AFLP

9-2007 Biotechnological Section, Department of Biology, Hue University of Sciences

Kỹ thuật dựa trên cơ sở PCR

Đa hình độ dài các đoạn khuyếch đại

Amplified fragment length polymorphisms

(AFLPs)


Nội dung

• Những nét chính• Các bước của kỹ thuật AFLP

– Phân giải và kết nối DNA– Phản ứng PCR và sự thăm dò– Tóm tắt của kỹ thuật này

• Phương tiện• Dịch mã các bands AFLP• Những thuận lợi và bất lợi của AFLP• Ứng dụng


Những nét chính của kỹ thuật AFLP

Kỹ thuật AFLPs được phát triển bởi Keygene (Netherlands), một công ty công nghệ sinh học tư nhân và thuộc quyền sở hữu công nghệ của công ty này.

Những nét chính:– Một sự kết nối giữa kỹ thuật RFLP và PCR– Dựa vào sự khuyếch đại PCR một cách chọn lọc các

phân đoạn cắt hạn chế của DNA bị phân giải– Phương pháp có độ nhạy cao trong việc tìm dấu vết

của DNA của bất kỳ nguồn gốc nào hay sự phức tạp nào

– Có thể thực hiện với DNA của toàn hệ gen hay với cDNA (bản sao nguyên bản)


Bốn bước chính

1. DNA được phân giải bởi hai enzyme cắt hạn chế khác nhau

2. Phần nối (adapter) oligonucleotide được nối với những đầu tận cùng của các phân đoạn DNA

3. Các tập hợp con đặc trưng của các sản phẩm phân giải DNA được khuyếch đại, sử dụng kết hợp các primer chọn lọc

4. Thăm dò sự đa hình có thể thực hiện được với các đồng vị phóng xạ, nhuộm huỳnh quang hay nhuộm bạc


Phân giải và kết nối DNA

• Enzyme cắt hạn chế thứ nhất (điểm nhận biết 4 bases, vd:Msel)

• Enzyme cắt hạn chế thứ 2 (điểm nhận biết 6 bases, vd: EcoRI)

• Những phần kết nối 2 dãy được tổng hợp đặc biệt đối với mỗi điểm cắt hạn chế được gắn với đoạn DNA tiếp theo


PCRs và sự thăm dò

• Một phản ứng PCR thứ nhất được thực hiện (pre-selective PCR), dùng những primer oligonucleotide (17-21 nucleotides) có trình tự bổ sung với adapter và restriction sites. Một nucleotide được thêm vào primers để chỉ chọn những tập con của các phân đoạn

• Những sản phẩm khuyếch đại tiền chọn lọc rồi phải trải qua một phản ứng PCR khác, lại một lần nữa một tập hợp con của các phân đoạn lại được chọn. Thường thì đối với sự khuyếch đại chọn lọc thứ 2, 2 nucleotides phụ sẽ được thêm vào primers

• Những phân đoạn được phân tách bằng điện di gel gây biến tính polyacrylamide (gel trình tự) hay điện di gel thẩm thấu


Sơ đồ tóm tắt của AFLPs


Phương tiện

• Nguồn– Nước cất– Hoá chất

• Dụng cụ– Tủ lạnh, tủ đông sâu– Laminar có dòng hút khí– Máy li tâm– Máy PCR– Máy điều chỉnh nguồn điện – Microwave– pHmeter– Cân chuẩn– Máy điện di phương thẳng đứng– Máy soi màu cực tím (UV transilluminator)


Dịch mã các bands AFLPs• Cơ sở phân tử của đa hình AFLP thường được tạo ra ở

mức độ nucleotide• Kỹ thuật AFLP thăm dò sự đa hình xuất hiện từ các thay

đổi (hình dáng hay kích cỡ) trong những điểm cắt hạn chế hoặc cạnh những điểm cắt này, được gây ra do thiếu các nu. ở đầu 3’ và làm ngăn cản sự khuyếch đại– Những enzyme cắt hạn chế khác nhau có thể được sử dụng,

những sự kết nối khác nhau của các nucleotide chọn lọc và tiền chọn lọc sẽ gia tăng tìm kiếm các đa hình có ích

– Càng nhiều nucleotide chọn lọc thì càng ít đa hình được thăm dò– Những bands thường được ghi cả khi hiện diện hay không– Những bands dị hợp ngược lại với đồng hợp có thể được thăm

dò dựa vào độ dày các dấu hiệu, mặc dù điều này có thể đòi hỏi sự tinh tế


Một bản gel chạy với thuốc nhuộm huỳnh quang

• Đây là hình ảnh một AFLP gel chạy trong máy đọc trình tự tự động. Trước khi load mẫu vào gel, mẫu được gắn với 3 loại thuốc nhuộm huỳnh quang (yellow, blue, green). Màu đỏ gắn với mẫu điều khiển cùng với các mẫu khác để điều khiển sự trình diễn trong điện di. Việc biết chắc sự hiện diện hay vắng mặt của một band nhất định là không thể làm được bằng mắt thường mà phải nhờ vào máy laser và dữ liệu được thu thập với sự giúp đỡ của phần mềm máy tính đặc biệt


AFLPs được thăm dò bằng nhuộm bạc


Những ưu điểm của kỹ thuật AFLPs

• AFLPs cho phép kiểm tra nhanh sự đồng hình trên toàn bộ gene

• Bởi vì một lượng lớn các bands được sinh ra, mỗi marker sẽ cho ra một dấu hiệu informative cao

• Khả năng lặp lại cao• Không cần biết trước về thông tin của các trình tự và

việc tạo ra các đầu dò là cần thiết• Rất có ích trong trong việc tạo ra nhanh bản đồ gene• ‘transcript profilling’ (sự chép lại nguyên bản-sao bản)


Những bất tiện của phương pháp này

• AFLPs tạo ra một lượng lớn thông tin cần phải được phân tích tự động, vì thế cần sự giúp đỡ của kỹ thuật máy tính cao

• AFLP marker biểu hiện sự ưu thế• Trong xây dựng bản đồ di truyền, AFLPs

thường tập trung lại ở vùng centromeres và telomeres

• Chúng đòi hỏi những kỹ thuật phòng thí nghiệm và đặc biệt là phân tích dữ liệu


Ứng dụng

• Đánh giá đa dạng di truyền

• Phân tích độ dài di truyền

• Kiểm tra dấu hiệu di truyền

• Phân tích bộ sưu tập nguồn gene (germplasm collections)

• Xây dựng bản đồ gene

• Quản lý các chỉ thị thăm dò


Tóm lại

• Kỹ thuật AFLP dựa vào sự khuyếch đại chọn lọc các phân đoạn hạn chế sau khi phân giải DNA

• Nó thăm dò sự đa hình gây ra bởi những thay đổi trong những điểm hạn chế hay những vùng lân cận

• Kỹ thuật này tạo nên một lượng lớn bands trong một lần chạy, và các bước tiến hành đòi hỏi kỹ thuật cao


Câu hỏi

• Các bước khác nhau liên quan đến quá trình thực hiện kỹ thuật AFLPs

• Những quan tâm chính khi dịch mã các bands AFLP

• Những thuận lợi và bất lợi của AFLP trong phân tích đa dạng di truyền

Documents

AFLP