Comunicazione cellulare Per segnali cellulari (cell signaling) si può intendere sia una catena di segnali tutti all’interno di una cellula sia la catena di eventi che consente ad un segnale extracellulare di generare uno o più segnali intracellulari. Quest’ultimo processo viene specificamente denominato trasduzione del segnale. In questo capitolo esamineremo alcuni meccanismi di trasduzione e la successiva catena di segnali intracellulari innescati dalla trasduzione. Due cellule connesse da gap junction, essendoci continuità citoplasmatica, possono comunicare direttamente sia mediante segnali chimici che elettrici (Fig. 5.1). I segnali elettrici sono costituiti da flussi ionici, per cui anche i segnali elettrici sono, di fatto, una modalità di segnalazione chimica. Le gap junction consentono il passaggio di molecole sino ad 1 kD. Fig. 5.1. Le cellule possono comunicare mediante ponti citoplasmatici formati dalle gap junction o tramite molecole prodotte da una cellula che interagiscono con recettori di membrana (come mostrato in figura) od intracellulari (vedi fig. 5.11) della cellula-bersaglio (modificata da Cell Signalling Biology, M. Berridge). Se due cellule sono separate dal liquido extracellulare, la comunicazione avviene generalmente tramite una molecola prodotta da una cellula che viene in contatto con recettori di membrana della cellula bersaglio (Fig. 5.1). Se la molecola è lipofila (per esempio, un ormone steroideo) può anche attraversare la membrana ed interagire direttamente con un recettore intracellulare (vedi Fig. 5.11). Le diverse modalità con cui la molecola-segnale entra in contatto con il recettore della cellula bersaglio sono illustrate in Fig. 5.2. Le molecole-segnale possono essere inserite nella MP e poi a) essere scisse da una metalloproteasi anch'essa residente nella MP, detta ADAM (ADAM è l'acronimo di "A Disintegrin And Metalloproteinase"), b) uscire nel mezzo extracellulare senza essere racchiuse in vescicole, c) essere liberate nel mezzo extracellulare mediante esocitosi. Nel caso delle sinapsi, il neurotrasmettitore viene sintetizzato nel corpo cellulare e trasportato lungo l'assone, dalla cui terminazione fuoriesce per esocitosi. Se la molecola-segnale resta ancorata alla MP, interagisce con il recettore con modalità "iustacrina". Se viene liberata nel mezzo extracellulare può agire localmente, con modalità "autocrina" (interagisce con i recettori della cellula che l'ha prodotta) e/o "paracrina" (interagisce con i recettori di cellule vicine); può altresì entrare nel flusso sanguigno ed essere trasportata in tutto l'organismo, agendo con modalità "endocrina".

Proteasi

Sangue

Stimolo ancorato alla membrana

Endocrina Autocrina Paracrina Iustacrina

Ormoni (sangue); neuro- trasmettitori (assone e poi esocitosi)

EicosanoidiNO, ATP

Fattori di crescita Citochine

Fig. 5.2. Interazione tra molecole-segnale e recettori. Gli ormoni sono liberati per esocitosi e vanno nel sangue, mentre i neurotrasmettitori sono trasportati lungo l'assone, dalla cui terminazione fuoriescono per esocitosi (modificata da Cell Signalling Biology, M. Berridge).

La catena di eventi attivati dall'interazione dello stimolo con il recettore di membrana è schematizzata in Fig. 5.3.

Effettori e sensori

Fig. 5.3. Trasduzione del segnale (modificata da Cell Signalling Biology, M. Berridge).

Nel processo di trasduzione l'interazione stimolo-recettore induce un cambio di conformazione nel recettore, che diviene capace di interagire con molecole anch'esse inserite nella MP (i trasduttori). Queste attivano una o più molecole (gli amplificatori, l'adenilato ciclasi, per esempio), che generano molecole dette messaggeri ( come l'AMP ciclico) che attivano gli effettori (quali le chinasi). Questa catena può inviare dei messaggi di feedback, cosicchè le molecole attivate a partire dalla trasduzione membranale possono influenzare i meccanismi che le hanno prodotte.

LE PROTEINE G TRIMERICHE Le proteine G (G sta per GTP binding protein) trimeriche sono costituite da 3 subunità (α, β e γ) ed interagiscono con recettori di membrana denominati GPCR (G protein coupled receptor). Nello stato inattivo, la subunità α è legata al GDP (Fig. 5.4, fase 1); se il recettore interagisce con il ligando (fase 2), cambia conformazione (fase 3) ed induce nella subunità α lo scambio tra GDP e GTP (fase 4). La subunità α, legata al GTP, si stacca dalle subunità βγ, che restano unite (fase 5), e sia la subunità α-GTP, e possibilmente anche il complesso βγ, attivano una catena di segnali intracellulari. La subunità α, legata al GTP, ha anche una sua intrinseca attività GTPasica (modulabile da altre molecole), e scinde il GTP in GDP e Fosfato (fase 6), ponendo termine al processo della trasduzione. Infine il complesso α-GDP si riunisce al complesso βγ (fase 1). Esistono numerose isoforme delle subunità α, β e γ, cosicchè l'attivazione di un recettore accoppiato a proteine G trimeriche può attivare un largo spettro di segnali intracellulari.

Fig. 5.4. Il ciclo delle proteine G trimeriche.

LE PROTEINE G MONOMERICHE (O SMALL G PROTEIN) Esistono proteine G monomeriche (sono dette anche small G protein) che presentano alcuni aspetti funzionali che le differenziano dalle proteine G trimeriche. Le proteine G monomeriche sono legate nello stato inattivo al GDP. L'attivazione di alcuni recettori membranali attiva una proteina detta GEF (Guanosin Exchange Factor), che promuove lo scambio GDP/GTP, attivando la proteina G. L'inattivazione avviene ad opera di una GAP (GTPase Activating Protein), che scinde il GTP in GDP e Fosfato, ponendo termine alla trasduzione (Fig. 5.5). I segnali intracellulari generati dall'attività delle G protein (monomeriche e trimeriche) sono numerosissimi e modulano l'attività di praticamente tutti i processi cellulari.

Recettore membranale

..................

Segnali intracellulari

Canali ionici

Citoscheletro

Fig. 5.5. Ciclo delle proteine G monomeriche (modificata da Cell Signalling Biology, M. Berridge).

G PROTEIN E PLC Numerosi agonisti sono in grado di attivare la PLC (fosfolipasi C) tramite una G protein trimerica avente una subunità α denominata αq (Fig. 5.6). La PLC scinde il fosfatidil-inositolo 4,5 bifosfato in diacilglicerolo (DAG) e Inositolo 1,4,5 fosfato (IP3 o InsP3, ).

q

β

eMessaggeri

Amplificatore

Trasduttore

ATP, ADP Angiotensina Endotelina Istamina Trombossano

Ach (recettori muscarinici) Noradrenalina Dopamina Glutammato 5-idrossitriptamina (5-HT)

Fig. 5.6. Sono indicati alcuni degli agonisti in grado di attivare un recettore accoppiato ad una G protein trimerica che a sua volta attiva la PLC, generando DAG e InsP3 (modificata da Cell Signalling Biology, M. Berridge). Esistono numerose isoforme di PLC: i recettori accoppiati a G protein attivano la PLCβ. Il DAG attiva la PKC e può aprire dei canali ionici della membrana plasmatica; l'InsP3 provoca la liberazione di Ca2+ dal reticolo endoplasmatico. In Fig. 5.7 è indicata la struttura del Fosfatidilinositolo, del Fosfatidilinositolo 4,5 bifosfato (PIP2), dell' inositolo 1,4,5 trifosfato (IP3 o InsP3), ed i siti scissi da alcune fosfolipasi.

Fig. 5.7. Struttura del Fosfatidilinositolo (sinistra) e del Fosfatidilinositolo 4,5 bifosfato e dell'InsP3 (in alto a destra; l'InsP3 è racchiuso da un rettangolo tratteggiato). In basso a destra sono indicati i siti scissi dalle fosfolipasi A1, A2, C e D.

G PROTEIN ED ADENILATO CICLASI L'attività dell'enzima adenilato ciclasi è modulata da numerosi recettori membranali che possono sia attivare che inibire l'enzima. La proteine G stimolano l'attività dell'enzima tramite una subunità α detta αs o la inibiscono tramite una subunità α detta αi; l'AMP ciclico modula numerosissimi processi cellulari (trasporti, canali ionici, metabolismo, espressione genica), principalmente tramite l'attivazione della PKA (protein chinasi A). Alcuni canali ionici sono modulati direttamente dall'AMP ciclico (Fig. 5.8).

Agonisti inibitori Agonisti stimolatori Adenilato ciclasi

Trasporti

AMP ciclico Adenilato ciclasi solubile

Effetto diretto sul canale ionico

Reticolo endoplasmatico

Lipasi Metabolismo

Espressione genica

Canali ionici

Fig. 5.8. Modulazione dell'attività dell'adenilato ciclasi e processi influenzati dall'AMP ciclico. Questo agisce principalmente attivando la PKA, ma in alcuni casi può operare direttamente, senza il tramite delle kinasi. Esiste una forma solubile (non inserita nella MP) di adenilato ciclasi, attivata dall'HCO3

- (modificata da Cell Signalling Biology, M. Berridge).

RECETTORI TIROSINA-KINASI E SERINA-TREONINA KINASI Numerosi fattori di crescita agiscono interagendo con recettori aventi attività auto-fosforilativa dell'aa tirosina: tali recettori sono detti recettori tirosina-kinasi. La famiglia dei Traforming Growth Factor β attiva dei recettori aventi attività auto-fosforilativa sugli aa Serina e Treonina (recettori Serina/Treonina kinasi), che a loro volta fosforilano proteine SMAD. Entrambi i recettori attivano via intracellulari connesse con la crescita e la proliferazione cellulare (5.9). La PLC attivata dai recettori tirosina-kinasi è la PLCγ.

γ

Nucleo

Serina-treonina kinasi

Recettore Serina- Treonina kinasi Tirosina-kinasi

Recettore Tirosina-kinasi

TGFβ (famiglia dei Trasforming growth factor)

Angiopoietina CSF-1 (Colony-stimulating factor) EGF (epidermal growth factor) HGF IGF PDGF SCF VEGF

Fig. 5.9. L'interazione dello stimolo con i recettori tirosina-kinasi provoca la loro dimerizzazione, attivando il dominio kinasico. Il recettore Serina/Treonina kinasi tetramerizza interagendo con 2 molecole di TGFβ, attivando il dominio kinasico. Il recettore tirosina-kinasi può attivare le vie della PLCγ, della PI 3-K (fosfatidilinositolo 3-kinasi) e RAF-ERK (modificata da Cell Signalling Biology, M. Berridge).

IL MONOSSIDO D'AZOTO Il monossido d'azoto (NO) è un messaggero prodotto da tre enzimi, la NO sintasi endoteliale (eNOS), la NO sintasi neuronale (nNOS) e la NO sintasi inducibile (iNOS). I primi due sono presenti nella cellula in condizioni basali e sono attivati dal complesso Ca2+/Calmodulina o mediante fosforilazione. La iNOS non è presente in condizioni basali; la sua sintesi viene attivata da stimoli infiammatori e l'enzima è attivo di per sè. L'NO attiva la guanilato ciclasi solubile, che sintetizza il GMP ciclico; questo a sua volta attiva la PKG (protein kinasi GMP ciclico-dipendente; Fig. 5.10). L'NO può anche nitrosilare le proteine, modificandone l'attività. Queste possono poi subire de-nitrosilazione (Fig. 5.10). I fattori natriuretici possono attivare una guanilato-ciclasi di membrana.

Proteine bersaglio

Denitrosilazione Nitrosilazione

Risposte cellulariFosforilazione

Altre cellule Fattori natriuretici

Fig. 5.10. LNO prodotto dalla cellula o da cellule vicine attiva la guanilato-ciclasi solubile o causa nitrosilazione cellulare. I fattori natriuretici possono attivare una guanilato-ciclasi di membrana (modificata da Cell Signalling Biology, M. Berridge).

GLI ORMONI STEROIDEI Gli ormoni stereoidei sono molecole lipofile, in grado di attraversare la MP. Possono quindi interagire con recettori intracellulari, modulando l'espressione genica. Interagiscono anche con i GPCR, e possono attivare l'adenilato ciclasi, la PI 3-K e la PLC

G PCR

Trascrizione genica

Recettore intracellulare

Ormoni steroidei: Aldosterone Cortisolo Estrogeni Testosterone

Fig. 5.11. Gli ormoni steroidei possono attraversare la MP, interagendo con recettori intracellulari. Possono anche interagire con GPCR (modificata da Cell Signalling Biology, M. Berridge).