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INFORME TÉCNICO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
TÍTULO DEL TRABAJO: AISLAMIENTO DE
MICROORGANISMOS DEGRADADORES DE CARBAZOL Y ALQUIL CARBAZOLES EN GASOLEOS.
QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE INGENIERO AMBIENTAL
PRESENTA: LUIS ARMANDO MORENO SÁNCHEZ
México, D. F: Mayo del 2006
DIRECTOR EXTERNO: Dra. María Elena Acuña Argüelles DIRECTOR INTERNO: M. En C. Gloria López Jiménez
2
Este trabajo fue realizado en el Instituto Mexicano del Petróleo, en el Área de Procesos
y Reactores bajo el financiamiento del proyecto D0293, bajo la dirección de la Dra.
María Elena Acuña Argüelles.
3
Comité de Evaluación
1.- Asesor Externo: Dra. María Elena Acuña Argüelles
2.- Asesor Interno: M. En C. Gloria López Jiménez
3.- Evaluador: Dr. Wilverth Villatoro Monzón
4.- Evaluador: Ing. Isabel García Ventura
4
Agradecimientos
A la Dra. María Elena Acuña Argüelles, por su gran labor de guía durante más de un
año y su empeño en la realización del presente trabajo.
A mis padres, que siempre me han apoyado, que bajo ninguna situación me volvieron
la espalda y siempre han dado lo mejor de si para que yo tuviera una formación
profesional.
A mi tía Laura, por el apoyo, consejos, motivación y ayuda que prestó a lo largo de mi
formación profesional.
A la Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología, por haberme formado como
Ingeniero Ambiental
Al Instituto Mexicano del Petróleo, por haber financiado este proyecto y haberme
permitido formar parte de el.
A Nancy, por ser el apoyo y refugio en los momentos difíciles.
A mis amigos, familiares y profesores.
5
Resumen El petróleo es una mezcla natural de hidrocarburos que contienen S,O y N. Los
hidrocarburos aromáticos nitrogenados (HAN) ocasionan corrosión en los ductos donde
se transportan y en los tanques dónde se almacenan. Sí están presentes en los
combustibles, al hacer combustión se producen NOX que son precursores de la lluvia
ácida. Ocasionan inhibición de los catalizadores de hidrodesulfuración (HDS). Los HAN
se dividen en básicos y no básicos, los no básicos son los más abundantes y el mas
representativo de estos compuestos es el carbazol (Cz). Existen métodos
fisicoquímicos para remover los HAN en los derivados del petróleo, como la
hidrodenitrogenación (HDN). Hay reportes de la degradación de los HAN por medio de
microorganismos, pero estos reportes usan como sustrato compuestos modelo como el
Cz y la quinolina, pero no hay reportes con cargas reales. Este trabajo se enfocó al
aislamiento de microorganismos degradadores de carbazol y alquil carbazoles de
gasóleo a partir de muestras de suelo contaminado con hidrocarburos, para degradar
los HAN del gasóleo ligero de petróleo (GLP).
Se obtuvieron cultivos capaces de utilizar carbazol como única fuente de carbono y
nitrógeno a 40°C. Estos cultivos también utilizan los HAN del gasóleo cómo fuente de
carbono y nitrógeno. Paralelamente, se utilizó como sustrato una fracción de FCC que
tenía una alta concentración de HAN, para facilitar su manejo se diluyó 1:6 con
hexadecano. Se seleccionó el cultivo que presentó mejor degradación. De estos
cultivos se aislaron las colonias en agar nutritivo y agar carbazol. El cultivo elegido en
gasóleo presentó 98x109 UFC/mL. En agar nutritivo se encontraron 11 bacterias y un
hongo.
Los HAN del GLP se identificaron según los artículos de Weiwel et. al. 2000 y Choi et.
al. 2003. Se obtuvieron cultivos capaces de degradar carbazol, y de utilizar como
sustrato los HAN del gasóleo. Únicamente se obtuvo crecimiento a 40 °C. El carbazol y
los carbazoles monometilados se consumen antes de las primeras 48 h. Los
dimetilados y trimetilados no se degradan en 96 h, pero se degradan por completo a
las 336 h. Hay reportes de carbazol degradado en 48 h, pero no existen trabajos que
reporten degradación de alquil carbazoles o el uso de gasóleo como sustrato. La
cantidad de CO2 esperada a partir de la degradación de los HAN fue 80% menor a la
real, lo que significa que se están degradando otros hidrocarburos del gasóleo.
6
ÍNDICE I.- Introducción 9 1.- El Problema de los Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados en el Petróleo 9 2.- Clasificación del los Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados 10 3.-Métodos Convencionales de Remoción de Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados.
12
A) Reacciones de la HDS 17 B) Reacciones de la HDN 18 4.- Método alternativo para la remoción de los Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados: Método Biotecnológico
20
A) Biotratamiento de los Compuestos Nitrogenados Básicos: Quinolina 21 B) Biotratamiento de los Compuestos Nitrogenados No Básicos: Carbazol 23 II.- Justificación 26 III.- Objetivos 26 IV.- Materiales y Métodos 27 V.- Resultados 34 1.- Obtención de cultivos con carbazol 34 2.- Experimentos con gasóleo 34 a) Obtención de cultivos con gasóleo 34 b) Aislamiento, conteo y características morfológicas de los microorganismos que conforman los cultivos con gasóleo
36
c) Evaluación de la degradación de los Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados en gasóleo ligero de petróleo (GLP)
37
d) Determinación de la degradación de los hidrocarburos aromáticos nitrogenados del gasóleo ligero de petróleo respecto del tiempo
43
3.- Experimentos con FCC 46 a) Obtención de los cultivos con FCC 46 b) Evaluación de degradación de los Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados en FCC
48
4.- Determinación de la velocidad de crecimiento 54 VI.- Conclusiones 57 VII.- Recomendaciones para un trabajo futuro 58 VIII.- Referencias 58
7
ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Algunas propiedades físicas de los hidrocarburos aromáticos nitrogenados
10
Tabla 2. Condiciones típicas de proceso para varias reacciones de hidrotratamiento
14
Tabla 3. Principales propósitos del hidrotratamiento en las diversas corrientes de las refinerías
15
Tabla 4. Evaluación de la capacidad de crecimiento en carbazol de las muestras a 40°C
33
Tabla 5. Evaluación de la capacidad de crecimiento de los cultivos con GLP como sustrato
34
Tabla 6. Número total de microorganismos que integran a los cultivos. 35 Tabla 7. Tipo y distribución de bacterias que integran los cultivos. 35 Tabla 8. Concentración inicial y porcentaje de degradación del carbazol y los carbazoles monometilados del GLP por cada cultivo.
40
Tabla 9. Concentración inicial y porcentaje de degradación los carbazoles dimetilados del GLP por cada cultivo.
40
Tabla 10. Concentración inicial y porcentaje de degradación los carbazoles trimetilados, nitrógeno de carbazoles y nitrógeno total del GLP por los 3 cultivos.
41
Tabla 11. Degradación del carbazol y los carbazoles monometilados del GLP respecto del tiempo.
43
Tabla 12. Degradación de los Carbazoles Dimetilados del GLP respecto del tiempo.
44
Tabla 13. Degradación de los Carbazoles Trimetilados y del contenido de Nitrógeno Total del GLP respecto del tiempo.
45
Tabla 14. Evaluación de la capacidad de crecimiento de los cultivos con FCC como sustrato.
46
Tabla 15. Concentración inicial y porcentaje de degradación del carbazol y los carbazoles monometilados de FCC por los 3 cultivos.
51
Tabla 16. Concentración inicial y porcentaje de degradación de los carbazoles dimetilados de FCC por los 3 cultivos.
52
Tabla 17. Concentración inicial y porcentaje de degradación los carbazoles trimetilados, nitrógeno de carbazoles y nitrógeno total de FCC por los 3 cultivos.
53
8
ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructura y nombres de los hidrocarburos aromáticos nitrogenados 9 Figura 2. Representación de una sección de una refinería en la cuál se muestran los puntos donde se aplica la hidrodesulfuración
11
Figura 3. Reacción del tiofeno en la HDS 16 Figura 4. Reacción del Dibenzotiofeno en la HDS 17 Figura 5.Reacciones de la quinolina en HDN 18 Figura 6. Ruta de degradación de quinolina de Kilbane et. al 1993 21 Figura 7. Ruta de Degradación de Isoquinolina de Rothenburger et. al. 1993 22 Figura 8. Ruta Propuesta por Ouchiyama et. al. (1993) para la bidegradación del Carbazol
23
Figura 9. Comparación entre una muestra de gasóleo sin inocular (izquierda) y una muestra tratada con el cultivo D tras 15 días de incubación (derecha)
35
Figura 10. Comparación entre una muestra de gasóleo sin inocular (derecha), una muestra tratada durante 15 días por el cultivo A (centro) y el cultivo D (izquierda).
36
Figura 11. Cromatogramas de las muestras de gasóleo: Testigo sin inóculo (centro arriba), muestra tratada por el cultivo D (abajo izquierda) y muestra tratada por le cultivo A+ (abajo derecha).
37
Figura 12. Comparación de los ajustes en Excel de los datos integrados por el cromatógrafo del blanco de gasóleos contra los ajustes de las muestras tratadas por los cultivos D (línea punteada) y A+ (línea gruesa).
38
Figura 13. Estructura del 1,8-dimetil-carbazol. 39 Figura 14. Ajuste en Excel de los datos integrados por el cromatógrafo de una muestra de gasóleo con identificación de sus componentes.
40
Figura 15. Comparación de una muestra de FCC sin inocular (izquierda), y una muestra de FCC tras 15 días de inoculación con el cultivo D3 (derecha)
47
Figura 16. Comparación entre una muestra de FCC sin inocular (derecha), una tratada con el cultivo A (izquierda) y una tratada con el cultivo D (centro).
47
Figura 17. Comparación entre los cromatogramas de FCC: testigo (rojo) y tratado por el cultivo D (negro).
48
Figura 18. Comparación entre los ajustes en Excel de los datos integrados por le cromatógrafo de una muestra de gasóleos (línea punteada) y una de FCC (línea continua).
49
Figura 19. Ajuste en Excel de los datos integrados por el cromatógrafo de una muestra de FCC sin tratamiento biológico (Línea continua) y muestras tratadas por los cultivos A+ (línea gruesa) y D3 (línea punteada)
50
Figura 20. Comparación entre la producción de CO2 del cultivo D con GLP, por duplicado (línea continua y punteada), y del cultivo D sin fuente de carbono y nitrógeno (línea gruesa)
54
Figura 21. Comparación entre la producción de CO2 del cultivo D con FCC, por duplicado ( línea continua y punteada), y del cultivo D sin fuente de carbono y nitrógeno (línea y gruesa)
55
Figura 22. Crecimiento de la población del cultivo determinada por diferencia de pesos durante la cinética: D con GLP (línea continua), D con FCC (línea punteada)
56
Anexo 1. Cromatograma de los hidrocarburos aromáticos nitrogenados obtenida por Choi et. al. 2003.
61
9
I.- INTRODUCCIÓN
1.- El Problema de los Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados en el Petróleo.
El petróleo crudo es una mezcla heterogénea natural de compuestos orgánicos. Está
formado de una mezcla de hidrocarburos alifáticos y aromáticos, saturados e
insaturados, de estructura homogénea y sustituidos, de los homogéneos podemos
señalar a los que contienen nitrógeno, azufre y oxígeno (Benedik et. al. 1998).
Los hidrocarburos aromáticos que contienen nitrógeno dentro de su molécula,
representan el 0.3% de la composición total del petróleo crudo. Estos compuestos son
de gran importancia para la industria del petróleo porque causan inhibición de los
catalizadores de la hidrodesulfuración; tienden a inactivar los sitios catalíticos ácidos,
esto supone un mayor gasto para la empresa ya que al inhibirse es necesario
recambiarlos; además, ocasiona corrosión en los equipos de refinamiento, transporte y
almacenamiento. Estos compuestos junto con los hidrocarburos sulfurados están
presentes en los combustibles, al producirse la combustión se generarán óxidos de
nitrógeno y azufre que son causantes de la lluvia ácida (Benedik et. al. 1998).
Los yacimientos de petróleo varían mucho en calidad, uno de los aspectos que se toma
en cuenta es el punto de ebullición de los compuestos presentes. Los yacimientos de
alta calidad presentan una volatilidad más alta, es decir, un punto de ebullición más
bajo; lo que se refleja en el uso de condiciones de separación menos severas, es decir,
menor temperatura para la destilación, el uso de temperaturas menos extremas
favorece el tiempo de vida del equipo de destilación, a este crudo de bajo punto de
ebullición se le conoce como crudo ligero. El crudo de baja calidad o pesado tiene una
volatilidad más baja, o sea un punto de ebullición más alto. Los compuestos como el
carbazol tienen un punto de ebullición bastante elevado, lo que significa que aquellos
crudos ricos en carbazol necesitarán condiciones más severas de operación para
separarse y que sus derivados más pesados tendrán un gran contenido de carbazol y
alquil carbazoles, esto acarrea problemas debido a que el carbazol es un compuesto
10
aromático nitrogenado por lo que presenta todos los inconvenientes mencionados en el
párrafo anterior (Benedik et. al. 1998).
El carbazol es el compuesto nitrogenado heteroaromático más abundante del alquitrán
o del carbón de la creosota, y a pesar de que tiene una gran utilidad como materia
prima industrial para elaborar tintes, medicinas, insecticidas y plásticos; también es
considerado un contaminante del ambiente (Benedik et. al. 1998).
A pesar de su extendido uso, poco se sabe acerca del destino que tiene el carbazol en
el ambiente, heteroaromáticos nitrogenados, carbazol incluido, han sido detectados en
muestras de sedimentos de ríos, agua subterránea y suelo de sitios contaminados.
Esto es causa de preocupación pues es bien sabido que el carbazol, igual que muchos
otros hidrocarburos aromáticos policíclicos y heterocíclicos, es tóxico y mutagénico,
aunque si bien no es altamente tóxico por si solo puede generar hidroxinitrocarbazoles
genotóxicos (Benedik et. al. 1998).
2.- Clasificación de los Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados del Petróleo.
Los hidrocarburos aromáticos nitrogenados se dividen en dos grupos:
- Moléculas básicas: En esta categoría se hallan compuestos como la quinolina y
piridina así como sus derivados.
- Moléculas no básicas: Aquí encontramos pirroles, indoles, carbazol y alquil
derivados del carbazol.
Dentro de las moléculas básicas, la quinolina es la más estudiada, las moléculas no
básicas representan el 75% de los compuestos nitrogenados del petróleo, siendo el
carbazol la molécula más abundante de este grupo (Benedik et. al. 1998).
11
La estructura de los compuestos arriba mencionados se encuentra ilustrada en la figura
1. A su vez la tabla 1 contiene algunas de sus propiedades.
Figura 1. Estructura y nombres de los hidrocarburos aromáticos nitrogenados presentes en el petróleo, del lado izquierdo encontramos los no básicos y del derecho los básicos (Benedik et. al. 1998). Las siguientes propiedades son importantes debido a que el petróleo crudo es
sometido a una separación por destilación, la destilación es un método físico de
separación, este método se basa en las diferencias de las temperaturas de ebullición
de los componentes de una mezcla para separarlos. La propiedad log P es el
coeficiente de bipartición en octanol:agua, mientras más bajo sea, significa que el
hidrocarburo es más polar y esto lo vuelve tóxico para los microorganismos del suelo,
se ha comprobado que el límite es un valor de 1.3, debajo de este el hidrocarburo es
altamente tóxico(Benedik et. al. 1998, Topsoe et. al. 1996).
Tabla 1. Algunas propiedades físicas de los hidrocarburos aromáticos nitrogenados.
Hidrocarburo P de vapor (mmHg) T de ebullición (ºC)
T de fusión (ºC)
Log P
Carbazol 354.8 354.8 244 3.59 Acridina 346 346 110.5 3.51 Indol 253 253 52 2.13 Quinolina 237.7 237.1 -15 2.04 Pirrol 131 131 0.52 Piridina 115.4 115 - 42 0.70
HN
Carbazol
NH
Indol
NH
Pirrol
N
Piridina
N
Quinolina
NAcridina
12
Mientras más alto es el punto de ebullición de una fracción de petróleo, esta fracción se
considera más pesada, por lo tanto de la tabla anterior podemos deducir que aquellos
destilados que contengan pirrol o piridina serán más ligeros, un ejemplo de las
fracciones ligeras es la gasolina. Mientras que las fracciones más pesadas contendrán
carbazol, por ejemplo (Benedik et. al. 1998, Topsoe et. al. 1996).
3.- Métodos Convencionales de Remoción de Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados.
El hidrotratamiento o hidroprocesamiento se refiere a una variedad de procesos de
hidrogenación catalítica a la que son sometidos los hidrocarburos saturados, este
proceso satura a estos hidrocarburos, remueve azufre, nitrógeno y oxígeno de los
hidrocarburos, además de eliminar metales de las diferentes corrientes del petróleo de
la refinería (Topsoe et. al. 1996).
En la figura 2 se esquematiza el proceso que sufre el crudo en una refinería y muestra
los lugares donde se aplica el hidrotratamiento (Topsoe et. al. 1996).
Este tratamiento usualmente implica solo cambios pequeños en la estructura molecular
general del crudo, sin embargo, frecuentemente ocurren reacciones de
hidrorompimiento (HCR) que de hecho pueden ser deseadas (Topsoe et. al. 1996).
Hoy en día el hidrotratamiento es ampliamente usado tanto para la conversión de
fuentes de alimentación pesadas así como para el mejoramiento de la calidad de los
productos finales (Topsoe et. al. 1996).
El incremento en la severidad de la legislación ambiental acerca de las emisiones
dañinas ha desatado un incremento en el interés acerca de las investigaciones sobre
hidrotratamiento con el fin de que por medio de este, también se incremente la calidad
ambiental de los combustibles (Topsoe et. al. 1996).
13
Simbología: Hidrotratamiento. Extracción de Aromáticos Alquilación. Rompimiento de Fluidos Catalíticos (FCC). Reformador. Polimerización. Figura 2. Representación de una sección de una refinería en la cuál se muestran los puntos donde se aplica la hidrodesulfuración. Los procesos de hidrotratamiento han evolucionado desde procesos de hidrogenación
y rompimiento hasta la remoción de sulfuros de varias fracciones de combustibles.
Consecuentemente al hidrotratamiento se le ha llamado hidrodesulfuración (HDS), los
catalizadores para la hidrodesulfuración comúnmente consisten de molibdeno
soportado por aluminio con cobalto o níquel como promotores de la actividad catalítica
(Topsoe et. al. 1996).
Crudo
Desalación
Destilación atmosférica del crudo.
Destilación del crudo de vacío.
Elaborador de Coque. Coque
Remoción de asfalteno. Asfalteno.
Gasóleo atmosférico.
Keroseno.
Nafta pesada.
Nafta ligera
Gas.
Gasolina.
Aromáticos.
Keroseno.
Aceites combustibles
Planta de gas.
14
El agotamiento de las fuentes de petróleo de alta volatilidad y bajo punto de ebullición,
ha contribuido también al interés por el mejoramiento de los procesos de
hidrotratamiento, para tratar con alimentaciones más pesadas, que incluyen derivados
del carbón o arenas de alquitrán. El tratamiento de estas fuentes requiere
hidrodesulfuración profunda, conversión de grandes moléculas en otras de menor
tamaño, reducción de aromáticos, remoción de metales (hidrodemetalización, HDM),
nitrógeno (hidrodesnitrogenación, HDN) y oxígeno (hidrodesoxigenación, HDO). El
auge de tratamiento de estas fuentes pesadas ha forzado a que más del 50% de las
corrientes de refinerías cuenten con hidrotratamiento cuando en 1980 la cifra era
menor al 40% (Topsoe et. al. 1996).
Los logros de la aplicación del hidrotratamiento están basados en: características de la
alimentación, las condiciones de operación y calidad deseada del producto final
(Topsoe et. al. 1996).
Las reacciones que se llevan a cabo se clasifican de acuerdo a la severidad de la
operación:
- El Hidrotratamiento y la hidrogenación implican que no se afectarán el tamaño
molecular (Topsoe et. al. 1996).
- El hidrorompimiento moderado o hidroconversión implican el rompimiento de
gasóleos pesados en condiciones menos severas que el hidrorompimiento. El
cambio en el tamaño molecular es menor al 30% (Topsoe et. al. 1996).
- El hidrorompimiento implica que más del 50% de la alimentación sufre cambios
en la distribución del tamaño molecular (Topsoe et. al. 1996).
Las condiciones de proceso implican altas temperaturas y presiones, la tabla 2
presenta las condiciones típicas de proceso para las reacciones de hidrotratamiento
(Topsoe et. al. 1996).
15
Tabla 2. Condiciones típicas de proceso para varias reacciones de hidrotratamiento. (Topsoe et. al. 1996) Proceso de Hidrotratamiento. Temperatura (ºC). Presión Parcial de Hidrógeno
(atm). Nafta. 320 10 a 20 Keroseno. 330 20 a 30 Gasóleo atmosférico. 340 25 a 40 Gasóleo de vacío(VGO). 360 50 a 90 Residuo de desulfuración atmosférica (ARDS).
370 a 410 80 a 130
HCR de VGO. 380 a 410 90 a 140 HCR de residuos. 400 a 440 100 a 150. Uno de los puntos importantes a tomar en cuenta es la composición del crudo a tratar.
Por ejemplo el azufre, la impureza heteroatómica más abundante, puede estar
contenido en tan baja proporción como 0.1% p/p en el caso de crudos como el del
Norte de África o de Indonesia, mientras que en Venezuela o Arabia Saudita puede
variar entre 2 y 5% p/p (Topsoe et. al. 1996).
El contenido de nitrógeno usualmente varía entre 0.1 y 1% p/p. De estos, alrededor de
un tercio están presentes como compuestos básicos que contienen el núcleo de
piridina, el resto esta representado como compuestos no básicos que contienen el
núcleo de pirrol.
El oxígeno está poco presente, menos del 0.1%, y está representado frecuentemente
como ácidos carboxílicos y fenoles en las fracciones de punto de ebullición medio
(Topsoe et. al. 1996).
Los catalizadores más frecuentes están compuestos de combinaciones de metales,
como cobalto-molibdeno (CoMo), níquel-molibdeno (NiMo) y níquel-wolframio (NiW); la
concentración en % peso de los metales es por lo general: de 1 a 4 % para el cobalto y
el níquel, del 8 al 16 % para Molibdeno y del 12 al 25 % para el Wolframio (Topsoe et.
al. 1996).
Los materiales de soporte son típicamente aluminio, sílica-aluminio, sílica y magnesio
(Topsoe et. al. 1996).
La elección de un catalizador se hace basándose en el proceso que se quiere realizar,
para la HDS los catalizadores de cobalto-molibdeno son excelentes, pero estos
mismos muestran poca actividad para la HDN y la HID (hidrogenación), ya que
16
muestran poco consumo de hidrógeno. Los catalizadores de níquel-molibdeno son muy
buenos en HDN y HID pero incrementan el consumo de hidrógeno por lo que se
utilizan para tratar fuentes con grandes cantidades de insaturados. Los catalizadores
de NiW tienen la más alta actividad en hidrogenación de aromáticos y son muy activos
para el HCR pero su uso se ha limitado debido a su alto costo (Topsoe et. al. 1996).
Los diversos propósitos con que se utilizan el hidrotratamiento y sus variantes están
enlistados en la tabla 3.
Tabla 3. Principales propósitos del hidrotratamiento en las diversas corrientes de las refinerías (Topsoe et. al. 1996).
Reacción de Hidrotramiento Corriente Tratada Propósito principal. Alimentación reformadora catalítica .. Evitar inhibición de la catálisis ( 1 ppmS
máximo).
Diesel Cumplir límites ambientales. Combustibles destilados Cumplir límites ambientales. Alimentación de Rompimiento de Fluidos Catalíticos. (FCC)
Evitar la liberación de óxidos de azufre.
Corrientes varias Reducir la corrosión durante el refinamiento y el manejo.
Productos de corrida contínua. Mejorar el olor. Alimentación de HCR Evitar inhibición de los catalizadores. Residuos Cumplir las especificaciones para
combustibles o corrientes de alimentación de pretratamiento para mejoramiento de residuos por FCC.
HDS
Alimentación para coque Reducir contenido de sulfúro del coque. Diesel HID de aromáticos para mejorar el
contenido de Cetano.
Diesel Cumplir límites ambientales. Queroseno y combustibles de Jets Reducción de aromáticos. Alimentación de FCC Saturación parcial de compuestos
poliaromáticos.
HID
Alimentación proveniente de rompimiento.
HID de olefina y diolefina para incrementar estabilidad.
HDN Aceites lubricantes. Pulirlos (mejorar estabilidad) Alimentaciones de FCC y HCR Evitar inhibición de los sitios ácidos del
catalizador.
Alimentaciones de HCR Evitar inhibición de los sitios ácidos del catalizador.
HCR, Delavado, HCR moderado.
Residuos, Diesel, gasóleos de vacío (VGO).
Conversión a fracciones más ligeras y mejorar las propiedades de flujo.
Alimentación de FCC y HCR Evitar depósitos de metales, rompimiento no selectivo, fortalecimiento del coque, destrucción del zeolito.
HDM
Residuos Reducir depósitos de metales.
Reducción de CCR Alimentación de FCC y residuos Reducir la producción de coque de catalizadores de FCC.
17
A) Reacciones de la HDS.
Para los procesos de HDS las reacciones más estudiadas son las del tiofeno y el
dibenzotiofeno. Ambas reacciones son similares, la cinética es sencilla ya que se trata
de hidrogenaciones consecutivas para romper todas las instauraciones e incluso se
llega al rompimiento de la molécula aromática para formar alifáticas (Topsoe et. al.
1996).
Se sugieren dos posibles rutas para cada molécula, ambas vía hidrogenación. Para el
tiofeno, el hidrotratamiento puede romper la molécula de tiofeno para liberar butadieno
y ácido sulfhídrico, luego el butadieno es reducido a buteno y luego a butano. La otra
ruta menciona una hidrogenación del tiofeno que resulta en un tetrahidro – tiofeno, esta
molécula es rota y genera ácido sulfhídrico y buteno que más tarde es reducido a
butano, Estas reacciones se mencionan en la figura 3 (Topsoe et. al. 1996).
Figura 3. Reacción del tiofeno en la HDS. (Topsoe et. al. 1996)
S
Tiofeno
S
tetrahidro-tiofenoH2
1,3 -butadieno
1-buteno
1-buteno
H2
H2
Butano
H2
2H2
-H2S
-H2S
-H2S
-H2S
18
El caso del diobenzotiofeno es similar, una ruta habla de una extracción directa de
azufre, lo cual lleva al bifenil (producto en mayor cantidad) y más tarde llega al
ciclohexilbenceno por hidrogenación. La segunda ruta propone primero una
hidrogenación que resulta en el hexahidrodibenzotiofeno y luego una HDS que lleva al
ciclohexilbenceno, estas reacciones se ilustran en la figura 4 (Topsoe et. al. 1996).
Figura 4. Reacción del Dibenzotiofeno en la HDS. (Topsoe et. al. 1996).
B) Reacciones de HDN.
Este proceso se lleva a cabo previo a la HDS, para este caso, se tiene el mecanismo
de reacción de la quinolina (fig. 5). Para esta reacción tenemos una serie de pasos que
se cumplen:
1.- Hidrogenación del anillo nitrogenado.
2.- Rompimiento de un enlace C –N, y formación de un intermediario amínico.
3.- Hidrogenolisis del amino hasta carbohidratos y amoniaco.
S
Dibenzothiofeno
S
hexahidro-dibenzotiofenobifenil
Ciclohexil-benceno
H2-H2S
-H2SH2
19
Figura 5.Reacción de la quinolina en HDN. (Topsoe et. al. 1996)
Los compuestos que contienen nitrógeno son potentes inhibidores de la catálisis ya
que neutralizan los sitios activos ácidos (Benedik et. al. 1998).
La importancia de la desnitrogenación previa a la HDS para lograr una HDS ultra
profunda, fue estudiada por Choi et. al.(2004). En este trabajo se evaluaron tres
corrientes de gasóleo ligero a HDS, la diferencia entre estas tres corrientes era que la
primera se trataba de un gasóleo ligero que contenía 1.435 % p/p de S y 120 ppm de N
N
Quinolina
N5,6,7,8-Tetrahidro-quinolina
NH
1,2,3,4-Tetrahidro-quinolina
NH
C3H7
NH2Decahidro-quinolina 2-Propil-fenilamina
C3H7
NH2
C3H7
2-Propil-ciclohexilamina
Propil-ciclohexano
C3H7
NH3NH3
C3H7
NH3
1-Propil-ciclohexeno
Propil-benceno
+H2
+H2
+H2+H2
+H2
+H2+H2
+H2
+H2
+H2
-H2-H2
-H2
-H2
-H2
20
(LGO-A), los dos siguientes gasóleos eran derivados del primero ya que contenían una
cantidad similar de azufre pero tenían la característica de que habían sido
desnitrogenados hasta dejarlos en 43 (LGO-B) y 24 (LGO-C) ppm de N
respectivamente. El estudio tuvo un gran impacto debido a los resultados obtenidos, el
LGO-A tenía una concentración inicial de S de 14364 ppm, el LGO-B 12956 ppm S y el
LGO-C 13427 ppm S. El LGO-A a condiciones de HDS normales (340ºC y 30 bar H2)
redujo su contenido de S a 290 ppm, y aún en condiciones más severas (360ºC) su
contenido de S (65 ppm) no llegó a las 15 ppm que se está imponiendo como norma.
Los gasóleos desnitrogenados ofrecieron resultados mucho más satisfactorios: LGO-B
en condiciones convencionales llegó a 24 ppm S y a 360ºC alcanzó las esperadas 15
ppm. El LGO-C en condiciones convencionales alcanzó una concentración de S
bastante aceptable, 19 ppm y a 360ºC llegó hasta 8 ppm. Desde que fueron analizados
previo a la HDS, los gasóleos desnitrogenados mostraron un contenido menor de
sulfuros, lo que lleva a concluir que la HDN también remueve parcialmente los
compuestos azufrados. De este estudio podemos concluir que la previa
desnitrogenación favorece al desempeño de la HDS profunda, y que la HDS de un
gasóleo previamente desnitrogenado puede realizarse en condiciones menos severas.
Un trabajo similar fue desarrollado por Sumbogo et. al. (2003). En este se evaluó la
eficiencia de la HDS en gasóleos convencionales y en gasóleo previamente
denitrogenado. Luego de someter ambos a las mismas condiciones de HDS se
encontró que el gasóleo que las concentraciones de S en el gasóleo previamente
desnitrogenado eran mucho menores que las del gasóleo convencional.
4.- Método alternativo para la remoción de los Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados: Método Biotecnológico.
El método biotecnológico utiliza microorganismos para degradar algunos compuestos
nitrogenados sin alterar la composición del petróleo. Los dos compuestos modelos
usados en el estudio de la degradación biológica de los hidrocarburos nitrogenados
son el carbazol, representante de las moléculas no básicas, y la quinolina como
modelo de las moléculas básicas. Entre los microorganismos estudiados se encuentran
los géneros: Pseudomonas (degradadores de carbazol y quinolina), Sphingomonas
21
(Carbazol), Bacillus, Xanthomonas, Burkholderia, Comamonas (quinolina), Beijerinckia,
Mycobacterium y Serratia.
Estos microorganismos son aislados de muestras de descargas de agua residual, de
suelos contaminados con hidrocarburos, de efluentes industriales, así como de sitios
de licuefacción de carbón y petróleo.
Las rutas metabólicas para la degradación de quinolina y carbazol ya han sido
dilucidadas. Se han identificado los metabolitos y se sabe que el primer ataque a la
molécula de hidrocarburo se da por medio de oxidasas y que se generan
intermediarios di-hidroxilados que luego pueden pasar al ciclo de Krebs (Rothenburger
et. al. 1993, Kilbane et. al. 1999, Ouchiyama et. al. 1992)
A) Biotratamiento de los Compuestos Nitrogenados Básicos: Quinolina. El biotratamiento de la quinolina se ha llevado a cabo utilizando principalmente
bacterias del género Pseudomonas y Comamonas. Los microorganismos crecen a
temperaturas de alrededor de 30ºC y pH alrededor de 7. En los casos de
Pseudomonas la degradación de la quinolina se lleva a cabo en tiempos corto, de 9 a
24 horas.
Miethling et. al. (1993) estudió la degradación de quinolina por Comamonas
acidovorans. La cepa fue puesta en crecimiento en medios con quinolina como fuente
de carbono, nitrógeno y energía. Se utilizó también cultivo continuo en un reactor de
células inmovilizadas. Los resultados fueron bastante satisfactorios ya que se obtuvo
una degradación total de la quinolina en 1 h, considérese que la concentración inicial
era de 3.5 mM.
Kilbane et. al. (1999) estudiaron la remoción selectiva de nitrógeno de la quinolina y
del petróleo por Pseudomonas ayucida IGTN9m. La cepa es capaz de utilizar quinolina
como fuente de nitrógeno pero no la utiliza como fuente de carbono. Otros cultivos
microbianos reportados utilizan a la quinolina como fuente de carbono, nitrógeno y
energía. Pseudomonas ayucida IGTN9m es capaz de dejar intacto el esqueleto
carbonado de la quinolina y de remover el nitrógeno. Se identificaron algunos
22
intermediarios de la ruta metabólica de la degradación de la quinolina, como la 2 –
quinolinona y la 8 – hidroxicumarina.
La ruta metabólica para esta degradación selectiva de la quinolina viene ilustrada en la
figura 6.
Figura 6. Ruta de degradación de quinolina de Kilbane et. al. 1993. Rothenburger et. al.(1993) estudiaron la hidroxilación y biodegradación de 6 –
metilquinolina por células inmovilizadas de Psudomonas en un bioreactor en medio
acuoso y no acuoso. Las metil quinolinas son muy resistentes al ataque microbiano y
solo unas pocas de estas se habían comprobado que fueran susceptibles a la
hidroxilación microbiana. Para probar su efectividad contra alquil derivados de la
quinolina se utilizaron seis derivados de la quinolina. Se aisló un cultivo de puro que
fue identificado como Pseudomonas putida QP1. Por enriquecimiento con derivados
alquilados de quinolina se obtuvo la cepa Pseudomonas putida QP2 que degrada la
quinolina y la 6 – metilquinolina. La degradación en el reactor inmobilizado dio mejores
resultados que las pruebas por lotes, la quinolina fue completamente degradada tras 9
horas, la isoquinolina en 24 h y la 6- metilquinolina en 48 h. Cuando se utilizó el
reactor con medio no acuoso (decano), los tiempos de degradación resultaron aún
mejores, la 6 – metilquinolina se degradó en 24 h.
En la figura 7 se muestra la ruta de degradación de la isoquinolina.
N
QuinolinaNH
O
2-Quinolinona
O O
OH
8-hydroxicumarina
OHCOOH
Ácido 3-(2-hidroxifenil) -propionico
Productos Alifáticos
23
Figura 7. Ruta de Degradación de Isoquinolina de Rothenburger et. al. 1993.
B) Biotratamiento de los Compuestos Nitrogenados No Básicos: Carbazol. Dentro de los trabajos con carbazol se hallan estudios con bacterias de los géneros
Pseudomonas, Sphingomonas, Mycobacterium y Bacillus. Las bacterias estudiadas
mostraron capacidad para utilizar al carbazol, como fuente de energía, carbono y
nitrógeno. Los microorganismos crecen a temperaturas de entre 25°C y 37°C y valores
de pH entre 6.5 y 7.5.
Ouchiyama et. al. (1992) realiza la comparación de dos bacterias del mismo género
capaces de degradar carbazol, Pseudomonas sp. CA06 y CA10. La diferencia de estas
dos cepas es su origen, CA06 fue aislada de muestras de suelo de granja y CA10
proviene de lodos activados. Se caracterizó la vía de degradación de carbazol
analizando los metabolitos encontrados. Los principales metabolitos detectados fueron
el ácido antranílico y el catecol. Ouchiyama y su equipo propusieron la ruta metabólica
que está en la figura 8.
Kirimura et. al. (1999), aislaron a partir de 350 muestras de suelo y aguas
contaminados con hidrocarburos una bacteria capaz de degradar carbazol sin afectar
otros componentes del petróleo, esta bacteria fue llamada Sphingomonas sp. CDH-7.
La bacteria Sphingomonas sp. CDH-7 logró degradar todo el carbazol en 50 h. En la
degradación continua se lograba una eficiencia de remoción de casi el 100%. En este
N
Isoquinolina
NH
Odihidro-Isoquinolinona
COOH
COOHÁcido ftálico
DESCONOCIDO
24
trabajo se evalúo la degradación de otros componentes orgánicos cómo dibenzofurano,
fluoreno, dibenzotiofeno y bifenil; pero no los degradó. También se estudio la
degradación del carbazol en presencia de solventes orgánicos cómo queroseno (al
100%, al 50%, y al 20%), heptanol (20%), tolueno (20%), xileno (20%), ciclohexano
(20%), hexano (20%) e iso octano (20%). La degradación se redujo en 90% con
heptanol, 70% con tolueno ,50% con queroseno y 30% con xileno. La degradación no
se vio afectada con queroseno ( al 20 y 50%), ciclohexano, hexano e iso octano.
Figura 8. Ruta Propuesta por Ouchiyama et. al. (1993) para la bidegradación del Carbazol.
Se sabe que solventes como el tolueno y el xileno causan inhibición del crecimiento o
muerte de los microorganismos. Riddle et. al. (2003) utilizaron Pseudomonas putida
Idaho que es resistente a la toxicidad por solventes. A esta bacteria se le insertaron los
genes para la dioxigenasa inicial de la ruta de degradación del carbazol. Estos genes
NH
Carbazol
NH
OH
OH
2,9-Dihdiro-1H-carbazol-1,2-diol OH OH
NH2
2'-Amino-bifenil-2,3-diol
HOOC
O
OH
NH2
Ácido 6-(2-Amino-fenil)-2-hidroxi-6-oxo-hexa-2,4-dienoicoHOOC
O
OH
NH2
Ácido 6-(2-Amino-fenil)-2-hyidroxi-6-oxo-hex-4-enoico
COOH
OHÁcido 2-Hidroxi-penta-2,4-dienoico
H2N
O
HO
Ácido anthranilico
HO
HO
Catecol
COOH
COOHCiclo de Krebs
Ácido Hexa-2,4-dienedioico
25
provenían de la bacteria Pseudomonas sp. LD2 que es capaz de degradar el carbazol
pero es sensible a solventes. La bacteria recombinante degradó exitosamente el
carbazol, transformándolo a un intermediario no aromático; solubilizado en 1-
metilnaftaleno y en la presencia de 10%v/v de xilenos.
Li et. al. (2004) estudiaron la degradación de carbazol presencia de una fase líquida no
acuosa. Se utilizó una combinación de agua-ciclohexano a diferentes proporciones. El
resultado más óptimo se tuvo cuando la proporción de fase orgánica y acuosa fue de
1:2, con esta proporción el 70 % el carbazol se consumió. Se hicieron pruebas con
varios solventes orgánicos (tolueno 1:1, tolueno 1:10, xileno, ciclohexano, hexano,
heptano y tetradecano) y diesel que fueron usados como la fase orgánica de la mezcla
de reacción. Con diesel y tetradecano se degradó más del 80% de carbazol, con
ciclohexano, hexano, y heptano se degradó menos del 80%, con tolueno y xileno la
degradación fue menor del 20%.
Existen pocos estudios con cargas reales, Kilbane et. al. (1999) estudió la remoción
biológica del nitrógeno de la quinolina y del petróleo crudo, pero solo a nivel laboratorio
y obtuvo una disminución de nitrógeno total del 5%.
Otro estudio con cargas reales fue el conducido por Grossman et. al. (1999). Este
estudio esta enfocado a la biodesulfuración, la fuente de azufre eran fracciones de
destilado intermedio de petróleo crudo, este estudio arrojó como resultado que, la
biodesulfuración biológica en conjunto con la HDS son efectivas para remover
compuestos azufrados, incluso aquellos que causan problemas a la HDS sola, como el
dibenzotiofeno.
Márquez Rocha et. al. (2001) publicó un artículo sobre biodegradación de diesel por un
consorcio bacteriano en el suelo, este estudio es interesante ya que utiliza una carga
real, el diesel. En este trabajo se logró reducir la concentración del diesel en suelo
contaminado en un 15%.
26
II.- JUSTIFICACIÓN.
Los HAN ocasionan una serie de problemas: desde económicos a la industria del
petróleo, hasta ambientales que afectan a la población, y debido a la existencia de
microorganismos capaces de degradar HAN modelo, como carbazol y quinolina,
consideramos necesario desarrollar un proyecto el cual involucre el uso de
microorganismos para disminuir la concentración de los HAN en el gasóleo. Se utilizará
el gasóleo por su alto contenido de HAN (El gasóleo de madero tiene un 40% de
aromáticos, 2.3% de azufrados y 563 ppm de compuestos nitrogenados).
III.- OBJETIVOS.
Objetivo general:
Aislar microorganismos a partir de suelos contaminados que demuestren capacidad
para remover los compuestos nitrogenados presentes en los gasóleos.
Objetivos específicos:
1.- Obtener cultivos microbianos a partir de muestras de suelo contaminado con
hidrocarburos, capaces de utilizar carbazol como única fuente de carbono y nitrógeno a
diferentes temperaturas.
2.- Evaluar a los cultivos con medios con gasóleos y una mezcla de nitrogenados.
3.- Seleccionar al mejor cultivo y aislar los microorganismos que lo conforman.
4.- Reconstituir un cultivo mixto a partir de las bacterias aisladas para validar
resultados obtenidos con el cultivo.
5.- Determinación de los parámetros de crecimiento y degradación de los hidrocarburos
aromáticos nitrogenados del gasóleo
27
IV.- MATERIALES Y MÉTODOS.
1.- Obtención de los cultivos.
a) Preparación del inóculo. Muestras de suelo, lodo y aguas fueron obtenidas de sitios contaminados con
hidrocarburos del estado de Veracruz. De las muestras de suelo se prepararon
dos mezclas: la primera, llamada X, se elaboró mezclando 0.5 g de las
muestras 1, 2 y 3 para formar un inóculo de 1,5g, la segunda mezcla, llamada
Y, se conformó mezclando 0.5g de las tierras 4 y 5 para formar un inóculo de 1g
, en el caso del lodo y el agua, se tomo 1 ml de estas como inóculo. Para las
siguientes siembras se tomaron 15 ml de los cultivos crecidos y esta alícuota se
utilizó para inocular matraces de 250 ml con 100 ml de medio mineral estéril
(MM) sin fuente de carbono o nitrógeno, y 100 mg/L de Carbazol (CA).
b)Medios de cultivo. Se utilizaron matraces Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de medio mineral
estéril (MM) con la siguiente composición por litro: 0.2 g de KH2PO4, 0.6 g de
K2HPO4, 0.250 g de MgSO4, 0.03 g de CA SO4 y 0.01 g de FeSO4. La fuente de
carbono y nitrógeno es carbazol (CA) en una concentración de 300 mg/L, este
se administró disuelto en dimetil sulfoxido (DMS) con una concentración de 1 g
de CA en 30 ml de DMS. El medio tiene un pH inicial de 7.
c)Condiciones de crecimiento. Estos medios se incubaron a 40, 50 y 60 °C con agitación de 100 r.p.m. hasta
observar desaparición del color blanco característico del carbazol. Los medios
se incubaron a las mismas condiciones que los anteriores por dos semanas.
2.- Biodegradación de Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados del Gasóleo.
a)Preparación del inóculo. De los cultivos que utilizaron el carbazol como sustrato se tomaron 15 ml como
inóculo. En la sexta generación se tomó como inóculo la totalidad de la biomasa
28
del cultivo, el contenido del matraz se centrifuga a 10,000 r.p.m. por 10 minutos,
se separan las fases, la biomasa remanente se suspende con solución salina
estéril al 0.85% (SS) agitando con vórtex, para lavar las células. La biomasa con
solución salina se centrifuga a 10,000 r.p.m. por 10 min. Se desecha la solución
salina y la biomasa se resuspende en MM y esta suspensión se utiliza como
inóculo.
b) Medios de cultivo. El medio se elaboró con un 50% de MM y un 50% de gasóleo ligero de petróleo
(GLP) obtenido de la refinería de Madero. A este medio se le adicionó carbazol
a una concentración de 100 mg/L. En la sexta transferencia se dejó de
administrar carbazol a los medios.
c)Condiciones de crecimiento. Los medios se incubaron a 40°C con agitación de 100 r.p.m. por dos semanas.
d)Determinación de la degradación de los Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados. Tomar 1 ml de la fase orgánica, centrifugar a 1000 r.p.m. por 10 min. Para
eliminar sólidos y agua, inyectar la muestra en un cromatógrafo de gases
Thermo-Quest 2000, con detector selectivo de nitrógeno-fósforo (NPD). La
temperatura fue elevada con una programa 100 a 280 °C. La temperatura del
detector fue 250 y 280 OC. Para el inyector se usó Helio como gas acarreador y
nitrógeno como Makeup. La corriente eléctrica fue mantenida en 2.75 A, y el
voltaje de polarización en 3.5 V. Se inyectó 1 µL de muestra
Se usaron anilina, indol, quinolina y carbazol como compuestos modelo. La
identificación de las especies nitrogenadas fue llevada a cabo por comparación
con los compuestos modelo y los patrones cromatográficos de los compuestos
nitrogenados reportados. El cromatógrafo integró los datos de las áreas y
tiempo de retención, estos datos se utilizaron para construir un ajuste en Excel,
se igualó el área total a la concentración total de N del GLP, de esta manera se
procedió a calcular la concentración de todos los compuestos.
29
3.- Biodegradación de Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados del FCC.
a)Preparación del inóculo. De los cultivos que utilizaron carbazol se tomaron 15 ml como inóculo. En la
sexta generación se tomó como inóculo la totalidad de la biomasa del cultivo, el
contenido del matraz se centrifuga a 10,000 r.p.m. por 10 minutos, se separan
las fases, la biomasa remanente se suspende con solución salina estéril al
0.85% (SS) agitando con vortex, para lavar las células. La biomasa con solución
salina se centrifuga a 10,000 r.p.m. por 10 min. Se desecha la solución salina y
la biomasa se resuspende en MM y esta suspensión se utiliza como inóculo.
b)Medios de cultivo. El medio se elaboró con un 75% de MM y un 25% de una solución de FCC. A
este medio se le adicionó carbazol a una concentración de 100 mg/L. En la
sexta transferencia se dejó de administrar carbazol a los medios. La solución de
FCC se preparó diluyendo 5 ml de una muestra de FCC con 25 ml de
hexadecano.
c)Condiciones de crecimiento. Los medios se incubaron a 40°C con agitación de 100 r.p.m. por dos semanas.
d)Determinación de la degradación de los Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados. Tomar 1 ml de la fase orgánica, centrifugar a 1000 r.p.m. por 10 min. Para
eliminar sólidos y agua, inyectar la muestra en un cromatografo de gases
Thermo-Quest con las condiciones citadas previamente (ver inciso d del punto
dos de la sección Materiales y Métodos). 4.- Aislamiento de bacterias.
a)Medios de cultivo. Se tomó un 1ml de un cultivo crecido con gasóleo, se adicionó a un tubo que
contenía 9 ml de solución salina estéril al 0.85%, con este se hicieron diluciones
en solución salina tomando 1ml de la solución anterior y adicionándolo a la
30
siguiente. Se tomó 1 ml de cada dilución y se agregó a una caja de Petri
plástica vacía. A estas se les adicionó agar nutritivo y se dejan solidificar. Las
placas se incuban a 40°C y se debe verificar crecimiento a la 24 y a las 48
horas.
b)Aislamiento. A partir de las placas que fueron sembradas con las diluciones, se deben
sembrar por estría cruzada, en placas de agar nutritivo, todas aquellas colonias
que presenten una morfología colonial distinta. Las placas se incuban a 40°C y
se debe verificar crecimiento a la 24 y a las 48 horas.
c)Morfología microscópica Realizar tinción de Gram de cada una de las colonias aisladas y observar en el
microscopio con el objetivo 100X.
5.- Obtención de un cultivo reconstitiuido.
a)Medios de cultivo. Se utilizan placas de agar nutritivo, placas de agar nutritivo + 300 mg/L de
Carbazol (AN+Cz), estas se preparan adicionando la solución de carbazol al
agar nutritivo líquido caliente, para lograr que el carbazol se disuelva. Se utilizan
placas de agar carbazol (ACz), estas se preparan suspendiendo 18g de agar
noble (sin nutrientes) en 1L de agua destilada, se esteriliza en autoclave a
121°C y 15 psi por 15 min. Cuándo el agar aún esta caliente se le añade
carbazol suficiente para llegar a una concentración de 300 mg/L.
b)Determinación del número de microorganismos y la predominancia. De las placas de las diluciones (ver número 4, inciso b de este apartado) se
debe contar el número de colonias totales y el número de colonias de cada
microorganismo aislado, basándose en la proporción que cada microorganismo
tenga se determina la predominancia, el que este presente en mayor número
será el más predominante y así sucesivamente hasta ordenar todas las cepas
aisladas.
31
c)Proceso de enriquecimiento individual de las cepas. Si las bacterias aisladas tienen más de 3 días de haber sido sembradas, se
deben sembrar en placas de AN para tenerlas frescas, de las placas de AN se
siembran en AN+Cz, estas se incuban a 40°C y se debe verificar crecimiento a
las 24 y 48 h. De las bacterias crecidas en AN+Cz se siembran en ACz, se
incuban a 40°C y se debe verificar el crecimiento cada tercer día.
d)Obtención del inóculo para cultivo líquido. De las placas de ACz con crecimiento se debe formar un inóculo en MM, este
se elabora tomando asadas de las placas y adicionándolas al MM, el número de
asadas depende de la predominancia(ver inciso anterior), la bacteria más
predominante debe ser adicionada en mayor cantidad y así sucesivamente
hasta haber adicionado todas las bacterias.
e)Enriquecimiento con carbazol del cultivo reconstituido. Se toma el inóculo del inciso anterior y se le añade carbazol a una
concentración de 300 mg/L. Se incuba a 40°C hasta observar desaparición del
color blanco característico del carbazol.
6.-Determinación de condiciones de degradación.
a) Preparación del inóculo. De los medios crecidos con carbazol se tomaron 15 ml como inóculo. En la
sexta transferencia se tomó como inóculo la totalidad de la biomasa del cultivo,
el contenido del matraz se centrifuga a 10,000 r.p.m. por 10 minutos, se
separan las fases, la biomasa remanente se suspende con solución salina
estéril al 0.85% (SS) agitando con vórtex, para lavar las células. La biomasa con
solución salina se centrifuga a 10,000 r.p.m. por 10 min. Se desecha la solución
salina y la biomasa se resuspende en MM y esta suspensión se utiliza como
inóculo.
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b) Medios de cultivo. El medio se elaboró con un 50% de MM y un 50% de gasóleo ligero de petróleo
(GLP) obtenido de la refinería de Madero. A este medio se le adicionó carbazol
a una concentración de 100 mg/L. El recipiente usado para esta etapa fueron
botellas serológicas con una capacidad de 125 ml, cerradas con válvulas
minninert.
c)Condiciones de crecimiento. Los medios se incubaron a 40°C con agitación de 100 r.p.m. por dos semanas.
d)Determinación de la degradación de los Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados. Tomar 1 ml de la fase orgánica, centrifugar a 1000 r.p.m. por 10 min. Para
eliminar sólidos y agua, inyectar la muestra en un cromatografo de gases
Thermo-Quest con las condiciones citadas previamente (ver inciso d del punto
dos de la sección Materiales y Métodos).
e) Determinación del crecimiento celular
Etiquetar una cápsula de porcelana y ponerla en la estufa a 200 °C por 24 h
sacarla y dejarla enfriar en un desecador, una vez fría, pesarla, adicionar una
cantidad preestablecida de fase líquida bien agitada proveniente del cultivo.
Poner a desecar en la estufa a 200°C por 24 h, sacarla y dejar enfriar en
desecador, pesarla una vez fría, determinar la cantidad de biomasa como
sólidos por diferencia de pesos.
d) Determinación de producción de CO2. Cada 24 h, tomar 0.5 ml de muestra de la fase gaseosa de las botellas de 125
ml e inyectarla en un cromatógrafo Gow-Mac con detector de conductividad
térmica y las siguientes condiciones: Temperatura del inyector: 60 °C,
temperatura de la columna: 70 °C, temperatura del detector: 125 °C.
33
7.- Diseño experimental
Inóculo preparado de muestras de suelo
Siembra en medio liquido con carbazol como única fuente de C y N a diferentes T
Selección de los mejores cultivos
Los cultivos anteriores se siembran con GLP como sustrato
Selección del mejor cultivo
Aislamiento de los microorganismos que componen el cultivo
Obtención de morfología colonial y microscópica
Determinación de parámetros de crecimiento
Elaboración de un cultivo reconstituido
Comparación de la actividad degradativa entre cultivo original y reconstituido
34
V.-RESULTADOS
1.-Obtención de los cultivos en Carbazol.
Se evaluó la capacidad de degradar carbazol de dos mezclas de suelo, una muestra de
lodos y una muestra de agua. Se utilizó un medio mineral libre de nitrógeno y carbono,
la fuente de carbono y nitrógeno fue carbazol. Los medios inoculados se incubaron a
temperaturas de 40, 50 y 60°C hasta observar desaparición del color blanco del
carbazol. Los medios inoculados presentaron crecimiento excepto el inoculado con
agua. Los medios inoculados a partir de suelo, mostraron buen crecimiento pero solo a
40 °C. Los lodos mostraron actividad a 40 y 50 °C, en la primera siembra, pero para la
siguiente transferencia se perdió actividad a 50 °C.(tabla 4).
Tabla 4. Evaluación de la capacidad de crecimiento en carbazol de las muestras a 40°C.
1ra Siembra 2da Siembra Inóculo Muestra pH Crecimiento pH Crecimiento Mezcla de suelo X A 7.5 + 7.6 + Mezcla de suelo Y D 7.5 + 7.5 + Lodos F 7.4 + 7.4 + Agua I ND - ND -
En las muestras de tierra y lodos se detectaron microorganismos con capacidad de
utilizar carbazol como única fuente de carbono y nitrógeno. Los valores de pH oscilaron
entre 7.4 y 7.6. La muestra de agua no presentó crecimiento.
2.- Experimentos con Gasóleo
a) Obtención de los cultivos con gasóleo.
Los cultivos obtenidos anteriormente: A, D y F se utilizaron cómo inóculo medio que
estaba compuesto de 50 mL de MM y 50 mL de gasóleo ligero de petróleo, al que se le
añadieron 300 mg/L de carbazol. Además de estos cultivos ya mencionados se
obtuvieron dos nuevas mezclas llamadas A+ y C+. Se incubaron a 40°C por dos
semanas. Al pasar las dos semanas se realizó una resiembra en las mismas
condiciones (tabla 5).
35
Tabla 5. Evaluación de la capacidad de crecimiento de los cultivos con GLP como sustrato.
1ra Siembra 2da Siembra Inóculo. Muestra pH Crecimiento pH Crecimiento Mezcla de tierras 1. A 5.4 + 5.5 + Mezcla de tierras 2. D 5.5 + 5.4 + Lodos. F 6.5 + 6.5 + Tierras 1 y 2. A+ 5.5 + 5.4 + Tierra 2 y lodos. C+ 6.3 + 6.2 +
Todos los cultivos crecieron en GLP, el crecimiento se comprueba si observamos
ciertos cambios en la apariencia de la muestra tratada en comparación con la muestra
sin inóculo, estos cambios se pueden observar en la figura 9. El pH de la muestras
varían entre 5.4 y 5.5, excepto en F y C+ donde el rango de pH es de 6.2 a 6.5.
Podemos observar diferencias entre una muestra sin inóculo comparada con la tratada
por dos semanas con los cultivos, la fase acuosa del testigo es traslucida e incolora,
mientras que la fase acuosa de la muestra tratada presenta turbidez debida a la
biomasa, la fase acuosa presenta también una coloración amarilla opaca. La fase
orgánica también sufre cambios, en el testigo se diferencian perfectamente las dos
fases, y el gasóleo presenta un color naranja brillante. En la muestra tratada, existe
una emulsión de la fase orgánica y presenta una coloración rojiza (figura 9).
Figura 9. Comparación entre una muestra de gasóleo sin inocular (izquierda) y una muestra tratada con el cultivo D tras 15 días de incubación (derecha). Existen diferencias visuales entre muestras tratadas, tras dos semanas de incubación,
la muestra A presenta, en la fase acuosa, una coloración café oscura, a diferencia de la
amarilla opaca de la muestra D. También la fase orgánica de A es distinta a la de D,
aunque ambas presentan emulsión, la de A tiene el mismo color café oscuro de la fase
líquida, mientras que la de D ya se ha descrito (figura 10).
36
Figura 10. Comparación entre una muestra de gasóleo sin inocular (derecha), una muestra tratada durante 15 días por el cultivo A (centro) y el cultivo D (izquierda).
b) Aislamiento, conteo y características morfológicas de los microorganismos que conforman los cultivos con gasóleo.
A partir de los cultivos se hicieron diluciones en solución salina, posteriormente estas
diluciones se usaron para sembrar en placa con agar nutritivo, esto con el fin de
cuantificar el número total de microorganismos que integran los cultivo (tabla 6).
Tabla 6. Número total de microorganismos que integran a los cultivos.
Cultivo UFC/ml A 42 x1010
D 98 X 109 F 15 x 109 A+ 56 x 10 10
C+ 9 X 109 El cultivo A+ es el que tiene un número mayor de microorganismos mientras que el C+
es el que tiene un número menor.
La morfología microscópica determinada por medio de la Tinción de Gram y
observación en el microscopio Nikon E800, se muestra en la tabla 7, así como el
número de bacterias que conforman cada cultivo.
37
Tabla 7. Tipo y distribución de bacterias que integran los cultivos. Cultivo Colonias de Bacterias
diferentes que lo conforman.
Reacción de Gram. Morfología microscópica.
A 11 6 positivas y 5 negativas 9 bacilos, 2 cocos D 11 y un hongo. 5 positivas y 6 negativas 10 bacilos, 1 coco F 7 6 positivas y 1 negativa 6 bacilos, 1 coco A+ 8 5 positivas y 3 negativas 5 bacilos, 3 cocos C+ 8 4positivas y 4 negativas 6 bacilos, 2 cocos
Todos los cultivos tienen una mayoría de bacterias Gram +, siendo los cultivos A y D
los que tienen una mayor variedad de bacterias, y D es el único que tiene un hongo.
c) Evaluación de la degradación de los Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados
en gasóleo ligero de petróleo (GLP). Para analizar la degradación de cada cultivo, se utilizó un cromatografo de gases con
detector de nitrógeno-fósforo, con el fin de comparar las áreas que representaban a los
HAN en una muestra testigo y en muestras tratadas.
Figura 11. Cromatogramas de las muestras de gasóleo: Testigo sin inóculo (centro arriba), muestra tratada por el cultivo D (abajo izquierda) y muestra tratada por le cultivo A+ (abajo derecha).
38
Notamos que los picos del cromatograma de ambas muestras son menores a las del
testigo, por lo que deducimos que existe degradación de los HAN del gasóleo, también
notamos que D tiene menores picos que A+, por lo tanto, D tiene una mejor
degradación que A+. A partir de estos cromatogramas, el cromatógrafo realizó una
integración de las áreas y con los datos arrojados se construyeron ajustes en Excel
para determinar la degradación del carbazol y los metil carbazoles. El ajuste en excel
del testigo y los cultivos se presentan en la figura 12.
Figura 12. Comparación de los ajustes en excel de los datos integradso por el cromatógrafo del blanco de gasóleos contra los ajustes de las muestras tratadas por los cultivos D (línea punteada) y A+ (línea gruesa). Se observa que de la muestra D es la que presenta los menores picos al blanco, esto
indica que en la muestra tratada por D ocurrió una mayor degradación de los
hidrocarburos aromáticos nitrogenados (HAN). Posiblemente se debe a la presencia de
microorganismos que desde la toma de muestra tenían una mayor afinidad por estos
compuestos.
El primer pico que nos interesa es el que representa al carbazol, este pico aparece a
un tiempo de retención de alrededor de 17.7 min. Podemos observar que el pico es
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
0.000 10.000 20.000 30.000 40.000 50.000 60.000
tr (m in)
Control GLPD3GA+1G
39
muy pequeño en los tres cultivos comparados con el del blanco. Sin embargo, D tiene
un pico de carbazol menor que A+, por lo que podemos concluir que D degrada en
mayor parte el carbazol.
Los carbazoles monometilados aparecen en un intervalo entre 19 y los 22 min. Existen
4 de estos y aparecen en el siguiente orden: 1-metil-carbazol, 3-metil-carbazol, 2-metil-
carbazol y finalmente el 4-metil-carbazol. Podemos observar que de nuevo las señales
de estos picos son menores en los cultivos que en el blanco, y entre cultivos,
nuevamente D presenta picos menores.
Los carbazoles dimetilados aparecen desde los 22 y hasta los 25 min. Los tres cultivos
muestran una degradación menor de los dimetilados en comparación con los
monometilados, esto se debe a que mientras más compleja es la molécula, es más
difícil su degradación.. De los dimetilados existe una gran variedad, el primero que se
observa es el 1,8-dimetil-carbazol, representado por un pico que aparece alrededor de
los 22.6 min. Se observa que el pico es aproximadamente igual en los cuatro
cromatogramas, lo que indica que este compuesto presenta una degradación mínima o
nula, esto se debe a la estructura de este compuesto, presentada en la figura 13.
Figura 13. Estructura del 1,8-dimetil-carbazol.
Los grupos metilo en los carbonos 1 y 8 hacen que el átomo de nitrógeno sea de difícil
acceso para las enzimas de los microorganismos.
El resto de los compuestos dimetilados presenta degradación dependiendo del cultivo
por el que fue tratado, hay picos que son menores en D y mayores en A+.
NH
1,8-dimetil-carbazol
40
Los carbazoles trimetilados aparecen en un intervalo de tiempo de retención que va
desde los 27 a los 31 minutos. Al igual que con los dimetilados existe una gran
variedad de compuestos, se mantiene la tendencia de que los compuestos más
complejos presentan menor degradación. Los picos de los trimetilados han disminuido
muy poco respecto del blanco, existen picos que en algunos cultivos han desaparecido
totalmente, pero en general el comportamiento de los cultivos es similar, ya que
muestran poca capacidad de degradar los carbazoles trimetilados.
La integración por computadora, realizada por el cromatógrafo, de los cromatogramas
arroja una tabla de datos de tiempos de retención y el área del pico que aparece a ese
tiempo. Con base a esa tabla, y a un artículo donde se identificaron los distintos
componentes de una muestra de gasóleo (Weiwel et. al. 2000), se identificaron los
picos que aparecen en el cromatograma (figura 14).
Figura 14. Ajuste en Excel de los datos integrados por el cromatógrafo de una muestra de gasóleo con identificación de sus componentes. Algunos compuestos no están identificados, la razón principal es que no existen
referencias bibliográficas sobre la composición exacta de los gasóleos, y en la muestra
-1 0 .0 0
0 .0 0
1 0 .0 0
2 0 .0 0
3 0 .0 0
4 0 .0 0
5 0 .0 0
6 0 .0 0
1 5 .0 0 1 7 .0 0 1 9 .0 0 2 1 .0 0 2 3 .0 0 2 5 .0 0 2 7 .0 0 2 9 .0 0 3 1 .0 0 3 3 .0 0 3 5 .0 0
tr (m in )
ppm
N
1 .- C a rb a z o l2 .- 1 M C z3 .- 3 M C z4 .- 2 M C z5 .- 4 M C z6 .- N I7 .- 1 ,8 D M C z8 .- 1 ,3 D M C z9 .- 1 ,6 D M C z1 0 .- 1 ,7 D M C z1 1 .- 1 ,4 D M C z1 2 .- 1 ,5 D M C z1 3 .- 3 ,6 D M C z1 4 .- 2 ,6 D M C z1 5 .- 3 ,5 D M C z
1 6 .- 2 ,4 D M C z1 7 .- 1 ,2 D M C z1 8 .- N I1 9 .- 2 ,3 D M C z2 0 .- 1 ,4 ,8 T M C z2 1 .- N2 2 .- N I2 3 .- N I2 4 .- N I2 5 .-1 ,3 ,5 T M C z2 6 .- 1 ,5 ,7 T M C z2 7 .- 2 ,4 ,6 T M C z2 8 .- 1 ,3 ,4 T M C z2 9 .- 2 ,4 ,7 T M C z3 0 .- 1 ,4 ,5 T M C z
3 1 .- 2 ,3 ,6 T M C z3 2 .- 2 ,3 ,5 T M C z3 3 .- 2 ,4 ,6 T M C z3 4 .- N I3 5 .- N I3 6 .- N I3 7 .- N I3 8 .- N I3 9 .- N I4 0 .- N I4 1 .- N I
1
2
3
4 5
6
7 8
9
1 0 1 2
1 1
1 3
1 4 1 51 6
1 7
1 8
1 9
2 0
2 6
2 1 2 2
2 3 ,2 4 ,2 5
2 9
2 7 , 2 8
3 0 3 1
3 2
3 3 ,3 4 ,3 5
3 63 7
3 8
3 9 4 04 1
41
utilizada el artículo consultado no aparecen compuestos que pueden estar presentes
en otros gasóleos.
A continuación, en la tabla 8, se muestra el porcentaje de degradación del carbazol y
de los carbazoles monometilados en la muestra de gasóleos con cada cultivo.
Tabla 8. Concentración inicial y porcentaje de degradación del carbazol y los carbazoles monometilados del GLP por cada cultivo.
Control GLP D3G A1+G A3G Compuesto ppm %D %D %D
Carbazol 54 97 22 96 1-metil-carbazol 19 89 26 77 3-metil-carbazol 8 93 15 40 2-metil-carbazol 13 81 27 100 4-metil-carbazol 15 80 24 33
El cultivo D, a dos semanas de la inoculación ha degradado el 97.8% del carbazol,
arriba del 80% de los carbazoles monometilados. El cultivo A+ degrada un 22.25% del
carbazol, menos del 30% del N de los monometilados. A3 degrada el 96.6 % del
carbazol, pero su degradación de los metilados es menor que la de D.
A continuación, en la tabla 9 se muestra el porcentaje de degradación de los
dimetilados por los tres cultivos.
Tabla 9. Concentración inicial y porcentaje de degradación los carbazoles dimetilados del GLP por cada cultivo.
Control GLP D3G A1+G A3G Compuesto ppm %D %D %D
1,8-dimetil-carbazol 5 0 9 01,3-dimetil-carbazol 6 89 19 221,6-dimetil-carbazol 8 87 17 61,7-dimetil-carbazol 13 60 16 21,4-dimetil-carbazol 14 85 37 241,5-dimetil-carbazol 16 89 9 03,6-dimetil-carbazol 6 62 40 192,6-dimetil-carbazol 5 59 16 03,5-dimetil-carbazol 1 41 16 02,4-dimetil-carbazol 7 65 16 41,2-dimetil-carbazol 5 83 22 9tr25.053 4 14 13 02,3-dimetil-carbazol 8 48 15 100
D degrada 4 de los dimetilados casi al 90%, 4 alrededor del 60%, dos más de 40% y no
degrada el 1,8-dimetil-carbazol. A+ Degrada menos del 15% de los dimetilados excepto
42
el 3,6-dimetil que degrada en un 40%,y a diferencia de D reduce el nitrógeno del 1,8-
dimetil en un 10%. A3 es el que tiene una degradación menor.
A continuación, en la tabla 10 se muestra el porcentaje de degradación de los
trimetilados por los tres cultivos. Tabla 10. Concentración inicial y porcentaje de degradación los carbazoles trimetilados, nitrógeno de carbazoles y nitrógeno total del GLP por los 3 cultivos.
Control GLP D3G A1+G A3G Compuesto ppm %D %D %D
1,4,8-trimetil-carbazol 18 44 18 0tr26.227 4 0 14 0tr26.387 4 69 0 0tr26.737 3 0 10 0tr26.978 9 100 5 0tr27.152 8 0 12 01,3,5-trimetil-carbazol 10 37 6 01,5,7-trimetil-carbazol 27 29 7 02,4,6-trimetil-carbazol 0.5 0 0 331,3,4-trimetil-carbazol 9 0 1 1002,4,7-trimetil-carbazol 18 47 26 51,4,5-trimetil-carbazol 3 12 13 02,3,6-trimetil-carbazol 7 0 0 02,3,5-trimetil-carbazol 13 0 6 03,4,6-trimetil-carbazol 5 0 0 0tr30.228 6 0 5 0tr30.417 5 0 5 0tr30.748 6 0 4 0tr31.127 13 0 8 0tr31.308 9 0 24 0tr31.612 3 0 0 0N de Carbazoles 415 42 16 17N Total 550 19 15 0.1
La mayoría de los carbazoles trimetilados no son afectados por D, solo 7 compuestos
presentan degradación y en 5 de estos la degradación es menor al 50%. A+ degrada
20 compuestos, pero a excepción de 2, la degradación es menor al 15%. A es el cultivo
con menor actividad ya que solo afecta a 3 compuestos.
Finalmente, D es el más efectivo ya que degrada 42.45% del nitrógeno de los
carbazoles y casi el 19% del N total del GLP. A+ degrada el 15.3% del N total y A solo
0.1%.
43
d) Determinación de la Degradación de los Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados del Gasóleo Ligero de Petróleo respecto del tiempo.
Para determinar la degradación de los HAN del GLP, se utilizaron botellas serológicas
con 12.5 ml de MM con inóculo y 12.5 ml de GLP por duplicado, cada 48 h se tomó
muestra de la fase orgánica del medio y se midió su contenido de HAN con un
cromatógrafo de gases durante dos semanas.
En la tabla 11 se muestran la concentración del carbazol y los carbazoles
monometilados a través del período de dos semanas.
Tabla 11. Degradación del carbazol y los carbazoles monometilados del GLP respecto del tiempo.
ppm N Compuestos tiempo (h) 0 48 96 168 216 264 336Carbazol 54 1 1 1 0.8 0.7 0.51-metil-carbazol 18 1 1 0.5 0 0 03-metil-carbazol 8 3 1 0.8 0.5 0 02-metil-carbazol 14 1 0 0 0 0 04-metil-carbazol 15 1 0 0 0 0 0
Podemos notar que el carbazol ha disminuido un 97.6% en tan solo 48 h, a excepción
del 3-metil, que es degradado un 62.3%, todos los carbazoles monometilados son
consumidos alrededor del 93% en las primeras 48 h. En la tabla 16 podemos observar
la concentración de los carbazoles dimetilados en el mismo período de tiempo.
De la misma manera, en la tabla 12 se hallan los resultados correspondientes a los
carbazoles dimetilados.
44
Tabla 12. Degradación de los Carbazoles Dimetilados del GLP respecto del tiempo. ppm N Compuestos tiempo (h) 0 48 96 168 216 264 336 tr21.983 11 6 3 2 2 2 1 1,8-dimetil-carbazol 5 4 2 1 1 1 0.6 1,3-dimetil-carbazol 6 1 1 0 0.7 0 0.4 1,6-dimetil-carbazol 9 3 2 2 1.3 1 0 1,7-dimetil-carbazol 13 8 4 2 0.9 0 0 1,4-dimetil-carbazol 14 2 1 0 0 0 0 1,5-dimetil-carbazol 16 11 8 4 3 0 0 3,6-dimetil-carbazol 6 2 1 1 0.5 0.4 0 2,6-dimetil-carbazol 5 4 3 2 0.8 0.7 0 3,5-dimetil-carbazol 1 0.4 0 0 0 0 0 2,4-dimetil-carbazol 7 2 1 1 0.7 0 0 1,2-dimetil-carbazol 5 4 1 1 0.8 0.4 0 tr25.053 5 5 2 2 2 1.8 0.8 2,3-dimetil-carbazol 7 4 3 3 3 0 0
Podemos notar que, a diferencia de los carbazoles monometilados, estos compuestos
son de degradación más lenta, ya que para las primeras 48 horas, los monometilados
se habían degradado más del 90%, en cambio, los dimetilados se han degradado, en
promedio, un 46%. Podríamos decir que durante las primeras 48 h, son el doble de
resistentes a la degradación que los monometilados. Y hay 5 compuestos que son
degradados en un 25% o menos en el mismo intervalo de tiempo, entre los que se
incluye el 1,8-dimetil-carbazol, el cuál debe su resistencia a su estructura, asunto que
fue justificado en el apartado 2 de la sección de resultados. Para las 96 horas, el
promedio es de degradación es del 66%, lo que significa que, se degradaron un 20%
adicional durante las siguientes 48 h. Para las 168 h, la degradación promedio es de
78%, es decir, que durante un tercer período de 48 h, hubo una degradación adicional
del 12%, para las 216 h, la degradación promedio ha alcanzado un 83%, o sea, solo un
5% más, aunque cabe destacar que la mayoría de los compuestos se han consumido
totalmente y solo el 2,3-dimetil, el 1,5-dimetil, y los dos compuestos no identificados
conservan concentraciones significativas. Finalmente, después de las 264 h solo 3
compuestos rebasan 1 ppm de concentración y para un tiempo de 336 h, todos los
compuestos se han consumido a menos de 1 ppm excepto el no identificado con
tiempo de retención de 21.9 min.
45
En la tabla 13 encontramos los resultados del análisis de los carbazoles trimetilados
así como del contenido total de nitrógeno de la muestra del GLP.
Tabla 13. Degradación de los Carbazoles Trimetilados y del contenido de Nitrógeno Total del GLP respecto del tiempo.
ppm N Compuestos tiempo (h)
0 48 96 168 216 264 3361,4,8-trimetil-carbazol 18 11 7 4.5 4 3.8 2.8tr26.227 4 1 1 0.9 0 0.5 0tr26.387 5 2 2 1 1 1 0.4tr26.737 3 1 1 0.9 0.7 0.7 0tr26.978 9 5 4 4 3 2 0tr27.152 8 3 2 2 1 0 01,3,5-trimetil-carbazol 9 4 4 3 2 1 01,5,7-trimetil-carbazol 27 18 13 11 7 4 01,3,4-trimetil-carbazol 9 8 4 2 1 1.2 0.32,4,7-trimetil-carbazol 18 7 4 4 2 1.6 1.31,4,5-trimetil-carbazol 3 2 0.7 0 0 0 02,3,6-trimetil-carbazol 6 4 2.7 2 0 0.3 02,3,5-trimetil-carbazol 13 12 7 6 3 2 23,4,6-trimetil-carbazol 5 3 1 0 0 0 0tr30.228 6 3 2 1 1 0 0tr30.417 5 4 3 1 1 0 0tr30.748 6 4 2 2 1 0 0tr31.127 13 9 8 4 1 0.7 0tr31.308 9 6 5 2 0.8 0 0tr31.612 4 1 0.4 0 0 0 0N Total 550 162 148 139 112 79 45
Los carbazoles trimetilados son más difíciles de degradar que los dimetilados, aunque
la diferencia no es tanta como la que hay entre dimetilados y monometilados, aquí la
diferencia es de apenas un 6.5% menos de nitrógeno consumido para las primeras 48
h, excepciones a esta media son los compuestos no identificados con tiempos de
retención de 26.22 y 31.61 minutos, que han sido consumido en un 60 y 73%
respectivamente. El contenido de nitrógeno total de la muestra ha disminuido en un
70% para las primeras 48 h. Para las 96 h, la degradación promedio, 59% es 5%
menor que las de dimetilados para este tiempo, solo 2 compuestos no han sido
degradados en más de 50%. Vemos una disminución en la velocidad de degradación
del contenido de nitrógeno total, ya que luego de un 70% en las primeras 48 h, solo ha
degradado un 2% más. Para las 168 h, la degradación promedio es de 72%, solo 3 no
se han degradado a más del 60%, la degradación de nitrógeno total es de 74%. Para
46
las 216 h, la degradación promedio alcanza 82% de los compuestos consumidos, solo
un compuesto, el de tiempo de retención de 26.97 minutos, se ha degradado menos
del 70% (66%), y ya tres compuestos han desaparecido totalmente, entre ellos, el 3,4,6
y el 1,4,5-trimetil-carbazol, la degradación en general es apenas 1% menor que la que
llevaban hasta este tiempo los carbazoles dimetilados, el nitrógeno total ha disminuido
apenas un 80%. Para las 336 horas, la degradación promedio es de 97.5%, solo cinco
compuestos aún permanecen presentes pero su concentración es de alrededor del 5%
de la inicial, la degradación del nitrógeno total es del 91.7%.
Es importante destacar, que la actividad del cultivo aumenta conforme ha estado en
contacto con el sustrato, ya que compuestos que antes mostraban una degradación
mínima o nula cómo el 1,8-dimetil-carbazol, ahora se degradan en gran parte, el 1-8-
dimetil se degradó un 89%. En general, los dimetilados, al paso de dos semanas de
incubación, habían reportado una degradación promedio de 60.22%, y actualmente se
observó una degradación promedio 96.61%. Los trimetilados, al inicio reportaban
apenas 11% de degradación, y ahora tenemos una degradación de 91.77%.
3.- Experimentos con FCC
a) Obtención de los cultivos con FCC.
A partir de los cultivos que degradaron el carbazol, se realizaron experimentos
utilizando como sustrato una fracción de hidrocarburos aromáticos nitrogenados
obtenidos por adsorción con un material nanoparticulado. Se incubaron a 40°C por dos
semanas, transcurrido este tiempo se realizaba una resiembra. Los resultados de este
experimento se hallan en la tabla 14.
Tabla 14. Evaluación de la capacidad de crecimiento de los cultivos con FCC como sustrato.
1ra Siembra 2da Siembra Inóculo. Muestra pH Crecimiento PH Crecimiento Mezcla de suelos 1. A 7.2 + 7.2 + Mezcla de suelos 2. D 7.2 + 7.3 + Lodos. F 6.5 + 6.4 + Suelos 1 y 2. A+ 7.3 + 7.3 + Suelo 2 y lodos. C+ 7.3 + 7.3 +
47
Todos los cultivos crecieron con FCC como sustrato, el pH de las muestras varía entre
7.2 y 7.3, excepto en F donde el rango de pH es de 6.4 a 6.5.
En la figura 15 se observa que al igual que los cultivos con GLP existe una diferencia
entre las muestras de FCC que no han sido inoculados comparadas a las
biológicamente tratadas.
Figura 15. Comparación de una muestra de FCC sin inocular (izquierda), y una muestra de FCC tras 15 días de inoculación con el cultivo D3 (derecha). La muestra tratada presenta emulsión de la fase orgánica, también hay un incremento
en la turbidez de la fase líquida debido al crecimiento de los microorganismos, hay un
cambio de coloración de la fase líquida ya que mientras las muestra sin inóculo es
incolora la muestra tratada presenta un color anaranjado (figura 16).
Figura 16. Comparación entre una muestra de FCC sin inocular (derecha), una tratada con el cultivo A (izquierda) y una tratada con el cultivo D (centro).
48
b) Evaluación de la degradación de los Hidrocarburos Aromáticos Nitrogenados en FCC.
Al tiempo que se llevaba a cabo el experimento con gasóleos, se utilizaba también un
sustrato adicional, el FCC. Los hidrocarburos aromáticos nitrogenados se encuentran
en mayor proporción en las fracciones destiladas con mayor punto de ebullición. Estas
fracciones pueden ser : gasóleo, aceite cíclico ligero y carga de alimentación a FFC. En
este trabajo nos enfocamos a evaluar gasóleo, y un concentrado de nitrogenados de la
carga de FFC obtenido con un adsorbente nanoestructurado.
En la figura 17 se muestra el cromatograma donde se representan los HAN del FCC en
una muestra testigo y una muestra tratada por le consorcio D. Este cromatograma
puede ser divido en dos fracciones, antes y después de un tiempo de retención de 16
min. La fracción que eluye después de 17 min representa la mayor parte de la total de
nitrógeno de la muestra. Los compuestos que eluyen antes de los 16 min. fueron
predominantemente indol, quinolina, anilina y sus derivados metil sustituidos
representan aproximadamente 45 ppm de N. Después de los 16 minutos eluye el
carbazol y los derivados metilados del carbazol, monometilados, dimetilados,
trimetilado y tetramentilados. El carbazol y mono-metilados representan 30 y 92 ppm N,
dimetilados 125, trimetilados 210 y tetrametilados 100 ppm N aproximadamente
(Datos obtenidos por Acuña Arguelles ,2005).
Figura 17. Comparación entre los cromatogramas de FCC: testigo (rojo) y tratado por el cultivo D (negro).
49
La carga de alimentación a FCC se integra por la mezcla de 3 corrientes: gasóleo
ligero obtenido de la destilación atmosférica, gasóleo pesado obtenido de la destilación
al vacio y gasóleo pesado de la planta de desintegración H-OIL. El concentrado de
nitrogenado de la carga FCC. Esta es altamente viscoso y difícil de manejar. Por lo que
se hizo una disolución en hexadecano. La concentración total de azufre y nitrógeno es
2.3% y 1740 ppm.
En la figura 18 se muestra la comparación entre los cromatogramas del gasóleo ligero
de petróleo y el FCC.
-10
0
10
20
30
40
50
60
0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00
tr(min)
ppm
N
Figura 18. Comparación entre los ajustes en excel de los datos integrados por le cromatógrafo de una muestra de gasóleos (línea punteada) y una de FCC (línea continua). Podemos observar que aunque en general son similares, hacia el final del tiempo de
retención, la muestra de FCC presenta una gran cantidad de picos que son
prácticamente inexistentes en el cromatograma de GLP, estos picos corresponden a
compuestos de alto peso molecular no identificados, se cree que se tratan de
hidrocarburos nitrogenados con anillos aromáticos fusionados.
50
En la figura 19 se muestra el ajuste en excel de los datos del cromatograma de una
muestra de FCC sin tratamiento biológico y de dos muestras tratadas por los cultivos.
Figura 19. Ajuste en Excel de los datos integrados por el cromatógrafo de una muestra de FCC sin tratamiento biológico (Línea continua) y muestras tratadas por los cultivos A+ (línea gruesa) y D3 (línea punteada) Los picos de las muestras tratadas son menores que los del blanco. El carbazol
aparece alrededor de los 17.7 min. En el blanco y podemos apreciar que este pico ha
disminuido casi en su totalidad en las dos corrientes tratadas.
Después del carbazol los picos que aparecen son los metilados: 1-metil-carbazol, 3-
metil-carbazol, 2-metil-carbazol y 4 metil-carbazol, estos picos han disminuido casi en
su totalidad en los tres cultivos.
Para los dimetilados, la degradación que sufre cada compuesto depende del cultivo
con que fue tratado, ya que existe una serie de picos que en el cromatograma del
blanco son iguales a los de D, lo que indica que no hubo degradación de estos
compuestos. En cambio A+ presenta picos correspondientes a dimetilados con
menores alturas que las del blanco, lo que demuestra que este cultivo es capaz de
degradar dimetil-carbazoles.
- 3 0 .0 0 0 0
- 2 5 .0 0 0 0
- 2 0 .0 0 0 0
- 1 5 .0 0 0 0
- 1 0 .0 0 0 0
-5 .0 0 0 0
0 .0 0 0 0
5 .0 0 0 0
1 0 .0 0 0 0
1 5 .0 0 0 0
2 0 .0 0 0 0
0 .0 0 0 1 0 .0 0 0 2 0 .0 0 0 3 0 .0 0 0 4 0 .0 0 0 5 0 .0 0 0 6 0 .0 0 0
t r (m in )
C o n tro l F C CD 3 NA + 1 N
51
Los trimetilados demuestran ser muy resistentes a la degradación, ya que A+ muestra
solo 4 picos que han disminuido su altura respecto al cultivo, y la han disminuido solo
una pequeña parte. En cambio D, solo disminuye un pico y lo disminuye muy poco.
Por lo anterior reafirmamos nuestra anterior hipótesis de que los compuestos más
ramificados muestran mayor resistencia a la degradación. También observamos que el
cultivo D no tiene la misma efectividad que con GLP como sustrato.
A continuación, en la tabla 15, se muestra la concentración inicial del carbazol y de los
carbazoles monometilados en la muestra de FCC así como el porcentaje de
degradación de cada compuesto por cada cultivo.
Tabla 15. Concentración inicial y porcentaje de degradación del carbazol y los carbazoles monometilados de FCC por los 3 cultivos.
Control FCC D3N A1+N F3N Compuesto ppm N %D %D %D
Carbazol 139 99 100 99 1-metil-carbazol 8 100 95 100 3-metil-carbazol 4 100 73 100 2-metil-carbazol 6 100 100 100 4-metil-carbazol 6 100 95 100
Después de dos semanas de tratamiento los cultivos A+, D y F degradaron más del
99% del carbazol. Tanto D como F degradaron el 100% de los monometilados, A+
degradó más del 90% de todos los monometilados excepto del 3-metil-carbazol, el cual
consumió en un 63.6%.
A continuación, en la tabla 16, se muestra la concentración inicial de los carbazoles
dimetilados en la muestra de FCC así como el porcentaje de degradación de cada
compuesto por cada cultivo.
52
Tabla 16. Concentración inicial y porcentaje de degradación de los carbazoles dimetilados de FCC por los 3 cultivos.
Control FCC D3N A1+N F3N Compuesto ppm N %D %D %D
1,8-dimetil-carbazol 3. 41 100 83 tr22.202 1 100 88 100 tr22.612 1 0 100 0 1,3-dimetil-carbazol 3 100 100 100 1,6-dimetil-carbazol 4 100 100 100 1,7-dimetil-carbazol 6 4 87 73 1,4-dimetil-carbazol 5 100 50 100 1,5-dimetil-carbazol 7 10 100 0 3,6-dimetil-carbazol 1 100 100 100 2,6-dimetil-carbazol 1 0 2 100 3,5-dimetil-carbazol 3 31 19 100 2,7-dimetil-carbazol 2 100 100 100 2,4-dimetil-carbazol 5 100 87 82 1,2-dimetil-carbazol 3 100 100 100 2,5-dimetil-carbazol 3 0 80 74 2,3-dimetil-carbazol 3 0 44 26 3,4-dimetil-carbazol 1 0 86 100
El cultivo A+ es el único que degrada en cierta cantidad todos los dimetilados, ya que D
no degrada en absoluto el 3,6-dimetil, 2,7-dimetil, 2,4-dimetil, 1,2-dimetil, 2,5-dimetil, y
3,4-dimetil-carbazol. F no afecta al 1,2-dimetil y 1,4-dimetil-carbazol. Podríamos
concluir que el cultivo A+ tiene enzimas que no poseen D y F, por eso tiene un mayor
rango de compuestos que puede usar como sustratos.
A continuación, en la tabla 17, se muestra la concentración inicial de los carbazoles
trimetilados de la muestra de FCC así como el porcentaje de degradación de cada
compuesto por cada cultivo. También contiene la concentración inicial y porcentaje de
degradación del nitrógeno aportado por los carbazoles y el total de la muestra de FCC.
53
Tabla 17. Concentración inicial y porcentaje de degradación los carbazoles trimetilados, nitrógeno de carbazoles y nitrógeno total de FCC por los 3 cultivos.
Control FCC D3N A1+N F3N Compuesto ppm N %D %D %D
1,4,8-trimetil-carbazol 6 0 25 0 tr26.137 1 27 100 100 1,3,5-trimetil-carbazol 5 14 37 100 1,5,7-trimetil-carbazol 3 0 20 29 2,4,6-trimetil-carbazol 5 0 61 32 tr27.593 15 0 100 21 tr28.248 5 0 0 4 1,3,4-trimetil-carbazol 3 0 35 100 2,4,7-trimetil-carbazol 3 0 4 10 tr28.662 12 19 53 4 1,4,5-trimetil-carbazol 2 0 0 6 2,3,6-trimetil-carbazol 4 0 0 0 2,3,5-trimetil-carbazol 7 0 0 0 3,4,6-trimetil-carbazol 4 0 0 0 tr30.115 4 0 0 0 tr30.335 4 0 0 0 tr30.667 4 0 0 0 tr31.037 10 0 0 0 tr31.223 8 0 0 0 tr31.512 3 0 0 100 tr31.678 3 0 0 0.3 tr31.853 2 100 100 100 tr31.972 1 0 100 100 tr32.148 1 0 0 0 tr32.287 1 0 0 0 tr32.478 2 0 0 0 tr32.837 5 47 53 0 tr33.095 2 100 95 0 N Carbazoles 358 36 54 45 N Total 504 0 4 31
Los compuestos trimetilados han sido degradados en muy poca cantidad por los tres
cultivos, D solo degrada el 20% del 1,5,7-trimetil-carbazol, A+ y F solo afectan al 1,4,8-
trimetil, al 1,3,5-trimetil y al 1,5,7-trimetil-carbazol, y a excepción del 1,4,8-trimetil, A+
degrada una mayor cantidad que F.
En total, el cultivo que degrada en mayor cantidad los hidrocarburos aromáticos
nitrogenados no básicos del FCC es A+. Lo que indica que los microorganismos que lo
integran cuentan con una cantidad de enzimas mayor a los otros cultivos, por lo que es
capaz de degradar más compuestos y en mayor cantidad que los otros cultivos. Sin
embargo, estas enzimas se han desarrollado solo en el medio con FCC como sustrato,
54
ya que como vimos con anterioridad el cultivo D tiene una mayor actividad que A+
cuando se usa gasóleo ligero de petróleo como sustrato.
4.- Determinación de la velocidad de crecimiento.
Al paralelo con el punto cuatro, se realizó el monitoreo de la producción de CO2, como
una forma indirecta de medir la degradación del carbazol y los alquil carbazoles, así
como el crecimiento celular. En la figura 20, podemos apreciar una comparación de la
producción de CO2 entre el cultivo D con GLP y una muestra que no incluye fuente de
carbono y nitrógeno, ambos con la misma cantidad de inóculo.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 100 200 300 400
tiempo (h)
ppm
CO
2
Figura 20. Comparación entre la producción de CO2 del cultivo D con GLP, por duplicado (línea continua y punteada), y del cultivo D sin fuente de carbono y nitrógeno (línea gruesa). La producción de CO2 con GLP alcanzó las 850 ppm, partiendo de 50 ppm, medidas a
las 48 h, con 25 ml de GLP cómo sustrato, mientras que el cultivo sin fuente de
carbono y nitrógeno aumento de 30 a 50 ppm y mantuvo esta concentración de CO2
durante toda la cinética.
55
A continuación, en la figura 21, se muestra la comparación entre la producción de CO2
del cultivo D con FCC como sustrato y un cultivo sin fuente de carbono y nitrógeno.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 100 200 300 400
tiempo (h)
ppm
CO
2
Figura 21. Comparación entre la producción de CO2 del cultivo D con FCC, por duplicado ( línea continua y punteada), y del cultivo D sin fuente de carbono y nitrógeno (línea y gruesa). La producción de CO2 alcanzó las 350 ppm, 500 ppm menos que el cultivo con GLP, y
la respiración endógena, llegó a las 10 ppm, 40 ppm que el cultivo con GLP.
Es probable que las diferencias entre la producción de CO2 en los cultivos se debe al
hecho de que el inóculo para la prueba con GLP fue de 0.24 g/L, y la de FCC contenía
un inóculo inicial de 0.16 g/L. También puede deberse al hecho de que el cultivo D ha
demostrado menor degradación con FCC cómo sustrato que con GLP.
Se realizó un balance basado en la oxidación estequiométrica del carbazol:
4 C12H9N + 114 O2 = 48 CO2 + 18 H2O + 2N2
Basándonos en esta ecuación determinamos la cantidad de CO2 que cada mol de
carbazol debía emitir, se obtuvo una relación que indica que por cada mol de carbazol
se debían generar 12 mol de CO2, se hizo una aproximación similar para los alquil
56
carbazoles y se determinó que los monometilados producirían 13 mol de CO2, los
dimetilados producirían 14 y los trimetilados 15.
Los valores de concentración de carbazol y alquil carbazoles se utilizaron para evaluar
la capacidad de emisión de CO2 que cada compuesto tiene observando las relaciones
determinadas en el párrafo anterior.
Obtuvimos que la degradación de los alquil carbazoles producía 0.0004 mol de CO2, la
lectura obtenida del cromatógrafo, transformado a moles de CO2, es de 0.002 mol , es
decir, la cantidad esperada es solo el 20% de lo obtenido, por lo tanto, podemos
darnos cuenta de que la mayor parte de esta producción de CO2 se debe a la
degradación de otros hidrocarburos contenidos en el GLP.
También se monitoreo el crecimiento del cultivo, por diferencia de pesos, tomando 3 ml
cada 48 h, desecándolo en el horno, y determinando la diferencia de pesos entre la
cápsula con y sin sólidos (figura 22).
02468
101214161820
0 50 100 150 200 250 300
t (h)
Bio
mas
a (g
/L)
Figura 22. Crecimiento de la población del cultivo determinada por diferencia de pesos durante la cinética: D con GLP (línea continua), D con FCC (línea punteada). Ambos experimentos iniciaron en un valor de biomasa cercano, 0.24 g/L para GLP y
0.16 g/L para FCC, sin embargo, las diferencias comienzan a surgir desde las primeras
48 h, en que el cultivo con GLP, ha sobrepasado los 2 g/L de biomasa, mientras que el
57
cultivo con FCC ha alcanzado un valor de apenas 1.5 g/L. Estas diferencias
continuarán incrementándose hasta que al final de las cinética, dos semanas, el cultivo
con GLP presenta casi 20 g/L de biomasa mientras que el de FCC muestra alrededor
de 10 g/L, es decir, el cultivo con GLP, al final del período de incubación, muestra el
doble de biomasa que el cultivo con FCC, estos resultados corresponden con los
observados en el monitoreo de CO2, ya que ahí observamos que al final del tiempo de
incubación, el cultivo con GLP había alcanzado las 800 ppm de CO2, mientras que con
FCC se llegaron a 350 ppm.
VI.- CONCLUSIONES.
a) Se obtuvieron cultivos capaces de utilizar carbazol como fuente de carbono y
nitrógeno, y de usar los HAN del GLP como sustrato.
b) Solo se obtuvo crecimiento a 40 °C.
c) Se lograron aislar algunos microorganismos que conforman el cultivo D en agar
nutritivo y agar noble con carbazol.
d) El carbazol y los carbazoles monometilados se consumieron antes de las 48 h,
los carbazoles dimetilados y los trimetilados no se degradan para las 96 h,
excepto: 1, 4-DMCz, 3, 5-DMCz, 2, 4-DMCz, 3, 6-DMCz, 1, 3-DMCz, 3,4,6-
TMCz, 1, 4, 5-TMCz, y 2, 3, 6-TMCz. Pero a las 336 h ya se han degradado
completamente todos los carbazoles dimetilados y trimetilados.
e) La cantidad de CO2 esperada de la degradación de los HAN fue 80% menor a
la real. Es decir, se degradan otros compuestos del gasóleo.
f) No se logró reconstituir un cultivo mixto. Puede deberse a varias razones: Hay
microorganismos que no son aislables por técnicas convencionales de
microbiología, no son cultivables cuándo se les intenta separar de otras
bacterias, por lo tanto, cuando se aislaron bacterias, estas no cultivables se
perdieron, y por lo tanto no estaban presentes cuando se intentó reconstituir.
Otra explicación posible, es porque se aislaron en placas de agar nutritivo y
agar noble con carbazol, y posiblemente algunos microorganismos no crecieron
en estos medios y por lo tanto no se contó con ellos al momento de intentar la
reconstitución.
58
VII.- RECOMENDACIONES PARA UN TRABAJO FUTURO.
Se recomienda utilizar técnicas de biología molecular para la identificación de los
microorganismos aislados de cada cultivo.
También recomendamos probar el cultivo en otras fracciones del petróleo, como el
diesel.
VIII.- REFERENCIAS.
1.- 1.- Benedik, Gibbs, Riddel. 1998. Microbial Denitrogenation of Fosil Fuels. T.
Biotechnol., No. 16 Vol. 9.390-395.
2.- Kilbane, John J.; Ranganathan, Rajaram; Cleveland, Lisa; Kayser, Kevin J.; Ribiero,
Claudia and Linhares, Monica M.; ”Selective Removal of Nitrogen from Quinoline and
Petroleum by Pseudomonas ayucida IGTN9m”. Applied and Environmental
Microbiology, February 2000,Vol. 66, No. 2. p.p 688-693.
3.- Kirimura, Kohtaro; Nakagawa, Hiroyuki; Tsuji, Kenji; Matsuda, Kasuya; Kurane,
Ryuichiro and Usami, Shoji. ”Selective and Continuous Degradation of Carbazole
Contained in Petroleum Oil by Resting Cells of Sphingomonas sp. CDH-7”, Biosci.
Biotechnol. Biochem. No. 63, Vol. 9, 1999. p.p. 1563-1568.
4.- Meyer, Susanne and Steinhart, Hans. “ Effects of heterocyclic PAHs (N, S, O) on
the Biodegradation of Typical Tar Oil PAHs in a Soil/Compost Mixture” Chemosphere,
No. 40, 2000, p.p. 359-367
5.- Rothenburger, Stephen; Atlas, Ronald M. “ Hydroxylation and Biodegradation of 6 –
methylquinolina by Pseudomonads in Aqueous and Nonaqueous Immobilized Cell
Reactor”, Applied and Environmental Microbioloby, June 1993, p. 2139 – 2144.
6.- Li, L.; Xu, P.; Blankespoor, H.D. “Degradation of Carbazole in the Presence of Non-
Aqueous phase liquids by Pseudomonas sp.” Biotechnology Letters, No. 26, 2004, p.p.
581 –584.
59
7.- Topsoe, H.; Clausen, B.S; Massoth, F.E.; “Hydrotreating Catalysis” Springer
Editorial, Germany 1996, p 1-155.
8.- Choi, Ki-Hyouk; Korai, Yozo; Mochida, Isao; Ryu, Jae-Wook; Min, Washik; “Impact
of Removal Exent of Nitrogen Species in Gas Oil on its HDS performance: an efficient
approach to its Ultra Deep Desulfurization.” Elsevier, Applied catalysis B: Environmental
50, October 29 2003, p 9 - 16.
9.- Riddle, Robert R.; Gibbs, Phillip R.; Willson, Richard C.; Benedik, Michael J.;
“Recombinant carbazole-degrading strains for enhaced petroleum processing”, J Ind
Microbiol Bitechnol, No.30, 2003, p 6-12.
10.- Ouchiyama, Naoki; Zhang, Yan; Omori, Toshio; Kodama, Tohru. “ Biodegradation
of Carbazole by Psudomonas spp. CA06 and CA10”, Biosci. Biotech. Biochem. No. 57
Vol. 3, 1993, p.p. 455 – 460.
11.- Miethling, R.; Hecht, V.; Deckwer, W.D.; “Microbial Degradation of Quinoline:
Kinetc Studies with Comamonas acidovorans DSM 6426” Biotechnol. Bioing. 42 589 –
595.
12.- Murti, Sri Djangkung Sumbogo. Yang, Hojung. Choi, Ki-Hyouk. Korai, Yozo.
Mochida, Isao. “Influences of nitrogen species on the hydrodesulfurization reactivity of
gas oil over sulfide catalyst of variable activity” Elsevier Applied Catalysis A: General
252, 2003, p.p. 331-346.
13.- Grosser, Robert J. Warshawsky, David. Vestal, J. Robie. “Indegenous and
Enhanced Mineralization of Pyrene, Benzoapyrene and Carbazole in soils” Applied and
Environmental Microbiology, Vol. 57, No. 12. 1991, p.p. 3462-3469.
14.- Grossman, M.J. Lee, M.K. Prince, R.C. Garret, K.K. George, G.N. and Pickering,
I.J. “ Microbial Desulfurization of a Crude Oil Middle-Distillate Fraction: Analysis of the
Extent of Sulfur Removal and the Effect of Removal on Remaining Sulfur” Applied and
Environmental Microbiology, Vol. 65, No. 1. 1999, p.p. 181-189.
60
15.- Wiwel, Peter. Knudsen, Kim. Zeuthen, Per. Whitehurst, Duayne. “ Assesing
Compositional Changes of Nitrogen Compounds during Hydrotreating of Typical Diesel
Range Gas Oils Using a Novel Preconcentration Technique Coupled with Gas
Chromatography and Atomic Emission Detection” Ind. Eng. Chem. Res. No. 39, 2000,
p.p. 533-540.
16.- Caldwell, Douglas E. Wolfaardt, Gideon M. Korber, Darren R. Lawrence John R.
“Cultivation of Microbial Consortia and Communities” p.p. 79-90
17.- Márquez-Rocha, Facundo J. Hernández Rodríguez, Vanesa. Lamela, María
Teresa. ”Biodegradation of Diesel Oil in Soil by a Microbial Consortium” Water, Air and
Soil Pollution, Kluwer Academic Publishers, No. 128, 2001, 313-320.
18.- Pineda Flores, Gabriel. Mesta Howard, Ana María. “Petroleum Asphaltenes:
Generated problematic and possible biodegradation mechanisms” Revista
Latinoamericana de Microbiología. Vol. 43. No. 3. 2001. p.p. 143-150.
61
Anexo 1. Cromatograma de los hidrocarburos aromáticos nitrogenados obtenida por
Choi et. al. 2003.
8.- Choi, Ki-Hyouk; Korai, Yozo; Mochida, Isao; Ryu, Jae-Wook; Min, Washik; “Impact
of Removal Exent of Nitrogen Species in Gas Oil on its HDS performance: an efficient
approach to its Ultra Deep Desulfurization.” Elsevier, Applied catalysis B: Environmental
50, October 29 2003, p 9 - 16.
