Republica Bolivariana de VenezuelaUniversidad del Zulia Facultad Experimental de CienciasDepartamento de Biología Materia: Microbiología General

Realizado por:Jennifer Morales

CI: 18.962.740

Tomar con la mano izquierda un tubo que tenga un cultivo de caldo y otro un caldo nutritivo estéril

Mechero

Asa en forma de anillo

Asa de platino y Tubos de ensayo

Tubos de ensayo

Insertar el asa en el cultivo de Staphylococcus y transferir una asada al tubo con caldo estéril moviendo el asa dentro del medio

Flamear y colocar las tapas

Esterilizar el asa y rotular

Tubos de ensayo

37ºC t= 24 – 48h

Incubar en una estufa

Mechero y otros

Siembra en medios líquidos

Organizar área de trabajo colocando los materiales necesarios

Materiales: Cultivo en caldo de 24h de StaphylococcusCultivo en agar nutritivo de Escherichia coli Caldo nutritivo estéril

Tubos de ensayo

Asa de inocular

Sostener los tubos para formar un trípode con los dedos pulgares, índice y medio y recogiendo los dedos anular y meñique hacia el centro de la mano.

Con la mano derecha. Esterilizarla flameando, hasta obtener color rojo y dejar enfriar

Quitar las tapas sosteniéndola con los dedos medio, anular y meñique de la mano derecha

Flamear la boca de ambos tubos

Maracaibo, Septiembre de 2012Metodología

Transferencia y siembra de microorganismos en medios en tubos de ensayo.

Cultivos:Staphylococcus aureus Escherichia coli Bacillus subtilis Cultivo mixto

Siembre en medios líquidos

Tubos de ensayo

Siembra en medios Sólidos

Agar Inclinado

Agar en Taco

Mechero Continuar con el procedimiento anterior desde flamear la boca de los tubos y colocar tapas

Asa

Asa de inocular y tubo de ensayo

Insertar un asado en el medio de cultivo

Transferir el tubo de agar inclinado, introducir el asa y hacer una punción en el centro del medio, desde la parte superior hasta el fondo del tubo

Repetir procedimiento anterior hasta la flameación de ambos tubos

Eliminar el asa suavemente

Continuar de la misma forma que el ejercicio anterior

Insertar un asa en punta en el cultivo Asa

Trasladar el material que está unido a la punta al tubo en forma de taco y hacer una punción en el centro del medio, comenzando desde la parte superior hasta el fondo del tubo

Aguja

Asa de inoculación en punta

Repetir procedimiento anterior hasta la flameación de ambos tubos

Mechero

Placa de petri

Asa de platino circular

Colocar en posición invertida en la mesa

Levantar el fondo de la placa que contiene el medio y mantenerla cerca del mechero

Técnica de siembra por estria en placa

Tomar muestra con el asa esterilizada

Métodos para aislar cultivos puros

Placa de petri

Diseminar los microorganismos de acuerdo a la técnica (cuadrante radial o

Esterilizar entre los rayados de cada Asa

Volver a esterilizar el asa

37ºC t= 24 -48hIncubar en forma invertida

Resultados y Discusión

Transferencia y siembra de microorganismos en medios en tubos de ensayo.

El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En general, podemos distinguir cultivos líquidos y sólidos en función de las características del medio y cultivos discontinuos y continuos en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio.

Siembra en medios líquidos:

Caldo Nutritivo: se emplearon los cultivos de S. aureus, E. coli y B. subtilis la técnica fue empleada correctamente se observo crecimiento de los microorganismo.

Siembra en medios sólidos:

Gelatina nutritiva: se observo crecimiento.

Tabla N° 1 Taco - Agar nutritivo

CultivoCalidad de la técnica

Observación

E. coli BB. subtilis BS. aureus B

Leyenda: Calidad de la técnica: Buena (B), Regular (R) y Mala (M)

Tabla N° 2 Bisel - Agar nutritivo

CultivoCalidad

de la técnica

Observación

E. coli B

B. subtilis R Se rompió un poco el Agar , la estría no se aprecio mucho se observo como un recorrido recto pero uniforme

S. aureus R se rompió un poco el Agar, se observo crecimiento Leyenda: Calidad de la técnica: Buena (B), Regular (R) y Mala (M)

Tabla N° 3 Taco/bisel - Agar nutritivo

CultivoCalidad

de la técnica

Conclusión de la Técnica

E. coli RLa punción se realizo muy arriba cerca del borde del tubo, además al final del medio se rompió el Agar.

B. subtilis RLa estría no comenzó desde la primera punción, se rompió el Agar un poco al final

S. aureus RLa punción se realizo muy arriba cerca del borde del tubo.

Leyenda: Calidad de la técnica: Buena (B), Regular (R) y Mala (M)

Medios para aislar cultivos puros

Para el aislamiento de cultivos puros, se realiza mediante la producción de colonias aisladas en cultivos sólidos. El crecimiento de las bacterias permite producir un gran número de ellas a partir de una única célula inicial de forma que, tras un periodo de incubación en las condiciones ambientales adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos iguales. Por medio de un cultivo mixto se puede obtener un cultivo puro de bacterias, a través de la obtención de colonias aisladas, ya que cada colonia representa una población de microorganismos procedentes de una sola célula, y a partir de esta se obtiene dicho cultivo puro de un solo tipo de microorganismo. Para ello se utilizan diferentes técnicas de aislamiento.

Técnica por siembra por estría en placa

No fue realizado en practica

- Estría Continua: Se realiza un solo rallado de manera continua por toda la placa de petrí.

Para este método se emplea un asa de siembra, Las estrías se realizan en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. Por cada rallado se debe flamear el asa, se toca una zona que no tenga cultivo primero para enfriar el aso y luego se toca la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales, Luego se incuban.

Estría en forma de T: se realizan tres rallados, el primer rallado es hasta la mitad de la placa, el segundo solo debe tocar un poco la parte final de primer rallado, igualmente el tercer rallado.

Tabla 4 Estría en forma de T

MedioCalidad

de la Técnica

Estría en forma de T. Observaciones

Agar Mckonkey -Cultivo mixto

RPrimer Rallado se observo crecimiento con

separación de colonias de 2mm, segundo y tercer Rallado no se observo crecimiento

Manitol Salado - Cultivo mixto

R Primer Rallado se observo poco crecimiento.

Leyenda: Calidad de la técnica: Buena (B), Regular (R) y Mala (M)

- Estría Radial: Se emplean tres estrías, el primer rallado se realiza en cerca del borde de la placa, el segundo rallado debe empezar en el centro del primero a partir de la periferia e ir perpendicular hacia arriba, el tercer rallado comienza desde el final del segundo y va hacia abajo

Técnica de Vertido en Placa Tabla N°5 Técnica de Vertido en Placa

Tubo Observaciones

N°1Crecimiento uniforme, incontable, tamaño de las colonias mayor

N°2 contaminadaN°3 poco crecimiento

1 32

1 2 3

Las muestras diluidas se mezclaron con Agar fundido a 45°C, se inoculo el tubo N°1 luego a partir de este se transfirió una asada al tubo N°2, se agito vigorosamente para diluir las células y el proceso se repite siguiendo la secuencia en el tubo N°2 y 3. Luego se hecho sobre la placa cada uno de los tubos. De acuerdo a la tabla N°5 en el tubo 1 hubo presento mayor número de colonias debido a la concentración de inoculo, el tamaño de las colonias fue menor ya que como hay poco espacio en el medio las colonias no pueden alcanzar mayor tamaño.

En el tubo N°2 la vértelo en la placa se produjo contaminación de la misma

Se tomo en cuenta en el momento del contaje es que si se observan dos colonias que quedaron juntas se cuentan como una. En el tubo N°3 se observo poco crecimiento lo cual pudo deberse a la dilución del cultivo.

ConclusiónSe conocieron y se practicaron las técnicas de siembra y

aislamiento de los microorganismos en cultivos líquidos y sólidos, así mismo se evaluó la práctica de las técnicas y se corrigieron las fallas.

Referencias Bibliográficas

Prieto, J. 1997. Microbiología para Ciencias de la Salud. Conceptos y Aplicaciones. Segunda Edición. EDITORIAL ELSEVIER. España

Rodríguez F. Prácticas de Microbiología. Catedrático de Universidad, Área de Microbiología Disponible en: http://egg.umh.es/frvalera/manualDePracticas.pdf

Republica Bolivariana de VenezuelaUniversidad del Zulia Facultad Experimental de CienciasDepartamento de Biología Materia: Microbiología General

Realizado por:Desireé RevillaCI: 20.280.895

Maracaibo, Septiembre de 2011Metodología

Características del Cultivo. Evaluación de las Técnicas de Aislamiento

Caldo nutritivo

Llevar los cultivos inoculados al mesón

Tratar de moverlos lo menos posible para no alterar el crecimiento de los

Tomar los siguientes datos

Agar Inclinado

1.- SuperficiePelícula, Membranoso, Floculento y Anillado

2.- Debajo de la Superficie

Turbio, Granular y Floculento

3.- Sedimento

Crecimiento en la parte inferior

Tubo de ensayo

4.- Cantidad de Crecimiento

AgitarTubo de ensayo

Determinar de acuerdo a poco, moderado y abundante

Evaluar el bisel, Taco/bisel de acuerdo

1.- Cantidad de crecimiento

Determinar de acuerdo: ninguna, poco, moderado y abundante

Gelatina en Taco

2.- Color

Se puede observar sobre el crecimiento y/o medio

3.- Opacidad

Expresar el grado de opacidad como opaco, transparente,

translucido

4.- FormaFiliforme, Erizado, Arrosariado, Difuso, Arborescente y Rizoide

Observar el Tipo de crecimiento ausencia o presencia de licuefación

Colocar los tubos en la nevera para solidificar si están licuados

CrecimientoLicuefación

Evaluar de acuerdo

Placa con Agar

Resultados

Características del Cultivo. Evaluación de las Técnicas de Aislamiento

Tabla N° 1 Caldo NutritivoCaracterísticas Evaluadas

Cultivo SuperficieDebajo de

la Superficie

SedimentoCantidad de Crecimiento

S. aureus - Granular - Poco

B. subtilis -Floculent

oSedimento Poco

La Morfología de la Colonia depende de

1.- MargenEntero, Ondulados, Lobulados, Erisionados, Contorneado, Filamentosos Encrespadas

2.- Espesor

3.- Forma

4.- Superficie

5.- Opacidad

Planas, Convexas, Elevadas, Umbilicadas, Umbonante y Protuberante

Filiforme, circular, irregular, rizoide y de huso

6.- Consistencia

7.- Cromogenésis

E. coli - TurbioSedimento-Floculento

Moderado

Tabla N°2 Taco - Agar NutritivoCaracterísticas Evaluadas

CultivoTipo de

Crecimiento

OpacidadCromogén

esisCantidad de Crecimiento

S. aureus Arrosariado opaco Blanco Poco

B. subtilisArborescente

Transparente

Blanco Moderado

E. coli Velloso opaco Blanco Moderado

Tabla N°3 Bisel - Agar NutritivoCaracterísticas Evaluadas

Cultivo Forma Color OpacidadCantidad de Crecimiento

S. aureus Arrosariado Blanco opaco PocoB. subtilis Difuso Blanco Traslucido Poco

E. coli Difuso Blanco opaco Abundante

Tabla N°4 Taco/Bisel - Agar Nutritivo Características Evaluadas

Cultivo Forma Color OpacidadCantidad de Crecimiento

S. aureus Arrosariado Blanco opaco ModeradoB. subtilis Filiforme Blanco opaco Moderado

E. coli Filiforme Blanco opaco Moderado

Tabla N°5 Gelatina Nutritiva – TacoCaracterísticas Evaluadas

Cultivo Crecimiento Licuefación

S. aureusDifuso a lo largo del

TuboNo

B. subtilis Difuso en la Superficie NoE. coli Arrosariado No

Tabla N° 6 Placas con Agar

Morfología de

Colonias

Agar Mckonkey Manitol Salado Agar nutritivo

Placa 1

Placa 2

Placa 3

Placa 1 Placa 2Placa 1 S.

aureus

Placa 2: B.

subtilis 

Placa 3: E. coli

Margen Ondulado Entero Entero Entero Entero Entero

Entero Entero

Espesor Convexa

Convexa

Convexa

Convexa

Convexa

Plano Convexa

Plano

Forma Circular

Circular

Circular

Circular Circular Circular

Circular

Circular

SuperficieLisaMate

LisaMate

LisaMate

LisaLustrada

LisaLustrada

LisaMate

LisaLustrad

a

LisaLustrad

aConsistenci

aViscos

aViscos

aViscos

aViscosa Viscosa Viscos

aViscos

aViscos

a

Opacidad Opaco Opaco Opaco Opaco Opaco Opaco

Opaco Opaco

Cromogénesis

Fucsia Fucsia FucsiaAmarilloBlancusc

o

AmarilloBlancusc

o

Blanco

BlancoBlanc

o

Discusión

Evaluación de los Cultivos

Caldo Nutritivo

Se presento crecimiento debido a las 48 h que estuvo en la incubadora. En la superficie del caldo, para su identificación se procedió a tocar con el asa de platino la superficie del caldo, tomando las precauciones de asepsia, generalmente se pueden formar una película que es una capa fina de células adyacentes pero sin estar pegadas, un anillo cuando se forma crecimiento en la superficie de los bordes del tubo, membranoso cuando es capa de células finas, que se puede identificar tocando la superficie del cultivo con el asa y si se adhiere una membrana, presenta este crecimiento, y floculento cuando son agregados de colonias en forma de masas que flotan en la superficie. En la tabla N°1 no se observo indicio de forma de crecimiento en la superficie. Luego se observo por medio del asa se toco el fondo para comprobar si se encuentra algún precipitado, esta se forma debido a los días ya que las bacterias tienden a depositarse o a precipitarse cuando se refrigeran por varios días. Seguido a esto se agitaron los tubos, dando golpecitos, rodando el tubo en la palma de la mano, para comprobar el

crecimiento debajo de la superficie, que se presento de acuerdo a la Tabla N°1 de forma floculenta formando masas densas, de forma granular por medio de partículas que flotaban en el caldo y un tubo con turbidez, presento un crecimiento uniforme.

Taco - Agar Nutritivo

El agar nutritivo es un requermiento absoluto para el crecimiento de las bacterias, en general menos del 80% de la masa de las bacterias es agua, por lo que la disponibilidad de agua, condiciona el tamaño de las poblaciones bacterianas

Taco – Gelatina Nutritiva

Se usa gelatina a diversos medios para determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas de tipo proteolítico que, a su vez, son detectadas por la digestión o licuefacción de la gelatina presente se avalúa dicha capacidad. Estas enzimas, que son capaces de gelatinósis, se denominan gelatinasas.

Las proteínas que se producen naturalmente son demasiado grandes para entrar a la célula bacteriana; por lo tanto, para que una célula utilice estas proteínas primero debe ser degradada a componentes más pequeños, las enzimas exocelulares de tipo proteolítico; gelatinasas, son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las proteína y dicha capacidad ayuda a la identificación bacteriana. El catabolismo de la proteínas por las gelatinasas da el resulta de una mezcla de aminoácidos

Placas con Agar Nutritivo

- MS: se cultivo en este medio cultivo mixto compuesto por E. coli y S. aureus se observo cambio de color donde en la región donde se encontraba la cepa del medio se torno amarillo, está técnica se emplea para obtener el aislamiento y diferenciación de estafilococos, inhibiendo el crecimiento de otras bacterias ya que se utiliza una alta concentración de sal, el medio de cultivo, presenta el extracto de carne y la pluripeptona, que constituyen la fuente de carbono, nitrógeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro

de sodio (que se encuentra en alta concentración) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante, y el rojo fenol es el indicador de pH. 

Las bacterias que crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, producen ácidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Por ende las colonias de color amarillo observadas provienen de S. aureus ya que estas crecen en un medio con alta concentración de sal y fermentan el manitol, hidrolizando el medio y acidificándolo, los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o púrpura.

- MC: la cepa se torno fucsia oscura y el medio rosado claro este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gramnegativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que fermentan lactosa (L+) de las no fermentadoras (L-). Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae se desarrollan en el mismo. Contiene sales biliares y cristal violeta, lo que inhibe el crecimiento de bacterias Grampositivas, lo que convierte en un medio diferencial poco selectivo.

- AN: esté medio de cultivo utilizado para propósitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos.

Referencias Bibliográficas:

McdLab. Agar sal y manitol MCD LAB, S. A. de C.V. México. Disponible en: http://www.mcd.com.mx/pdfs/AGAR%20SAL%20Y%20MANITOL.pdf

BritaniaLab. Manitol Salado. Disponible en: http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/manitolsalagar.htm

http://books.google.com/books?id=ZttS4I6wCpYC&pg=PT41&lpg=PT41&dq=aislamiento+de+microorganismos&source=bl&ots=VJnQ22RuYl&sig=7vkz67nuOnkMQV3Tt5uwWqODVvU&hl=es-419&ei=FiVyTpXeFdO_gQfUoZCNBQ&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=7&ved=0CEkQ6AEwBg#v=onepage&q=aislamiento%20de%20microorganismos&f=false