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I
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
“AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
MICROORGANISMOS PRESENTES EN SUELOS
CONTAMINADOS CON HIDROCARBUROS
DERIVADOS DEL PETRÓLEO”
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
PARA OBTENER EL TÍTULO DE
QUÍMICO BACTERIÓLOGO PARASITÓLOGO
P R E S E N T A :
FLORES PÉREZ DENISSE JACQUELINE
ASESOR DE TESIS:
Q.B.P. SILVANO MONTES VILLAFÁN
COASESOR DE TESIS:
DRA. AÍDA VERÓNICA RODRÍGUES TOVAR
MÉXICO, D. F., 2011
II
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de
Fisiología Vegetal del Departamento de Botánica en
colaboración con el Laboratorio de Micología Médica del
Departamento de Microbiología de la Escuela Nacional de
Ciencias Biológicas, del Instituto Politécnico Nacional, bajo
la dirección de:
Asesor: Q.B.P. Silvano Montes Villafán
Coasesor: Dra. Aída Verónica Rodríguez Tovar
III
AGRADECIMIENTO
El presente trabajo está dedicado a todas las personas que siempre confiaron
en mí y siempre me apoyaron.
Gracias sobre todo a mis padres por todo su esfuerzo, cuidado, amor y
comprensión.
También agradezco a Alejandro por brindarme, su compañía, amor y paciencia,
y por darme ánimos todo el tiempo.
A mi asesor el Q.B.P. Silvano Montes Villafán, gracias por su tiempo, dirección,
sus consejos y sugerencias para la elaboración de este proyecto, también por
dejarme ser creativa y diseñarlo.
A mi coasesora la Dra. Aída Verónica Rodríguez Tovar por su apoyo y
orientación.
Agradezco también a la Dra. Angélica Rodríguez Dorantes por las muestras de
suelo que me proporcionó y que hicieron posible este trabajo.
A mis compañeros y amigos Leslie, Esmeralda, Olivia y Humberto muchas
gracias por su amistad, compañía y por hacerme tan agradable y divertida la
estancia en la escuela.
IV
ÍNDICE
1 Introducción ........................................................................................................ 1
1.1 El petróleo ......................................................................................................... 1
1.2 Composición del petróleo .................................................................................. 2
1.3 Refinería y extracción del petróleo .................................................................... 5
1.4 Técnicas para remediación de suelos contaminados con hidrocarburos ......... 5
1.5 Biorremediación ................................................................................................ 5
1.6 Microorganismos involucrados en la biodegradación de HTP y HAP ............... 8
1.7 Efecto de los factores ambientales sobre la biodegradación de
hidrocarburos ......................................................................................................... 9
1.7.1 Temperatura ................................................................................................... 9
1.7.2 pH ................................................................................................................. 10
1.7.3 Salinidad ....................................................................................................... 10
1.7.4 Presión ......................................................................................................... 10
1.7.5 Oxígeno ........................................................................................................ 11
1.7.6 Nutrientes ..................................................................................................... 11
1.8 Métodos para el aislamiento y la identificación de bacterias degradadoras
de HAP Y HTP ...................................................................................................... 12
2 Justificación ..................................................................................................... 14
3 Objetivos ........................................................................................................... 15
3.1 Objetivo general .............................................................................................. 15
3.2 Objetivos particulares ...................................................................................... 15
4 Materiales y Métodos ....................................................................................... 16
4.1 Análisis fisicoquímico del suelo ....................................................................... 16
4.1.1 Textura ......................................................................................................... 16
4.1.2 Humedad relativa y Capacidad de retención de agua .................................. 19
4.1.3 pH ................................................................................................................. 20
4.1.4 Materia orgánica ........................................................................................... 20
4.1.5 Capacidad de intercambio iónico ................................................................. 21
4.1.6 Conductividad eléctrica del suelo ................................................................. 21
4.2 Análisis microbiológico del suelo ..................................................................... 22
4.2.1 Pruebas de tolerancia a los hidrocarburos ................................................... 24
V
4.3 Prueba de oxidasa .......................................................................................... 25
4.4 Aislamiento de DNA genómico ........................................................................ 26
4.5 Identificación de géneros y especies bacterianas presentes en las muestras
de suelo ................................................................................................................. 27
4.6 Evaluación de la producción de AIA ................................................................ 28
4.7 Ensayo con semillas de pasto y AIA ............................................................... 30
5 Resultados ........................................................................................................ 33
5.1 Análisis fisicoquímico del suelo ....................................................................... 33
5.1.1 Textura ......................................................................................................... 33
5.1.2 Humedad relativa y Capacidad de retención de agua .................................. 33
5.1.3 pH ................................................................................................................. 34
5.1.4 Materia orgánica ........................................................................................... 34
5.1.5 Capacidad de intercambio iónico ................................................................. 35
5.1.6 Conductividad eléctrica del suelo ................................................................. 35
5.2 Análisis microbiológico del suelo ..................................................................... 36
5.2.1 Microorganismos aislados ............................................................................ 36
5.2.2 Morfología microscópica y afinidad tintorial .................................................. 36
5.2.3 Tolerancia a hidrocarburos ........................................................................... 37
5.3 Prueba de oxidasa .......................................................................................... 38
5.4 Identificación molecular de los géneros de microorganismos presentes en
las muestras de suelo ........................................................................................... 38
5.5 Determinación de la producción AIA ............................................................... 40
5.6 Efecto del AIA sobre el crecimiento y germinación de semillas de pasto ........ 41
6 Discusión .......................................................................................................... 44
7 Conclusión ........................................................................................................ 50
8 Apéndice de reactivos ..................................................................................... 52
9 Bibliografía ........................................................................................................ 54
VI
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Derrame de petróleo en una zona litoral ........................................................2
Figura 2. Compuestos aromáticos presentes en el petróleo ..........................................3
Figura 3. Compuestos azufrados presentes en el petróleo ............................................3
Figura 4. Compuestos nitrogenados presentes en el petróleo .......................................4
Figura 5. Compuestos oxigenados presentes en el petróleo .........................................4
Figura 6. Esquema de un sistema de composteo basado en el uso de biopilas ..............8
Figura 7. Triángulo de clasificación textural ............................................................... 18
Figura 8. Método de textura al tacto del suelo ............................................................ 19
Figura 9. Prueba de tolerancia a petróleo utilizando discos de papel filtro metodología . 25
Figura 10. Metodología para el ensayo con semillas de pasto y AIA ............................ 32
Figura 11. Prueba de tolerancia a petróleo con discos de papel filtro impregnados de
petróleo ................................................................................................................... 38
Figura 12. DNA genómico ............................................................................................ 39
Figura 13. Amplificado del gen 16S de aproximadamente 1.5 Kpb ............................. 39
Figura 14. Determinación de AIA, desarrollo de color mediante la técnica de
Salkowski ................................................................................................................. 40
Figura 15. Distribución de semillas en agar para el ensayo de promoción de la
germinación y crecimiento por el AIA .......................................................................... 42
Figura 16. Comparación de las diferentes longitudes del pasto y su raíz. A) semilla de
pasto a la que se adicionó AIA producido por Pseudomonas putida, B) semilla de pasto
a la que se adicionó AIA producido por Paenibacillus sp y C) semilla a la que se
adicionó AIA producido por Azospirillum sp ................................................................. 43
VII
INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Mezcla de reacción y condiciones de amplificación para la RCP .................... 28
Tabla 2. Clase textural de las muestras de suelo ....................................................... 33
Tabla 3. Humedad relativa y capacidad de retención de agua de las muestras de
suelo ...................................................................................................................... 34
Tabla 4. Determinación de pH de las muestras de suelo ............................................ 34
Tabla 5. Determinación de materia orgánica de las muestras de suelo ........................ 34
Tabla 6. Determinación de capacidad de intercambio iónico de las muestras de suelo . 35
Tabla 7. Determinación de la conductividad eléctrica de las muestras de suelo ............ 35
Tabla 8. Cuenta estándar de los microorganismos viables y cultivables presentes en
las muestras de suelo .............................................................................................. 36
Tabla 9. Morfología microscópica y afinidad tintorial de los 42 microorganismos
aislados a partir de las muestras de suelo .................................................................. 37
Tabla 10. Microorganismos identificados en las muestras de suelo ............................. 40
Tabla 11. Determinación cualitativa de la producción de AIA de los microorganismos
tolerantes a los hidrocarburos en caldo nutritivo con triptofano ..................................... 41
Tabla 12. Concentración de AIA producido por los microorganismos aislados en
extracto de suelo. Azospirillum sp se desarrollo en caldo nutritivo ................................ 41
Tabla 13. Efecto del AIA en el tiempo de germinación, longitud del pasto y de la raíz,
así como la presencia de pelos radicales absorbentes sobre las semillas de pasto ....... 42
.
VIII
ABREVIATURAS
AIA…………………………………………………………………..Ácido indolacético AL…………………………….……………………………………………………Arcilla AR………………………………………………………………………………….Arena CE……………………………………………………...……...Conductividad eléctrica CII…………………………………………………..Capacidad de intercambio iónico CRA………………………………………………..Capacidad de retención de agua HAP………………………………………..Hidrocarburos aromáticos polinucleares HR……………………………………………………………………Humedad relativa HTP……………………………………………….Hidrocarburos totales del petróleo LI….…………………………………………………………………………………Limo MO…………………………………………………………………….Materia orgánica QP…………………………………………………………………Químicamente puro RCP……………………………………….Reacción en la cadena de la polimerasa UFC…………………………………………………….Unidad formadora de colonia
IX
RESUMEN
El petróleo es un líquido de origen natural, tiene un gran valor económico y está
formado por hidrocarburos aromáticos y alifáticos. Actualmente ha llamado mucho la
atención el problema de la contaminación por hidrocarburos en el ambiente, por lo
que se han generado nuevas técnicas para poder remover a los contaminantes; una
de ellas es la biorremediación, la cual se basa en el uso de microorganismos cuyo
metabolismo es capaz de transformar los contaminantes y así poder eliminarlos del
suelo.
En este estudio, se trabajó con tres suelos, un testigo, un suelo poco contaminado y
un suelo muy contaminado con hidrocarburos.
Mediante el análisis fisicoquímico se determinó que la textura del suelo testigo y la
de los dos suelos contaminados es franco arenoso. También se encontró que la
humedad relativa, capacidad de retención de agua, materia orgánica, capacidad de
intercambio iónico y la conductividad eléctrica son bajas, lo cual limita el desarrollo
de las poblaciones microbianas, el pH es cercano a la neutralidad y adecuado para
la biodegradación de hidrocarburos. En el análisis microbiológico se determinó la
cuenta microbiana y se encontró que es insuficiente para un proceso eficiente de
biorremediación.
A partir de las muestras de suelo contaminado se logró aislar 42 microorganismos
diferentes, se realizaron pruebas de tolerancia a los hidrocarburos y se
seleccionaron a 3 microorganismos de cada suelo que presentan una tolerancia a
hidrocarburos del 100%.
Además se realizó la identificación molecular de dichos microorganismos y se
encontró en el suelo poco contaminado a los géneros Paenibacillus, Arthrobacter y
Bacillus, y en el suelo muy contaminado se identificó a Pseudomonas putida y otras
dos especies del género Pseudomonas. A dichos microorganismos se les determinó
la producción de Acido Indolacético (AIA), y se encontró que los mejores
productores son Paenibacillus sp y Pseudomonas putida.
X
Por lo anterior se realizó un ensayo con semillas de pasto a las cuales se les
adicionó el AIA producido por los microorganismos para determinar si tenía algún
efecto sobre el crecimiento vegetal y se encontró que si tienen un efecto en el
incremento de longitud del pasto y su raíz y además en el desarrollo de pelos
radicales absorbentes. Por todo lo anterior se propone a estos dos microorganismos
para participar en procesos de biorremediación y así lograr remover del suelo a los
hidrocarburos derivados del petróleo.
1
1. INTRODUCCIÓN
1.1 El petróleo
Es un líquido oleoso de origen natural y está compuesto por diferentes
sustancias orgánicas, es el resultado de procesos de descomposición de origen
vegetal y animal, que hace mucho tiempo quedaron incorporados en depósitos
de cuencas marítimas. Tiene un gran valor económico, ya que se puede
transformar por medio de procesos industriales en productos de alto valor
económico como son: combustibles, lubricantes, solventes, ceras, fertilizantes,
materiales para la construcción, pinturas, textiles y en la generación de
electricidad (1).
Por todo lo anterior, el petróleo tiene una importancia relevante en la economía
de todas las naciones; sin embargo, actualmente se ha observado que no se
han tomado las medidas adecuadas en el manejo del petróleo y sus derivados,
ya que se ha constatado un importante impacto en los ecosistemas, entre los
cuales están: contaminación de los mantos freáticos, derrames de crudo en el
suelo y cerca de cuerpos de agua (Figura 1), bioacumulación de productos
tóxicos en las cadenas tróficas (5), alteración de la flora y fauna, así como la
modificación y disminución de las poblaciones bacterianas presentes tanto en
cuerpos de agua como en el suelo.
2
Figura 1. Derrame de petróleo en una zona litoral (6)
1.2 Composición del petróleo
El petróleo está formado por hidrocarburos aromáticos y alifáticos; los primeros
se denominan así debido a que son polímeros cíclicos que pueden presentar
resonancia y que tienen una gran estabilidad. Los hidrocarburos alifáticos son
compuestos de cadena lineal formada principalmente de carbono e hidrógeno y
son menos estables que los aromáticos.
Entre los principales componentes del petróleo están los
Hidrocarburos aromáticos como: benceno, tolueno, naftaleno,
ortoxileno, antraceno, fenantreno, bifenilo (Figura 2).
Compuestos de azufre son: ácido sulfhídrico, sulfuros, mercaptanos,
sulfuros cíclicos, disulfuros y tiofenos (Figura 3).
Compuestos de nitrógeno: pirrol, indol, carbazol, benzocarbazol,
piridina, quenoleína, indolita, enzoquinoleína (Figura 4).
Compuestos de oxígeno: alcoholes, ésteres, éteres, cetonas,
furanos, ácidos carboxílicos (Figura 5) (2).
3
Figura 2. Compuestos aromáticos presentes en el petróleo (2)
Figura 3. Compuestos azufrados presentes en el petróleo (2)
4
Figura 4. Compuestos nitrogenados presentes en el petróleo (2)
Figura 5. Compuestos oxigenados presentes en el petróleo (2)
5
1.3 Refinerías y extracción de petróleo
Las refinerías son plantas industriales, las cuales llevan a cabo la refinación del
petróleo (3). Esta refinación se hace con la finalidad de explotar al máximo
todos los derivados del mismo; gracias a ésto se obtiene una gran diversidad
de compuestos que luego posteriormente son utilizados como combustibles
tales como: la gasolina, el gasóleo y el queroseno. Otros derivados del petróleo
pueden ser transformados en asfaltos, gas natural, diesel y generación de
energía eléctrica, etc. (4). En dicha industria el sitio más contaminado se
encuentra en el lugar en donde se almacena y se extrae el crudo, debido a que
es el lugar en donde se generan la mayor cantidad de derrames durante su
procesamiento (3).
1.4 Técnicas para remediación de suelos contaminados con
hidrocarburos
Actualmente ha llamado mucho la atención el problema de la contaminación
por hidrocarburos en el ambiente, por lo que se han generado nuevas técnicas
para poder remover a los contaminantes, una de ellas es la biorremediación.
1.5 Biorremediación
Se define como la acción de los microorganismos u otros sistemas biológicos
para la degradación de contaminantes presentes en el ambiente (9).
6
La biorremediación se basa en el uso de microorganismos cuyo metabolismo
es capaz de transformar los contaminantes, que en este caso son los
hidrocarburos totales del petróleo (HTP) y los hidrocarburos aromáticos
polinucleares (HAP), y transformarlos en productos que menos tóxicos o bien
en productos que puedan integrarse a los ciclos biogeoquímicos y así poder
eliminarlos del suelo con ayuda de otros microorganismos (13).
Este tipo de tratamiento es de gran utilidad, ya que es de bajo costo, no es
nocivo y es muy eficiente para remover los HTP presentes en suelos
contaminados, con lo que se facilita la recuperación de áreas contaminadas.
Entre los grupos microbianos que son capaces de degradar a los HTP y los
HAP se encuentran los hongos, las bacterias y las algas (9).
En la rizorremediación se hace uso de las bacterias presentes en las raíces de
las plantas que pueden crecer en sitios contaminados, de manera que el
consorcio que existe entre las bacterias de la rizósfera con la planta funciona a
través de los exudados secretados por las plantas que son capaces de
estimular la supervivencia de las bacterias, así como la acción de éstas en la
eliminación de los contaminantes presentes en el suelo, lo que indica un
incremento en su actividad metabólica (7 y 8).
En el caso de la fitorremediación se usan ciertas especies de plantas, las
cuales pueden remover contaminantes del suelo incorporándolos a sus tejidos
o convirtiéndolos en compuestos menos tóxicos (9 y 10).
7
En la fitorremediación, una herramienta muy útil es la producción de
fitohormonas por las plantas, como es el caso del ácido indolacético (AIA) que
favorece el crecimiento vegetal y el desarrollo de pelos radicales en la raíz de
las plantas, lo cual incrementa la absorción de nutrientes. El AIA se sintetiza a
partir de triptofano el cual tiene un importante papel ecológico en el
establecimiento de interacciones entre las plantas y las poblaciones
microbianas del suelo (11).
Otra de las técnicas más frecuentemente utilizadas para la eliminación de
contaminantes es el composteo, el cual es un proceso biológico controlado, en
el que los contaminantes orgánicos se convierten en productos inocuos (Figura
6).
El material contaminado se mezcla en pilas, con sustancias orgánicas sólidas
biodegradables, como paja, aserrín, estiércol y desechos agrícolas, que sirven
como soporte y así se asegura la generación del calor necesario para el
proceso.
El composteo puede aplicarse para tratar suelos y sedimentos contaminados
con compuestos orgánicos biodegradables y se pueden utilizar
simultáneamente microorganismos biodegradadores para poder hacer más
eficiente la degradación de contaminantes (12).
8
Figura 6. Esquema de un sistema de composteo basado en el uso de biopilas (12)
En el proceso de bioaumentación, se aíslan microorganismos que están
presentes en el suelo contaminado, los cuales pueden ser modificados al
introducirles material genético extracromosómico en forma de plásmidos, los
cuales contienen genes importantes para la degradación de contaminantes del
suelo. Un ejemplo de esta técnica es el uso de inóculos de Pseudomonas
fluorescens HK44 para degradar el naftaleno presente en el suelo (9).
1.6 Microorganismos involucrados en la biodegradación de HTP y HAP
En recientes investigaciones se ha demostrado la presencia de ciertos géneros
bacterianos que están involucrados en la biodegradación de HTP y HAP (10);
entre los cuales están Pseudomonas sp (13), Bacillus sp, Ralstonia sp,
Burkholderia sp, Staphylococcus sp, Micrococcus sp, Acinetobacter sp,
Aeromonas sp, Serratia sp y Enterobacter sp (14).
9
1.7 Efecto de los factores ambientales sobre la biodegradación de
hidrocarburos
En general, se considera que los hidrocarburos alifáticos son los componentes
del petróleo más fácilmente biodegradables, seguidos por los alcanos
ramificados, los aromáticos de bajo peso molecular y finalmente los
hidrocarburos aromáticos. El proceso de biodegradación de hidrocarburos no
sólo depende de la estructura química de los mismos, sino también de factores
ambientales, cuyos efectos se describen a continuación.
1.7.1 Temperatura
La temperatura es un factor esencial en el proceso de biorremediación in situ,
ya que la biodisponibilidad y solubilidad de los compuestos altamente
hidrofóbicos, como son los hidrocarburos, dependen de este parámetro. Un
incremento de temperatura disminuye la viscosidad y afecta al grado de
dispersión de los compuestos contaminantes y, por lo tanto, ayuda a la difusión
de dichos compuestos, por otro lado, a bajas temperaturas se imposibilita la
volatilización de alcanos de cadena corta de menos de diez átomos de carbono
(< C10), lo que aumenta su solubilidad en la fase acuosa y su toxicidad, lo cual
puede ser desfavorable para el proceso de biodegradación. La temperatura
óptima para la degradación de hidrocarburos está entre 30 y 40°C.
En general la degradación de compuestos contaminantes mediante la
biorremediación se ve favorecida en los ecosistemas mesofílicos, aunque
10
también se han identificado microorganismos adaptados a temperaturas muy
bajas o a climas cálidos, capaces de degradar hidrocarburos (6).
1.7.2 pH
La mineralización de hidrocarburos se ve favorecida a valores de pH cercanos
a la neutralidad. En algunas bacterias acidófilas se ha demostrado la expresión
de genes que codifican para enzimas implicadas en la degradación de
hidrocarburos aromáticos. Los microorganismos alcalófilos, producen una serie
de enzimas extracelulares de uso industrial, pero su capacidad de degradar
hidrocarburos es limitada (6).
1.7.3 Salinidad
Entre la biodegradación de hidrocarburos y la salinidad existe una relación
inversa, debido a que se ha observado que a concentraciones osmóticas
superiores al 2.4% peso/volumen (p/v) de NaCl, hay un efecto de inhibición de
la degradación de los hidrocarburos aromáticos. Sin embargo, también se
conocen microorganismos capaces de oxidar hidrocarburos a una
concentración osmótica de 30% (p/v) de NaCl. La salinidad de un suelo
también afecta directamente la conductividad eléctrica del mismo, ya que al
tener una baja concentración de sales inorgánicas, la conductividad eléctrica
también es baja (6).
1.7.4 Presión
La presión elevada y baja temperatura provocan una baja actividad microbiana
(6).
11
1.7.5 Oxígeno
La eficacia de los procesos de biodegradación aeróbicos depende
principalmente de la temperatura, ya que la solubilidad y disponibilidad del
oxígeno depende de la misma. En el catabolismo de hidrocarburos alifáticos,
cíclicos y aromáticos por parte de bacterias u hongos requieren de la oxidación
del sustrato mediante oxigenasas, que son enzimas que requieren cierta
concentración de oxígeno molecular. La biodegradación anaeróbica de
hidrocarburos tiene lugar a tensiones muy bajas de oxígeno, por lo tanto su
importancia ecológica es limitada (6).
1.7.6 Nutrientes
En un suelo contaminado con derivados del petróleo generalmente se presenta
una baja concentración de nutrientes inorgánicos, los cual es desfavorable
para el crecimiento microbiano. También la disponibilidad de nitrógeno y fósforo
limita la degradación microbiana de hidrocarburos. Este fenómeno tiene como
consecuencia que se deben adicionar los nutrientes necesarios de una forma
equilibrada, lo más usual es adicionarlos en forma de fertilizantes y con esto se
puede estimular la biodegradación.
Para el diseño de una estrategia adecuada de biorremediación se debe tener
conocimiento acerca de las condiciones ambientales que caracterizan el
ecosistema que ha sido contaminado, ya que así se podrá recuperar la zona
afectada de una forma más eficiente (6).
12
1.8 Métodos para aislamiento e identificación de bacterias degradadoras
de HAP y HTP.
El análisis de las poblaciones bacterianas presentes en muestras de suelo se
logra mediante técnicas microbiológicas básicas, entre las cuales destacan: la
siembra por espatulado, aislamiento por estría cruzada, vaciado en placa y las
pruebas bioquímicas, las cuales aún se utilizan debido a que son rápidas,
sencillas y confiables y así se puede tener un resultado presuntivo de los
géneros bacterianos involucrados en la degradación de HPH y HAP.
Para determinar con certeza la especie de los microorganismos, actualmente
se utilizan técnicas de detección molecular, en particular la técnica de reacción
en la cadena de la polimerasa (RCP); la cual presenta una alta especificidad,
sensibilidad y versatilidad. Con esta técnica se pueden generar cientos de
copias de un fragmento de DNA, el cual será usado como un marcador
molecular. Para llevar a cabo dicha técnica, es necesario aislar el DNA
genómico de interés, desnaturalizarlo con temperaturas elevadas, diseñar los
iniciadores específicos para la secuencia que se usa como marcador
molecular, adicionar los desoxirribonucleótidos trifosfatados (dNTPs), y una
enzima altamente específica llamada DNA polimerasa la cual es termoestable.
Usando la técnica de forma adecuada, entonces se podrá sintetizar el
fragmento de interés.
13
La RCP se ha convertido en una herramienta fundamental para la biotecnología
aplicada al suelo, ya que se trata de una herramienta de gran utilidad para
identificar a los grupos microbianos presentes en muestras de suelo (15).
14
2. JUSTIFICACIÓN
Debido a la importancia de la biotecnología agrícola en los últimos años, el
grupo de trabajo pretende aislar e identificar por técnicas microbiológicas y
moleculares, microorganismos capaces de degradar algunos hidrocarburos a
partir de un suelo contaminado, con la finalidad de usarlos en un futuro como
microorganismos biorremediadores.
15
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Identificar microorganismos degradadores de hidrocarburos presentes
en suelos contaminados.
3.2 Objetivos particulares
Estudiar las características fisicoquímicas de un suelo contaminado con
hidrocarburos.
Estudiar por medio de técnicas microbiológicas y bioquímicas a los
microorganismos viables y cultivables presentes en los suelos
contaminados.
Identificar por técnicas moleculares los géneros y especies de los
microorganismos probables biodegradadores de hidrocarburos,
presentes en estos suelos contaminados.
16
4. MATERIALES Y MÉTODOS
Se analizaron dos muestras de suelos contaminados con hidrocarburos, las
cuales provienen de una refinería de petróleo. A dichos suelos no se les
cuantificó la concentración de hidrocarburos presentes, pero se identificaron
como un suelo poco contaminado y otro muy contaminado. A estos suelos se
les realizó análisis fisicoquímico, microbiológico, y mediante análisis bioquímico
y molecular se identificaron los géneros de microorganismos con la probable
capacidad de degradar hidrocarburos.
4.1 Análisis fisicoquímico del suelo
Para estudiar las características físicas y químicas de las muestras de suelo se
realizaron varias determinaciones, las cuales se describen a continuación (16 y
17). Para todas las determinaciones se utilizó suelo que fue tamizado y
conservado en recipientes cerrados y sin exposición a la luz.
4.1.1 Textura
La textura de las muestras de suelo se determinó por el método de Bouyoucos
y estimación al tacto.
Por la técnica de Bouyoucos se pesaron 60 g de suelo, al cual se le
adicionaron 40 mL de peróxido de hidrógeno al 30% y se puso a evaporar
hasta que estuviera seco, en caso de observar efervescencia se repitió lo
17
anterior hasta que la efervescencia desapareciera y así asegurar que se
eliminó la materia orgánica.
Se secó la muestra a 80°C por 24 horas, a partir de esta muestra se tomaron
50 g en un vaso de precipitados de 250 mL, posteriormente se le adicionó agua
destilada hasta completar un volumen de 200 mL y se la adicionaron 5 mL de
metasilicato de sodio al 3.6% y 5 mL de oxalacetato de sodio al 3% y se dejó
reposar por 15 minutos, transcurrido este tiempo, se agitó mecánicamente por
5 minutos.
A continuación se transfirió la suspensión a una probeta de 1000 mL y se
adicionó agua destilada hasta completar el volumen a 1000 mL, con un
hidrómetro dentro de la suspensión.
Se resuspendió la muestra y se procedió a efectuar las lecturas con ayuda del
hidrómetro a los 40 segundos y a las dos horas, también se tomó la
temperatura en °C.
Se realizaron los siguientes cálculos: por cada grado arriba de 19.4°C se
agrega 0.36 unidades a la lectura del hidrómetro; en caso contrario por cada
grado debajo de 19.4°C se debe de restar 0.36 unidades a la lectura del
hidrómetro. Los cálculos son los siguientes: (% LI + AL = 1ª lectura del
hidrómetro / g de muestra x 100); (% AR = 100 - % LI + AL); (% AR = 2ª lectura
del hidrómetro / g de muestra x 100) y (% de LI = 100 - % AR + % AL). Donde
(LI) es limo, (AR) arena, (AL) arcilla (Figura 7).
18
En el caso de la estimación al tacto se utilizó 1 g de suelo y se le adicionó
agua hasta que se pudo moldear en la mano, de acuerdo a la medida en que
se pueda moldear se determinó su textura con ayuda de un triángulo para
hacer clasificación textural creado por Ilaco (Figura 8) (16 y 17).
Figura 7. Triángulo de clasificación textural (16)
19
Figura 8. Método de textura al tacto del suelo (16)
4.1.2 Humedad relativa y capacidad de retención de agua
La humedad relativa y la capacidad de retención de agua se midieron
utilizando un método gravimétrico. Para determinar la humedad relativa se
pesaron 10 g de suelo y se colocaron en una caja Petri, la cual se pesó antes,
luego se llevó a una estufa a 80°C hasta obtener un peso constante, se calculó
la humedad por la diferencia entre el peso del suelo húmedo y el peso del suelo
seco. El porcentaje de humedad relativa será (% Hr = H x 100/10).
20
4.1.3 pH
El pH se midió utilizando 10 g de la muestra de suelo, a la que se adicionan 20
mL de agua, se dejan reposar 30 minutos, se mezclan y se toma la lectura con
un potenciómetro.
4.1.4 Materia orgánica (MO)
La materia orgánica se midió con la técnica de Walkey y Black colocando 1 g
de suelo en un matraz, se le adicionaron 10 mL de dicromato de potasio 1 N,
se mezcló y se adicionaron lentamente 20 mL de ácido sulfúrico concentrado,
se mezcló de nuevo y se dejo reposar por 30 minutos.
Posteriormente se llevo la muestra a 200 mL con agua destilada, se le
añadieron 10 mL de ácido fosfórico al 85% y 30 gotas de indicador de
difenilamina, se valoró titulando con una solución de sulfato ferroso 1 N; el
punto final de la titulación se alcanza cuando aparece un color verde brillante
de la solución que se está valorando. Este procedimiento se repitió con un
testigo, el cual no contenía muestra de suelo.
Se realizaron los cálculos siguientes: para calcular el % MO = 10 (1-P/T) x 0.67;
donde (P) son los mL de solución de sulfato ferroso gastados en el problema,
(T) son los mL de solución de sulfato ferroso gastados por el testigo y 0.67 es
una constante.
21
4.1.5 Capacidad de intercambio iónico (CII)
La capacidad de intercambio iónico se realizó con la técnica del versenato 0.1
N, en la cual se pesaron 5 g de suelo, y se colocaron en un embudo de
filtración con papel filtro y se le adicionaron 10 mL de solución de cloruro de
calcio 1 N; 5 veces, después se agregaron 10 mL de etanol al 96%; 5 veces y
finalmente se adicionaron 10 mL de solución de cloruro de sodio 1 N, 5 veces y
este filtrado se colectó para titular iones de calcio, para lo anterior al filtrado se
añadieron 10 mL de solución amortiguadora de pH 10, 5 gotas de la solución
de cianuro de potasio al 2%, 5 gotas de la solución de hidroxilamina al 4% y 5
gotas de indicador negro de eriocromo T. Finalmente se tituló con la solución
de versenato 0.1 N hasta que el color de la solución fue azul y se calculó la
capacidad de intercambio iónico según la siguiente fórmula; (CII en meq/100 g
de suelo = mL versenato usados para titular X N X 100/g de suelo, donde (N)
es la normalidad de la solución de EDTA o versenato.
4.1.6 Conductividad eléctrica del suelo (CE)
Se determinó la conductividad eléctrica del suelo utilizando el equipo Hanna
Instruments (H I 993310), para el análisis se utilizó una muestra de suelo de 50
g, el cual se secó en un horno a 40°C, se tamizó en una malla de 2 mm y se
pesaron 20 g de suelo y se colocaron en un vaso de precipitados. A los 20 g de
suelo se le agregaron 40 mL de agua destilada, se mezclo por 30 segundos y
se dejo reposar por una hora. Posteriormente se filtró la mezcla y se realizó la
lectura de la conductividad eléctrica.
22
4.2 Análisis microbiológico del suelo
Se efectuó el estudio microbiológico del suelo, el cual consistió en aislar a los
microorganismos viables y cultivables, para lo cual se tomó una muestra
representativa del suelo de 10 g; la cual fue diluida con 90 mL de solución
salina al 0.85% para obtener una dilución decimal (10-1), a partir de la cual se
realizaron otras diluciones decimales, hasta la dilución (10-12).
A partir de todas las diluciones anteriores se tomaron inóculos de 0.1 mL que
se sembraron por la técnica de vaciado en placa, utilizando de 15 a 20 mL de
agar nutritivo fundido al cual se le adicionó el inóculo de 1 mL y se vació a una
placa, se dejó solidificar y se incubó a 28°C.
También se sembró por espátulado utilizando placas de agar nutritivo en las
que se depositó un inóculo de 0.1 mL y se dispersó uniformemente con una
varilla de vidrio acodada y se incubaron a 28°C.
Lo anterior se realizó con la finalidad de poder aislar la microbiota presente en
la muestra de suelo y de hacer cuenta viable para determinar las UFC/g de
suelo mediante la técnica de vaciado en placa.
Asimismo se realizó una dilución 1:1 del suelo utilizando una muestra de 5 g y
5 mL de solución salina, la cual se sembró por espátulado y estría cruzada.
Se tomó un inóculo del sobrenadante de la dilución 10-1, así como de la
interfase del suelo y la solución salina, para aislar a todos los microorganismos
23
que por sus requerimientos de oxígeno se desarrollen en diferentes
concentraciones del mismo.
Se estableció que el tiempo adecuado de incubación de las placas a 28°C es
de 48-72 horas para los ensayos posteriores, dependiendo de si los
microorganismos presentes en la muestra son de crecimiento lento o rápido.
Después de la incubación se revisaron las placas y se seleccionaron las
colonias aisladas, para posteriormente realizar una resiembra por estría
cruzada de las colonias seleccionadas. Luego de la incubación se verificó el
crecimiento microbiano y se realizó la descripción de la morfología colonial y
microscópica, además de una tinción con la técnica de Gram para determinar la
afinidad tintorial que presentan estos microorganismos. Los 42 aislamientos se
conservaron para realizar pruebas bioquímicas y moleculares; para esto se
sembraron en medio de cultivo preparado con extracto de los suelos
contaminados para evitar así que pierdan la tolerancia a los hidrocarburos. El
extracto de suelo se preparó utilizando 200 g de suelo y se adicionaron 300 mL
de agua destilada, se agitó y el recipiente se selló con papel parafilm. Se dejó
reposar 48 horas, luego de este tiempo, se filtró el contenido del recipiente y se
recolectó el extracto de suelo. Para preparar el agar extracto de suelo se utilizó
1 L del mismo y se le adicionó 15 g de agar bacteriológico y se esterilizó en
autoclave.
24
4.2.1 Pruebas de tolerancia a los hidrocarburos
Como primera prueba de tolerancia a los hidrocarburos se preparó agar
extracto de suelo proveniente de los suelos problema y en estos extractos se
sembraron las 42 aislamientos. Se tomó como criterio de tolerancia el
desarrollo de los microorganismos en el medio de cultivo.
Para determinar cuáles eran los microorganismos que tenían una mayor
tolerancia a los hidrocarburos se realizó un ensayo que consistió en adicionarle
diferentes cantidades de petróleo a 100 g de suelo testigo; 0, 10, 20, 30, 40 y
50 mL de petróleo, lo cual corresponde a las siguientes concentraciones; 0, 9,
17, 23, 29 y 33% de hidrocarburos presentes en 100 g de suelo, posteriormente
se adicionaron 250 mL de agua destilada y a partir de cada dilución se preparó
extracto de suelo. En las cajas con agar extracto de suelo se sembraron por
estría abierta los microorganismos aislados a partir de los suelos contaminados
y se determinó la tolerancia con el desarrollo de biomasa por parte de los
microorganismos.
Además se realizó otro ensayo en el cual se utilizaron discos de papel filtro
impregnados de petróleo a concentraciones de 0, 20, 40, 60, 80 y 100% de
petróleo, para lo cual se utilizó Tween 80 (20). Los discos se aplicaron a placas
de agar nutritivo, los cuales se sembraron por espatulado con 0.1 mL de una
suspensión celular ajustada al tubo No. 3 del Nefelómetro de McFarland. Todas
las pruebas de tolerancia se realizaron también con Azospirillum sp como cepa
de referencia (Figura 9).
25
Figura 9. Prueba de tolerancia al petróleo, utilizando discos de papel filtro,
metodología
4.3 Prueba de oxidasa
Se realizó la prueba de oxidasa a los 6 microorganismos seleccionados. Se
utilizó una colonia de cada microorganismo, la cual se tomó de placas de agar
extracto de suelo. Con un palillo se tomó un inóculo de la colonia y se depositó
en un fragmento de papel filtro, al cual posteriormente se le adicionaron varias
gotas de solución de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%.
26
La prueba fué positiva si se desarrolla sobre el papel una coloración azul o
púrpura en los primeros 10 segundos.
4.4 Aislamiento de DNA genómico
Técnica de extracción de DNA genómico usando bromuro de cetil-metil-trimetil
-amonio (BCTA), (18)
Se usó la biomasa de una placa de Petri de medio de gelosa nutritiva de cada
una de las bacterias aisladas, se congeló con N2 líquido y se maceró en un
mortero estéril, hasta obtener un polvo fino. Se adicionó 1 ó 2 mL de BCTA
nuclear (BCTA al 2%, EDTA 50 Mm, trisma base 200 Mm pH 8.0, NaCl 2 M y
polivinil pirrolidona 0.5%) y se mezcló hasta obtener una suspensión
homogénea. Se separó la suspensión en tubos de 1.5 mL (0.5 mL en cada uno)
y se incubó 65°C/1 h.
Se dejó que la muestra alcanzara la temperatura ambiente, se agregaron 2 L
de RNAsa 10 mg/mL y se incubó 30 minutos a temperatura ambiente.
Se adicionó un volumen (500L) de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) para
favorecer la precipitación de DNA y se mezcló en vórtex hasta formar una
emulsión. Se centrifugo a 13, 000 g/10 minutos a temperatura ambiente y se
transfirió la fase acuosa a un tubo nuevo.
27
Se adicionó 1/10 de volumen de BCTA 10% (BCTA al 10% y NaCl 0.7 M) y se
realizaron tres extracciones con cloroformo:alcohol isoamílico (24:1) (se
conservó la fase acuosa).
Se transfirió el sobrenadante a un tubo limpio y se adicionó un volumen de
isopropanol y se mezcló por inversión, se incubó a –20°C por 2 horas o toda la
noche.
Se recuperó el DNA por centrifugación a 13, 000 g/10 minutos a 4°C, se lavó la
pastilla con etanol al 70% dos veces y se centrifugó en frío, se decantó el
sobrenadante y se dejó secar la pastilla. Finalmente se resuspendió el DNA en
30 ó 50 L de agua desionizada estéril.
4.5 Identificación de géneros y especies bacterianas presentes en las
muestras de suelo
La identificación de los microorganismos presentes en el suelo se realizó por
análisis moleculares de las secuencias de un fragmento del gen 16S rDNA
como marcador molecular y se mandó secuenciar el amplificado al servicio de
secuenciación de la FES Iztacala (UNAM), posteriormente se realizó el análisis
bioinformático tipo BLAST correspondiente, el cual consiste en comparar los
resultados de cada una de las secuencias obtenidas con secuencias ya
conocidas de microorganismos y de acuerdo al porcentaje de identidad se
determina cual es el género y especie de los microorganismos aislados en las
muestras de suelo.
28
Para la RCP se utilizaron la mezcla de reacción y condiciones de amplificación
que se muestran en la tabla 1.
Tabla 1. Mezcla de reacción y condiciones de amplificación para la RCP
Mezcla de reacción Condiciones de amplificación
Componente L Temperatura
ºC
Tiempo
(min)
No. de ciclos
Iniciador 5’ Iniciador 3’
dNTP’s Buffer MgCl2
DNA Taq Polimerasa
Agua
1 1 1 5 2 1
0.5 38.5
95 5
95 55 72
1 1 2
35
72 10
Simultáneamente se analizó una muestra de suelo, que no está contaminado,
la cual fungió como el testigo negativo.
4.6 Evaluación de la producción de AIA
Se determinó la producción de ácido indolacético a las 6 cepas tolerantes al
100% de hidrocarburos y a la cepa de control Azospirillum sp, ya que se
conoce que este microorganismo es un productor de AIA y, por lo tanto, una
rizobacteria promotora del crecimiento vegetal (RPCV) (20). Se utilizó caldo
nutritivo, al cual le fue adicionado triptofano a una concentración de 3 g/mL, ya
que éste es el precursor del ácido indolacético.
29
Se utilizaron 8 matraces Erlenmeyer de 250 mL, uno contenía sólo 100 mL de
caldo nutritivo, otros 6 matraces contenían 100 mL de caldo nutritivo y fueron
inoculados con las 3 cepas tolerantes a hidrocarburos provenientes del suelo
poco contaminado y los otros 3 matraces fueron inoculados con las 3 cepas
tolerantes a hidrocarburos provenientes del suelo muy contaminado y el último
con 100 mL de caldo nutritivo y fue inoculado con Azospirillum sp.
A cada matraz se le adicionó un inóculo de 10mL de una suspensión celular
ajustada al tubo No. 3 del nefelómetro de McFarland, excepto al matraz que
contenía sólo caldo nutritivo, ya que se utilizó como testigo negativo. A cada
una de las suspensiones celulares se le realizó una cuenta viable para
determinar UFC/mL y poder determinar cuáles eran las mejores productoras de
AIA.
Los matraces se incubaron 7 días a 28°C, después se centrifugó el contenido
de cada uno de los matraces para eliminar la biomasa y obtener el
sobrenadante, ya que en éste es donde se encuentra el AIA. Se tomaron 10 mL
de cada sobrenadante y se le agrego a cada uno 2 mL de reactivo de
Salkowski, se dejó reposar 20 minutos para el desarrollo de un color rosa y
finalmente se determinó la absorbancia a 530 nm. La concentración de AIA se
determinó interpolando las absorbancias obtenidas con una curva tipo de AIA
con una solución patrón con una concentración de 1 mM y la ecuación de esta
curva tipo es la siguiente: y = 11.16x, con un coeficiente de corelación de 0.99.
30
4.7 Ensayo con semillas de pasto y AIA
Luego de realizar la determinación y cuantificación del AIA, se selecciónó la
cepa mejor productora de AIA de cada uno de los suelos problema y se realizó
un ensayo con semillas de pasto de la marca comercial GerminalMR, la cual
contenía una mezcla de las siguientes especies de pasto; Festuca rubra,
Cynodon dactylon y Lolium multiflorum, para determinar si esta fitohormona
podía promover el crecimiento vegetal o promover el desarrollo de pelos
radicales absorbentes (19).
Para este ensayo se utilizaron 4 matraces, cada uno contenía lo siguiente: uno
con 100 mL de agua destilada estéril, otro con 100mL de extracto de suelo
poco contaminado, otro con 100 mL de extracto de suelo muy contaminado y el
último con 100 mL de caldo nutritivo.
Cada matraz fue inoculado con una asada de las cepas que demostraron ser
las mejores productoras de AIA de cada suelo en sus extractos
correspondientes y el matraz con caldo nutritivo se inoculó con Azospirillum sp,
el matraz con agua se utilizó como testigo negativo. Todos los matraces se
incubaron por 5 días a 25°C.
Luego del tiempo de incubación se centrifugó el contenido de los matraces para
obtener el sobrenadante que contenía el AIA y se determinó la concentración
del mismo en cada sobrenadante.
31
Para poner en contacto las semillas de pasto con el sobrenadante de cada uno
de los matraces que contenía el AIA, se utilizaron cajas de Petri con agar al
1.5% y por cada uno de los sobrenadantes se utilizaron 5 cajas y a cada una se
aplicó 10 semillas, las cuales fueron desinfestadas con solución de hipoclorito
al 3% por 5 minutos.
Luego de desinfestar las semillas se colocaron en las cajas con agar y se le
adicionó a cada caja 2 mL del sobrenadante que contenía el AIA. Se sellaron
las cajas con papel parafilm y se dejaron incubar por 15 días, se determinó el
tiempo y porcentaje de germinación, la longitud de los pastos y la presencia de
pelos radicales absorbentes (Figura 10).
32
Figura 10. Metodología para el ensayo con semillas de pasto y AIA
33
5. RESULTADOS
5.1 Análisis fisicoquímico del suelo
Se analizaron tres muestras de suelo, dos de las muestras de suelo están
contaminadas con hidrocarburos y la otra es un suelo testigo que no contiene
hidrocarburos.
5.1.1 Textura
Se determinó el tipo de textura de las tres muestras de suelo por estimación al
tacto y técnica de Bouyoucos (tabla 2).
Tabla 2. Clase textural de las muestras de suelo
Suelo Textura al
tacto
Textura método
Bouyoucos
Testigo Arena Franco Arenoso
Con bajo contenido de hidrocarburos Arena Franco Arenoso
Con alto contenido con hidrocarburos Arena Franco arenoso
5.1.2 Humedad relativa (HR) y capacidad de retención de agua (CRA)
Se estableció cual es el contenido de humedad y de la capacidad de retención
de agua de cada una de las muestras de suelo (tabla 3).
34
Tabla 3. Humedad relativa y capacidad de retención de agua de las muestras
de suelo
Suelo Humedad
relativa (%)
Capacidad de retención
de agua (%)
Testigo 20 33
Con bajo contenido de
hidrocarburos
15 27.9
Altamente contaminado con
hidrocarburos
22 26.2
5.1.3. pH
Se determinó el pH de cada una da las muestras de suelo (tabla 4).
Tabla 4. Determinación de pH de las muestras de suelo
Suelo pH
Testigo 7.21
Con bajo contenido de hidrocarburos 7.35
Altamente contaminado con hidrocarburos 7.2
5.1.4. Materia orgánica
Se determinó el contenido de materia orgánica de las muestras de suelo (tabla
5).
Tabla 5. Determinación de materia orgánica de las muestras de suelo
Suelo Materia Orgánica (%)
Testigo 7.8
Con bajo contenido de hidrocarburos 5.3
Alto contenido de hidrocarburos 4.5
35
5.1.5. Capacidad de intercambio iónico
Se determinó la capacidad de intercambio iónico de las muestras de suelos
(tabla 6).
Tabla 6. Determinación de capacidad de intercambio iónico de las muestras de
suelo
Suelo Capacidad de intercambio iónico
(meq/100 g de suelo)
Testigo 29.6
Con bajo contenido de hidrocarburos 27.2
Con alto contenido de hidrocarburos 23.0
5.1.6. Conductividad eléctrica
Se determinó la conductividad eléctrica de las muestras de suelo (tabla 7).
Tabla 7. Determinación de la conductividad eléctrica de las muestras de suelo.
Suelo Conductividad eléctrica del suelo
(mS/cm)
Testigo 0.57+/-2
Con bajo contenido de hidrocarburos 0.78+/-1
Con alto contenido de hidrocarburos 0.87
36
5.2 Análisis microbiológico del suelo
Mediante la cuenta viable se logró determinar las UFC/g de suelo (tabla 8).
Tabla 8. Cuenta estándar de los microorganismos viables y cultivables
presentes en las muestras de suelo
Suelo UFC/g de suelo
Testigo 45 000
Con bajo contenido de hidrocarburos 4 800
Con alto contenido de hidrocarburos 3 400
5.2.1 Microorganismos aislados
Se lograron aislar del suelo poco contaminado y del suelo altamente
contaminado con hidrocarburos a un total de 42 microorganismos, 15 del suelo
menos contaminado y 27 del suelo menos contaminado, el criterio de selección
utilizado fue la morfología colonial, ya que ésta es diferente para cada
microorganismo aislado y seleccionado para los ensayos posteriores. Dichos
aislamientos se realizaron a partir de la cuenta estándar, vaciado en placa,
estría cruzada y de la dilución 1:1 de cada suelo.
5.2.2 Morfología microscópica y afinidad tintorial
Se realizó una tinción de Gram para determinar la afinidad tintorial y la
morfología microscópica de cada uno de los 42 microorganismos aislados.
(tabla 9).
37
Tabla 9. Morfología microscópica y afinidad tintorial de los 42 microorganismos
aislados a partir de las muestras de suelo
Característica Microscópica Bajo Contenido de
hidrocarburos
Alto contenido de
hidrocarburos
Gram Positivos 78.5 % 72.3 %
Gram Negativos 21.5 % 27.7 %
Cocos 14.8 % 38.9 %
Bacilos 85.2 % 61.1 %
5.2.3 Tolerancia a hidrocarburos
Se determinó la tolerancia a los hidrocarburos de acuerdo a si el
microorganismo se desarrollaba o no en agar extracto de suelo con
hidrocarburos. El suelo utilizado era el suelo del cual se aislaron a los
microorganismos. Se encontró que 32 de los 42 microorganismos aislados eran
tolerantes a los hidrocarburos presentes en cada suelo.
Debido a esto se realizaron otras pruebas inoculando el suelo testigo con
petróleo crudo y se adicionaron deferentes concentraciones del mismo para
crear un gradiente, posteriormente se prepararon los extractos de suelo
correspondientes a cada concentración de petróleo adicionado al suelo. En
este ensayo también se encontró que los 42 microorganismos eran tolerantes
hasta al 33% de petróleo.
Por lo anterior se realizó un nuevo ensayo de tolerancia en el cual se utilizaron
discos de papel filtro impregnados con diferentes concentraciones de petróleo.
Dicho ensayo permitió seleccionar a 3 microorganismos tolerantes al 100% de
38
petróleo en cada suelo (Figura 11). En todas las pruebas que se realizaron se
observó que Azospirillum sp no es tolerante a los hidrocarburos presentes en el
medio de cultivo.
Figura 11. Prueba de tolerancia a petróleo con discos de papel filtro
impregnados de petróleo
5.3 Prueba de oxidasa
Se realizó la prueba de oxidasa a las 6 cepas seleccionadas. Todas dieron una
reacción positiva.
5.4 Identificación molecular de los géneros de microorganismos
presentes en las muestras de suelo
Se realizó la extracción de DNA de los 6 microorganismos seleccionados con
las pruebas de tolerancia y se encontraron los siguientes resultados (Figura
12).
39
Figura 12. DNA genómico
A partir del DNA genómico obtenido se realizó la amplificación del gen 16S
rDNA y se obtuvo un amplificado de aproximadamente 1.5 Kb, lo cual indica
que se logró amplificar el gen en su totalidad (Figura 13).
Figura 13. Amplificado del gen 16S rDNA de aproximadamente 1.5 Kpb
Los productos de RCP fueron secuenciados y luego del análisis bioinformático
tipo BLAST se obtuvieron los siguientes resultados (Tabla 10).
1.5 Kb
40
Tabla 10. Microorganismos identificados en las muestras de suelo
Suelo Microorganismos identificados % de Identidad Poco contaminado Arthrobacter sp
Paenibacillus sp Bacillus sp
97 81 93
Muy Contaminado Pseudomonas sp Pseudomocas putida
Pseudomonas sp
94 95 92
5.5 Determinación de la producción de AIA
Se realizó la determinación de la producción de AIA de Azospirillum sp y de los
6 microorganismos tolerantes al 100% de hidrocarburos, los cuales ya fueron
identificados molecularmente y se obtuvieron los siguientes resultados (Tabla
11 y Figura 14).
Figura 14. Determinación de AIA, desarrollo de color mediante la técnica de
Salkowski. El color rosa indica la presencia de AIA y es proporcional a la
concentración del mismo.
41
Tabla 11. Determinación cualitativa de la producción de AIA de los
microoganismos tolerantes a los hidrocarburos en caldo nutritivo con triptofano.
El microorganismo fué seleccionado debido a presentar la mayor absorbancia a
530 nm.
Suelo Microorganismo UFC/mL Absorbancia a 530 mn
Microorganismo seleccionado
Poco contaminado
Arthrobacter sp 7.04 x 105 0.196
Paenibacillus sp 5.66 x 105 0.295 x Bacillus sp 5.35 x 105 0.205
Muy contaminado
Pseudomonas sp 8.52 x 105 0.234
Pseudomonas putida
3.72 x 105 0.356 x
Pseudomomas sp
3.04 x 105 0.158
Testigo Azospirillum sp 4.64 x 106 0.367
5.6 Efecto del AIA sobre el crecimiento y germinación de semillas de
pasto
Se realizó un ensayo con semillas de pasto para poder determinar si el AIA
producido por los microorganismos aislados de las muestras de suelo tiene
algún efecto sobre el crecimiento o en las raíces de los pastos. Se obtuvieron
los siguientes resultados (tabla 12 y 13, figuras 15 y 16).
Tabla 12. Concentración de AIA producido por los microorganismos aislados
en extracto de suelo. Azospirillum sp se desarrollo en caldo nutritivo
Microorganismo Absorbancia a 530 mn
Concentración de AIA
(g/mL)
Suelo
Paenibacillus sp 0.396 35.4 Poco contaminado
Pseudomonas putida
0.409 36.6 Muy contaminado
Azospirillum sp 0.378 33.8 Testigo
42
Figura 15. Distribución de semillas de pasto en agar para el ensayo de
promoción de la germinación y crecimiento por el AIA
Tabla 13. Efecto del AIA en el tiempo de germinación, longitud del pasto y de
la raíz, así como la presencia de pelos radicales absorbentes sobre las raíces
de pasto
Microorganismo Tiempo de germinación
(días)
Longitud del pasto (mm)
Longitud de la raíz
(mm)
Presencia de pelos radicales
absorbentes Azospirillum sp 4 11.75 2.1 - Paenibacillus sp 4 12.36 2.5 + Pseudomonas
putida 4 11.94 2.3 +
Agua 4 10.86 1.7 -
43
Figura 16. Comparación de las diferentes longitudes del pasto y su raíz. a)
semilla de pasto a la que se adicionó AIA producido por Pseudomonas putida,
b) semilla de pasto a la que se adicionó AIA producido por Paenibacillus sp y c)
semilla a la que se adicionó AIA producido por Azospirillum sp.
A B C
44
6. DISCUSION
En cuanto a los resultados que se obtuvieron en el estudio fisicoquímico del
suelo se encontró que las dos muestras de suelos contaminados con
hidrocarburos y el suelo testigo presentan una textura arenosa, la cual puede
ser un factor limitante para el desarrollo de microorganismos, así como en la
aireación y humedad del suelo (16).
La humedad relativa del suelo es de 20% en el testigo, en el suelo poco
contaminado de 15% y en el muy contaminado de 22%, dichos valores de
humedad en suelos diferentes se debe generalmente a diversas condiciones
físicas ambientales como es el caso de la evaporación y a la conservación de
las muestras analizadas (20).
Por lo anterior existe otro parámetro para poder determinar si el suelo permite
una tasa óptima de biodegradación de los hidrocarburos y es la capacidad de
retención de agua (CRA). Se ha demostrado en estudios previos que cuando la
CRA se encuentra entre 30 al 60% se crean las condiciones óptimas para la
biodegradación de hidrocarburos. En este caso se encontró que sólo el suelo
testigo presenta esos valores de CRA, los suelos contaminados presentan un
menor porcentaje de CRA, lo cual no es favorable para la actividad microbiana,
ya que la cantidad de agua disponible para los microorganismos limita su
desarrollo (21).
45
En el caso del pH el óptimo para que se lleven a cabo de mejor forma los
procesos de biodegradación de hidrocarburos es entre 5 y 7.8, esto es debido a
que a pH mayores o menores de ese intervalo hay una menor disponibilidad de
nutrientes. En el caso de nuestros suelos, todos presentan un pH cercano a la
neutralidad y ésto significa que están dentro del intervalo de pH óptimo para la
biodegradación de hidrocarburos (21).
La materia orgánica en las muestras de suelos contaminados es muy baja
(5.3% y 4.5%), al igual que el del suelo testigo (7.8%). De acuerdo a estos
resultados al presentar materia orgánica en baja cantidad se provoca que el
suelo tenga una menor capacidad de intercambio iónico y una menor retención
de agua, características que son fundamentales para el desarrollo de los
microorganismos del suelo, así como para la fertilidad del mismo (17).
La capacidad de intercambio iónico de los suelos contaminados es baja (27.2 y
23 meq/100 g de suelo), lo cual es un indicador de que no hay reservas de
nutrientes minerales en dichos suelos. Lo anterior se debe a la textura de los
suelos, ya que al ser arenosos no contienen una cantidad de arcilla suficiente
que permita un intercambio de cationes adecuado, la poca matera orgánica
presente en las muestras también es un factor que limita el intercambio de
cationes en el suelo. En el caso del testigo la capacidad de intercambio iónico
es alta, por lo cual se puede considerar como un suelo fértil (17).
En las determinaciones de conductividad eléctrica de los suelos se encontró
que todos los suelos son no alcalinos, ya que presentan una muy baja
46
conductividad (0.78 y 0.87 mS/cm), lo cual se debe a que no presentan sales
inorgánicas disponibles y esto se encuentra directamente relacionado con la
baja capacidad de intercambio iónico de los suelos (17).
En el estudio microbiológico se encontró que el suelo testigo presenta una
cuenta microbiana de 45, 000 UFC/g de suelo y el suelo poco contaminado y
muy contaminado presentan 4, 800 UFC/g de suelo y 3, 400 UFC/g de suelo
respectivamente. Si tomamos como 100% las UFC/g del suelo testigo, la
cuenta microbiana del suelo poco contaminado es de 10.6% y del muy
contaminado de 7.5%. Las UFC/g de suelo que se requieren para un buen
proceso de biorremediación son de aproximadamente 6.5 X 105. Los resultados
indican que los suelos contaminados no tienen una cuenta microbiana para
llevar a cabo el proceso de biodegradación eficientemente (20).
Se aislaron 42 cepas de los dos suelos contaminados, de las cuales sólo 32
fueron tolerantes a los hidrocarburos presentes en el extracto de suelo del que
provenían, luego de diseñar otra prueba de tolerancia se encontró que 12
cepas fueron tolerantes al 100% de petróleo presente en el medio de cultivo, 6
de cada suelo (ver Figura 11). Azospirillum sp, el cual es una RPCV no es
tolerante al petróleo. De las 12 cepas se seleccionaron a las 6 que presentaran
un mejor crecimiento a las 48 h de incubación a 28°C en presencia de
hidrocarburos.
47
Se realizó la prueba de oxidasa a las 6 cepas seleccionadas y todas fueron
positivas ya que para poder metabolizar y degradar a los hidrocarburos dicha
enzima es indispensable (23).
Las 6 cepas seleccionadas fueron identificadas por un análisis molecular en el
cual se secuenció el gen 16S rDNA como marcador molecular y se logró
identificar los siguientes géneros: en el suelo menos contaminado se encontró
a, Paenibacillus sp, Arthrobacter sp y Bacillus sp, mientras que en el suelo
muy contaminado se identificó a Pseudomonas putida y otros dos
microorganismos que también pertenecen el género Pseudomonas sp. Los
géneros identificados en este trabajo concuerdan con un estudio realizado en
Venezuela, donde se aislaron e identificaron a los mismos géneros de
microorganismos presentes en suelos contaminados con hidrocarburos (14).
En el caso del suelo menos contaminado se encuentra una mayor diversidad
de microorganismos, lo cual puede ser debido a que al contener una menor
concentración de hidrocarburos; ésto les permite una cooperación entre dichos
microorganismos para poder metabolizar las mezclas de contaminantes
presentes en el suelo (21).
En el suelo más contaminado se encontró solo un género de microorganismos,
lo cual se puede atribuir a que el género Pseudomonas sp posee plásmidos
que permiten degradar diferentes hidrocarburos como son el fenol, fenantreno y
antraceno, entre otros (22 y 23).
48
También se sabe que este género bacteriano posee plásmidos de resistencia a
diversos hidrocarburos, los cuales se transfieren horizontalmente entre las
poblaciones de microorganismos en el suelo, lo que las hace altamente
resistentes a altas concentraciones de hidrocarburos. También se reconoce a
este género con un gran potencial de biodegradar hidrocarburos policíclicos y
hetrocíclicos (22).
En el ensayo de la cuantificación de AIA se determinó que Paenibacillus sp y
Pseudomonas putida son los mejores productores de AIA usando como medio
de cultivo caldo nutritivo con triptofano, al igual que el testigo positivo
Azospirillum sp; por lo cual se puede considerar como microorganismos
RPCV´S (24).
Además se clasificaron en bajas productoras de AIA (1 a 10 µg/mL de AIA),
medianas productoras (11 a 100 µg/mL de AIA) y altas productoras (más de
100 µg/mL de AIA) (25). De acuerdo a la clasificación anterior todas nuestras
cepas son medianas productoras de AIA.
Por lo anterior, se realizó un ensayo con una mezcla de semillas de pasto para
poder comprobar si el AIA producido por estos Paenibacillus sp y
Pseudomonas putida tenía algún efecto sobre el crecimiento vegetal. Se
encontró que dicha fitohormona si produce un incremento en la longitud del
pasto y de la raíz, así como un incremento en el número de pelos radicales
absorbentes, no se realizó un análisis estadístico pero a simple vista se
observó una diferencia en la longitud de los pastos, este efecto es reproducible,
49
ya que se realizó en 50 semillas por cada microorganismo. No se observó
ningún efecto sobre el tiempo de germinación de las semillas (19).
En este ensayo se observó también que Paenibacillus sp y Pseudomonas
putida producen una mayor cantidad de AIA utilizando extracto de suelo como
medio de cultivo, ya que en el ensayo previo se utilizó caldo nutritivo
adicionado de triptofano. Estos resultados indican que dichos microorganismos
utilizan como fuente de carbono los hidrocarburos presentes en el extracto de
suelo y que no requieren la adición de triptofano para sintetizar AIA (19).
50
7. CONCLUSIONES
Se logró determinar mediante el análisis fisicoquímico que los suelos
contaminados no presentan las características adecuadas para que se lleve a
cabo el proceso de biodegradación de hidrocarburos.
Se consiguió aislar a 42 cepas a partir de las dos muestras de suelo, de las
cuales se logró identificar por medio de técnicas moleculares a 6 diferentes
microorganismos, los cuales son capaces de tolerar concentraciones de
petróleo presentes en el medio de cultivo de hasta 100%. Se demostró que los
6 microorganismos identificados son oxidasa positivos, dicha enzima es
necesaria en la biodegradación de compuestos derivados del petróleo.
En el suelo poco contaminado se identificaron a los siguientes géneros de
microorganismos: Arthrobacter sp, Bacillus sp y Paenibacillus sp. Dichos
géneros pueden estar formando asociaciones o consorcios microbianos, ya que
al estar presentes poblaciones mixtas en los suelos, se puede tener una mayor
capacidad de metabolizar contaminantes, ya que cada microorganismo
presenta diferentes capacidades enzimáticas y esto puede ocasionar que se
amplíe la cantidad de sustratos que se pueden metabolizar.
En el suelo muy contaminado se identificó como único género a Pseudomonas
sp, esto es por su capacidad de tolerancia y de degradación de hidrocarburos.
51
Se determinó la concentración de AIA y se encontró que Paenibacillus sp y
Pseudomonas putida son los mejores productores de AIA y que se clasifican
como medianas productoras de AIA.
En el ensayo con plantas se demostró que el AIA producido por estos dos
microorganismos produce un incremento en la longitud del pasto y su raíz, así
como la presencia de pelos radicales aborbentes.
Lo anterior indica que estos dos microorganismos pueden participar en
procesos de biorremediación, para poder remover del suelo hidrocarburos
derivados del petróleo.
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8. APÉNDICE DE REACTIVOS
1. Cianuro de potasio al 2%. Disolver 2 g de KCN en 100 mL de agua
destilada. Conservar en frasco ámbar de cristal.
2. Dicromato de potasio 1 N. Se disuelven 49.025 g de K2Cr2O7 QP en
agua destilada y se afora a 1000 mL.
3. Difenilamina. Disolver 0.5 g de difenilamina en 20 mL de agua y 100 mL
de H2SO4 concentrado.
4. Hidroxilamina al 4%. Disolver 4 g de NH2OH-HCl en 100 mL de agua
destilada.
5. Metasilicato de sodio al 3.6%. Disolver 50 g de metasilicato de sodio en
un litro de agua destilada y se ajusta hasta una lectura de 36 con un
hidrómetro.
6. Negro de eriocromo T. Disolver 0.5 g de eriocromo T y 4.5 g de NH2OH-
HCl en 100 mL de alcohol metílico.
7. Oxalacetato de sodio al 3%. Disolver 3 g de oxalacetato de sodio en 100
mL de agua destilada.
8. Reactivo de Salkowski. FeCl3 0.5 M en ácido perclórico al 35%. 2% (p/v).
9. Solución amortiguadora de pH 10. Disolver 67.5 g de NH4Cl en 200 mL
de agua destilada, adicionar 570 mL de NH4OH concentrado y diluir con
agua destilada a 1000 mL.
10. Solución de cloruro de calcio 1 N pH 7. Pesar 109.5 g de CaCl2-6H2O,
oforar a 1000 mL con agua destilada libre de CO2 y ajustar el pH a 7 con
Ca(OH)2.
53
11. Solución de cloruro de sodio 1 N pH 7. Disolver 58.5 g de NaCl en agua
destilada y aforar a 1000 mL.
12. Solución salina 0.85%. Disolver 8.5 g de NaCl en 1000 mL de agua
destilada.
13. Sulfato ferroso 1 N. Disolver 278 g de FeSO4-7H2O QP en agua
destilada, agregar 15 mL de H2SO4 concentrado y aforar a 1000 mL con
agua destilada.
14. Solución de verseno 0.1 N. Disolver 20 g de EDTA deshidratado en 900
mL de agua destilada en la que previamente se disolvieron 0.39 g de
MgCl2-6H2O y aforar a 1000 mL con agua destilada. Conservar en frasco
de polietileno.
15. Tetrametil p-fenilendiamina 1%. Disolver 1 g de dihidrocloruro de
tetrametil-p-fenilendiamina y aforar a 100 mL con agua destilada.
Proteger de la luz.
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