab ½ ab / ab

(AaBb) aabb

6

อยางไรก็ตาม linked gene สามารถแยกจากกันและแลกเปลี่ยนระหวาง homologous ดวยกระบวนการ crossing over

A B PT

A B A B A b RT

a B RT

a b PT

ไมโอซ ิส I ไมโอซ ิส II

Pachytene Recombinant type

a bb a b

7

% recombinaton = จํานวนของ Recombinant type x 100

จํานวนทั้งหมด

จํานวนทั้งหมด : จํานวน parental types (PT) + recombinant types (RT)

% crossing over = 2 ( % recombination )

ดังนั้น % recombination มีคาสูงสุดเทากับ 50 % x-over = 100

ถา % recombination > 50 หมายความวา ยีน 2 ยีน ที่ทําการทดสอบนั้นไม linked กัน หรืออยูบนโครโมโซมตางกัน

8

ตัวอยางเชน ถาเกิด cross-over ระหวางตําแหนงของยีน A และ Bของยีโนไทป AB/ ab เทากับ 30 %

ดังนั้นเซลลสืบพันธุ RT คือ Ab และ aB เกิดขึ้น 15 %( Ab = aB = 7.5 % )

PT คือ AB และ ab เกิดขึ้น 85 %( AB = ab = 42.5 % )

9

ตัวอยาง ในกรณีทํา testcross ระหวาง Ab/ aB กับ ab/ ab

เกิดลูก Ab/ab 40 % aB/ab 40% AB/ab 10%

และ ab/ab 10 %

ยีโนไทป RT คือ AB/ab และ ab/ab = 10+10 = 20 %

% x-over = 2(20%) = 40%

10

แผนที่ยีนการทําแผนที่ยีนอาศัยหลัก 2 ขอ คือ

1. ตําแหนงของยีนบนโครโมโซมเรียงกันเปนเสนตรงในชวงความยาว หนึ่ง

2. ตําแหนงของยีนหาไดจากระยะทางของยีนขางเคียงทั้ง 2 ขาง

ระยะทางของยีน 1 map unit ( centimorgan) = 1 % recombination

ตัวอยาง ถาระยะทางระหวางยีน X และ Y เทากับ 12 หนวย สิ่งมีชีวิตที่มียีโนไทป XY/ xy เมื่อสรางเซลลสืบพันธุควรมีการสรางเซลลสืบพันธุ RT (Xy และ xY) อยางละ 6 %

11

การทดสอบระยะทางระหวางยีน 2 ตําแหนง

โดยวิธี Two-point Testcross

ทําโดยหา % Recombination จากลูก RT ที่เกิดขึ้น

ตัวอยางเชน การผสมทดสอบ coupling phase genotype AC / ac

- เกิดลูกที่มีฟโนไทปเดนของยีนทั้งสองตําแหนง 37%

- ฟโนไทปดอยของยีนทั้ง 2 ตําแหนง 37%

- ฟโนไทปเดนที่ตําแหนง A แตดอยที่ C 13% และ

- ฟโนไทปที่ดอยที่ตําแหนง A แตเดนที่ตําแหนง C 13%

12

A C a c

x

a c a c

เซลลสืบพันธุ RT ไดแก Ac และ aC

RT genotypes คือ Ac / ac และ aC / ac

ซึ่งมีจํานวนเทากับ 13% + 13% = 26 % = % Recombination

ดังนั้นระยะทางระหวาง A-C = 26 หนวย ( map unit )

13

การทดสอบระยะทางระหวางยีน 2 ตําแหนง

โดยใช Three-point Testcross

ปกติการหาระยะทางระหวางยีนทําโดยการตรวจดูลูกที่เกิดจาก single crossing-over เทานั้น

แตถายีนทั้ง 2 อยูหางกันจนสามารถเกิด double crossover ลูกที่เกิดจาก double x-over จะมีฟโนไทป เชน เดียวกับ

parental type ซึ่งไมสามารถจําแนกได

จึงตองมี marker gene อยูระหวางยีนทั้งสอง จึงเรียกวิธีนี้วา การทดสอบ 3 ตําแหนง ( ถายีน 2 ยีน อยูหางกันไมเกิน 5 หนวย จะไมเกิด double crossover )

14

ตัวอยางการทดสอบ trihybrid ABC / abc เกิดลูกดังนี้

A B C a b c

a b c a b c

36% ABC/abc 9% Abc/abc 4% ABc/abc 1% AbC/abc

36% abc/abc 9% aBC/abc 4% abC/abc 1% aBc/abc

72% PT 18% SCO(A-B) 8% SCO(B-C) 2% DCO

15

ระยะทางระหวางยีน = % SCO + % DCO

ระยะทาง A-B = %SCO(A-B)+% DCO = 18+2 = 20%

= 20 หนวยระยะทาง B-C = %SCO(B-C)+% DCO = 8+2 = 10%

= 10 หนวยระยะทาง A-C = ระยะทาง A-B + ระยะทาง B-C

= 20+10 = 30 หนวย

ในกรณีถาทําเพียง Two-point Testcross ระหวาง A-C ลูก DCO จะเหมือน PT

% Recombination = % SCO A-B+ % SCO B-C

= 18 + 8 = 26%

16

ลําดับของยีน ( Gene Order )การเรียงลําดับของยีนก็ใชหลักการวา ตําแหนงของยีนเรียงกันเปน

เสนตรงแลวหาโอกาสที่เปนไปได

ตัวอยางเชน ถาระยะทางระหวาง A-B = 12 หนวย B-C= 7 หนวย A-C = 5 หนวย

โอกาสที่ 1 ถาให A อยูกลาง ดังนั้น

B 12 A 5 C

7โอกาสที่ 2 ถาให B อยูกลาง ดังนั้นA 12 B 7 C

5โอกาสที่ 3 ถาให C อยูกลาง ดังนั้น

B 7 C 5 A12

จากทั้งโอกาส จะพบวาโอกาสที่ 3 เปนลําดับที่ถูกตอง

17

ลักษณะของ linked genes จาก Two- point Testcrossจากการผสมระหวางลูกผสม 2 ลักษณะกับตัวทดสอบ

( AaBb x aabb )

เกิดลูก Aabb 42 % aaBb 42 %

AaBb 8 % aabb 8 %

เซลลสืบพันธุที่ตัวทดสอบสรางคือ ab

ลูกที่เกิดขึ้นในปริมาณ หรือจํานวนมาก คือ PT

ลูกที่เกิดขึ้นในปริมาณ หรือจํานวนนอย คือ RT

เซลลสืบพันธุ RT ไดแก AB และ abเซลลสืบพันธุ PT ไดแก Ab และ aB

ลักษณะของ linked genes เปน repulsion phase มียีโนไทป Ab / aB

18

ลักษณะของ linked genes จาก Three-point Testcross

จากการผสม trihybrid กับตัวทดสอบ

( AaBbCc X abc / abc ) เกิดลูกดังนี้

Aabbcc 36% aabbCc 9% AabbCc 4% AaBbCc 1%

aaBbCc 36% AaBbcc 9% aaBbcc 4% aabbcc 1%

ลูกที่เกิดมากที่สุด เปน PT ไดแก Aabbcc และ aaBbCc

เซลลสืบพันธุ PT คือ Abc และ aBC

การพิจารณา ลําดับของยีน อาศัยลูก DCO เปนเกณฑแลวพิจารณา

19

โอกาสที่ 1 ถา B อยูกลาง

A b c

x abc/abc ลูก DCO คือ ABc / abc และ

a B C abC / abc

โอกาสที่ 2 ถา C อยูกลาง

A c b

x acb / acb ลูก DCO คือ ACb / acb และacB / acb

a C B

โอกาสที่ 3 ถา A อยูกลาง

b A c

x bac / bac ลูก DCO คือ bac / bac และ BAC/ bac

B a C

20

โอกาสที่ 3 ( A อยูกลาง ) เปนลําดับที่ถูกตองเนื่องจาก

SCO A-B - baC / bac BAc/ bac = aabbCc AaBbcc

SCO A-C –bAC / bac Bac / bac = AabbCc aaBbcc

เกิดลูก aabbCc และ AaBbcc ซึ่งเปนผลของ SCO ของ A-B และ

AabbCc และ aaBbcc ซึ่งเปนผลของ SCO ของ A-C

การหา linkage จาก F2

- Square root method

- Product ratio method

- Maximum likely-hood method

SQUARE ROOT METHOD

หาจากจํานวน หรือ เปอรเซ็นตของฟโนไทปที่เปน double recessive แลว หาความถี่

21

การหาตําแหนงยีนโดยใชเครื่องหมาย

โมเลกุล (biochemical & molecular markers) ใชหลักการ

เชนเดียวกับ Conventional mapping

22

การหาตําแหนงยีนโดยใช Trisomics

23

การหาตําแหนงยนีโดยใชไพรมารไีตรโซมิก

A

A

A

a

aX

P

gamete

A A

A

a

A

a

A

Aa

F1

ไพรมารีไตรโซมิกดิพลอยดไดโซมิก

A

Aa

A1

A2a

24

gamete

A1

A2a

ไพรมารีไตรโซมิก

X

A1

A2a

A1

A2

a A1

A2

a

มีเซลลสืบพันธุทัง้หมด 4 แบบ

25

เพศผู

เพศเมยี

n

2A 1a

n+1

2Aa 1AA

2Aa

n+1 1AA

4AAa Aaa

2AAA AAa

2A

n 1a

4AA Aa

2Aa aa

F2 2n+1 9A_ _

2n 8A_:1aa

รวม 17A_:1aa

Random chromosome segregation

26

Random chromatid segregation

AA AA AA Aa Aa

AA AA Aa Aa

AA Aa Aa

Aa Aa

aa

A1 A1 A2 A2 a a

A1

A1

A2

A2

a

a

การสรางเซลลสืบพนัธุ n+1 ของ F1 AAa จะได 6AA : 8Aa :1aa

และเซลลสืบพันธุ n ที่สรางขึ้นจงึเทากับ 10A : 5a

27

เพศผู

เพศเมยี

n

10A 5a

n+1

6AA 8Aa 1aa

6AA

n+1 8Aa

1aa

60AAA 30AAa

80AAa 40Aaa

10Aaa 5aaa

10A

n 5a

100AA 50Aa

50Aa 25aa

F2 2n+1 220A_ _ : 5aaa = 44A_ _: 1aaa

2n 200A_ : 25aa = 40A_ : 5aa

รวม 84A : 6a = 14 A : 1a

28

Maximum equational segregation

A1

A2

A3A4

a1a2

A1

A3

A2a1

A4a2

1

2

3

Meiosis I

A2a1A4a2

2

3

A1

A3A4a2

3

1

A1

A31

A2a1

2

29

เพศผู

เพศเมยี

n

8A 4a

n+1

5AA 6Aa 1aa

5AA

n+1 6Aa

1aa

40AAA 20AAa

48AAa 24Aaa

8Aaa 4aaa

8A

n 4a

64AA 32Aa

32Aa 16aa

F2 2n+1 140A_ _ : 4aaa = 35A_ _: 1aaa

2n 128A_ : 16aa = 32A_ : 4aa

รวม 67A : 5a

30

การหาตําแหนงยีนโดยใชเซคคันดารีไตรโซมิก

A

AAA

X

a

a

A

a

A

AAa

X

31

Current aspects of FISH technology

32

Current aspects of FISH technology

High resolution FISH• principles and technology

Applications

• chromosome maps, genomics, meiosis, phylogeny, chromatin structure

33

FISH technology

• introduction and concepts of multicolourhybridization

• technical limitations

• high-resolution FISH in plants

• chromosome painting in plants and mammals

34

Principle FISH• Labelling probe DNA (total genomic DNA, single

copy or repeat sequences) with biotin, FITC etc.

• Hybridization on chromosome preparation + blocking DNA to decrease background

• Amplification and detection steps; background staining of hybridized DNA

• Observe and capture images in the fluorescence microscope

35

Cartoon FISH

36

BAC signal on Anophelespolytene

37

m-FISH

38

Combinational FISH

39

Rational labelling

40

Protocol for chromosome painting

• Chromosome specific DNA librariesmicrodissection/flow sorting – DOP PCR

• FISH with blocking DNA (CISS): Chromosome in situ suppression with Cot100

• In mammals: ZOO-FISH

41

Chromosome libraries

42

example mFISH

43

Zoo-FISH reveals translocations

• Probes from chromosome-specific DNA libraries

• Hybridization on metaphase sets of related species

• Large-scale translocations during evolution

44

Example ZOO-FISH

45

Comparative Zoo-FISH in mammals

pig chromosomehu

man

chro

mos

o me

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

46

Chromosome painting for plants?

• Schubert, Fransz, Fuchs and de Jong (2001): no chromosome painting (CISS) in plants!

• Through repeat homogenization no chromosome specific paint by CISS (Heslop-Harrison et al.)

• Alternatively, “BAC-FISH painting” in plants is possible with pooled chromosomal DNA if:

DNA from small genome species (Arabidopsis)Painted to related genomes (Capsella, Arabis)

47

Alternative painting strategies

• genomic painting of alien chromosomes in addition lines (e.g., wheat x rye; potato x tomato)

• specific repeats sometimes paint whole chromosomes

• Painting chromosomes with BAC contigs; only species with small genomes; larger genomes require Cot100 blocking

48

Painting in plants

49

Alternative painting strategies

• genomic painting of alien chromosomes in addition lines (e.g., wheat x rye; potato x tomato)

• specific repeats sometimes paint whole chromosomes

• Painting chromosomes with BAC contigs; only species with small genomes; larger genomes require Cot100 blocking

50

Chromosome painting plants

51

Alternative painting strategies

• genomic painting of alien chromosomes in addition lines (e.g., wheat x rye; potato x tomato)

• specific repeats sometimes paint whole chromosomes

• Painting chromosomes with BAC contigs; only species with small genomes; larger genomes require Cot100 blocking

52

Chromosome painting plants

53

Targets for FISH

• metaphase complements

• interphase nuclei

• polytene / lamp-brush chromosomes

• meiotic prophase: pachytene complements

• extended DNA fibres / DNA combing

54

tomato pachytene

55

BAC FISH Medicago truncatula

Spatial resolution of adjacent signals far lower in heterochromatin than in euchromatin

56

Resolution FISH (tomato)

target kb (0.1 µm)

metaphase 4500-5000

interphase 2000-100

pachytene 1200-120

extended DNA ~1

57

Pachytene chromosomes

• 7-50 times longer than metaphase

• heterochromatin pattern

• chromosome identification

• appropriate especially in small genome and diploid species

58

FISH to extended DNA fibres

1µm ~ 3.4 – 2.9 kb

‘

‘

‘

59

Extended DNA technology• Isolation of interphase nuclei from leaf tissues

transfer small sample on slide

• breakdown of nuclear matrix in SDS-EDTA-TRIS buffer

• DNA fibres produced by tilting slide; fibresrelease from nuclei while drop is receding along slide

• DNA Combing: purified DNA on +coated slideespecially for YACs and BACs, bacterial DNA

60

• metaphasenumber of siteslow resolution

• Pachytene / interphaseonly plantshigher resolutionchromosome identificationheterochromatin / euchromatin

• extended DNA fibres / DNA combinghighest resolution and detectionno chromosome structuremolecular organization

FISH spational resolution

61

Detection limits

• on interphase / extended fibres ~ 1 kb

• rolling circle amplification: oligos and point mutations (Zhong et al. PNAS 2001)

• position of target within native chromosome determines success of probe hybridization!

62

RCA FISH

63

RCA-FISH reveals point mutations

DAPI

FITC

Cy3

Cy5

Com

MutationWild Type

Δ 508 G542X Wt M1101K Δ 508 G542X mu M1101K

Zhong et al. PNAS 2001

64

Detection limits

• on interphase / extended fibres ~ 1 kb

• rolling circle amplification: oligos and point mutations (Zhong et al. PNAS 2001)

• position of target within native chromosome determines success of probe hybridization!

65

Current aspects of FISH technology

High resolution FISH• principles and technology

Applications• chromosome maps, genomics, meiosis,

phylogeny, chromatin structure

66

FISH technology - 2

• Genome painting in F1 hybrids shows relations between species

• Physical mapping of plant genomes• Meiotic pairing and recombination

• Chromatin organization and DNA sequence data

67

Three FISH painting technologies

• Genome paintingdifferential FISH of parental genomes in an interspecific hyrid: species specific dispersed and tandem repeats

• Chromosome paintingFISH with DNA sequences from one chromosome. For plants: in development

• “Gene” paintingFISH with single copy and repeat sequences

68

examples of GISH

69

Repeats at telomeres in tomato

• Telomere repeat [TTTAGGG]n

• tomato specific subtelomere repeat TGR1

• pachytene complements: assign probes to chromo-some ends and intercalary FISH sites

• extended DNA fibres for establishing molecular organization

70

Idiogram tomato pachytene

71

example extended fibres in tomato

72

Exf in tomato

73

FISH to pachytene and ext. DNA

• telomere and subtelomere repeats assigned to specific sites (mostly distal ends)

• Chromosomes have unique telomeres, each with different telomere repeat and subtelomere repeat lengths

• Regulation of telomere length different from human!

74

Applications

• Genome painting in F1 hybrids shows relations between species

• Physical mapping of plant genomes• Meiotic pairing and recombination• Chromatin organization and DNA

sequence data

75

Genome maps

76

FISH of BACs containing Mipds0.0

32.1 tlcf-237.5MiAps-1,yv

39.540.6

ms-33d-2coams-16m-2vea

60.466.173.174.776.777.3

BAC355 kb

BAC160 kb

B, ogrv-3spc

gib-1

95.596.297.3

100.9

111.7

CEN

YAC

C

High-resolution FISH to extended DNA fibres and pachytene cells: at the border of heterochromatin and euchromatin on the short arm of chromosome 6 of tomato

77

Advanced FISH maps

• Pachytene for heterochromatin patterns: positioning in regions of suppressed meiotic recombination and rich in repeats

• FISH of different repeat classes: FISH bar coding

• FISH of single copy DNA with Cot100 blocking for eliminating backgroundBAC FISH

78

BAC FISH Medicago truncatula

Olga Kulikova et al., Plant J. 2001

79

BAC FISH Medicago truncatula

80

Applications

• Genome painting in F1 hybrids shows relations between species

• Physical mapping of plant genomes• Meiotic pairing and recombination• Chromatin organization and DNA

sequence data

81

Painting a weed…

82

• Small genome size

• Low chromosome number

• simple heterochromatin organization

• Saturated linkage map,BAC contigs and full DNA sequence

• Transformation system possible

Arabidopsis: cytogenetic model

83

Heterochromatin knob on 4S

84

Heterochromatin knob on 4S

• Small knob on chromosome arm 4S

• In Columbia and C24; not in Landsbergerecta and Wassileskija (WS)

• Paracentric inversion including part of pericentromeric heterochromatin

• Unique system to study heterochromatin

85

Paracentric inversion in 4S

F4C2F4C 21 F9H3E DF-F9 H3 Colmi 233LERF9H 3 T5L2

T5 L23

T5H2

T5 H22

T7M2

T7 M24

T25H

T2 5H8

T24M

T2 4M8 T24HT2 4H24 T27DT27D 20 T19BT1 9B17 T26NT2 6N6 F4H6

F4H 6

T19J

T1 9J18

T4B2

T4 B21

T1J1

T1 J1

T32N

T3 2N4

knob hk4S

pericentromeric

heterochromatin

pericentromeric

heterochromatin

telo Telo

kno bacces sionknob lessacces sion

knob hk4S

pericentromeric heterochromatin

pericentromeric heterochromatin

knobless accessionLandsberg etc.

telo Telo

F4C21F9H

3T5L23

T5H

22T7M

24T25H

8T24M

8T24H

24T27D

20T19B17

T26N6

F4H6

T19J18

T4B21

T1J1

T32N4

F4C21F9H

3

T5L23

T5H

22T7M

24T25H

8T24M

8T24H

24

T19B17

T26N6

F4H6

T19J18

T4B21

T1J1

T32N4

knob containing Columbia etc.

centromere telomere

T27D

20heterochr euchr

heterochr euchr

86

FISH map of chromosome arm 4S

centromere region knob hk4S

YACs

BACs

chromosome 4

pAL1 5S rDNA mi306 mi233 ga1

CIC6H11 CIC11H10 CIC7C3

C17L7 T1J1F21I2T32A17 F14G16 F9H3T26N26

CIC8B1

PHR 106B PHR PHR+106B+TR

87

Interphase chromosome model

• How are chromosome loops organized in interphase nuclei?

• How to trace individual chromosomes (BAC-FISH)

• What are the functions of chromocentres(pericentromere heterochromatin clusters)

88

Chromocenters: two repeat families

106B / 17A20

89

Organization of chromocentres

Immuno-labelling studies:C. DAPI with 5-Methyl cytosineD. DAPI / FISH of centromeric pAL1

with H4Ac5

n = nucleolus

90

Organization of chromocentres

• Two main pericentromere repeat families:pAL1 and F17A20 repeats

• Hypermethylated DNAHypo-acetylated histones

• Chromosomes in loops anchored at chromocentres

91

Loops anchor at chromocentres

4nor

k l

m n

cen 45S rDNA

45S rDNA

short arm 4Scen4

chromocentre

euchromatinloops

M

HH

HH

H

H

HH

H

HH

H

H

H

HH

H

MM M

M MM M

Fransz et al. 2002a - PNAS

92

Chromatin genomics

• Effect of chromatin genes on interphase and pachytene morphology

• Relation of chromatin morphology and cell type

• 3D reconstruction of root and shoot meristems of wild type and chromatin mutants

• Effect on gene expression

93

DDM1 has reduced chromocenters

Paul Fransz, Ingo Schubert 2001

94

Fas1 subunit of CAF-1

Ler fas1

Olga Kulikova unpublished, 2001

95

AcknowledgementsWU – Molecular Biology:

Paul Fransz*, Xiao-bo Zhong**, Pim Zabel, Ton Bisseling, Olga Kulikova

WU – Plant Breeding:Manikote S. Ramanna, Anja Kuipers***, Evert Jacobsen

WU – Genetics:Jannie Wennekes, Christa Heyting, Maarten Koornneef, Hans de Jong

*) University of Amsterdam **) Yale University ***) Plant Research International