วารสารชีวผลิตภัณฑ์ - DLDbiologic.dld.go.th/th/images/file/book/journal/doc... · 2014-11-14 · วารสารชีวผลิตภัณฑ์

วารสารชวผลตภณฑ

ปท 22 ฉบบท 2 กนยายน 2556

สารบญ

จากกองบรรณาธการ

6

พฒนาการผลตชดตรวจสอบโรคปากและเทาเปอยโดยวธอไลซา วไล ลนจงสบงกช กงกานต บญสยา สโย จฬานย นวมจตร ปยภรณ เจรญผล จรรยา สมานตย โสภา สงคลบตร รตนย ทองทา

7

เปรยบเทยบวธการลดอณหภมในการเกบรกษาเซลล BHK21C13ชนดแขวนลอย อนรกษ ตระการรงส สายพณ ขมทรพย

18

การท าไวรสโรคปากและเทาเปอยใหเขมขนโดยใชเครองกรองแบบเมมเบรน เสนใยกลวงชนดโพลซลโฟน อมรรตน สวสดสงห กงกานต บญสยา สโย

28

ความรและหลกการเบองตนดาน Bio-safety และ Bio- security หองปฏบตการ วไล ลนจงสบงกช

36

คอลมน “เขมในกองฟาง” - การท าเครองหมายหนไมซดวยวธงาย ๆ - หลอดกกหนไมซอยางงาย !!!

40 41 44

The Journal of Veterinary Biologics

Volume 22 No. 2 September 2013

Contents

The editorial

6

Development of production of foot and mouth disease ELISA reagent kit Wilai Linchongsubongkoch Kingkarn Boonsuya Seeyo Julanee Nuamchit Piyaporn Chareonphol Janya Samanit Sopha Singkleebut Rattanee Thongtha

7

Comparison of temperature reduction methods in the cryopreservation of BHK21C13 suspension cell Anurak Trakarnrungsee Saipin khumsub

18

Concentration of foot and mouth disease virus by hollow fiber ultrafiltration using polysulfone membrane Amornrat Sawatsing Kingkarn Boonsuya Seeyo

28

Knowledge and basic principle of laboratory biosafety and biosecurity Wilai Linchongsubongkoch

36

Column : “Needle in a haystack” - Simple method for mouse identification - Simple mouse restrainer

40 41 44

วารสารชวผลตภณฑ The Journal of Veterinary Biologics

http://biologic.dld.go.th/th/

วตถประสงค

1. เพอเผยแพรงานวชาการดานชวผลตภณฑ 2. เพอเผยแพรความรความเขาใจเกยวกบการใชชวผลตภณฑ 3. เพอสนบสนนการศกษา คนควา และการวจยทเกยวของกบชวผลตภณฑ 4. เพอเพมพนความร ความกาวหนาทางวชาการ

วารสารชวผลตภณฑ The Journal of Veterinary Biologics

ทปรกษาบรรณาธการ นเทศ เลศลมชลาลย Advisory board Niteth Lertlimchalalai

บรรณาธการ รชน อตถ Editor Ratchanee Atthi หวหนากองบรรณาธการ สหวชร องวนชบรรณ Editorial director Sahawatchara Ungvanijban กองบรรณาธการ วไล ลนจงสบงกช Editorial board Wilai Linchongsubongkoch จารณ สาตรา Jarunee Satra นพพร พฒนประสทธ Nopporn Patanaprasit กมลทพย

วรพร ธญพมล อ าเงน

Kamonthip Woraporn

Thunpimon Amngoen

ฝายจดการวารสาร สมเกยรต เลศวมลลกษณ Manager Somkiat Lerdwimonluk

ส านกงาน ส านกเทคโนโลยชวภณฑสตว กรมปศสตว

อ.ปากชอง จ.นครราชสมา 30130 โทรศพท 0-4431-1476 ตอ 123 โทรสาร. 0-4427-9794

Office: Bureau of Veterinary Biologics, Pakchong, Nakhonratchasima, Thailand 30130 Tel. 0-4431-1476 extension 123 Fax. 0-4427-9794

ก าหนดออก ปละ 2 ฉบบ เดอนมนาคม และกนยายน Publications: Twice a year in March and September

จดพมพโดย ส านกเทคโนโลยชวภณฑสตว กรมปศสตว อ.ปากชอง จ.นครราชสมา 30130

วารสารชวผลตภณฑ ปท 22 ฉบบท 2 กนยายน 2556 1 J. Vet. Biol. Vol. 22 No. 2 September 2013

ขอแนะน ำส ำหรบผเขยน

วารสารชวผลตภณฑ ก าหนดออกปละ 2 ฉบบ คอ เดอนมนาคมและกนยายน

1. เรองทจะน ำลง 1.1 ผลงานวจย (Research article) เปนการเสนอผลการวจยทผเขยนไดท าขนเอง มการก าหนด

ปญหาและวตถประสงคทชดเจน มการรวบรวมขอมล วเคราะห สรปและอภปรายผลการวจย อนน าไปสความกาวหนาทางวชาการ

1.2 บทความทางวชาการ (Technical article) เปนงานเขยนขนาดสน ซงมการก าหนดประเดนทชดเจนโดยผเขยนเรยบเรยงจากผลงานทางวชาการของตนเอง หรอของผอนในลกษณะทเปนการวเคราะห วจารณ หรอเสนอแนวความคดใหม ๆ จากพนฐานทางวชาการนนๆทรวบรวมขอมลความคดเหนและประสบการณ ของผเขยน

1.3 บทความปรทรรศน (Review article) คอบทความทรวบรวมผลงาน หรอแนวคดเรองใดเรองหนงโดยเฉพาะ ซงเคยลงตพมพมาแลว น ามาวเคราะห วจารณ เพอใหเกดความกระจางในเรองนนยงขน

1.4 เรองอน ๆทคณะบรรณาธการวารสารพจารณาเหนสมควร 2. กำรจดท ำตนฉบบ

2.1 ตนฉบบทจะเผยแพรในวารสารชวผลตภณฑตองไดรบการอนมตใหเผยแพรจากตนสงกด และตองไมเปนเรองทเคยเผยแพรหรออยระหวางการพจารณาเพอเผยแพรในสออน

2.2 การพมพผลงานทางวชาการ

2.2.1 ตวพมพ ใชตวอกษร Angsana New แบบปกต ขนาด 15 ชอหวขอใหญ เชน ชอเรอง บทคดยอ บทน ำ อปกรณและวธกำร ผล วจำรณ สรป กตตกรรมประกำศ และ เอกสำรอำงอง ใชตวอกษรแบบหนา (Bold) ขนาด 17 สวนหวขอยอย เชน ค ำส ำคญ ตำรำง รปภำพ เปนตน พมพโดยใชตวอกษรแบบหนา ขนาด 15

2.2.2 กระดำษทใชพมพ ใชกระดาษ A4 พมพหนาเดยว จ านวนไมเกน 10 หนา 2.2.3 กำรเวนทวำงขอบกระดำษ ดานบนท 6.5 ซม. และดานซายท 4.5 ซม. สวนดานขวาและ

ลางท 1.5 ซม. 2.2.4 กำรล ำดบหนำ ใชหมายเลข 1,2,3…... ทกงกลางหนา ดานบน และใชตวอกษรปกต

ขนาด 15


2.2.5 ตำรำง รปภำพ แผนภม กรำฟ จดพมพแยกหนาเฉพาะ และจดวางหลงเอกสารอางอง โดยมรายละเอยดดงน ตาราง ระบเลขทของตาราง (table number) ชอของตาราง (table title) หวตาราง

(table heading) และทมาของตาราง (ถาม) ใหท าเปนภาษาองกฤษหรอภาษาไทยทงตาราง พมพอยในหนาเดยวกนทงหมด ถาตารางมความยาวเกน 1 หนา ใหพมพสวนทเหลอในหนาถดไปโดยพมพเลขทตารางและตามดวยค าวา (ตอ) ค าบรรยายตารางใหเขยนไวดานบนของตาราง

รปภาพ แผนภม กราฟ ควรเปนภาพขาวด า และท าเชนเดยวกบตาราง แตค าบรรยายใหเขยนไวดานลาง

2.2.6 กำรพมพชอวทยำศำสตรของสงมชวต ชอวทยาศาสตรเปนไปตามการตงชอระบบทวนาม (Binomial nomenclature) พมพดวยตวเอน เชน Escherichia coli ในกรณไมระบชอสปชสหรอตองการกลาวถงหลายสปชส เชน Salmonella spp.

3. ตนฉบบเพอพจำรณำเผยแพรในวำรสำรชวผลตภณฑ 3.1 จดท าตนฉบบผลงานทางวชาการ (original manuscript) และส า เน า (photocopied

manuscript) อกจ านวน 3 ชด พรอมแผ นบนทกไฟล ข อม ลอเล กทรอนกส ท ระ บรายละเอยดชอผลงาน ชอเจาของผลงาน และทอยพรอมเบอรโทรศพท

3.2 สงตนฉบบทงหมดพรอมเอกสารน าสงถง กองบรรณาธการวารสารชวผลตภณฑ ส านกเทคโนโลยชวภณฑสตว อ.ปากชอง จ.นครราชสมา 30130

โทรศพท 0-4431-1476 ตอ 122, 123 โทรสาร 0-4431-5931 3.3 ไมสงคนตนฉบบ 3.4 ตนฉบบทสงใหพจารณาจะมใบตอบรบใหเจาของผลงาน และจะแจงผลการพจารณาใหทราบ

ภายใน 2 เดอน 3.5 ผลงานทางวชาการทไดรบการเผยแพรในวารสาร เจาของผลงาน (เฉพาะชอแรก) จะไดรบ

วารสารชวผลตภณฑ จ านวน 1 เลม พรอม reprint จ านวน 5 ชด 4. กำรล ำดบเรอง

4.1 ชอเรอง (Title) ตงชอใหสนและสอความหมายไดด 4.2 ชอผ เข ยนและผ รวมงำน (Author and co-workers) เขยนชอนามสกลเตมทงภาษาไทย

และภาษาองกฤษ วางกงกลางใตชอเรอง พรอมทงสถานทท างานทตดตอไดสะดวก พมพเปนเชงอรรถ


4.3 บทคดยอ (Abstract) สนไดเนอความคลมเรองทงหมด โดยเฉพาะวตถประสงค วธการ และผลการทดลองความยาวไมควรเกน 15 บรรทด ภาษาไทยและภาษาองกฤษเขยนแยกหนา

4.4 ค ำส ำคญ (Key words) ค าหรอขอความส น ๆ ทมความหมายแสดงถงความเปนไปของการทดลองนน ๆ ไมเกน 5 ค าส าคญ โดยพมพอยใตบทคดยอ

4.5 เนอหำ (Text) ส าหรบผลงานวจยประกอบดวย 4.5.1 บทน ำ (Introduction) บรรยายถงความเปนมาและวตถประสงค รวมทงควรมการทบทวน

วรรณกรรม (literature review) ประกอบ 4.5.2 อปกรณและวธกำร (Materials and Methods) ถาเปนการคดคนขนใหมควรอธบายอยาง

ละเอยด แตถาเปนททราบกน ควรเขยนในลกษณะอางองถง ถาเปนชอการคาใหท าเปนเชงอรรถ

4.5.3 ผล (Results) บรรยายผลการทดลองใหเขาใจงาย อาจเสนอเปนตาราง รปภาพ หรอกราฟ พรอมค าบรรยายประกอบ

4.5.4 วจำรณ (Discussion) วจารณถงหลกการทแสดงออกมาจากผลการทดลอง เพ อสนบสนน หรอคดคานทฤษฎทมผเสนอมากอน เพอเปรยบเทยบกบผลการทดลองและการตความหมายของผอน เนนถงปญหาขอโตแยงในสาระส าคญของเรองทก าลงกลาวถง และการน าผลไปใชใหเปนประโยชน

4.5.5 สรป (Conclusion) เขยนใจความทส าคญและคณคาของงานเพอผอานเขาใจไดงายขน 4.5.6 กตตกรรมประกำศ (Acknowledgement) ระบแหลงสน บสนนทนวจย เค รองมอ

อปกรณ และความชวยเหลอจากบคคลตาง ๆ 4.5.7 เอกสำรอำงอง (References)

ก. กำรอำงองในเนอเรอง 1. วารสารหรอหนงสอ เมออยตนประโยค เชน นพพร (2539), Lin and Lee (1981)

เมออยกลางหรอทายประโยค เชน (วไลและคณะ, 2532; Kumakai et al., 1961) กรณ อางองเอกสารหลายเรองทเขยนโดยผแตงคนเดยวกนและปทพมพซ ากน ใหใช a b c หรอ d ตามหลงปทพมพส าหรบเอกสารภาษาตางประเทศ และใช ก ข ค หรอ ง ตามหลงปทพมพ ส าหรบเอกสารภาษาไทย เชน เจอ และคณะ (2516ก), Katz (1984a)

2. บคคลหรอขอมลทไมเคยลงพมพมากอน ใหอางเฉพาะในเนอเรองเทานน ไมตองน าไปรวมในรายชอเอกสารอางอง เชน .....similar results (Layton, R. B. and


Weathers, C. C., unpublished data), .....for other bacteria (Jones, A. X., personal communication)

3. เอกสารทหนวยงานเปนผจดท า ใหระบชอหนวยงานเตมในการอางถงครงแรก และระบชอยอทเปนทางการหลงเครองหมายจลภาค (,) การอางถงครงตอไปใหใชชอยอนน กรณทไมมชอยอ ใหระบชอหนวยงานเตมทกครง เชน (องคการรบสงสนคาและพสดภณฑ, ร.ส.พ., 2519)

ข. กำรเขยนเอกสำรอำงองทำยเรอง เ รมจากเอกสารอ างองภาษาไทยเขยนเรยงตามล าดบพยญชนะของผเขยน เอกสารอางองภาษาองกฤษเขยนเรยงล าดบชอสกลตามดวยชอยอของผเขยน 1) วารสาร ระบชอผเขยน ตามดวยป ชอเรอง ชอยอวารสาร ปท ฉบบท และหนาท

อางถง เชน สายพณ ขมทรพย สรพล ขมทรพย และจาตรนต พลราช 2544 การเจรญเตบโตของ

เซลล IFFA-3 ชนดแขวนลอยในมเดยมทมกรดอะมโนและวตามนผสมส าเรจ วารสารชวผลตภณฑ 11(1-2): 27-35

Johnson, R. H. and Collings, D. F. 1971. Transplacental infection of piglets with a porcine parvovirus. Res. Vet. Sci. 12: 570-572.

กรณอางองเอกสารหลายเรองทเขยนโดยผแตงคนเดยวกนและปทพมพซ ากน ใหใช a b c หรอ d ตามหลงปทพมพ ส าหรบเอกสารภาษาตางประเทศ และใช ก ข ค หรอ ง ตามหลงปทพมพ ส าหรบเอกสารภาษาไทย เชน Carter, G.R. 1963a. A discussion of recent developments relating to Pasteurella hemolytica

with special reference to strains pathogenic for cattle. Can. Vet. J. 4(7): 170–174.

Carter, G.R. 1963b. Immunological differentiation of type B and E strains of Pasteurella multocida. Can. Vet. J. 4(3): 61–63.

2) หนงสอ ระบชอผเขยน ปทพมพ ชอเรอง บรรณาธการ (ถามบรรณาธการหลายคนใหอางทกคน) ชอหนงสอ ครงทพมพ ส านกพมพ เมองทพมพ ประเทศ หนาแรกและหนาสดทายทอางถง ส าหรบหนงสอภาษาองกฤษ ถาอางเพยง 1 หนา ใช p. ถาอางองหลายหนาใช pp. เชน กองแผนงาน กรมปศสตว 2543 ขอมลจ านวนปศสตวในประเทศไทย โรงพมพ

ชมนมสหกรณการเกษตรแหงประเทศไทยจ ากด กรงเทพฯ หนา 81


ไพโรจน จวงพานช 2520 โรคออยทเกดจากเชอรา ใน เกษม สขสถาน และอดม พลเกษ บรรณาธการ หลกการท าไรออย มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรงเทพฯ หนา 141-145

Office International des Epizooties. 2000. Principles of Veterinary Vaccine Production. In Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 4th ed. OIE. Paris, France. p. 42.

Dutta, S. K., Shankarappa, B. and Mattingly-Napier, B. 1991. Antigenic analysis of Ehrlichia risticii isolates. In Plowright, W., Rossdale, P. D., Wade, J. F. (ed.), Equine Infectious Diseases VI Proceedings of the Sixth International Conference 7-11 July 1991. R&W Publication (Newmarket) Limited. Suffolk, UK. pp. 61-65.

Van Oirschot, J. T. 1986. Hog Cholera. In Leman, A. D. (ed.), Diseases of Swine, 6th ed. Iowa State University Press. Iowa. pp. 293-297.

3) เวบไซต ระบชอผเขยน ปทพมพ ชอเรอง ชอหนงสอ (ถาม) แหลงทมาและวนทเขาถง เชน จนทรา แปนตม จฑาพร ศรวพฒน วรวทย แสงสงแกว และพงพศ ดลยพชร 2541

อาห ารจากข าวโพด ค ม อ ส ง เส ร ม ก าร เก ษ ต ร ท 4 3 แห ล ง ท ม า http://www.ku.ac.th/agri/cornn/corn.htm 27 มนาคม 2541

Boscos, C. M. 2004. Canine TVT: Clinical findings, Diagnosis and Treatment. The 29 th World Congress of the World Small Animal Veterinary Association. 6-9 October 2004. Rhodes, Greece. Available from http://www.vin.com/proceedings/Proceedings.plx [Accessed 10 January 2006].

http://www.ku.ac.th/agri/cornn/corn.htm

http://www.vin.com/proceedings/Proceedings.plx


จำกกองบรรณำธกำร

เนอหาของวารสารฉบบนประกอบดวย ผลงานการศกษาทดลองของนกวชาการส านกเทคโนโลย-ชวภณฑสตว ซงเปนเรองทเกยวของกบการพฒนาชวภณฑในการตรวจสอบและเทคนคการผลตทเกยวกบไวรสโรคปากและเทาเปอย รวม 3 เรอง ซงแมวาผลงานวชาการเหลานจะยงไมกอใหเกดนวตกรรมเปนผลตภณฑทน าออกสผใชหรอเกษตรกรโดยตรง แตมความส าคญในการน าไปสการตอยอดทางวชาการตอไปเพอใหไดมาซงผลตภณฑทมคณภาพดยงขน นอกจากนยงมบทความทางวชาการทเปนความรและหลกการเบองตนดานความปลอดภยและความมนคงทางชวภาพของหองปฏบตการ และเกรดความรสน ๆทเกดจากประสบการณการท างานซงน ามาบอกเลาเปนการเผยแพรความรทแฝงอย ซงบางครงไมสามารถหาอานไดจากต ารา เพอเปนองคความรแกผอานภายใตคอลมนทชอวา เขมในกองฟาง โดยในฉบบนเปนเกรดความรเกยวกบการท างานทดลองทใชหนไมซ ซงจะเปนประโยชนกบผทมปญหาการท าเครองหมายและการควบคมหนไมซเพอการทดลอง กองบรรณาธการหวงเปนอยางยงวาวารสารชวผลตภณฑฉบบนจะเปนประโยชนในการด าเนนงานวชาการของนกวชาการและเปนขอมลแกผเกยวของและผสนใจทกทาน ขอขอบคณ สพ.ญ.รชน อตถ

บรรณาธการ


พฒนำกำรผลตชดตรวจสอบโรคปำกและเทำเปอยโดยวธอไลซำ

วไล ลนจงสบงกช1 กงกานต บญสยา สโย2 จฬานย นวมจตร2 ปยภรณ เจรญผล2 จรรยา สมานตย2 โสภา สงคลบตร2 รตนย ทองทา2

บทคดยอ

ชดตรวจสอบโรคปากและเทาเปอยไทป O, A และ Asia1 โดยวธอไลซา ไดถกพฒนาและตรวจสอบความใชได ซงไดแก แอนตเจนชนดเขมขน (concentrated antigen), rabbit trapping antibody และ guinea pig detecting antibody จากการตรวจสอบความใชไดของแอนตเจนโดยการไตเตรทดวยวธอไลซา พบวามความจ าเพาะสงตอไทป O, A และ Asia1โดยใหคา working dilution ท 1:512, 1:1024 และ 1:1024 ตามล าดบ นอกจากนยงพบวาแอนตเจนชนดเขมขนสามารถเกบรกษาคณภาพไดยาวนานไมต ากวา 1 ป ส วน rabbit trapping antibody และ guinea pig detecting antibody ไท ป O, A และ Asia1 เ ม อท าก ารตรวจสอบความใชได โดยวธไตเตรท พบวา rabbit trapping antibody ให working dilution หรอ optimal dilution สงท 1:12800 ท ง 3 ไทป ในขณะท guinea pig detecting antibody ให working dilution ห รอ optimal dilution สงท 1:3200 ทง 3 ไทป แสดงถงมความจ าเพาะและความไวสง สรปโดยภาพรวมการพฒนาการผลตชดสารตรวจสอบเหลาน สามารถน ามาใชในการตรวจวนจฉยโรคปากและเทาเปอยโดยวธอไลซา และยงเปนการเพมประสทธภาพในการตรวจวนจฉยโรคไดอยางถกตองและแมนย ายงขน นอกจากนพบวาสารตรวจสอบดงกลาวสามารถเกบรกษาคณภาพทอณหภม -20oC ไดยาวนาน ดงน นชดสารตรวจสอบทพฒนาขนจะเปนประโยชนท งดานลดการน าเขาและประหยดงบประมาณประจ าปในการสงซอจากตางประเทศ ค ำส ำคญ: ชดสารตรวจสอบ โรคปากและเทาเปอย อไลซา

1 ผเชยวชาญดานโรคปากและเทาเปอย ทปรกษากรมปศสตว 2 ศนยอางองโรคปากและเทาเปอย ภมภาคเอเซยตะวนออกเฉยงใต ปากชอง นครราชสมา 30130


บทน ำ

โรคปากและเทาเปอยเปนโรคระบาดเกดจากเชอไวรส ตดตองาย และแพรกระจายไดอยางรวดเรวในสตวเศรษฐกจ สงผลท าใหการสงออกสตวหรอผลตภณฑสตวไปยงตางประเทศไมได เนองจากตางประเทศใชเปนขอกดกนทางการคา โรคปากและเทาเปอยมทงหมด 7 ไทปคอ O, A , Asia1, C, SAT1, SAT2 และ SAT3 (Brooksby and Rogers, 1975) ซ งในแตละไทปไมใหความคมขามซงกนและกน นอกจากนยงแบงออกเปนไวรสชนดยอยอกประมาณ 64 subtype (Pereira,1977) โดยแบงตามคณสมบตของแอนตเจนของไวรสแตละชนด พบระบาดในประเทศไทยเพยง 3 ไทปคอ O, A และ Asia1 การตรวจวนจฉยโรคทใหประสทธผลถกตอง แมนย า อานผลรวดเรวและไดมาตรฐานตามหลกวชาการ จะสงผลเพมประสทธภาพดานการปองกนและควบคมโรคปากและเทาเปอยทงในระดบประเทศและระดบภมภาคใหบรรลผลส าเรจตามเปาประสงค กรมปศสตวมนโยบายและแผนยทธศาสตรหลกในการปองกนและควบคมโรคปากและเทาเปอย โดยเนนควบคมการเคลอนยายสตว และฉดวคซนสตวในพนทใหได 80% ของประชากรสตวทงประเทศเพอเสรมสรางภมค มกนใหกบสตวใหได herd immunity ไมต ากวา 80% ซงทางระบาดวทยาถอวาสามารถปองกนโรคจากการระบาดได การตรวจหาไวรส (antigen detection) ในสตวปวย และการตรวจหาแอนตบอด (antibody detection) ในสตวทไดรบการฉดวคซนหรอไดรบการตดเชอ โดยการตรวจหาแอนตบอดตอไวรสโรคปากและเทาเปอยไทป O, A และ Asia1 ซงสามารถตรวจไดหลายวธ ไดแก Complement fixation (CF) test (Casey, 1995), Virus neutralization test (Rweyemamu et al., 1987) ปจจบนไดมการพฒนาวธ Indirect Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) มาใชในการตรวจวนจฉยโรคปากและเทาเปอย โดยตรวจหาแอนตเจนดวยวธ ELISA typing จากตวอยางเยอลนหรอเยอกบของสตวปวย (Roeder and Le Blanc Smith, 1987) ซงพบวาใหความไวและแมนย ากวาวธ CF test (Ferris and Dawson, 1988; Westbury et al., 1988) นอกจากนยงไดมการพฒนาเทคนค ELISA มาใชตรวจหาแอนตบอด ไดแก liquid phase blocking ELISA (LP ELISA) (Hamblin et al., 1987) ซงใหความไวและความจ าเพาะมากกวา วธ VN test ถง 2-2.5 เทา (Westbury et al., 1988; Linchongsubongkoch and Janukit, 1994) สารตรวจสอบทใชส าหรบการตรวจวนจฉยโรคดวยวธ ELISA ทง antigen detection และ antibody detection ทใชปจจบน เปนสารตรวจสอบทผลตทศ นยอางองโรคปากและเทาเปอยภมภาคเอเชยตะวนออกเฉยงใต เพอใชภายในศนยและแจกจายใหกบหนวยงานศนยวจยและพฒนาการสตวแพทยของกรมปศสตว หรอบางครงแจกจายใหกบหนวยงานตางประเทศภายใตโ ค ร งก าร South East Asia and China Foot and Mouth Disease Control (SEACFMD) Campaign ส า รต ร ว จส อ บ เห ล า น ไ ด แ ก rabbit trapping antibody serum, guinea pig detecting antibody serum แ ล ะ inactivated FMD antigen ของไวรสไทป O, A และ Asia1 ซงเปนสารตรวจสอบทมลกษณะเปน fresh reagent โดยเฉพาะอยางยง inactivated FMD antigen จะมความไมคงทนตอสภาวะแวดลอมทไมเหมาะสม


การเกบรกษาไมยาวนานและคณภาพของแอนตเจนเสอมงาย สวนสาร rabbit trapping antibody และ guinea pig detecting antibody มความบรสทธไมเพยงพอ จะสงผลใหเกดปฏกรยากบโปรทนตางๆ (non specific blinding reaction) ในซรมได ท าใหเกด background สงรวมถงการเกดปฏกรยาขาม serotype (cross reaction) สงผลใหการตรวจสอบผดพลาดได ดงนนการวจยในครงนจะเปนการพฒนาการผลตชดสารตรวจสอบส าหรบใชในการตรวจวนจฉยโรคปากและเทาเปอย antigen detection และ antibody detection รวมท งตรวจสอบความใชไดของสารตรวจสอบไดแก rabbit trapping antibody, guinea pig detecting antibody และ inactivated FMD antigen ทงดานความบรสทธ ความจ าเพาะ ความไว และคณภาพการเกบรกษา เพอลดการสญเสยและลดคาใชจายในการสงซอจากตางประเทศ

อปกรณและวธกำร

เตรยมแอนตเจนโรคปำกและเทำเปอยชนดเขมขน เพาะเลยงไวรสโรคปากและเทาเปอยไทป O, A และ Asia1 ลงบนเซลล BHK-21 ท าการ inactivate ดวย 2% binaryethyleneimine (BEI) น าไปอนใน water bath ทอณหภม 26C เปนเวลา 18-24 ชวโมง ท าใหแอนตเจนเขมขนโดยการตกตะกอนดวย 7% polyethylene glycol (PEG 6000) ละลายตะกอนดวย PBS หรอ Tris-Hcl ใหมปรมาณความเขมขนประมาณ 20 เทาจากปรมาตรเรมตน เตม 1% bovine serum albumin (BSA) เพอยดอายการเกบรกษาคณภาพ ท าการตรวจสอบความใชไดของ antigen ไดแก complete inactivation โดยผานลงบนเซลลเพาะเลยงตอเนองกนจ านวน 3 ครง, ตรวจ cross reaction และworking dilution หรอ optimal dilution โดยวธ antigen titration ดวยวธ ELISA กอนน าไปใช

เตรยมอนภำค 146 S ของไวรสโรคปำกและเทำเปอยไทป O, A และ Asia1 น ายาไวรสโรคปากและเทาเปอยทผานการ inactivate ดวย 2% binary ethyleneimine (BEI) (Bahnemann, 1975) ท าการตกตะกอนดวย 7% PEG 6000 และท าใหเขมขนประมาณ 200-250 เทา โดยการปนดวยเครอง ultracentrifuge ภายใตสญญากาศทความเรว 30,000 rpm เปนเวลา 3 ชวโมง ท าการแยกอนภาค 146S ทบรสทธโดยผาน 15-45 % sucrose density gradient ultracentrifugation ทความเรวรอบ 27,000 rpm เปนเวลา 4 ชวโมง (Brown and Cartwright, 1968; Cowan, 1968) ท าการเกบหลอดทมปรมาณ 146S สง(peak)โดยใช fraction collector ทตอเขากบเครอง monitor ใช spectophotometor วดคา optical density (OD) ทความยาวคลน 254 นาโนมเตอร เพอค านวณคาปรมาณอนภาค 146S (ug/ml) (Bachrach et al., 1964) เกบเปนสตอกในต -80oC กอนน าไปฉดเขากระตายและหนตะเภาตอไป


เตรยม rabbit trapping antibody ของไวรสโรคปำกและเทำเปอยไทป O, A และ Asia1 เจอจางอนภาค 146S จากสตอกดวย 0.01M PBS ใหมปรมาณ 50ไมโครกรมตอกระตาย 1 ตว น ามาผสม

กบ complete Freund’s adjuvant ปรมาตรเทากน ผสมสารท งสองใหเขากนจนได emulsion ทเปนเนอเดยวกน น าไปฉดเขากลามเนอกระตาย หลงจากนน 28 วน ท าการฉดซ าโดยใช 146S ในปรมาณ 25 ไมโครกรมตอกระตาย 1 ตว ผสมกบ incomplete Freund’s adjuvant ปรมาตรเทากน ผสมสารทงสองใหเขากนจนได emulsion ทเปนเนอเดยวกน ฉดเขากลามเนอกระตาย ท าการเจาะเลอดหลงฉดครงทสอง 10 วน แยกซรมน าไปตรวจสอบความใชไดโดยตรวจ cross reaction และตรวจ หา working dilution กอนเกบเปนสตอกส าหรบใชเปนสารตรวจสอบในงาน ELISA ตอไป

เตรยม guinea pig detecting antibody ของไวรสไทป O, A และ Asia1 เจอจางอนภาค 146S จากสตอกดวย 0.01M PBS ใหมปรมาณ 25 ไมโครกรมตอหนตะเภา 1 ตว

น ามาผสมกบ complete Freund’s adjuvant ปรมาตรเทากน ผสมสารทงสองใหเขากนจนได emulsion ทเปนเนอเดยวกน น าไปฉดเขากลามเนอหนตะเภา หลงจากนน 28 วนท าการเจาะเลอดแยกซรมน าไปตรวจสอบความใชไดโดยตรวจ cross reaction และตรวจหา working dilution กอนเกบเปนสตอกส าหรบใชเปนสารตรวจสอบในงาน ELISA ตอไป

ตรวจสอบควำมใชไดของชดสำรตรวจสอบ ชดสารตรวจสอบทผลตไดคอ แอนตเจนชนดเขมขน, rabbit trapping antibody และ guinea pig

detecting antibodyไทป O, A และ Asia1น ามาตรวจสอบความใชไดโดยวธ titration เพอหา working dilution และตรวจสอบ cross reaction เพอใหมนใจวาสารตรวจสอบเหลานมความจ าเพาะและมความไวโดยไมม cross binding reaction กบไวรสไทปอน ดงน

Antigen titration ส ำหรบแอนตเจนชนดเขมขนไทป O, A และ Asia1 coat เพลทดวย rabbit trapping antibody ตอไทป O, A และ Asia1 ลงบน ELISA เพลท ในความ

เขมขนทเหมาะสม ทงคางคนในตเยน วนรงขนเตรยมตวอยางแอนตเจนเขมขนของแตละไทปโดยเจอจางแบบ two fold serial dilution เรม ท 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 จนถง 1:8192 ตามล าดบ เตมลงบนเพลท incubate ท 37oC เปนเวลา 1 ชวโมง จากนนเตมสารละลาย guinea pig detecting antibody ของแตละไทปลงบนเพลท incubate ท 37oC เปนเวลา 1 ชวโมง เตรยมสารละลาย conjugate เตมลงในเพลท incubate ท 37oC เปนเวลา 1 ชวโมง จากนนเตมสารละลาย substrate ปลอยไวทอณหภมหอง 20 นาท เตมสารละลายของกรดซลฟรค (H2SO4) เพอหยดปฏกรยาของ substrate อานคา optical density (OD) ทความยาวคลน 450 นาโนมเตอร และหาคา optimal dilution หรอ working dilution ของไวรสแตละไทป โดยอานคาท dilution สงสดของไวรสทใหคา OD อยในชวง 1.5-1.8


Rabbit trapping serum titration ตอไวรสไทป O, A และ Asia1 coat เพลทดวยตวอยาง rabbit trapping antibody ของแตละไทป โดยการเจอจางแบบ two fold serial

dilution เรมท 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200 จนถง 1:10240 ตามล าดบ ทงคางคนในตเยน วนรงขนเตรยมสารละลายแอนตเจนของแตละไทปโดยใชความเขมขนทเหมาะสมทผานการ titrate มาแลวเตมลงบนเพลท ท าการ incubate ท 37oC เปนเวลา 1 ชวโมง จากนนเตมสารละลาย guinea pig detecting antibody ของแตละไทปลงบนเพลท incubate ท 37oC เปนเวลา 1 ชวโมง เตรยมสารละลาย conjugate เตมลงในเพลท incubate ท 37oC เปนเวลา 1 ชวโมง จากนนเตมสารละลาย substrate ปลอยไวทอณหภมหอง 20 นาท เตมสารละลายของกรดซลฟรคเพอหยดปฏกรยาของ substrate อานคา OD ทความยาวคลน 450 นาโนมเตอร และหาคา optimal dilution หรอ working dilution ของ rabbit serumแตละไทป โดยอานคาท dilution สงสด serum ทใหคา OD อยในชวง 1.5-1.8

Guinea pig serum titration ตอไวรสไทป O, A และ Asia1 coat เพลทดวย rabbit trapping antibody ตอไทป O, A และ Asia1 ลงบน ELISA เพลท ในความ

เขมขนทเหมาะสม ทงคางคนในตเยน วนรงขนเตรยมสารละลายแอนตเจนของแตละไทปโดยใชความเขมขนทเหมาะสมทผานการ titrate มาแลวเตมลงบนเพลท ท าการ incubate ท 37oC เปนเวลา 1 ชวโมง จากนนเตรยมตวอยาง guinea pig serum ของแตละไทป โดยการเจอจางแบบ two fold serial dilution เรมท 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200 จนถง 1:6400 ตามล าดบ เตมลงบนเพลท ท าการ incubate ท 37oC เปนเวลา 1 ชวโมง เตรยมสารละลาย conjugate เตมลงในเพลท incubate ท 37oC เปนเวลา 1 ชวโมง จากนนเตมสารละลาย substrate ปลอยไวทอณหภมหอง 20 นาท เตมสารละลายของกรดซลฟรค เพอหยดปฏกรยาของ substrate อานคา OD ทความยาวคลน 450 นาโนมเตอรและหาคา optimal dilution หรอ working dilution ของ guinea pig serum แตละไทปโดยอานคาท dilution สงสด serum ทใหคา OD อยในชวง 1.5-1.8

ตรวจสอบควำมคงทนของแอนตเจนชนดเขมขน การตรวจสอบความคงทนของแอนตเจนชนดเขมขนไทป O, A และ Asia1 หลงเกบรกษาในตแชแขง

อณหภม -20oC เปนเวลา 12 เดอน ต งแตเดอนมกราคม ถงเดอนธนวาคม ท าการสมตวอยางทกเดอนมาตรวจสอบคณภาพโดยวธ antigen titration

ผล

การพฒนาผลตชดสารตรวจสอบส าหรบใชตรวจวนจฉยโรคปากและเทาเปอยโดยวธ ELISA นนสารตรวจสอบทผลตไดมดงน แอนตเจนชนดเขมขน, rabbit trapping antibody และguinea pig detecting antibody


ไทป O, A และ Asia1 ซงไดผานการตรวจสอบความใชไดและความจ าเพาะโดยวธ antigen titration, cross reaction titration และ working dilution ผลดงแสดงในรปแผนภมท 1, 2 และ 3 ตามล าดบ

ผลการตรวจสอบความใชไดของแอนตเจนชนดเขมขน พบวาแอนตเจนไทป O , A และ Asia1 ชนดเขมขนทผลตไดให working dilution ท 1:512, 1:1024 และ 1:1024 ตามล าดบ และพบวาไมม cross reaction กบไทปอน ดงแสดงในตารางท 1

ผลการตรวจสอบความคงทนของแอนตเจนชนดเขมขนไทป O, A และ Asia1ทเกบรกษาในตแชแขง -20oC เปนเวลานาน 12 เดอน ผลปรากฏวา แอนตเจนแตละไทปยงคงมคณภาพให antigen titer สง โดยมคา OD อยในชวง 2.5–2.8 ดงแสดงในแผนภมท 1

ผลการตรวจสอบความใชไดของ rabbit trapping antibody โดยการตรวจหา working dilution ของไทป O, A และ Asia1 ไดคา working dilution ท 1:12800 ทง 3 ไทป ดงแสดงในแผนภมท 2

ผลการตรวจสอบความใชไดของ guinea pig detecting antibody โดยการตรวจหา working dilution ของไทป O, A และ Asia1 ไดคา working dilution ท 1:3200 ทง 3 ไทป ดงแสดงในแผนภมท 3

สรปและวจำรณ

การพฒนาการผลตชดตรวจสอบโรคปากแลเทาเปอยไทป O, A และ Asia1 ไดแก แอนตเจนชนดเขมขน rabbit trapping antibody และ guinea pig detecting antibody พบวาสารตรวจสอบทผลตไดมความเขมขนและความบรสทธสงระดบหนง เปนสารทมคณภาพ ใหความจ าเพาะและความไวสงในแตละไทป ซงปจจบนไดมการแจกจายสารตรวจสอบเหลานใหกบหนวยงานในกรมปศสตวไดแก ศนยอางองโรคปากและเทาเปอย สถาบนสขภาพสตวแหงชาต และศนยวจยและพฒนาการสตวแพทยประจ าภมภาคเพอน าไปใชในงานตรวจวนจฉยโรคปากและเทาเปอย เพอเปนการเพมประสทธภาพในการตรวจวนจฉยโรคไดอยางถกตองและยงใหความจ าเพาะและความไวสง นอกจากนยงพบวาสารตรวจสอบทผลตเปนแอนตเจนทมความเขมขนประมาณ 20 เทา เมอน ามาตรวจโดยวธ antigen titration พบวาใหคา working dilution สงตงแต 1:512 ถง 1:1024 (ตารางท 1) ซงการใช working dilution ทสง จะสามารถเพมความจ าเพาะใหสงขนและยงสามารถแกปญหาเรอง background อนเนองมาจาก non specific binding reaction และการเกด cross reaction ระหวางไทปอนได การผลตดวยวธนจงไดแอนตเจนทมความจ าเพาะสงและจะสงผลใหการตรวจวนจฉยโรคปากและเทาเปอยไดอยางถกตองและแมนย า จากการทดสอบความคงทนในการเกบรกษาคณภาพของแอนตเจนทง 3 ไทป โดยการสมตรวจสอบ antigen titration ทกเดอนเปนเวลานาน 12 เดอน พบวาแอนตเจนดงกลาวไมมการเสอมคณภาพ ยงคงให titer ในระดบสงและคงท ไดคา OD อยระหวาง 2.5 ถง 2.8 (แผนภมท 1) ในการศกษาวจยครงนไมไดท าการทดลองตอหลงเกบรกษาเกนระยะเวลา 1 ป


สวนกรณการตรวจสอบ rabbit trapping antibody และ guinea pig detecting antibody ไทป O, A และ Asia1 ในแผนภมท 2 และ 3 พบวาให working dilution คอนขางสงและไมม cross reaction กบไทปอน แสดงถงความจ าเพาะสง ซงสามารถน าไปพฒนาตอยอดเพอเพมปรมาณหรอขยายการผลตในเชงพาณชยไดในอนาคต โดยเพมอปกรณและครภณฑวทยาศาสตรทจ าเปนบางอยาง เชน อปกรณส าหรบการขยายปรมาณการเพาะเลยงเซลลและเพาะเลยงไวรส เครองท าไวรสใหเขมขนและบรสทธเปนตน จากผลส าเรจในการพฒนาการผลตชดสารตรวจสอบเหลานจะสามารถประหยดงบประมาณประจ าปไดปละหลายลานบาท โดยไมจ าเปนตองสงซอจากตางประเทศ ปจจบนชดสารตรวจสอบส าหรบตรวจวนจฉยโรคปากและเทาเปอยทงหมด 7 ไทป จะมแหลงผลตและจ าหนายทหนวยงาน World Reference Laboratory for FMD, Pirbrigth Laboratory ประเทศองกฤษเทานน ซงสารตรวจสอบเหลานมราคาสงมาก ดงนนในการวจยและพฒนาการผลตชดสารตรวจสอบครงนพบวาไดสารตรวจสอบทมคณภาพ ไดมาตรฐาน ราคาประหยด รวมทงสามารถแจกจายใหกบหนวยงานตางๆในกรมปศสตว และศนยวจยและพฒนาการสตวแพทยทง 7 แหงของกรมปศสตว เพ อใชในการตรวจวนจฉยโรคและการตรวจเฝาระวงโรคปากและเทาเปอยตามแผนยทธศาสตรกรมปศส ตวไดอยางมประสทธภาพ นอกจากนยงสามารถแจกจายหรอจ าหนายใหกบหนวยงานตางประเทศโดยเฉพาะประเทศสมาชก OIE ภายใตโครงการ South East Asia and China Foot Mouth Disease Control Campaign (SEACFMD) ใหบรรลเปาหมายและผลส าเรจส าหรบการยนขอรบรองจาก OIE ในการจดตงเขตปลอดโรคปากและเทาเปอยโดยฉดวคซนในภมภาคเอเชยตะวนออกเฉยงใตภายในป คศ. 2020 ตามแผนยทธศาสตร SEACFMD 2020 Roadmap

กตตกรรมประกำศ

ขอขอบคณเจาหนาททกทานในหนวยเตรยมสารและเตรยมเซลล ของศนยอางองโรคปากและเทาเปอย ภมภาคเอเชยตะวนออกเฉยงใตทใหความอนเคราะหและใหความชวยเหลอในการเพาะเลยงเซลล เพาะเลยงไวรส เตรยมสารละลายบฟเฟอร มเดยและวสดอปกรณทใชในโครงการนจนบรรลผลส าเรจ

เอกสำรอำงอง

Bachrach, H.L, Trautman, R., and Breese, S. Jr. 1964. Chemical and physical properties of virtually pure foot and mouth disease virus. Am. J. Res. 25: 333-342.

Bahnemann, H.G. 1975. Binary ethyleneimine as an inactivant for foot and mouth disease virus and it application for vaccine production. Arch Virol. 17: 47-56.


Brooksby, J. and Rogers. 1957. Method used in typing the virus of foot and mouth disease at Pirbright, 1950-1955. In Method of typing and cultivation of foot and mouth disease virus. Project 208 of OEEC, Paris. 31-34.

Brown, F. and Cartwright, B. 1963. Purification of radioactive foot and mouth disease virus. Nature (Lond). 199:1168-1170.

Casey, H.L. 1995. Standardized diagnostic complement fixation method and adaptation micro test. U.S. Public Health Service, Washington D.C., Publ. Health Monogr. 74: 1-34.

Cowan, K.M. 1968. Immunochemical studies of foot and mouth disease. IV. Preparation and evaluation of antisera specific for virus protein, sub-unit and the infection- associated antigen. J. of Imm. 10:1183-1191.

Ferris, N.P. and Dawson, M. 1988. Routine application of enzyme-linked immunosorbent assay in comparison with complement fixation for the diagnosis of foot and mouth disease and swine vesicular diseases. Vet. Microbiol. 16: 201-209.

Hamblin, C., Kitching, P.R., Donaldson, A.I., Crowther, J.R. 1987. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for the antibody against foot and mouth disease virus. III. Evaluation of antibodies after infection and vaccination. Epidem. Inf. 99: 733-744.

Linchongsubongkoch, W. and Janukit, T. 1994. Detection of antibody titer to foot and mouth disease virus by liquid phase blocking ELISA. Proceeding on 1st Vet. Biologics Conference. 62-72.

Pereira, H.G. 1977. Subtyping of foot and mouth disease virus. Dev. Biol. Stand. 35: 167-174. Roeder P.L., Le Blance Smith P.R. 1987. Detection and typing of foot and mouth disease virus by enzyme

linked immnusorbent assay: a sensitivity, rapid, reliable technique for primary diagnosis. Res. Vet. Sci. 43: 225-232.

Rweyemamu, M.M., Booth, J.C., Heak, M., Pay, T.W.F. 1987. Microneutralization test for serology typing and subtyping of foot and mouth disease virus strains. J. Hygiene. Camb. 81: 107-122.

Westbury, H.A., Chamnanpood, P., Tungchaitrong,S. Doughty, W.J. 1988 . Single dilution ELISA for detection of serum antibody to foot and mouth disease virus in cattle. Vet. Microbiol. 18: 273-283.


ตำรำงท 1 แสดงการตรวจสอบความใชไดของไวรสชนดเขมขนไทป O, A และ Asia1 โดยวธ antigen titration และตรวจหา working dilution และ cross reaction สรปผลการหา working dilution โดยอานคาท OD ชวง 1.5-1.8 ของไทป O, A และ Asia1 เทากบ 1:512, 1: 1024 และ 1:1024 ตามล าดบ

แผนภมท 1 แสดงคาการตรวจสอบคณภาพ ความคงทนของไวรสชนดเขมขนไทป O, A และ Asia1 ทเกบ รกษาในตแชแขงอณหภม -20oC เปนเวลานาน 12 เดอน โดยสมตวอยางตรวจทกเดอน


แผนภมท 2 แสดงผลการตรวจสอบความใชไดของ rabbit trapping antibody โดยตรวจหา working dilution

ของไทป O, A และ Asia1 ตามล าดบ

แผนภมท 3 แสดงผลการตรวจสอบความใชไดของ guinea pig detecting antibodyโดยตรวจหา working dilution ของไทป O, A และ Asia1 ตามล าดบ


Development of production of foot and mouth disease ELISA reagent kit

Wilai Linchongsubongkoch1 Kingkarn Boonsuya Seeyo2 Julanee Nuamchit2 Piyaporn Chareonphol2 Janya Samanit2 Sopha Singkleebut2 Rattanee Thongtha2

Abstract

The production of ELISA reagents used for foot and mouth disease diagnosis were developed and validated, those reagents were concentrated antigen, rabbit trapping antibody and guinea pig detecting antibody against serotype O, A and Asia1, respectively. The validation of concentrated antigen using ELISA titration assay was demonstrated specificity that illustrated the high working dilution of serotype O, A and Asia1 at 1:512, 1:1024 and 1:1024 respectively. In addition, a keeping quality of concentrated antigen was investigated; the result demonstrated a high antigen titer that prolonged stability up to one year. The validation of rabbit trapping and guinea pig detecting antibody were carried out, the high working dilution of rabbit antiserum to serotype O, A and Asia1 was found at 1:12800, while working dilution of guinea pig antiserum to serotype O, A and Asia1 was found at 1:3200. This result indicated a high specificity and sensitivity of all reagents. In conclusion, the developed ELISA reagents could be used to enhance the efficacy and accuracy of foot and mouth disease diagnosis and those reagents could be kept freezer -20oC for a long time which prolonged high quality. Thus, these developed reagents will be benefit for reducing of importing and saving of annual budget for purchasing the reagents from foreign country.

Key words: Reagent kit, foot and mouth disease, ELISA

1 FMD Expert and Consultant of Department of Livestock Development 2 Regional Reference Laboratory for FMD in Southeast Asia, Pakchong, Nakhonratchasima 30130


เปรยบเทยบวธกำรลดอณหภมในกำรเกบรกษำเซลล BHK21C13ชนดแขวนลอย

อนรกษ ตระการรงส1 สายพณ ขมทรพย1

บทคดยอ

เปรยบเทยบวธการลดอณหภมในการเกบรกษาเซลล BHK21C13 ชนดแขวนลอย 2 วธ คอการควบคมอตราการลดอณหภมดวยเครองแชเยอกแขงและการลดอณหภมตามล าดบจาก 4°ซ. -20°ซ. และเกบรกษาทอณหภม -80°ซ. ทดสอบการรอดชวตและจ านวนเซลลเฉลยทก 3 เดอน หลงเกบเปนเวลา 2 ป พบวาเซลลทเกบดวยเครองแชเยอกแขงเซลลมเปอรเซนตรอดชวตและจ านวนเซลลเฉลยในแตละ passage ทน าเซลลมาเพาะเลยงหลงเกบสงกวาเซลลทเกบดวยการลดอณหภมตามล าดบอยางมนยส าคญ (P<0.05) เมอเปรยบเทยบการใชมเดยมส าหรบแชเยอกแขงทมและไมมซรม ในการเกบรกษาเซลลแตละวธ พบวา การรอดชวตและจ านวนเซลลเฉลยไมแตกตางกนอยางมนยส าคญ (P>0.05) นอกจากนในการเพาะเลยงเซลลหลงเกบรกษาตงแต 12 เดอนขนไป เพอใหมจ านวนเพยงพอส าหรบใชเปนเซลลตงตนในการเพาะขยายเซลลในระดบอตสาหกรรม เซลลทเกบดวยเครองแชเยอกแขงตองการการเพาะเลยงดวยจ านวน passage นอยกวาเซลลทเกบดวยการลดอณหภมตามล าดบ ดงนนสามารถใชเครองแชเยอกแขงเซลลในการเกบรกษาเซลล BHK21C13 ชนดแขวนลอย โดยใชมเดยมส าหรบแชเยอกแขงทมหรอไมมซรมได ค ำส ำคญ: เซลล BHK21C13 ชนดแขวนลอย การรกษาสภาพเยอกแขง การลดอณหภม 1กลมผลตชวภณฑ ส านกเทคโนโลยชวภณฑสตว อ.ปากชอง จ.นครราชสมา 3013


บทน ำ

การเกบรกษาเซลล BHK21C13 ของส านกเทคโนโลยชวภณฑสตวเพอใชเปนเซลลเรมตนในการผลตวคซนโรคปากและเทาเปอยใน growth medium for suspension (GMS) ทม 20% fetal calf serum (FCS) และ 10% dimethylsulfoxide (DMSO)โดยใชเซลลจ านวน 1 x 107 เซลล/มล. บรรจขวดละ 10 มล. ซงการเกบรกษาเซลลในปจจบนโดยการลดอณหภมเปนล าดบขนจากอณหภม 4°ซ. นาน 2 ชม. ยายไปเกบทอณหภม -20°ซ. นาน 1 ชม. หลงจากนนจงน ามาเกบทอณหภม -80°ซ. การเกบโดยวธน สามารถเกบรกษาเซลลไดนาน 24 เดอน แตขนตอนนมความยงยากและใชเวลานาน นอกจากนอตราการรอดชวตประมาณ 60% และตองใชเวลาเพาะเลยงเรมตน 3-5 passages เซลลจงสามารถขยายตอไปได

การเกบรกษาเซลลนอกจากใชวธการยายขวดบรรจเซลลจากตแชแขงอณหภมตางๆ เพอการลดอณหภมแลวอาจใชเครองแชเยอกแขงเซลล (Cryogenic freezer) ซงสามารถควบคมการลดอณหภมดวยไนโตรเจนเหลวไดอยางสม าเสมอ ตงแต 0.1°ซ./นาท ถง 50°ซ./นาท และท าความเยนไดถง -170°ซ. จากการศกษาของ Mazur (1984) พบวาการเกบรกษาเซลลไขของหนไมซในไนโตรเจนเหลว โดยลดอณหภมลงในอตรา 2°ซ./นาท เมอน ามาละลายท าใหเซลลไขของหนมอตราการรอดชวตถง 70 % จงมแนวคดทจะน าเครองแชเยอกแขงเซลลมาใชในการเกบรกษาเซลลเพอชวยลดขนตอนการยายขวดบรรจเซลล และเพมอตราการรอดชวตของเซลล BHK21C13 ซงมผลตอเวลาในการเพาะเลยงเซลลเรมตน เพอใหไดปรมาณเซลลมากเพยงพอส าหรบการเพาะขยายเซลลในถงขนาดใหญ

นอกจากนการใชมเดยมในการเกบรกษาเซลลสามารถใช Serum-free medium for cryopreservation (Cryo-SFM) ซงเปนมเดยมทไมมซรมเปนสวนประกอบท าใหควบคมคณภาพไดงาย ไมมความผนแปรจากผลตภณฑธรรมชาต และใชเปนมเดยมมาตรฐานระหวางหองทดลองตางๆ การเลอกใชมเดยมใหเหมาะสมกบชนดของเซลลจะชวยเพมประสทธภาพในการเพาะเลยงเซลล (Freshney, 2005)

ดงนนการศกษาครงนจะเปรยบเทยบการใชเครองแชเยอกแขงเซลลกบวธการยายขวดบรรจเซลลจากตแชแขงอณหภมตางๆ และเปรยบเทยบการใชมเดยมทประกอบดวย Cryo-SFM แทนมเดยมเดมทประกอบดวย GMS + 20% FCS + 10% DMSO เพอเปนทางเลอกในการเกบรกษาเซลลทเหมาะสม น ามาปรบปรงพฒนากระบวนการเกบรกษาและผลตเซลลทมคณภาพ


เซลล เซลล BHK21C13 ชนดแขวนลอย passage ท 15-20


มเดยม 1. มเดยมส าหรบเกบรกษาเซลล

1.1 Growth medium for suspension (GMS)1 ทม 20% fetal calf serum (FCS)2 และ 10% dimethylsulfoxide (DMSO)3

1.2 Cryo-SFM4 2. มเดยมส าหรบเพาะเลยงเซลล ประกอบดวย GMS ทม 5% FCS

เครองแชเยอกแขงเซลล5 (Cryogenic freezer) เปนเครองควบคมการท าความเยนดวยไนโตรเจนเหลว (liquid nitrogen) ท าใหสามารถลดอณหภม

ไดอยางรวดเรว ชวยลดขนตอนการเกบรกษาเซลลสามารถท าความเยนไดถง -170°ซ. สามารถปรบลดอณหภมเพอท าความเยนในอตราตงแต 0.1°ซ./นาท ถง 50°ซ./นาท ชองเยอกแขง (freezing chamber) มขนาด 300 x 250 x 350 มม. (กวาง x ยาว x สง) สามารถใสขวดขนาด 20 มล. ได 144 ขวด

กำรเพำะเลยงเซลล BHK21C13 เพาะเลยงเซลล BHK21C13 ชนดแขวนลอยในขวดเพาะเลยงเซลลขนาด 2 ลตรแบบเตมอากาศทม

GMS ทผสม 5% FCS จ านวน 3 ขวด ทอณหภม 37°ซ. เปนเวลา 2 วนใหไดจ านวนเซลลตอขวด เทากบ 3.2 x 106 เซลล/มล.

วธกำรเกบรกษำเซลล BHK21C13 แบงเซลล BHK21C13 ชนดแขวนลอยทเพาะเลยงไดในแตละขวด ออกเปน 4 กลม ๆ ละ 250 มล.

แลวน าเซลลทง 4 กลมไปปนเหวยงดวยเครองเซนตรฟวจยหอ Tomy Seiko model RB-18TS ความเรว 1,000 รอบ/นาท เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4°ซ. น าตะกอนเซลลแตละกลมผสมในมเดยมทตางกน (ตารางท 1) ใหไดความเขมขนเซลลเทากบ 1 x 107 เซลล/มล. แบงเซลลใสขวดเกบเซลลขนาดความจ 20 มล. ขวดละ 10 มล. จ านวน 8 ขวด/กลม ท าวธเดยวกนนจนครบทง 3 ขวด แลวน าไปเกบรกษาโดยวธทตางกนทง 4 กลม 1Amresco, America Lot no.1712C419 2Biological Industries, Israel Lot no.215079 3BDH Laboratory Supplies Poole,England Lot no.K23327888 648 4Promocell,Germany Lot no.6082503 5Nicool Plus PC Air Liquidtm, France


ตำรำงท 1 สวนประกอบของมเดยมและวธการเกบรกษาเซลลแตละกลม กลมท

สวนประกอบมเดยมแตละขวด (มล.) วธเกบรกษาเซลล GMS FCS DMSO Cryo- SFM

1 2 3 4

7 7 - -

2 2 - -

1 1 - -

- -

10 10

วธทใชปจจบน* ใชเครองแชเยอกแขงเซลล** วธทใชปจจบน* ใชเครองแชเยอกแขงเซลล**

* แชเยนทอณหภม 4°ซ. 2 ชวโมง และทอณหภม -20°ซ. 1 ชวโมง น าไปเกบรกษาทอณหภม -80°ซ. **ใชเครองแชเยอกแขงเซลลโดยลดอณหภมลงในอตรา 2 °ซ./นาท จนถงอณหภม -40°ซ. และลดลงในอตรา 5°ซ./นาท จนถงอณหภม -80°ซ. น าไปเกบรกษาทอณหภม -80°ซ. กำรเพำะขยำยเซลล BHK21C13 หลงกำรเกบรกษำ

น าเซลลทเกบไวจากทง 4 กลม ๆ ละ 3 ขวด มาเพาะเลยงทก ๆ 3 เดอน จนครบ 24 เดอนโดยน ามาละลายในอางน าควบคมอณหภมทอณหภม 37 °ซ. จนละลายหมด ภายในเวลาไมเกน 5 นาท แลวน าไปปนเหวยงความเรว 1,000 รอบ/นาท เปนเวลา 10 นาท ทอณหภม 4°ซ. เกบตะกอนเซลลผสมกบมเดยม (5% FCS + GMS) pH 7.2 ปรมาตร 200 มล. ในขวด Roux นบจ านวนเซลลเพอหาอตราการรอดชวตของเซลล แลวน าไปเพาะเลยงในขวด Roux ทอณหภม 37°ซ. กวนดวยแทงแมเหลกความเรวรอบ 400 รอบ/ นาท เปนเวลา 48 ชวโมง เกบตวอยางเซลล 20 มล. เพอนบจ านวนเซลล ทมชวต ตรวจดความสมบรณของเซลลทงขนาดและรปรางของเซลล และค านวณหาอตราการเจรญเตบโตของเซลล ท าการเพาะเลยงตอไป 5 passages โดยในแตละ passage ใชเซลลเรมตนทมชวตในแตละขวดจ านวนเทากบ 0.5 x 106 เซลล/ มล. ในมเดยม (5% FCS + GMS) pH 7.2 ปรมาตร 200 มล. แลวน าไปเพาะเลยงทอณหภม 37°ซ. กวนดวยความเรวรอบ 400 รอบ/นาท เปนเวลา 48 ชวโมง เกบตวอยางเซลล 20 มล. เพอนบจ านวน เซลลทมชวตตรวจดความสมบรณของเซลล และค านวณหาเปอรเซนตรอดชวตเปรยบเทยบกบจ านวนเซลลเรมตนและเปรยบเทยบ passage ทใหปรมาณเซลลไมนอยกวา 2.4 x 106 เซลล/มล. ตามมาตรฐานวธปฏบตงานการเพาะเลยงเซลล BHK21C13 ชนดแขวนลอยในถงเฟอรเมนเตอรขนาด 50 ลตร (ส านกเทคโนโลยชวภณฑสตว, 2555) ซงใชเปนเกณฑตดสนในการน าไปเพาะขยายเซลลเพอการผลตในระดบอตสาหกรรมตอไป


กำรวเครำะหผล โดยเปรยบเทยบเปอรเซนตรอดชวตของเซลลและจ านวนเซลลเฉลยในแตละ passage เมอน ามา

เพาะเลยงหลงจากเกบรกษาของทง 4 กลมแลวน ามาเปรยบเทยบทางสถตโดย One-way ANOVA (multiple comparison แบบ Scheffe ) กำรนบจ ำนวนเซลล (Billie and Francis, 1981)

น าตวอยางเซลลปรมาตร 0.5 มล. ยอมสเซลลดวย Trypan blue ปรมาตร 0.5 มล. น าเซลลมาใสสไลดส าหรบนบเมดเลอด (Hemocytometer) ชนด Spencer bright line นบจ านวนเซลล ทอยบรเวณชองขอบทงสมมของสไลดทงหมด ซงมปรมาตรชองละ 1 x 10-4 มล. น าจ านวนเซลลทน บไดไปค านวณหาความเขมขนของเซลล/มล. โดยใชสตร C = ny x 104 เซลล/ มล. 4

C คอ ความเขมขนของเซลล/มล. n คอ จ านวนเซลลทอยบรเวณชองขอบทงสมมของสไลด ทงหมด y คอ dilution factor ของตวอยาง

ผล

พบวาเปอรเซนตรอดชวตเฉลยของเซลล BHK21C13 ชนดแขวนลอยทง 4 กลมหลงเกบรกษาไวเปนเวลา 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 และ 24 เดอน กลมท 2 และ 4 มเปอรเซนตรอดชวตเฉลยสงกวากลมท 1 อยางมนยส าคญ (P<0.05) สวนกลมท 3 และกลมท 1 ไมมความแตกตางอยางมนยส าคญ (P>0.05) ดงตารางท 2 เมอน าเซลล BHK21C13 ชนดแขวนลอยทง 4 กลมหลงเกบรกษาไวเปนเวลา 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 และ 24 เดอน ตามล าดบ มาเพาะเลยงจ านวน 5 passages พบวาจ านวนเซลลเฉลยในทก passage ของกลมท 2 และ 4 สงกวากลมท 1 อยางมนยส าคญ (P<0.05) สวนกลมท 3 และกลมท 1 ไมมความแตกตางอยางมนยส าคญ (P>0.05) ดงตารางท 3

วจำรณ

จากผลการทดลอง (ตารางท 2) พบวาการเกบรกษาเซลล BHK21C13 ชนดแขวนลอย ทอณหภม -80°ซ. โดยใชเครองแชเยอกแขงเซลล เปอรเซนตรอดชวตของเซลลและจ านวนเซลลเฉลยในแตละ passage สงกวาวธการเกบทใชในปจจบนอยางมนยส าคญ (P<0.05) เมอน ามาเพาะเลยงหลงจากการเกบรกษา ทงน เปนเพราะการเกบรกษาเซลลโดยวธปจจบน จะท าใหเกดผลกน าแขงภายนอกเซลลกอนทจะเกดผลกน าแขงภายในเซลล ซงผลกน าแขงภายนอกเซลลนจะท าใหเกดความเสยหายตอผนงเซลล ของเหลวภายในเซลลจะไหลออกสภายนอกเซลล ซงท าใหเซลลเสยหายและตายได การเกบรกษาเซลลโดยใชเครองแชเยอกแขงเซลลท าใหเซลลเยนลงอยางรวดเรว จะท าใหเกดผลกน าแขงภายในเซลลและภายนอกเซลลในเวลาใกลเคยงกน


ผลกน าแขงทเกดขนมขนาดเลกผนงเซลลจงไมเสยหาย เซลลยงคงสภาพและเกบรกษาไดเปนเวลานาน (Mazur, 1984) มเปอรเซนตรอดชวตทสงขนและขนตอนการเกบใชเวลานอยกวา

นอกจากนการใชเครองแชเยอกแขงเซลลยงชวยลดจ านวน passage ในการเพาะเลยงเซลลหลงการเกบรกษา เพอน าไปเปนเซลลเรมตนในการเพาะขยายเพอผลตเซลลในระดบอตสาหกรรมตอไป (ตารางท 3) ท าใหประหยดเวลา และลดขนตอนการปฏบตงาน

เมอเปรยบเทยบการใชมเดยม 2 ชนด การใช Cryo-SFM จะใหผลใกลเคยงกบการใชมเดยมทมซรม แสดงวาสามารถใชทดแทนกนได ทงนตองเปรยบเทยบขอดขอเสยในดานตางๆ เชน ตนทน คณภาพ และความสะดวกในการใชงาน

สรป

วธการลดอณหภมในการเกบรกษาเซลลชนดแขวนลอยโดยการใชเครองแชเยอกแขงเซลลซงสามารถควบคมอตราการลดอณหภมอยางสม าเสมอ ดวยไนโตรเจนเหลว ดกวาวธทใชในปจจบนซงลดอณหภมโดยน าเซลลไปแชในอณหภม 4°ซ. -20°ซ. และ -80°ซ. ดงนนสามารถน าเครองแชเยอกแขงเซลลมาใชในการเกบรกษาเซลลแทนวธการเดมได โดยใชมเดยม GMS+FCS+DMSO หรอมเดยม Cryo-SFM


ขอขอบคณเจาหนาทฝายผลตวคซนโรคปากและเทาเปอยทชวยใหการทดลองส าเรจลลวงดวยดและคณะกรรมการพฒนาวชาการทใหขอคดเหนทางดานวชาการ


ส านกเทคโนโลยชวภณฑ 2555 เรองมาตรฐานวธปฏบตงานการเพาะเลยงเซลล BHK21C13 ชนดแขวนลอย ในถงเฟอรเมนเตอรขนาด 50 ลตร (SOP-FCSM-030) หนา 3 Bird, B. R. and Forester, F. T. 1981. Basic Laboratory Techniques in cell culture. U.S. Department of Health

and Human Services, Public Health Service, Centers for Disease Control, Bureau of Laboratories, Laboratories Training and Consultation Division. p. 135.

Freshney, R. I. 2005. Introduction. In Culture of animal cells: a manual of basic technique, 5th ed. Hoboken N.J., John Wiley and Sons. pp. 1-9.

Mazur, P. 1984. Freezing of living cells : mechanism and implications. Am. J. Physiol. 247 : 125-142.


ปรมาณเซลล ปรมาณเซลล ปรมาณเซลล ปรมาณเซลล (× 108เซลล/ขวด) (× 108เซลล/ขวด) (× 108เซลล/ขวด) (× 108เซลล/ขวด)

± SD ± SD ± SD ± SD ± SD ± SD ± SD ± SD

3 0.78±0.02 78.3±1.5a 0.87±0.03 87.3±2.5b 0.76±0.02 76.3±1.5a 0.86±0.01 86.0±1.0b

6 0.75±0.01 75.0±1.0a 0.85±0.02 85.3±1.5b 0.73±0.02 72.5±1.5a 0.82±0.01 82.0±1.0b

9 0.71±0.02 71.0±2.0a 0.81±0.02 81.3±1.5b 0.70±0.02 69.7±1.5a 0.79±0.01 79.3±1.2b

12 0.68±0.02 68.3±1.5a 0.80±0.01 80.0±1.0b 0.65±0.01 65.0±1.0a 0.77±0.01 77.0±1.0b

15 0.66±0.01 66.0±1.0a 0.77±0.01 77.0±1.0b 0.62±0.01 62.0±1.0a 0.75±0.01 75.3±0.6b

18 0.64±0.02 63.7±1.2a 0.74±0.01 74.0±1.0b 0.59±0.02 59.0±2.0a 0.71±0.02 71.3±1.5b

21 0.61±0.01 61.0±1.0a 0.71±0.01 71.3±0.6b 0.58±0.02 58.0±2.0a 0.67±0.02 67.3±1.5b

24 0.59±0.02 58.7±2.1a 0.68±0.02 68.0±2.0b 0.55±0.03 55.0±2.6a 0.64±0.01 64.0±1.0b

หลงเกบ

(เดอน)% รอดชวต % รอดชวต % รอดชวต % รอดชวต

กลม 1 กลม 2 กลม 3 กลม 4

x x x x x x x x

ตำรำงท 2 ปรมาณและเปอรเซนตรอดชวตของเซลล BHK21C13 ชนดแขวนลอยหลงเกบรกษาไวเปนเวลา 24 เดอน

หมายเหต: ตวอกษร a, b ทตางกนเหนอตวเลขในแถวเดยวกน หมายถงมความแตกตางอยางมนยส าคญ (P<0.05)


ตำรำงท 3 ปรมาณเซลล BHK21C13 ชนดแขวนลอย 5 passages เมอน ามาเพาะเลยงหลงเกบรกษาไวเปนเวลา

24 เดอน

กลม 1 กลม 2 กลม 3 กลม 4ปรมาณเซลล ปรมาณเซลล ปรมาณเซลล ปรมาณเซลล

(×106 เซลล/มล.) (×106 เซลล/มล.) (×106 เซลล/มล.) (×106 เซลล/มล.) ± SD ± SD ± SD ± SD

3 1 2.45±0.02a 2.56±0.05b 2.45±0.02a 2.50±0.03b

2 2.47±0.01a 2.63±0.05b 2.46±0.02a 2.54±0.05b

3 2.50±0.02a 2.74±0.08b 2.49±0.02a 2.55±0.04b

4 2.51±0.01a 2.85±0.12b 2.52±0.04a 2.69±0.15b

5 2.54±0.01a 2.91±0.08b 2.55±0.06a 2.73±0.12b

6 1 2.06±0.02a 2.32±0.07b 2.03±0.02a 2.24±0.05b

2 2.45±0.02a 2.60±0.07b 2.50±0.05a 2.54±0.04b

3 2.48±0.01a 2.70±0.06b 2.51±0.06a 2.57±0.06b

4 2.51±0.02a 2.83±0.10b 2.55±0.06a 2.60±0.08b

5 2.53±0.01a 2.89±0.06b 2.57±0.07a 2.74±0.12b

9 1 1.92±0.03a 2.14±0.05b 1.83±0.03a 2.08±0.06b

2 2.43±0.02a 2.52±0.04b 2.25±0.17a 2.47±0.02b

3 2.47±0.02a 2.61±0.08b 2.46±0.01a 2.52±0.05b

4 2.49±0.02a 2.73±0.11b 2.49±0.03a 2.58±0.04b

5 2.51±0.02a 2.83±0.07b 2.51±0.07a 2.69±0.10b

12 1 1.83±0.02a 2.10±0.15b 1.74±0.02a 1.94±0.06b

2 2.25±0.02a 2.49±0.04b 2.11±0.03a 2.49±0.03b

3 2.44±0.03a 2.61±0.11b 2.42±0.03a 2.54±0.06b

4 2.52±0.01a 2.74±0.14b 2.47±0.02a 2.61±0.06b

5 2.54±0.02a 2.82±0.09b 2.49±0.01a 2.80±0.09b

15 1 1.51±0.02a 1.79±0.03b 1.58±0.04a 1.81±0.06b

2 2.03±0.02a 2.37±0.02b 1.84±0.05a 2.26±0.12b

3 2.44±0.04a 2.64±0.12b 2.14±0.03a 2.49±0.02b

4 2.51±0.04a 2.69±0.08b 2.42±0.03a 2.60±0.03b

5 2.55±0.05a 2.78±0.05b 2.47±0.02a 2.75±0.06b

หลงเกบ

(เดอน)Passage

x x x x


ตำรำงท 3 ปรมาณเซลล BHK21C13 ชนดแขวนลอย 5 passages เมอน ามาเพาะเลยงหลงเกบรกษาไวเปนเวลา 24 เดอน (ตอ)

กลม 1 กลม 2 กลม 3 กลม 4ปรมาณเซลล ปรมาณเซลล ปรมาณเซลล ปรมาณเซลล

(×106 เซลล/มล.) (×106 เซลล/มล.) (×106 เซลล/มล.) (×106 เซลล/มล.) ± SD ± SD ± SD ± SD18 1 1.32±0.02a 1.84±0.10b 1.62±0.11a 1.66±0.07b

2 1.46±0.06a 2.34±0.05b 1.78±0.10a 2.26±0.11b

3 2.02±0.05a 2.50±0.04b 2.09±0.06a 2.49±0.04b

4 2.42±0.03a 2.64±0.06b 2.43±0.02a 2.60±0.08b

5 2.45±0.03a 2.76±0.06b 2.45±0.02a 2.70±0.06b

21 1 1.20±0.02a 1.69±0.14b 1.17±0.02a 1.56±0.07b

2 1.51±0.03a 2.03±0.26b 1.31±0.03a 1.84±0.12b

3 1.81±0.07a 2.38±0.08b 1.84±0.03a 2.21±0.17b

4 2.05±0.21a 2.55±0.09b 2.28±0.03a 2.37±0.03b

5 2.44±0.04a 2.68±0.05b 2.46±0.09a 2.65±0.09b

24 1 0.88±0.04a 1.42±0.10b 0.87±0.02a 1.29±0.05b

2 1.25±0.09a 1.78±0.08b 1.16±0.03a 1.80±0.13b

3 1.56±0.14a 2.33±0.08b 1.33±0.02a 2.13±0.12b

4 2.12±0.13a 2.47±0.02b 1.80±0.08a 2.36±0.04b

5 2.43±0.03a 2.50±0.21b 2.43±0.02a 2.63±0.07b

หลงเกบ

(เดอน)Passage

x x x x

หมายเหต : ตวหนาหมายถง Passage ทผานเกณฑ (จ านวนเซลลไมนอยกวา 2.4x106 เซลล/มล.) ใชเพาะขยายจ านวน ตอไป : ตวอกษร a, b ทตางกนเหนอตวเลขในแถวเดยวกน หมายถงมความแตกตางอยางมนยส าค ญ (P<0.05)


Comparison of temperature reduction methods in the cryopreservation of BHK21C13 suspension cell

Anurak Trakarnrungsee1 Saipin khumsub1

Abstract

Two temperature reduction methods in the cryopreservation of BHK21C13 suspension cells were compared, i.e. a controlled- rate freezing by using cryogenic freezer and step freezing at 4 °C, -20°C then stored at -80°C. After storage, cell viability and average cell count were tested every three months for two years. The result showed that cells frozen by using cryogenic freezer had significantly (P <0.05) higher percentage of viable cells and cell number in each passage of cell recovery than cells frozen by step freezing. When compared the cryopreservative medium with serum to the medium without serum in each method, the viability and average cell count were not significantly different (P >0.05). In addition, for cells recovery after 12 months of longer storage to obtain sufficient number of cells for starting the cell expansion in an industrial scale, cells frozen by cryogenic freezer needed to be subcultured for less passages than cells frozen by step freezing. Therefore, cryogenic freezer could be used for storage BHK21C13 suspension cells in either serum containing medium or serum free cryopreservative medium. Key words: BHK21C13 suspension cells, cryopreservation, temperature reduction methods 1Bureau of Veterinary Biologics, Pakchong, Nakhonratchasima 30130


กำรท ำไวรสโรคปำกและเทำเปอยใหเขมขนโดยใชเครองกรอง แบบเมมเบรนเสนใยกลวงชนดโพลซลโฟน

อมรรตน สวสดสงห1 กงกานต บญสยา สโย2

บทคดยอ

ศกษาการท าไวรสโรคปากและเทาเปอยไทป O189 ใหเขมขนดวยเครองกรองแบบเมมเบรนเสนใยกลวงชนดโพลซลโฟนท MWCO 100,000 และ 500,000 ดาลตน โดยเกบตวอยางกอนการกรองและทความเขมขน 40 และ 100 เทา น ามาหาปรมาณอนภาค 146S ดวยวธ sucrose density gradient ultracentrifugation เพอเปรยบเทยบคาเปอรเซนต recovery และหาปรมาณโปรตนดวยวธ Lowry method เพอเปรยบเทยบคาเปอรเซนต purity พบวาเปอรเซนต recovery ของอนภาค 146S หลงผานเครองกรองท MWCO 100,000 และ 500,000 ดาลตน ไมมความแตกตางอยางมนยส าคญ (p > 0.05) ส าหรบคา purity พบวาท MWCO 500,000 ดาลตน มเปอรเซนต purity สงกวาท MWCO 100,000 ดาลตน อยางมนยส าคญ (p < 0.05) การทดลองครงนแสดงใหเหนวาเครองกรองแบบเมมเบรนเสนใยกลวงชนดโพลซลโฟน ท MWCO 500,000 ดาลตน สามารถกรองไวรสไดบรสทธกวาท MWCO 100,000 ดาลตน ทงนการเลอกใช MWCO ตองค านงถงวตถประสงค ปจจยอน ๆ รวมทงสภาวะในการกรองและความบรสทธทตองการ ค ำส ำคญ: เครองกรองแบบเมมเบรนเสนใยกลวง, โพลซลโฟนเมมเบรน, ไวรสโรคปากและเทาเปอย

1 ส านกเทคโนโลยชวภณฑสตว อ.ปากชอง จ.นครราชสมา 30130 2 ศนยอางองโรคปากและเทาเปอย ภมภาคเอเชยตะวนออกเฉยงใต อ.ปากชอง จ.นครราชสมา 30130


บทน ำ ส านกเทคโนโลยชวภณฑสตวผลตวคซนโรคปากและเทาเปอยดวยวธ suspension cell culture method

(Makarasen and Sinsuwonkwat, 1982) ซงมกระบวนการผลตเรมต งแต การเพาะเลยงเซลล BHK21C13 แบบแขวนลอย การเพาะและเพมปรมาณไวรส การแยกสวนน าไวรสออกจากกากเซลล การท าไวรสใหเขมขนและบรสทธ การท าใหไวรสหมดฤทธในการกอโรคและเกบรกษาไวรสทเขมขนและบรสทธในไนโตรเจนเหลวทอณหภม -198oC เพอเกบเปนสตอกแอนตเจนส าหรบน าไปผสมเปนวคซน การผลตวคซนโรคปากและเทาเปอยในปจจบนจะผลตเปนวคซนทมความบรสท ธ (purified vaccine) สงปราศจากการปนเปอนสวน non structure protein, NSPs ของไวรสโรคปากและเทาเปอยตามมาตรฐาน World organization for animal health, OIE (2012) ทงนวคซนทมความบรสทธสงจะตองมปรมาณอนภาค 146S สง ซง Crowther (1986) พบวาอนภาค146S และ 75S มคณสมบตเปน immunogen สามารถกระตนระบบภมคมกนไดด ดงนนในกระบวนการผลตวคซนโดยเฉพาะขนตอนการท าไวรสใหเขมขนและบรสทธเพอจดเกบเปนสตอกแอนตเจนและน าไปผสมเปนวคซนนน จ าเปนตองผลตแอนตเจนทมปรมาณอนภาค 146S มากทสด เพอใหไดวคซนทมประสทธภาพและใหความคมโรคสง

กระบวนการ ultrafiltration เปนกระบวนการท าความเขมขนโดยแยกสารโมเลกลใหญ เชน โปรตน เอนไซม รวมทงแบคทเรยและจลชพอนๆ ออกจากน าและสารโมเลกลเลกอนๆ ซงอาศยแรงดนต าเปนแรงขบดนใหของเหลวเคลอนผานชองวางของเมมเบรนในการแยกอนภาคแขวนลอยทมขนาดใหญออกจากของเหลว สวนใหญใชกบอนภาคทมน าหนกโมเลกล (molecular weight cut off, MWCO) 1,000-1,000,000 ดาลตน วสดทใชเปนเมมเบรนในกระบวนการ ultrafiltration ไดแก โพลซลโฟน เซลลโลส อะซเตท โพลพรอพลน ไนลอน โพลไวนลคลอไรด เปนตน (พฒนพงษ, 2552) ซงโพลซลโฟนเปนเมมเบรนทมความแขงแรงสง ทนอณหภมไดตงแต -100 ถง 150 องศาเซลเซยส สามารถฆาเชอโดยการนงดวยไอน าและสารเคมได มความทนทานทงในกรด-ดาง (pH 2-13) (GE Healthcare Bio-Science, 2014)

มรายงานการท าใหไวรสเขมขนโดยกระบวนการ ultrafiltration โดยใชเมมเบรนชนดโพลซลโฟน ใน Polio virus, Baboon endogenous virus (BaEV), Rubella virus, Influenza virus และ Enteric virus (Zhi-Guo and Clark, 1994) นอกจากนยงมการใชเมมเบรนชนดโพลซลโฟน มาใชในการกรองไวรสโรคปากและเทาเปอยใหเขมขนในกระบวนการผลตวคซนโรคปากและเทาเปอยของประเทศอารเจนตนา (GE Healthcare Bio-Science, 2014) โดยบรษทผผลตแนะน าใหเลอกเมมเบรนทม MWCO ขนาดเลกกวาโมเลกลเปาหมาย 3-5 เทา (GE Healthcare Bio-Science, 2007) ซงอนภาค 146S ของไวรสโรคปากและเทาเปอยมขนาดน าหนกโมเลกลเทากบ 8.08 x106 ดาลตน จงมแนวคดทจะศกษาเครองกรองแบบเมมเบรนเสนใยกลวง


ชนดโพลซลโฟน MWCO ท 100,000 และ 500,000 ดาลตน ในการท าไวรสโรคปากและเทาเปอยใหเขมขนและบรสทธสงขน เพอน ามาใชเปนขอมลในการสนบสนนและพฒนากระบวนการผลตวคซนโรคปากและเท าเปอยของส านก เทคโนโลยชวภณฑส ตว กรมปศส ตวให ไดมาตรฐานสา กลและมประสทธภาพดยงขน เพอรองรบการเขาสประชาคมเศรษฐกจอาเซยน หรอ AEC ในอนาคต


ตวอยำงไวรสโรคปำกและเทำเปอย

ไวรสโรคปากและเทาเปอยไทป O189 จากฝายผลตวคซนโรคปากและเทาเปอย ซงเพาะเลยงโดยใชเซลล BHK21C13 แบบแขวนลอย และเกด cytopathic effect (CPE) อยางสมบรณภายใน 20-24 ชวโมง และผานการท าใหน าไวรสใสโดยแยกกากเซลลทงดวยการปนเหวยงแบบตอเนองและกรองผานไสกรองขนาดรกรอง 3 ไมครอน เกบตวอยางจ านวน 5 ชด ชดละ 10 ลตร

เครองกรอง

เครองกรองแบบเมมเบรนเสนใยกลวงชนดโพลซลโฟนประกอบดวย Peristaltic pump1 และชดไสกรองเมมเบรนเสนใยกลวงชนดโพลซลโฟน ขนาด MWCO ท 100,0002 และ 500,0003 ดาลตน ซงมพนทการกรอง 650 ตร.ซม.

กำรท ำไวรสใหเขมขน

แบงตวอยางไวรสแตละชดเปน 2 กลม กลมละ 5 ลตร ดงน กลมท 1 กรองโดยใชเมมเบรนขนาด MWCO ท 100,000 ดาลตน

กลมท 2 กรองโดยใชเมมเบรนขนาด MWCO ท 500,000 ดาลตน โดยตงคาความเรวรอบการหมนของเครองปม เทากบ 260 รอบ/นาท และแรงดนเทากบ 5 บาร เกบ

ตวอยางปรมาตร 5 มลลลตร กอนการกรองและทความเขมขน 40 เทา และ 100 เทา เพอตรวจหาปรมาณอนภาค 146S และปรมาณโปรตน

1 รน QuixstandTM Benchtop System ของบรษท GE Healthcare Bio-Science, USA 2 Xampler cartride: Cat. No. UFP-100-C-4MA ของบรษท GE Healthcare Bio-Science, USA 3 Xampler cartride: Cat. No. UFP-500-C-4MA ของบรษท GE Healthcare Bio-Science, USA


กำรตรวจวเครำะหตวอยำง น าตวอยางไวรสทผานการท าใหเขมขนดวยเครองกรองแบบเมมเบรนเสนใยกลวงชนดโพลซลโฟน

ขนาด MWCO ท 100,000 และ 500,000 ดาลตน ในแตละชดของแตละกลม มาตรวจหาปรมาณอนภาค 146S โดยใชวธ 15-45 % sucrose density gradient ultracentrifugation (ไชยาและนพพร , 2543) และตรวจหาปรมาณโปรตนโดยวธ Lowry method (Lowry et al., 1951)

กำรวเครำะหขอมล

ค านวณหา percent recovery (% recovery) ของอนภาค 146S และหา percent purity (% purity) ของปรมาณโปรตนทงหมดในตวอยางไวรสเขมขน ดงน % Recovery = total amount of 146S particle in the concentrate X 100

total amount of 146S particle in the original volume % Purity = (total protein before concentration – total protein after concentration) X100 total protein before concentration

ค านวณคาทางสถตและเปรยบเทยบความแตกตางระหวาง MWCO ท 100,000 และ 500,000 ดาลตน โดยวธ student t-test

ผล

ผลการศกษาพบวาน าไวรสกอนการท าใหเขมขนดวยการกรองมคาปรมาณเฉลยของอนภาค 146S เทากบ 4.08 1.58 µg/ml และปรมาณโปรตนทงหมดเทากบ 4.49 3.31 mg/ml และไวรสทท าใหเขมขน 40 เทาของ MWCO ท 100,000 และ 500,000 ดาลตน มคาเฉลยของอนภาค 146S เทากบ 148.4 3.82 µg/ml และ 156.4 59.94 µg/ml ตามล าดบ และปรมาณโปรตนท งหมดมคาเทากบ 33.37 3.79mg/ml และ 25.80 4.73 mg/ml ตามล าดบ (ตารางท 1) และไวรสทท าใหเขมขน 100 เทาของ MWCO ท 100,000 และ 500,000 ดาลตน มคาเฉลยของอนภาค 146S เทากบ 373 111.12 µg/ml และ 387.4 125.76 µg/ml ตามล าดบ และปรมาณโปรตนทงหมดมคาเทากบ 50.00 ± 1.86 mg/ml และ 37.03 ± 2.65 mg/ml ตามล าดบ (ตารางท 2)


สรปและวจำรณ

จากผลการศกษาการใชเครองกรองแบบเมมเบรนเสนใยกลวงชนดโพลซลโฟนพบวา คา purity ของ MWCO ท 500,000 ทงความเขมขน 40 และ 100 เทา มเปอรเซนต purity สงกวา MWCO ท 100,000 ดาลตน อยางมนยส าคญ (p < 0.05) สอดคลองกบขอมลของ Barteling (2002) วาเมอใช MWCO ทมขนาดใหญจะท าใหมความบรสทธมากขน จากการทดลองหาเปอรเซนต recovery ของอนภาค 146S หลงผานเครองกรอง MWCO ท 100,000 และ 500,000 ดาลตน พบวาไมมความแตกตางอยางมนยส าคญ (p > 0.05) แสดงใหเหนวาเครองกรองแบบเมมเบรนเสนใยกลวงชนดโพลซลโฟน ขนาด MWCO ท 500,000 ดาลตนสามารถกรองไวรสใหมความบรสทธมากกวา MWCO ท 100,000 ดาลตน ทงนการเลอกใชขนาด MWCO ตองค านงถงวตถประสงค สภาวะในการกรอง ความบรสทธและปรมาณไวรสทตองการ รวมท งปจจยอนๆ และถาน าไปใชในระดบอตสาหกรรมตองมการศกษาเพมเตม ดงนนจากการศกษาครงนพอสรปไดวาสามารถน าเครองกรองแบบเมมเบรนเสนใยกลวงชนดโพลซลโฟน มาใชในการท าใหไวรสเขมขนได และสามารถใชเปนขอมลสนบสนนเพอปรบปรงและพฒนากระบวนการผลตวคซนโรคปากและเทาเปอยของส านกเทคโนโลยชวภณฑสตว กรมปศสตวใหไดมาตรฐานสากล


ขอขอบคณ สพ.ญ รชน อตถ ผเชยวชาญดานพฒนาแบคทเรยวคซนส าหรบสตว สพ.ญ.วไล ลนจงสบงกช ผเชยวชาญดานโรคปากและเทาเปอยและทปรกษากรมปศสตว และคณะกรรมการพฒนาวชาการส านกเทคโนโลยชวภณฑสตว ในการใหค าแนะน าและตรวจแกไขเรองเตมผลงานวชาการ ขอบคณเจาหนาทและพนกงานหองปฏบตการฝายผลตและฝายทดสอบวคซนโรคปากและเทาเปอยทกทานทใหความรวมมอในการด าเนนงานวจยครงนจนบรรลผลส าเรจ


ไชยา สงาประโคน และนพพร พฒนประสทธ 2543 การทดสอบหาปรมาณอนภาค 146S ในวคซนโรคปากและเท าเป อยส าห รบส กรชน ดน ามนแบบรวม 3 ไทป โดยว ธ sucrose density gradient ultracentrifugation วารสารชวผลตภณฑ 10(1-2): 61-71

พฒนพงษ ตชะรา 2552 การศกษาประสทธภาพการบ าบดน าเสยสงเคราะหความเขมขนสงโดยระบบถงปฏกรณ

ชวภาพแบบใชเมมเบรน มหาวทยาลยเกษตรศาสตร กรงเทพฯ แหลงทมา

http://kmcenter.rid.go.th/kcresearch/km/pdf/1650/VC02668.pdf 27 พฤษภาคม 2557


Barteling, S.J. 2002. Development and performance of inactivated vaccines against foot and mouth disease.

Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 21(3): 577-588.

Crowther, J.R. 1986. Antigenic structure of foot and mouth disease virus. Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz.

5(2): 299-314.

GE Healthcare Bio-Science. 2007. Purification technologies for vaccines and vectors. Uppsala, Sweden.

pp. 12-13.

GE Healthcare Bio-Science. 2014. Cross flow filtration method handbook. Uppsala, Sweden. p.19.

Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Lewis, F.A. and Randall, R.J. 1951. Protein measurement with the folin

phenol reagent. J. Biol. Chem. 193: 265-275.

Makarasen, P. and Sinsuwonkwat, P. 1982. Vaccine Production. Proceedings in Third country training

Program on foot and mouth disease control (group training course), 24 February – 16 March,

Bangkok, Thailand. pp. 180-201.

World organization for animal health (OIE). 2012. Foot and Mouth Disease. In Manual of Diagnostic Test

and Vaccines for Terrestrial Animals. Seventh edition. Chapter 2.1.5 pp. 145-173.

Zhi-Guo, S. and Clark, K.C.. 1994. Crossflowmembrane filtration. In Roger, G.H.( ed.) , Protein purification

process engineering. Marcel Dekker, Inc. New York. USA. pp. 77-78.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12523698


ตำรำงท 1 ผลการวเคราะหตวอยางไวรสทท าใหเขมขน 40 เทา

กำรวเครำะห MWCO (ดำลตน)

100,000 500,000

146S (µg/ml) (mean SD) 148.443.32 156.459.94 Total protein content (mg/ml) (mean SD) 33.373.79 25.804.73

% Recovery 92.98a 95.84a % Purity 81.30a 85.09b ตวอกษร a, b ทตางกนในแตละแถวหมายถงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญ (p < 0.05)

ตำรำงท 2 ผลการวเคราะหตวอยางไวรสทท าใหเขมขน 100 เทา

กำรวเครำะห MWCO (ดำลตน)

100,000 500,000

146S (µg/ml) (mean SD) 373111.12 387.4125.76 Total protein content (mg/ml) (mean SD) 50.00±1.86 37.03 ±2.65

% Recovery 93.34a 96.09a % Purity 87.64a 91.45b ตวอกษร a, b ทตางกนในแตละแถวหมายถงมความแตกตางกนอยางมนยส าคญ (p < 0.05)


Concentration of foot and mouth disease virus by hollow fiber ultrafiltration using polysulfone membrane

Amornrat Sawatsing1 Kingkarn Boonsuya Seeyo2

Abstract

The concentration of foot and mouth disease virus (FMD) virus type O189 by polysulfone hollow fiber ultrafiltration was studied. Clarified FMD viral fluids were concentrated by ultrafiltration using the polysulfone membrane with molecular weight cutoff (MWCO) values of 100,000 and 500,000 Daltons. The samples were collected before the ultrafiltration process and after 40 and 100 times concentrations. The quantification of 146S particles by sucrose density gradient ultracentrifugation and total protein by Lowry method were carried out to determine recovery and purity of 146S particles. The recovery of 146S particles after ultrafiltration, at 40 and 100 times concentrations, using the membrane with MWCO of 100,000 Daltons were found to be no significant difference with MWCO of 500,000 Daltons. For the purity, using MWCO 500,000 Daltons resulted in significantly higher purity than the MWCO of 100,000 Daltons. This experiment indicated that the hollow fiber ultrafiltration using polysulfone membrane with higher MWCO tend to give a better purity concentrated virus than the lower MWCO. However, the selection of an appropriate membrane pore size requires the consideration of other factors including operating conditions and the purity requirement of the final product, for further pilot scale experiment. Key words: hollow fiber ultrafiltration, polysulfone membrane, foot and mouth disease virus 1 Bureau of Veterinary Biologics, Pakchong, Nakhonratchasima 30130 2 Regional Reference Laboratory for Foot and Mouth Disease in South East Asia, National Institute of Animal Health, Pakchong, Nakhonratchasima 30130


ควำมรและหลกกำรเบองตนดำน Bio-safety และ Bio- security หองปฏบตกำร (Knowledge and basic principle of laboratory biosafety and biosecurity)

สพ.ญ.วไล ลนจงสบงกช1

หลกกำรและเหตผล

เนองจากกรมปศสตวมนโยบายในการพฒนาศกยภาพหองปฏบตการใหมขดความสามารถในการตรวจสอบและตรวจวนจฉยโรคทางสตวแพทยไดอยางมประสทธภาพไดมาตรฐานสากลและมความปลอดภยทางชวภาพทงตอผปฏบตงานและตอสงแวดลอม เพอสอดคลองและรองรบโรคระบาดในปจจบนซงสวนใหญเปนโรคอบตใหม บางครงเปนโรคทเกดอบตซ า หรอโรคประจ าถนทระบาดอยางตอเนองซงอาจมสาเหตมาจากการเปลยนแปลงคณสมบตหรอการกลายพนธของเชอหรอผลกระทบจากภาวะโลกรอน ท าใหเกดความรนแรงและอนตรายมากขน ไดแกโรคไขหวดนก (Avian influenza), โรคไขหวดใหญสายพนธใหม หรอโรคปากและเทาเปอยชนด exotic เปนตน สงผลใหเกดความเสยหายทางเศรษฐกจอยางมหาศาล ดวยเหตผลดงกลาวจงมการจดท าระบบมาตรการความปลอดภยและความมนคงทางชวภาพของหองปฏบตการของหนวยงานภายในกรมปศสตวห รอ Laboratory Bio-safety and Bio-security โดยมวตถประสงคเพอใหเกดความรและความเขาใจในการปฏบตงานทเกยวกบเชออนตรายไดอยางถกตอง เปนการลดความเสยง เพมความปลอดภยใหกบผปฏบตงานและปองกนการรวไหลของเชออนตรายไปสชมชนและสงแวดลอม

Bio-safety หรอความปลอดทางชวภาพ เปนหลกการและวธปฏบตมาตรฐานของเจาหนาทหองปฏบตการใหสามารถปฏบตงานกบเชออนตรายไดอยางปลอดภย โดยมอปกรณทสามารถควบคมใหเกดความปลอดภยและปองกนการแพรกระจายเชอไมใหเปนอนตรายตอผปฏบตงาน

Bio-security หรอความมนคงทางชวภาพ เปนหลกการและวธปฏบตมาตรฐานดานความปลอดภยในการปองกนคน สตวหรอสงมชวตใหมความปลอดภยจากเชอโรค และเปนการปองกนไมใหเชออนตรายมผลกระทบตอสงแวดลอม จ าเปนตองมการตดต งระบบการควบคมความปลอดภยของอาคารหรอหองปฏบตการอยางสมบรณ (complete microsecurity system)

1 ผเชยวชาญดานโรคปากและเทาเปอย ทปรกษากรมปศสตว สถาบนสขภาพสตวแหงชาต


หลกกำรและมำตรฐำนเบองตนของ bio-safety and bio-security laboratory

หลกการดานความปลอดภยและความมนคงทางชวภาพเกยวกบการปฏบตงานกบเชออนตรายประกอบดวยอปกรณส าหรบควบคมความปลอดภยผปฏบตงานเชน personnel protective equipment (PPE) ไดแก เสอกาวน ถงมอ หมวก ผาปดปาก แวนตานรภย หรออปกรณส าหรบปองกนเชอไดแก biological safety cabinet class II , UV light cabinet ตนงหรออบฆาเชอ (autoclave or hot oven) เปนตน

ส าหรบระบบความปลอดภยของหองปฏบตการหรออาคารทมความปลอดภยทางชวภาพ ตองมการออกแบบใหถกตองตามมาตรฐานและสามารถใชงานไดอยางสมบรณและมประสทธภาพตามหลก Bio-security laboratory ซงสามารถแบงระดบหองปฏบตการหรออาคารตามมาตรฐานสากล ได 4 ระดบ ดงน

1. ควำมปลอดภยทำงชวภำพระดบ1 (Bio-safety laboratory level-1, BSL-1) 2. ควำมปลอดภยทำงชวภำพระดบ 2 (Bio-safety laboratory level-2, BSL-2)

เปนหองปฏบตการทปฏบตงานเกยวกบเชอทมความเสยงปานกลาง ไมตดตอโดยทางเดนหายใจ เช น hepatitis B, Salmonella, Measles virus, toxoplasma เปนตน อปกรณ ควบ คมความปลอดภยไดแ ก biological safety cabinet ม เค รอ งหมาย biohazard บอกชอโรคและชอบคคลทเขาปฏบต งานในหองน มอปกรณวทยาศาสตรทจ าเปน อปกรณปองกนไดแก เสอกาวน ถงมอ แวนตานรภย

เปนหองปฏบตการทปฏบตงานเกยวกบเชอทไมกอใหเกดโรคหรอเปนอนตรายตอมนษย สตว หรอผปฏบตงาน หองปฏบตการเปนแบบปดมประตชนเดยว โตะปฏบตงาน อางลางมอ อปกรณไดแก Fume hood, เครองมอวทยาศาสตรเบองตน, เสอกาวน ถงมอและแวนตานรภย ไมจ าเปนตองอาบน าเขา-ออก

Fume hood

Fume hood


3. ควำมปลอดภยทำงชวภำพระดบ 3 ( Bio-safety laboratory level-3, BSL-3) เปนหองปฏบตการทปฏบตงานเกยวกบเชอกอใหเกดโรคหรอเปนอนตรายกบมนษย สตวหรอ

ผปฏบตงานและตดตอโดยทางเดนหายใจ ระดบอนตรายเชออาจเปนอนตรายถงชวตหรอเปนโรคทไมเคยมระบาดในประเทศ เชน FMD exotic type, Avian influenza, H5N1, H1N1 หรอ H7N9 เปนตน อปกรณควบคมความปลอดภยไดแก biological safety cabinet class II เครองมอวทยาศาตรทจ าเพาะเพอปองกนการแพรกระจาย มเค รองหมาย biohazard เขมงวดกบบคคลเขา-ออกและตองปฏบตตามค มอการใชหองปฏบตการอยางเครงครด ตองแสดงชอผมสทธใชหองปฏบตการ มการควบคมบคคลภายนอกเขามาบรเวณเขตควบคม โดยใช access door หรอกญแจเฉพาะ อาคารหรอหองปฏบตการตองมการตดตงระบบควบคมความปลอดภยทางชวภาพเพอปองกนการรวไหลเชอไปสสงแวดลอม (complete microsecurity system) ไดแกระบบความดนตดลบ (negative pressure system), ระบบดกกรองเชอทางอากาศ (HEPA filter system) ทมประสทธภาพกรองไมนอยกวา 99.99% กอนปลอยอากาศออกนอกอาคาร, ระบบจายอากาศเขา-ออก 100% ตองไมมการดงอากาศภายในกลบเขามาใชใหม, ระบบบ าบดน าเสย (biowaste treatment) ตองผานกระบวนการฆาเชอกอนปลอยออกนอกอาคาร, ผปฏบตงานตองเปลยนชดปฏบตการแบบ 100% และตองอาบน า สระผมกอนออกนอกพนทเขตควบคม, มประตเขา-ออกเปนแบบ air-locked system ส าหรบควบคมและรกษาความดนตดลบใหคงท

ภาพระบบ microsecurity อาคาร BSL3 ของศนยอางองโรคปากและเทาเปอยฯ ไดแก ระบบจายอากาศเขา-ออก ระบบดกกรองเชอทางอากาศ ระบบบ าบดน าเสย อปกรณฆาเชอตาง ๆเชน pass box, dunk tank และ 2-door autoclave เปนตน


4. ควำมปลอดภยทำงชวภำพระดบ 4 (Bio-safety laboratory level-4, BSL-4) เปนหองปฏบตการทปฏบตงานเกยวกบเชอทกอโรคหรอเปนอนตรายถงชวตและมโอกาสตดผ

ปฎบตงานไดสง ไดแกโรคตดตอระหวางคนและสตว เชน NIPPA, SARS เปนตน อปกรณทควบคมความปลอดภยไดแก ต isolator และตองอยในพนทความดนตดลบสงกวาปกต พรอมอปกรณฆาเชออยภายใน เครองมอวทยาศาสตรทจ าเพาะเพอปองกนการกระจายเชอ ชดปฏบตการพเศษปองกนการตดเชอระหวางปฏบตงาน มการฉดพนน ายาฆาเชอเสอผาผปฏบตงานและตองอาบน าและเปลยนชดใหมกอนออกนอกพนทปฏบตงาน

ตวอยางเครองหมาย Biohazard, ต isolator และชดปฏบตการพเศษส าหรบเจาหนาทผปฏบตงานใน หองปฏบตการ BSL4 (แหลงรปภาพ: Australian Animal Health Laboratory, AAHL, ออสเตรเลย)

ตวอยางอปกรณควบคมความปลอภยผปฏบตงาน (Personnel Protective Equipment, PPE) ทใชใน หองปฏบตการ (แหลงรปภาพ : Australian Animal Health Laboratory, AAHL, ออสเตรเลย)

เอกสำรอำงอง - Biosafety in microbiological and Biomedical Laboratories, CDC , NIH, 4th Edition 1999. - Laboratory Biosafety Manual, 3rd Edition, World Health Organization (WHO), Geneva, 2004.


“เขมในกองฟำง”

ความรทแฝงในตวบคคลเปรยบเหมอนเขมทซอนอยในกองฟาง ถาคนหาพบและน าออกมาใชกสามารถกอประโยชนได

ความรทมอยในตวคน ถาไมมการน าออกมาเปดเผย ถายทอด แลกเปลยนความรระหวางกน ในทสด

ความรกจะสญหายไปพรอมตวคนนน ความรทขาดการจดเกบอยางมระบบ และไมมการน าความรนนไปใชประโยชนในการปฏบตงาน

ความรนนกจะไมย งยน


กำรท ำเครองหมำยหนไมซดวยวธงำยๆ (Simple method for mouse identification)

สพ.ญ.รชน อตถ1

การทดสอบคณภาพวคซนของส านกเทคโนโลยชวภณฑสตว เชน การทดสอบความปลอดภย และ

ความคมโรคของวคซน สวนใหญวเคราะหผลโดยการนบจ านวนสตวทดลองทมปฏกรยาตอบสนองตอวคซนเปนอตราหรอเปอรเซนตสตวรอด หรอตาย หรอแสดงอาการปวยจากจ านวนสตวทงหมดทใชในการทดลอง ซงมกใชสตวทดลองขนาดเลกเชน หนไมซ หนตะเภา เปด หรอไก จงไมจ าเปนตองท าเครองหมายทตวสตว เพยงแตมปายชอระบเปนกลมทดลองตดทกรงหรอคอก แตบางการทดลอง เชน การตดตามระดบภมคมโรค ทตองเจาะเลอดเปนระยะ และตองใชผลการทดลองรายตว จ าเปนตองท าเครองหมายทตวสตว เชน เปด ไก ใชวธหนบเบอรทปก ซงมกไมคอยมปญหาอะไร เพราะมการใชบอย จงมอปกรณพรอม แตส าหรบหนไมซซงในส านกเทคโนโลยชวภณฑสตวยงไมเคยมการทดลองทตองตดตามผลเปนรายตวมากอนจงตองหาวธท าเครองหมายทเหมาะสม วธท าเครองหมายทตวหนไมซมหลายวธ ดงน 1. การแตมส 2. การเจาะรใบห 3. การตดเบอรห 4. การฝงไมโครชบ 5. การสก

1 ผเชยวชาญดานพฒนาแบคทเรยวคซนส าหรบสตว ส านกเทคโนโลยชวภณฑสตว


ทมา:http://www.theodra.com/rodent_laboratory/identification.html

จากวธทกลาวมาขางตนทงหมดตองใชอปกรณทงสน แตวธท 1 การแตมส ใชอปกรณทหางายกวาวธอน เพยงแตเลอกวาจะใชอะไรมาแตมสทจะท าใหสตด เดมใชปากกา permanent marker ซงใชในหองแลปทวไป น ามาเขยนทหลง ขาหนาและขาหลง ตามแตก าหนดรหสวาแตมสทต าแหนงใดอานเปนหมายเลขอะไร แตสทเขยนดวย permanent marker ไวตดอยเพยงวนเดยวสกจางหายไปหมดท าใหเกดปญหาในการทดลอง จงแกปญหาเฉพาะหนาโดย แตมสทบทกวน ซงท าใหยงยากและเสยเวลามาก

ตอมามโอกาสคยกบเพอนรวมอาชพชาวไตหวน ซกถามกนไปมาในวงสนทนากไดความรวา เขาใช Picric acid แตมสทขนหนไมซ เปนสเหลอง สตดทนนานหลายเดอน แตกตองจดหาซอมาเพราะหองแลปของส านกเทคโนโลยชวภณฑสตวไมไดใชสารนเลย เพอนอกคนเลาวาเคยมคนเอายายอมผมของคนนแหละมาท าเครองหมายทตววว หรอหม จงเกดความคด หายายอมผมมาใชบางซงกไดผลดมาก เพราะขนของสตวกเหมอนผมคนนนเอง หลงจากนนกใชยายอมผมของคนยหอทเปนครมในซองเลกๆเพราะราคาไมแพง น ามาแตมสท าเครองหมายทตวหนไมซไดเปนรอยตว สตดทนนานตลอดการทดลองประมาณ 2 เดอน และหากสเรมจางกเตมสไดตลอดเวลา ซงปจจบนยงคงท าเครองหมายหนทดลองดวยการใชยายอมผมนอยเพราะสะดวกและปลอดภย ไมท าใหหนทดลองเจบปวด

การใช permanent marker สจางหายภายใน 1-2 วน

1-2 วน


การใชยายอมผมแตม สตดทนนานอยางนอย 2 เดอน

การท าเครองหมายสวนใหญจะใสหนขาวในกลอง ๆละ 5 ตว ดงนนท าเครองหมายตวหนขาวในกลองโดยแตมยายอมผมทหนไมซบนต าแหนงทแตกตางกนเพยง 5 ต าแหนงเทานน ผนวกกบเลขก ากบเบอรกลองแตละกลองกสามารถระบตวหนไมซในการทดลองไดอยางไมสบสนแลว ดวยวธงาย ๆคาใชจายไมแพง

ตวอยำงกำรก ำหนดรหสประจ ำตวหน

2 เดอน

1 2 5 3 4


หลอดกกหนไมซอยำงงำย !!! (Simple mouse restrainer)

อารรตน แพงเพง1 สพ.ญ.วราพร สนสวงศวฒน1

ปกตเราจะคนเคยกบการควบคมหนดวยมอ โดยการจบหนงคอและลอคหางหน แตบางครงการควบคมหนกไมงายอยางทคด โดยเฉพาะมอใหมหรอมอเกาแตหางหาย มกจะบบหนงคอหนไมอยและจะโดนหนแวงกดไดบอยครง หรอบางครงบบหนงคอผดต าแหนง หนอาจหายใจไมออกและสนใจคามอได

ภาพตวอยาง เทคนคการจบหนดวยมอเปลา โดยการดงหนงคอและลอคหางหน

ดวยปญหาดงกลาว “หลอดกกหนอยางงาย” จงถกท าขนเพอชวยในการควบคมหนไมซขณะปฏบตงานเจาะเลอด หรอฉดวคซน โดยหลอดนสามารถชวยลดความเจบปวด ความเครยดของหน จากการบบจบ และยงสามารถชวยปองกนผปฏบตงานจากการโดนกด 1 กลมวจยและพฒนา ส านกเทคโนโลยชวภณฑสตว

B A

C


หลอดกกหน ถกท ำขนจำกวสดงำยๆ ดงน 1. กระบอกฉดยา ขนาด 60 มล. 2. มดคตเตอร 3. ปากกา 4. ลวดยาว 15 ซม. หรอลวดหนบกระดาษใหญ มวธกำรท ำ 3 ขนตอน ดงน 1. ตดสวนปลายใหเปนชองเปด 2. ตดตามแนวยาวของหลอดใหเปนชองสเหลยมผนผาขนาด ประมาณ 5X1 ซม. 3. เจาะรทปลายหลอดดานชองเปด เพอใชสอดลวดส าหรบกนหน

วธกำรใชงำนหลอด 1. จบหนทสวนปลายหาง และวางหนไวบนโตะหรอฝากรง

2. ปลอยหนใหวงเขาหลอดกก

1 2

3


3. สอดลวดผานร เพอกนหนไว จากนนดนกานหลอดลงเพอใหชองพอดกบตวหน

ตวอยำงกำรใชงำนหลอดกกหนอยำงงำย

1. การฉดยาเขาใตผวหนง ดงหนงทหลงของหน ผานชองทเจาะตามแนวหลอด

2. การฉดยาเขากลาม ดงขาหลงของหนออกมาทางชองทเจาะตามแนวหลอด


3. การเจาะเลอดทหาง

ขอเสนอแนะ สามารถน าแนวคดของ “หลอดกกหน” ไปประยกตใชกบสตวทมขนาดใหญขน เชน หนตะเภา

กระตาย เปนตน ทงนควรค านงถงขนาดทอกกใหเหมาะสมกบขนาดสตว เพอไมใหสตวเครยด และอดอดเกนไป

Documents

วารสารชีวผลิตภัณฑ์ - DLDbiologic.dld.go.th/th/images/file/book/journal/doc... · 2014-11-14 · วารสารชีวผลิตภัณฑ์