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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : [email protected]
Tesis de Posgrado
Alteraciones producto de unaAlteraciones producto de unahipoxia aguda en el complejohipoxia aguda en el complejo
receptor Gaba : caracterizacionesreceptor Gaba : caracterizacionesbioquímicas, farmacológicas ybioquímicas, farmacológicas y
molecularesmoleculares
Rodríguez Gil, Diego Javier
Tesis presentada para obtener el grado de de la Universidadde Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:Rodríguez Gil, Diego Javier. (). Alteraciones producto de una hipoxia aguda en el complejoreceptor Gaba : caracterizaciones bioquímicas, farmacológicas y moleculares. Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3728_RodriguezGil.pdf
Cita tipo Chicago:Rodríguez Gil, Diego Javier. "Alteraciones producto de una hipoxia aguda en el complejo receptorGaba : caracterizaciones bioquímicas, farmacológicas y moleculares". Tesis de . Facultad deCiencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. .http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3728_RodriguezGil.pdf
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
_'g .‘u I ‘É‘á ¡a :3¡ _n¡.laMaui,"J ‘L'n- ¡4'
ALTERACIONES PRODUCTO D'É UNA HIPOXIA AGUDA EN
EL COMPLEJO RECEPTOR GABAA:CARACTERIZACIONES
BIOQUÍMICAS, FARMACOLÓGICAS Y MOLECULARES.
Tesista
LIC. DIEGO JAVIER RODRÍGUEZ GIL
Director de Tesis
DRA. SARA FISZER DE PLAZAS
Lugar de trabajo:
Instituto de Biologia Celular y Neurociencias
“Prof. Dr. Eduardo De Robertis”
Facultad de Medicina —Universidad de Buenos Aires
Tesis presentada para optar por el título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires
Mayo 2004
mi (a; c;¿y ’. - ' .- «
AGRADECIMIENTOS
Estos agradecimientos están dirigidos a todos aquellos que influyeron en mi carrera académica y que
hicieron posible que hoy escriba estas líneas:
A mi directora, la Dra. Sara Fisur de Plans, por haber confiado en mi, dándome la
oportunidad de trabajar en su laboratorio, brindándome su conocimientoy su apoyo, ayudándome en
los momentos dificilesy dejándome mucha libertad para trabajar dentro del laboratorio.
A las autoridades del Instituto de Biología Celular y Neurociencias Prof. Dr. E. De Robertis
por permitirme desarrollar mi trabajo de investigación en sus instalaciones.
A Alba Mitridate de Novara por su predisposición para aprender cosas nuevas y para
ayudarme en todo momento. Por el apoyo incondicional, por su compañerismo y por los consejos
brindados en todos estos años.
A todos aquellos que pasaron en este tiempo por el laboratorio, cada uno de los cuales me
ayudó a crecer en el plano científico, pero sobre todo por brindarme su amistad:
Al Dr. Mariano Viapiano por su eterna ayuda, sus enseñanus desinteresadas, su
amistad y por todas las horas invertidas juntos en la puesta a punto del modelo
experimental.
Al Dr. Leonardo Pignataro y a la Dra. María Clara Gravielle por su compañerismo, su
ayuda y sus enseñanzas.
A la Lic. Marina Vacotto por estar permanentemente dispuesta a ayudarme, aún
dejando de lado sus cosas. Por ser la gran persona que es y por su entrañable amistad.
A Victorio Pozo Devoto y a Sebastián Giusti Sachella por ser excelentes personas y por
aguantar todas mis indicaciones en sus primeros pasos en la mesada del laboratorio.
Al Dr. Vladimir Flores y al Dr. Gabriel Scicolone por su ayuda con la histologia del
lóbulo óptico.
A los demás compañeros del Instituto por sus consejos y por los buenos momentos que
pasamos juntos, María Ana Calviño, Claudia López, Florencia Coronel, Javier Ramos, Analia
Reinés, Lionel Müller, Patricia Schneider y Patricia Taglial'errro.
Finalmente quiero agradecer a quienes de una u otra manera me acompañaron y me
ayudaron, no en el plano científico sino en el personal a lo largo de estos dificiles años de mi vida.
Nombrarlos a cada uno de ellos sería arriesgarme a olvidar el nombre de alguno, lo cual no me
gustaría. Creo que cada uno de ellos sabe que es una parte importante de mi vida. Es por ello que:
por su ayuda, su compañerismo y principalmente por su amistad, a todos ellos quiero decirles
MUCHAS GRACIAS.
DEDICATORIA
Esta Tesis está dedicada:
A mi Madre María Luisa, por ser una luchadora
incansable más allá de los reveses que da la vida.
A mis hermanos Sergio y Silvina, por aguantarme
y quererme tal cual soy.
A Claudia por su amor incondicional y su cariño
infinito.
Al final, pero sabiendo que siempre están primero,
a toda Mi Familia. Porque sin ellos no sería
nada.
A mi Padre Edelmiro.
A mi Abuelo Eduardo.
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN
I.- METABOLISMO DEL ÁClDO y-AMINOBUTÍRICO
2.- CLASIFICACIÓN DE LOS RECEPTORES GABAÉRGICOS
3.- EL COMPLEJO RECEPTOR GABAA
3. l. Estructura molecular
3.2. Farmacología del Receptor GABAA
3.2.l Barbitúricos
3.2.2 Benzodiazepinas
3.2.3 Neuroesteroides
3.2.4 Etanol
4.- EL ESTADO HIPÓXICO
4. l. Alteraciones del SNC en condiciones de hipoxia
4.2. Factores inducibles por hipoxia
5.- MODELO DE TRABAJO
5.1. La via visual de las aves
5.2. Neurolransmisión GABAérgica m el lóbulo óptico
5.3. Morfología del lóbulo óptico
5.4. Desarrollo del lóbulo óptico
OBJETIVOS
MATERIALES Y MÉTODOS
1.- ANIMALES Y TRATAMIENTO HIPÓXICO
2.- ENSAYOS BIOQUÍMICOS
2.]. Reactivos
2.2. Preparación de membranas sinápticas
2.3. Ensayos de unión de radioligando
2.4. Determinación de los parámetros cinéticos de los sitios receptores
2.5. Ensayo de captación de cloruro
2.6. Deten'ninación del efecto de distintos moduladores sobre la unión de [3H]GABA a
sus sitios receptores
2.7. Determinación delos niveles de lactato
2.3. Determinación de proteinas
2.9. Análisis estadísitíco de los resultados.
2l
21
22
23
25
27
28
28
29
29
29
30
3|
33
34
35
35
35
I'm/¡w —Il
3.- ENSAYO DE HIBRIDACIÓN IN SITU 36
3.]. Reactivos 36
3.2. Oligonucleótidos utilimdos. 36
3.3. Obtención de los eu'tes. 37
3.4. Marcación de los oligmucleótidos 37
3.5. Hibridación y revelado 39
3.6. Procesamiento y análisis digital de las imágenes 39
3.7. Análisis estadístico de los resultados 40
RESULTADOS 4|
l.- PUESTA A PUNTO DEL MODELO 4|
l.l. Disdio de la cámarahipóxica 4|
¡.2. Validación del modelo 43
2.- ALTERACIONES PRODUCIDAS POR EL TRATAMIENTO HIPÓXICO 43
2. l . Efecto del tratamiento hipóxieo sobre el receptor GABAAdurante el desarrollo 43
embrionario del lóbulo óptico de pollo.
2.2. Tratamiaito hipóxioo en el DE l2: caracterización farmacológica y bioquímica del 44
receptor GABAA
2.3. Caracterizaciúi bioquímica del receptor GABAAluego del tratamiento hipóxieo en 50
el lóbqu óptico en desarrollo.
2.4. Alteración en los niveles de lactato en el LO durante el desarrollo en embriones 52
controles e hipóxicos
3.- ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DEL ARN MENSAJERO DE CUATRO SUBUNIDADES S3
DEL COMPLEJO RECEPTOR GABAAMEDIANTE HIBRIDACIÓN IN SITU.
3. l. Expresión de los ARNm de las subunidads al, az, BZy y; en condiciones 53
normales durante el desarrollo del LO
3.2. Modificaciones m los niveles de expresión de los ARNm producto del tratamiento 63
hipóxioo.
CONCLUSIONES v DISCUSIÓN 67
1.- MODELO DE TRABAJO - ¿POR QUÉ EMBRIONES DE AVES? 67
2.- ALTERACIONES EN Los PARÁMETROS FARMACOLÓGICOS Y BIOQUIMICOS 68
DEL COMPLEJO RECEPTOR GABAA
2.1. Reducción de la unión de GABA edad depmdiente. 68
2.2. Alteraciones en la modulación de la unión de GABA en el DE |2 y en la 73
fimcionalidad del canal de Cl'.
3. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DE CUATRO SUBUNIDADES DEL COMPLEJO
RECEPTOR GABAAEN EL LÓBULO OPTICO DEL POLLO.
3. l. Caracterización durante el desarrollo embrionario normal.
3.]. Cambios en la expresión de los ARNm de algunas mhmidades del recqator
GABAA.
PUBLICACIONES
BIBLIOGRAFÍA
¡In/ü 1»- III
77
77
8]
RESUMEN
Se ha demostrado que la hípoxia produce diversas alteraciones en la
neurotransmisión GABAérgica, principalmente en el período perinatal. El complejo
receptor GABAA está asociado a un canal de cloruro, el cual en presencia de GABA
aumenta la conductancia al ion Cl- hacia el interior de la neurona produciendo su
hiperpolarización. Los objetivos de la presente Tesis fiieron diseñar una cámara hipóxica
para embriones de aves, y caracterizar las alteraciones que se producen en el complejo
receptor GABAAluego del trauma hipóxico. Los resultados obtenidos demuestran que los
estadios embrionarios más tempranos son más sensibles a la injuria, exhibiendo una
reducción del máximo número de sitios de unión de baja afinidad, y un aumento de la
estimulación máxima producida por un barbitúrico (pentobarbital sódico) y un
neuroesteroide (alopregnanolona). Asimismo, se observó un aumento de la captación de
Cl' inducida por GABA de los receptores remanentes luego del tratamiento hipóxico.
Dado que los embriones detectan en todos los estadios embrionarios la injuria producida,
evidenciándose como un aumento en los niveles de lactato, es probable que existan
cambios durante el desarrollo en la composición de las subunidades del receptor que lo
hagan más resistente a la hípoxia, la cual además, ocurre fisiológicamente en los últimos
días de desarrollo. La expresión de algunas subunidades del receptor GABAA durante la
embriogénesis, mostró cambios en los niveles de expresión de on, [52y yz en embriones
control luego del tratamiento hipóxico, los cuales correlacionaron con lo observado luego
de producida la hípoxia fisiológica. Estos datos sugieren que, podrían existir
conformaciones del receptor más resistentes a la hípoxia, y que los niveles de oxígeno
podrían regular la expresión de algunas subunidades de alguna manera aún desconocida.
SUMMARY
lt has been demonstrated that hypoxic treatment produces functional disorders and
changes in the GABAergic neurotransmission, specially during perinatal period. GABAA
receptor complex is associated to a chloride channel, and GABA binding increases Cl'
influx, resulting in neuron hyperpolarization. The airns of this Thesis were (a) to design a
hypoxic Chamber for avian embryos and (b) to characteríze alterations on the GABAA
receptor complex after hypoxic injury. The results obtained demonstrated that the earlier
embryonic stages are more sensitive to injury, exhibiting a reduction in maxima] number
of low affinity binding sites, and an increase in the maximal stimulation produced by a
barbiturate (sodium pentobarbital) and a neurosteroid (alopregnanolone). Moreover, an
increase in chloride influx of the remaining receptors was observed after hypoxia. Taking
into account that the embryos sense hypoxic treatment at all embryonic days studied,
which was proved by the increase in lactate levels, it is probable that during development
receptor subunit composition is altered making this receptor subtype more resistant to
hypoxia. This occurs physiologically at latest embryonic days. The expression pattem of
some GABAA receptor subunits during ontogeny showed changes in al, B2and yz levels
in control embryos, and also after hypoxic treatment. A correlation could be observed
between hypoxic treatment and physiological hypoxia. These data suggest the existence
of some receptor isotypes which are more resistant to hypoxia, and that oxygen levels
may regulate subunit expression in some unknown way.
INTRODUCCIÓN
1.-METABOLISMODEL Ácmo x-AMINOBUTÍRICO
El ácido y-aminobutírico (GABA) es un aminoácido neutro (Roberts y Sherman
1993), que file descripto por primera vez en el Sistema Nervioso Central (SNC) hace ya
más de cincuenta años (Awapara y col. 1950; Roberts y Frankel 1950), y desde entonces
numerosos trabajos experimentales postularon la acción del GABA como molécula
neurotransmisora. In vivoH. o o o o r
Ho_¿_¿HCH26H2¿_OH Ho_¿_¿cmc“ u H la smtesrs del GABA seÁcidoL-sllllámíco a-Cetoglumnto ' ' lIllCla con unGAD GABA-T 9 9 Ciclo . . _ _
HCCHzCHzC-OH d mtermedlario del Ciclo deC
H? o Seminldehldosuoclnioo Krcbs
¿HzcuzcméLoH SSADH Krebs, el (x-cetoglutarato,Ácido y-aminobutírioo 0 0
(GABA) Ho-¿mcmñmm el cual se transforma en
Audommm ácido L-glutámico (figuraFigura 1: Metabolismo del ácido y-aminobutírico. El esquema Umuestra las vías de síntesis y degradación del GABA. GAD: L- 1) por una reaccwn deglutamato decarboxilasa; GABA-T: GABA- oc-cetoglutaratotransaminasaSSADH,semialdehídosuccinicodeshidrogenasa. transammacmn llevada a
cabo por la enzima
GABA- a-cetoglutarato transaminasa (GABA-T). La enzima L-glutamato decarboxilasa
(GAD), produce la decarboxilación del ácido L-glutámico a GABA. La enzima GAD es
utilizada como marcador de neuronas que sintetizan GABA (denominadas neuronas
GABAérgicas), ya que las isoformas caracterizadas hasta el momento sólo han sido
encontradas en neuronas que utilizan GABA como neurotransmisor (Varju y col. 2001).
Actualmente se conocen otras vías menores en la síntesis de GABA, como ser a partir de
poliaminas (espermina y espermidina), ornitina u homocamosina (Tillakaratne y col.
1995). Tanto el GABA como las enzimas GAD, en sus dos isoformas GAD65y GAD67,y
la enzima GABA-T han sido encontradas fuera del SNC, en órganos como corazón,
gónadas, hígado, riñones, páncreas y tracto gastrointestinal entre otros (Tillakaratne y col.
1995; Chessler y Lemmark 2000). El rol preciso del GABA en estos órganos aún no ha
sido determinado.
El proceso de degradación del GABA involucra la misma enzima GABA-T, la
cual produce una transaminación para generar ácido L- glutámico y semialdehído
succinico, pudiendo ser este último oxidado a ácido succinico por la enzima semialdehido
liz/¡l'u/Hr , ¡wn
succínico deshidrogenasa (SSADH), y entrar nuevamente al Ciclo de Krebs (figura l). De
esta manera una molécula de GABA puede ser degradada sólo si una molécula del
precursor, ácido L-glutámico, es formada. Los procesos de síntesis y degradación de
GABA se encuentran separados, localizándose el primero en el citoplasma, especialmente
en los terminales sinápticos, lugar donde mayoritariamente se encuentra la enzima GAD65
en estrecha asociación con la membrana de las vesículas sinápticas (Hsu y col. 2000).
Dado que la enzima GABA-T posee localización mitocondrial (Schousboe y col. 1977),
el segundo proceso, que es la transformación de GABA a semialdehido succínico, es una
reacción que forma parte del metabolismo de dicha organela y que provee intermediarios
para el ciclo de Krebs.
Teniendo en cuenta que GABA y glutamato son los dos principales
neurotransmisores del SNC, con acciones diametralmente opuestas en los adultos, el
balance de ambos aminoácidos se ha considerado como un reflejo del equilibrio
inhibición-excitación en el cerebro (Roberts y Sherman, 1993).
La liberación de GABA al espacio sináptico es estimulada por la despolarización
de la neurona presináptica, y el neurotransmisor liberado difunde hasta la membrana
postsináptica para unirse a sus receptores específicos. La acción del GABA finaliza por la
remoción del mismo del espacio sináptico llevada a cabo tanto por el terminal
presináptico como por las células gliales vecinas. Este transporte de GABA se realiza
mediante proteínas transportadoras de alta afinidad denominadas GATl a GAT4
(Guastella y col., 1990; Liu y col., 1993), las cuales son dependientes de la temperatura.
Poseen además, un requerimiento absoluto de Na+ extracelular y una dependencia
adicional de Cl' (Iversen y Kelly, 1975; Mabjeesh y col., 1992).
2.- CLASIFICACIÓN DE LOS RECEPTORES GABAÉRGICOS
El GABA liberado al espacio sináptico puede unirse a tres clases distintas de
receptores, denominados GABAA, GABAB y GABAc. Las diferencias entre ellos residen
en una serie de parámetros como ser estructura, propiedades farmacológicas,
conductancia iónica y mecanismos de transducción asociados. Tomando en consideración
que el receptor GABAA es objeto de estudio de este trabajo, se lo describirá ahora
someramente y luego se hará una descripción mas detallada.
El receptor GABAA es un complejo heterooligomérico transmembrana que
pertenece a la superfamilia de los receptores asociados a canales activados por ligando,
IIIÏÍ'HI/lh '(‘l‘rlll
por lo cual se lo clasifica como un receptor de tipo ionotrópico (Johnston 1986;
MacDonald y Olsen 1994). La activación del receptor aumenta la conductancia del ion
cloruro, lo que produce una hiperpolarización de la membrana postsináptica en neuronas
maduras. Sin embargo, dado que los iones se mueven a favor del gradiente
electroquírnico, se han descripto casos normales -de neuronas de ratas neonatas
(Cherubini y col. 1991) y post-traumáticos (Fukuda y col. 1998; Schwartz-Bloom y Sah
2001), en los cuales la apertura del canal asociado al receptor GABAA produce una
despolarización de la membrana postsináptica producto de una salida de los iones Cl'.
El receptor GABAB es un heterodímero, donde cada subunidad presenta la
estructura típica de siete pasos transmembrana y un dominio intracelular de asociación a
proteína G (Marshall y col., 1999). Si bien la existencia de receptores homodimérícos
asociados a proteína G era conocida (Hebert y Bouvier, 1998), el receptor GABAB fue el
primero para el cual se describió la existencia de una forma fimcional como heterodímero
(Jones y col., 1998; White y col., 1998). Dado que ejercen su acción por intermedio de
segundos mensajeros, por activación de la adenilato cíclasa vía proteína G, se los clasifica
como receptores metabotrópicos. Los receptores GABAB se encuentran tanto en la pre
como en la postsinapsis, y funcionalmente se asocian con canales de K+ y de CaH
(Bowery 1993). La activación del receptor GABAB presináptico produce, directa o
indirectamente, una disminución de la conductancia de Ca++que conduce a una reducción
en la liberación de los neurotransmisores, mientras que el aumento en la conductancia de
canales de K+conduce a una hiperpolarización lenta de la membrana postsináptica (Kerr
y Ong, 1995).
Finalmente el receptor GABAC se encuentra asociado a un canal de Cl' al igual
que el receptor GABAA, por lo tanto es de tipo ionotrópico. Su estructura molecular
parece ser la de un homooligómero, formado por subunidades denominadas rho (p) las
cuales conforman el canal (Johnston 1996). Farrnacológicamente posee una respuesta
diferencial frente a los agonistas y antagonistas clásicos de los receptores GABAA y
GABAB (Johnston 1996; Cherubini y Stratta, 1997). Sin embargo, debido a sus
características moleculares, se ha propuesto clasificarlo como un subtipo especial de
receptor GABAA,como se detallará más adelante (Barnard y col. 1998).
La Tabla l resume los principales agonistas, antagonistas competitivos y no
competitivos del GABA en los diferentes subtipos de receptores GABAérgicos.
Tabla l: Farmacología de los diferentes receptores GABAérgicos.
GABAA GABA, GABAC
Agom'stas -GABA -GABA -GABA
-muscimol —ácidoB-(4-clorofenil).y. -ácido cis-4-aminocrotónico
-Ísoguvacina aminobutírico [(-)baclofen] [CACA]
-4,5,6,7-tetrahidroixozasol -ácido (iH-am¡no.3_(5_ -ácido trans-4-aminocrotónico
(5,4-crpiperidina-3-ol cloro-2-tietil) butanoico [TACA]
[THIP] -ácido 3-aminoprop"- - ácido trans-Z-aminometil
-ác¡do 3-aminopropán (met¡|)fosfinico ciclopropano carboxílíco
sulfónico [APS] [SKF 9754 l] [TAMP]-ácido imidazol-4-acético
-ácido B-hidroxi-y-amino-n
butírico
-p¡peridina-4-sulfonato
Antagom'stas -(+)bicuculína -faclofen -lsoguvacina
campetía'vos -gabazina [SR 9553 l] -saclofen -THlP
-(+)—B-hidrastina -2-hidroxi-saclofen -APS
-APS -ácido (l,2,5,6
-ácido 4-amino-3-(S-metoxi- tetrahidropiridín-4-il)
benzo[B]furán-2-il) butírico metilfosfónico [TPMPA]
-CGP 35348, 36742 y - ácido imidazol-4-acético
54625 - SR-9553l
Antagom'stas -pícrotoxína -no corresponde -picrotoxina
no -dihidropicrotoxina -dihidropicrotoxina
competitivos -petilentetmzol [PTZ] -TBPS
bloquean el
canal de Cl
-t—butiIbiclofosforotionato
[TBPS]
-penici|ina
-y-hexaclorociclohexano
‘Datos obtenidos a partir de: De Lorey y Olsen, 19-94,Mehta y Ticku 1999, y Korpi y col. 2%2, para los
ligandos del receptor GABAA; Bowery 1993, Ken y Ong l995 y Ong y Kerr 2000 para los Iigandos del
receptor GABAB; Johnston 1996 y Bormann 2000 para los ligandos del receptor GABAC.
3.- EL COMPLEJO RECEPTOR GABAé
3.1. Estructura molecular
Como se mencionara anteriormente, el receptor GABAA pertenece a la
superfamilia de canales iónicos activados por ligandos, dentro de la cual encontramos
además, el receptor nicotínico de acetilcolina, el de glicina y el de serotonina. Los
receptores pertenecientes a esta familia se forman por la combinación de cinco
subunidades (Unwin 1993), donde cada péptido presenta cuatro pasos transmembrana
(Unwin 1989). El segundo segmento transmembrana (TMZ) de cada subunidad,
contribuye a la formación del canal (figura 2 y 3), otorgándole el ambiente de
hidrofobicidad necesario para el pasaje de los iones. Esta familia presenta además la
característica de poseer múltiples variantes para cada subunidad, siendo el receptor
GABAA uno de los que presenta mayor número de variantes. En la actualidad se
considera que el complejo receptor GABAA es una glicoproteína heteropentamérica de
aproximadamente 275 kDa.
Extracelular
Figura 2: Modelo de una subunidad genérica del complejo receptor GABAA. Según este esquema eldominio extracelular amino-terminal presenta sitios putatívos de glicosilación (*) y un puente disulfuro(S-S). Los cuatro segmentos transmembrana (TMl-)4) presentan estructuras del tipo a-hélice, y entrelos dominios TM3 y TM4, existe un segmento intracelular que presenta distintos sitios factibles defosforilación. Tanto el extremo amino- (N,) como el carboxi-terminal (C,) se encuentran hacia la caraextracelular (Sacado de MacDonald y Olsen, 1994).
Figura 3: Modelo del complejo receptor GABAA. Seobservan las cinco subunidades, que conforman elreceptor y el canal. Cada dominio transmembrana serepresenta por un cilindro, numerado del 1 al 4 desde elextremo amino-terminal. (Sacado de MacDonald y Olsen,1994).
Las distintas subum'dades del receptor GABAA han sido clasificadas en clases e
isoformas de acuerdo al grado de similitud que presentan (Figura 4), el cual es de un 70 %
entre miembros de una misma clase y del 30 % entre clases (Korpi y col. 2002). De esta
forma se las clasificó como: (xl-(16,[31-34,yl-y4, 8, s, 1:, 6 y pl-p3 (Burt y Kamatchi 1991,
Barnard y col. 1998, Korpi y col. 2002). Las subunidades clasificadas como [34y y4, han
sido aisladas de cerebro de pollos (Bateson y col., 199la, Harvey y col., 1993). Cada uno
de estos genes, codifica para un polipéptido de aproximadamente 50 kDa de peso.
ir.
Originariamente la clasificación
de los distintos tipos de receptores
GABAérgicos se realizó basándose en
las características farmacológicas, por lo
que los receptores GABAC fueron
agrupados como un subtipo insensible a
bicuculina y baclofen (Drew y col.
1984). Sin embargo, la caracterización
, molecular de las diferentes clases eFigura 4: Arbol filogenético de las diferentessubunidades del receptor GABAA. Este árbol seconfeccionó según las secuencias obtenidas de larata, salvo el caso de 9 obtenida de ratón. Seincluyen las subunidades al del receptor de glicina(GlyRal) y a7 del receptor nicotínico paraacetilcolina (nAChRoc7) (Sacado de Korpi y col.2002).
isoformas, llevó al descubrimiento de
que los receptores GABAC eran
derivados de la combinación de
subunidades p únicamente. Por lo tanto
recientemente se ha propuesto clasificar
a los receptores GABAC como un subtipo de receptor GABAA (Barnard y col. 1998), ya
que las subunidades p por su estructura forman parte de la familia de subunidades de los
receptores GABAAa pesar de sus sitios regulatorios diferentes.
A la heterogeneidad otorgada por la variedad de subunidades existente, se suma la
evidencia de que los ARN mensajeros (ARNm) de algunas subunidades sufren un
procesamiento alternativo. Hasta la actualidad se ha encontrado que presentan
procesamiento alternativo las siguientes subunidades: a5 (Kim y col. 1997) donde se
originan tres mensajeros distintos, pero con secuencias de proteínas idénticas; a6 (Korpi y
col. 1994) aunque esta variante no presenta funcionalidad; BZ(Harvey y col. 1994) y B4
(Bateson y col. l991a) en pollos, las cuales fileron denominadas formas L y S (“Iong” y
“short” respectivamente), y difieren en unos pocos aminoácidos del bucle intracelular
ubicado entre TM3 y TM4; [33(Kirkness y Fraser 1993) en humanos, originando dos
variantes; yz de la cual se originan dos variantes, yZLy 723,presentando la primera un sitio
putativo de fosforilacíón (Whiting y col. 1990) y con distribución diferencial de ambas en
distintas áreas del cerebro (Glencorse y col. 1992).
A continuación se detalla una tabla con las principales características de algunas
de las clases e isoformas.
‘i.íflé'"ur¿.¿‘f¿-Je':‘:’í » ,
Tabla Il: Subunidades del receptor GABAA
Subunidad a B y 8 pNúmero de 6 4 4 l 3isoformas
Número de 2 (a5, a6) 3 (¡32, ¡33, l (72) 0 0variantes con [34)procesamientoalternativo
- Peso en kDa al 50-51 [3| 57 yl 45-51 S4 pl ?según SDS-PAGE a2 52-53 ¡3254-57 ‘Yz43-49 ¡o2?
a3 58-61 [3357 y; 43-46 p; ?a4 66-67 B4 ? 74 ?a5 53-55a6 57-58
-% de identidad 70 -80 70 -8O 70 -80 NC 70 -80aminoacídicaintrafamiliar-% de identidad 30-40 30-40 30-40 30-40 30-40aminoacídicainterfamiliar
-Sitios consenso de a4, a6: PKA, 131-64:PKA, y¡, 73: PTK ? pl, pz: PKCfosforilación PKC PKC, 72m: PTK,
CamKII PKC, PKA,CamKlI
CamKll, Proteína quínasa dependiente de Cazi-Calmodulina de tipo ll; PKA, Proteína quinasa A; PKC,Proteína quinasa C; PTK, Proteína Tirosina quinasa; ?, no conocido; NC, no corresponde. Modificado deMacdonald y Olsen, ¡994; Mehta y Ticku, ¡999.
Teniendo en cuenta que el complejo receptor GABAAes un heteropentámero y la
gran cantidad de clases, isoformas y variantes existentes para las subunidades del
receptor, podrían existir teóricamente infinitas clases de receptores GABAA, si fuera
posible una combinación libre entre cinco subunidades cualesquiera. Sin embargo se sabe
en la actualidad que debido a restricciones durante el ensamblado no cualquier
combinación es posible. Esto se hizo evidente estudiando la formación in vitro de
receptores homooligoméricos, donde subunidades como a. o yz nunca forrmn pentámeros
ni se expresan en membrana (Sieghart y col. 1999). En la mayoría de los casos en los
cuales se combinó la expresión de dos subunidades distintas, la formación de canales
heterooligoméricos, fue más eficiente. Sin embargo la eficiencia de formación file
dependiente de la combinación de subunidades elegidas para transfectar las células. Las
combinaciones aB fueron capaces de formar pentámeros activables por GABA, mientras
que las combinaciones ay, By, ale, Bm, am, yzn no (Verdoom y col. 1990; Angelottí y
Macdonald 1993; Whiting y col. 1997; Hedblom y Kirkness 1997). No existe aún
lil/H Il/{Ik'l ¡Mi!
información sobre la posible formación de pentámeros compuestos por subunidades a6,
[36, o 76.
Por todo esto, existe en la actualidad una gran cantidad de trabajos tendientes a
elucidar la estequiometría de los receptores GABAA nativos, con el objetivo de contestar
preguntas tales como (a) ¿en qué tipos celulares se expresan los diferentes ARNm?, (b)
¿Se pueden asociar todas las subunidades entre sí libremente?, (c) ¿Todos los tipos de
receptores formados se insertan en la membrana plasmática?, (d) ¿Son todos los
receptores formados fimcionales?. Existen reportes que indican que las subunidades am,
[32/3y y; coexisten en muchos receptores nativos (Stephenson y col., 1990; Khan y col.,
1993; Benke y col, 1994). Aún más, se sabe que dos isoforrnas diferentes de a (Araujo y
col., 1996), B (Li y De Blas, 1997) o y (Quirk y col., 1994) pueden colocalizar en el
mismo receptor. Se ha postulado que la configuración pentamérica más frecuente incluye
dos subunidades on,una B y dos y, ZaXBXZy,‘(Backus y col., 1993) o bien, dos a, dos [3y
una y, 20536,51x(Chang y col., 1996, Tretter y col., 1997; Sieghart y col. 1999).
En la caracterización de las subunidades que componen el receptor GABAA, así
como en el estudio de los sitios de unión de los distintos ligandos, una de las
metodologías utilizadas fue la técnica de supresión de diferentes genes (“knock-out”) en
ratones, de las distintas subunidades del receptor. La Tabla III, resume las características
observadas luego de la supresión de alguna de las principales subunidades. Este tipo de
trabajos conjuntamente con experimentos de mutaciones puntuales en las secuencias de
las diferentes subunidades, permitieron demostrar que las subunidades a y B son
necesarias para la unión de GABA (Schofield y col., 1987; Pregenzer y col. 1993),
sugiriendo que el sitio de unión estaría en un bolsillo ubicado en la interfase entre ambas
subunidades. Asimismo se identificó la subunidad B como esencial para la unión del
antagonista no competitivo t-butilbiclofosforotionato (TBPS) (Zezula y col., 1996). Del
mismo modo se postuló que las subunidades y, son necesarias para la unión de
benzodiazepinas, y que el sitio de unión se ubicaría en la interfase entre las subunidades 0L
y y (Wong y col., 1992). Por lo tanto, los receptores GABAAque contengan dos isoformas
de subunidades a tanto como y tendrían dos sitios de unión benzodiazepínicos en la
misma molécula receptora (Khan y col., 1996).
Tabla III: Fenotipos luego de la supresión de alguna subunidad del receptor GABAA.
Subunidad Características observadas
suprimida
a,¡ Animales viables y fértiles. Reducción >50% de la unión de GABA, BZD y
TBPS en la mayoría de las regiones del cerebro.
Niveles de receptores normales. Falta de efecto ansiolítico y miorrelajante del
DZ a bajas dosis.
Niveles de receptores normales. Sólo se observó falta de efecto miorrelajante
del DZ a altas dosis.
Disminución de un 20% en la unión de BZD, y en la inmunorreactividad para
¡32/3 Y 72
Reducción de un 20-40 % de todos los sitios de unión en el cerebro anterior.
Gran pérdida de la expresión de la subunidad 8 en el cerebelo.
[52 Animales viables, fértiles, con un aumento en la actividad locomotora.
Disminución de la unión de GABA, BZD y TBPS >50% en la mayoría de las
regiones del cerebro por pérdida de la expresión de la mayor parte de los
subtipos de receptor.
[33 El 90% muere dentro de las 24 horas, y la mayoría presenta hendidura de
paladar. En general muestran severa pérdida de receptores GABAA en todas
las regiones del cerebro. Los animales que sobreviven son fértiles pero no
amamantan las crías. Son hiperactivos, con déficits de aprendizaje y
epilepsia.
‘Yz Mueren dentro de las tres semanas post-nacimiento. Ausencia de respuesta al
DZ. La mayoría de los sitios de unión para BZD desaparecen, mientras que
los GABAérgicos son normales.
‘YJ Sin cambios neurológicos aparentes.
BZD: Benzodíazepinas; DZ: Diazepam; TBPS: t-butilbiclofosforotionato. Modificado de Korpi y col.,2002.
3.2. Farmacología del Receptor GABAA
La caracterización de las propiedades farmacológicas de los compuestos que
afectan la neurotransmisión inhibitoria GABAérgica es importante no solamente en el
campo de la investigación básica sino también por sus aplicaciones y proyecciones
clínicas. Numerosas patologías han sido correlacionadas con alteraciones en la
transmisión GABAérgica, como por ejemplo los estados epilépticos (Mulley y col. 2003);
en otros casos se ha visto que, si bien no es la causa primaria de la enfermedad, la
neurotransmisión inhibitoria también se ve afectada como en el caso de la enfermedad de
Parkinson (Calon y Di Paolo 2002) y corea de Huntington (Alberch y col., 2002).
El complejo receptor GABAApresenta, además del sitio de unión de GABA, sitios
de unión para barbitúricos, benzodiazepinas, neuroesteroides, anticonvulsivantes y etanol
entre otros. En el presente trabajo sólo se caracterizó la modulación de la unión de GABA
por un barbitúrico y un neuroesteroide, sin embargo describiremos brevemente las
características de los principales ligandos del receptor GABAA.
3.2.1 Barbitúricos
Estos compuestos han sido ampliamente estudiados debido a su relevancia
farmacológica como hipnosedantes y anticonvulsivantes. Desde principios del siglo
pasado se comenzaron a utilizar para inducir
O sedación y sueño, pero luego fueron desplazados
HN R por las benzodiazepinas ya que el uso de
o R barbitúricos presenta mayores riesgos deHN
o intoxicación por su bajo índice de seguridad, con el
Figura 5: Fórmula molecular genérica
de l’arb‘tmms-La name” de 105 dependencia física. Durante su utilización en lasustituyentes (R) detemunan algunaspropiedades farmacológicas de los clínica médica, se han descripto síndromes dediferentes barbitúrioos.
agregado de que conducen a tolerancia y
dependencia (Morgan 1990), retraso mental y
malformaciones en los recién nacidos de mujeres que habían ingerido estos medicamentos
durante su embarazo (Dessens y col. 2000, Holmes y col. 2001).
Los barbitúricos tienen una forma de acción bifásica ya que potencian el efecto del
GABA a bajas concentraciones (actúan como moduladores positivos), mientras que
pueden activar al receptor directa e independientemente de GABA a concentraciones más
altas (Rho y col. 1996). Su acción produce un aumento del tiempo medio de apertura del
canal de Cl" (Study y Barker, 1981; MacDonald y col., 1989). Se ha encontrado que la
subunidad a, influencia el grado de eficacia (pero no la afinidad) de la potenciación de
GABA inducida por pentobarbital a bajas concentraciones, mientras que a altas
concentraciones, dicha subunidad influencia no sólo la eficacia sino también la afinidad
de la activación directa del receptor GABAA(Thompson 1996). Las subunidades 8 y BI se
'r"':v‘.’;‘,; '''''' I «
han visto incrementadas luego del tratamiento crónico con pentobarbital (Lin y Wang
1996, Yin y Lee 1998).
3.2.2 Benzodiazepinas
A comienzos de la década de 1960 las benzodiazepinas (BZD) fiieron introducidas
por primera vez en la terapia clínica, como alternativa a los barbitúricos, por su alto índice
de seguridad. Si bien pueden utilizarse por sus efectos hipnóticos y sedantes, el uso
R principal de las BZD en la práctica clínica actual estáI R . . . ,
Ní orlentado al tratamiento de la an51edadas1 como enR terapias anticonvulsivantes y de relajación muscular.
Su principal sitio de acción se encuentra en el
receptor GABAA (Chang y col., 1981, Paul y col.,
1981). Este sitio de unión es en realidad un sitio
modulatorio alostérico de la unión de GABA, y es elFigura 6: Fórmula molecular de13 mayoría de las que media los efectos producidos por estas drogas sobrebenzodiazepinas. La naturaleza . . .de los sustituyentes (R) la neurotransmi51ón GABAérglca. (Haefely, 1989).determinan el tipo de BZD.
Originalmente se reconoció un solo sitio de unión para
las BZD, pero el desarrollo de nuevos compuestos con estructura diferente de las BZD
clásicas (como por ejemplo algunas B-carbolinas e imidazopiridinas como el zolpidem)
que desplazan a las BZD de manera bifásica, permitieron la caracterización de un
segundo sitio de unión con afinidad diferente (Lippa y col., 1981; Sieghart, 1983). Se los
denominó subtipos BZD I y BZD II, del complejo receptor GABA/BZD. Además de estos
dos sitios de unión se describieron otros sitios de unión para benzodiazepinas en varios
tejidos no nerviosos, con propiedades farmacológicas claramente diferentes de los
receptores BZD “centrales”, los cuales fileron designados receptores BZD “periféricos”
(Davies y Huston, 1982). Estos receptores no están asociados con ningún subtipo de
receptor GABA, y la caracterización molecular de dichos sitios receptores condujo a la
identificación de una pequeña proteína que está asociada con la membrana mitocondrial
(Verma y Snyder, 1989) y que se ha encontrado también en el SNC, por lo cual se ha
sugerido dejar el término “periféricos” de lado (Barnard y col., 1998).
El mecanismo de acción de las benzodiazepinas es el de producir un aumento en la
frecuencia de apertura del canal de Cl' sin variar el tiempo de apertura (Study y Barker,
1981; MacDonald y col., 1989). Este efecto es siempre dependiente de la presencia de
GABA (MacDonald y Barker, 1978). El sitio de unión benzodiazepínico puede mediar
dos efectos modulatorios opuestos, uno facilitatorio, en el cual participan agonistas y otro
depresor, producido por agonistas inversos de las funciones del canal de Cl'. Existe
asimismo un espectro muy amplio de ligandos del sitio receptor benzodiazepínico (Figura
7), los cuales van desde compuestos con una eficacia intrínseca positiva máxima
(agonistas totales del receptor benzo-diazepínico), todo tipo de eficacias positivas
parciales (agonistas parciales), sin eficacia intrínseca (antagonistas), varios grados de
eficacias intrínsecas negativas parciales (agonistas inversos parciales) a compuestos con
eficacias negativas totales o máximas (agonistas inversos totales) (Haefely, 1989).
Se ha determinado que las benzodiazepinas se unen a la subunidad ocdel complejo
receptor (Wieland y col., 1992), mientras que la subunidad y es necesaria para transmitir
la activación al sitio de unión de GABA (Günther y col., 1995.).
Espectro de ligandos del sitio de unión benzodiazepínicoAGONISTAS AGONISTAS ANTAGONISTAS AGONISTAS AGONISTASTOTALES PARCIALES INVERSOS INVERSOS
PARCIALES T0 TALES
"ok :“crx ¿“a :"“a;e35«ai:RMS-4513midazolam ROIG-6028 RolS-l788
Sitio deunión BZD
Figura 7: Representación del espectro de ligandos con diferentes eficaciaspositivas o negativas en el sitio de unión de las benzodiazaepinas, y suinteracción alostén'ca con el sitio de unión de GABA. La eficacia depende dela composición de subunidades del receptor GABAA(Sacado de Bamard ycol., 1998).
3.2.3 Neuroesteroides
El término neuroesteroide (NE) fue utilizado por primera vez en el año 1987 (Le
Goascogne y col., 1987) para referirse a una serie de esteroides que se sintetizaban en el
SNC a partir de colesterol, independientemente de fiientes exógenas, y que ejercían una
modulación de las funciones cerebrales. Actualmente esta denominación se ha hecho
extensiva a cualquier esteroide que se sintetice en el SNC (Mellon, 2001). Conjuntamente
al concepto de neuroesteroides, se utiliza también el de esteroides neuroactivos (EN) para
referirse a todo esteroide con actividad biológica en el SNC, independientemente de si ha
sido generado o no en el tejido neural. Existen EN que no son NE pues provienen de otras
fuentes tisulares, como por ejemplo los metabolitos de la deoxicorticosterona, con fiJnción
demostrada en el SNC (Majewska y col., 1986) y con origen en las glándulas adrenales.
La definición de EN alcanzaría también a todo esteroide sintético con acción demostrada
en el SNC, lo que permite incluir una serie de conocidos anestésicos sintéticos, como por
ejemplo la alfaxalona (5a-pregnan-3a-ol-l1,20-diona, Harrison y Simmonds, 1984). Un
resumen de las principales vías de síntesis de NE en el SNC puede ser encontrada en
Mellon y col. del 200]. La sintesis de NE se ha demostrado en forma específica tanto en
neuronas (Tsutsui y col., 2000) como en células gliales (Jung-Testas y col., 1989),
habiéndose identificado la mayoría de las enzimas necesarias para la producción de los
distintos NE observados (revisado en Jung-Testas y col., 1999 y Mellon, 2001).
La modulación ejercida por los NE está dada por un aumento de la afinidad de los
agonistas de los sitios receptores GABA y benzodiazepínicos (Majewska y col., 1986;
Pignataro y col., 1996; Viapiano y col., 1998). También reducen la unión del antagonista
GABAérgico bicuculina y el convulsivante TBPS (Gee y col., 1988) y aumentan la
captación de Cl' en preparaciones de sinaptoneurosomas (Purdy y col., 1990). El aumento
de conductancia producido se debe a un incremento en el tiempo de apertura del canal
(Barker y col., 1987; Peters y col., 1988), mientras que a concentraciones mayores, los
NE también aumentan la fi'ecuencía de apertura del canal (Barker y col., 1987). A
concentraciones muy altas, al igual que los barbitúricos, pueden producir una apertura del
canal de Cl' en forma independiente de la presencia de GABA (Barker y col., 1987).
Existen también NE que modulan negativamente al receptor GABAA, entre ellos
los más importantes son la pregnenolona sulfato y la dehidroepiandrosterona sulfato,
disminuyendo la unión específica de los agonistas GABAérgicos y produciendo una
inhibición de la neurotransmisión (Majewska y col., 1990; Demirgoren y col., 1991).
Molecularmente no se ha llegado aún a una definición de la subunidad o
subunidades del receptor que podrían contener los sitios de unión de los NE (McKernan y
Whiting, 1996). Los NE en general interactúan con receptores GABAA formados por
subunidades [32solamente o por combinación de a1, [3| y y; (Puia y col., 1990., Puia y
col., 1993). La modulación de la acción del GABA por NE depende de la presencia de
una subunidad B pero no de y como las BZD y, por otro lado, se ha encontrado que el
cambio de una subunidad yl por yz aumenta la sensibilidad a los esteroides neuroactivos
(Puia y col., 1990). Por otra parte la presencia de subunidades 5 y s inhiben la modulación
de los receptores GABAA por NE (Zhu y col., 1996; Davies y col., 1997), mientras que la
isoforrna a presente, parece no jugar un rol relevante en la eficacia o en la potencia de los
NE como moduladores positivos (Puia y col., 1993).
3.2.4 Etanol
El etanol comparte varias acciones farmacológicas con las benzodiazepinas y los
barbitúricos y muchos de sus efectos son mediados por el receptor GABAA. Se ha
sugerido que la sensibilidad al etanol se correlaciona con la presencia de los sitios de
unión BZD I, así como también con la existencia de las subunidades ou, [52y yz (Criswell
y col., 1993). Sin embargo, el mecanismo de potenciación inducido por el etanol sobre el
receptor GABAA, aún no es claro. Diferentes estudios han demostrado variaciones en la
susceptibilidad al efecto potenciador del etanol en diferentes áreas cerebrales, lo cual
podría deberse a la heterogeneidad del receptor (Grobin y col., 1998.). El etanol no ejerce
efectos dramáticos en ninguno de los sitios de unión del receptor (Korpi, 1994), aunque la
unión de TBPS si se ha visto afectada, pero sólo en alta concentración de etanol
(Liljequist y col., 1986).
4.- EL ESTADO HIPÓXICO
El estado hipóxico consiste en una reducción de la disponibilidad de oxígeno por
parte de las células, resultando en una alteración del metabolismo celular y las
propiedades de membrana. La falta de oxígeno es un tipo de ‘stress’ que se encuentra en
todos los grupos de vertebrados. Los más adaptados a resistir la anaerobiosis son los
miembros de algunos grupos de peces y tortugas, los cuales son capaces de resistir
períodos de anoxia 1000 veces mis largos que las especies sensibles a la hipoxia. (Ultsch
y Jackson, 1982). En algunos vertebrados los procesos hipóxicos están principalmente
restringidos a un período del desarrollo, como puede ser el nacimiento en primates,
mientras que en otros grupos es un fenómeno diario asociado con el buceo o el vuelo a
gran altura. Es así que los procesos de hipoxia han sido estudiados principalmente en el
¡Hum/m r im;
período perinatal-neonatal, ya que son una de las principales causas de mortandad en
individuos recién nacidos (Jensen, 2002; Grafe y Kinney, 2002; Sanchez y col., 2001).
4.1. Alteraciones del SNC en condiciones de hipoxia
A nivel de la transmisión nerviosa, la hipoxia experimental aumenta la liberación
de aminoácidos neurotransmisores (Hagberg y col., 1987; Cataltepe y col., 1996; Rego y
col., 1996; Saransaari y Oja, 1998), causando un desbalance en la actividad normal de las
neuronas GABAérgicas y glutamatérgicas, lo que resulta en excitotoxicidad celular
(Lombroso, 1996). El SNC es especialmente sensible a injurias del tipo hipóxico
isquémicas durante el período perinatal, lo cual se asocia a diversas patologías como ser
pérdida de proyecciones nerviosas (Mallard y col., 1995), aumentada sensibilidad a
injurias posteriores (O’Reilly y Haddad, 1996), mayor susceptibilidad a estados
convulsivos (Jensen y col., 1991; Applegate y col., 1996) y apoptosis (Hill y col., 1995;
Oo y col., 1995; Walton y col., 1997).
El período perinatal representa una ventana temporal caracterizada por variaciones
dinámicas en la estructura y función tanto de neuronas como de células gliales. Las
observaciones clínicas así como los resultados obtenidos con modelos animales revelan
que el proceso de desarrollo del cerebro continúa y va en aumento en el momento del
nacimiento. Sin embargo, existen evidencias de que los factores que controlan este
desarrollo también hacen al cerebro más susceptible a ciertos tipos de injurias. Las dos
patologías más frecuentemente observadas durante este período son: la leucomalacia
periventricular, en general asociada a nacimientos antes de tiempo (Volpe, 2001a, 2001b)
y encefalopatías hipóxicas en recién nacidos (Hauser y col., 1993). Ambas patologías
pueden ser causadas por hipoxia o isquemia y resultar en déficit neurológico a largo
plazo, del tipo neurocognitivo o epiléptico (Bergamasco y col., 1984). Hasta el momento,
no existen estrategias terapéuticas para ninguno de ambos desórdenes.
Existen numerosas evidencias que asocian la liberación excesiva de glutamato y la
muerte celular luego de procesos isquémicos (Lipton, 1999). En este sentido, el mayor
esfuerzo se ha puesto en encontrar drogas con acción neuroprotectora que bloqueen la
neuronansmisión glutamatérgica. Sin embargo, no han surgido hasta la actualidad
antagonistas glutamatérgicos efectivos debido a problemas farmacocinéticos, toxicidad, y
efectos colaterales de los fármacos ensayados (Lees, 1997), así como también a la falta de
eficacia (De Keyser y col., 1999). Si bien existen otros neurotransmisores que juegan un
rol importante en la muerte neuronal inducida por procesos hipóxico-isquémicos, el
sistema GABAérgico puede ser uno de los más importantes, por sus fiinciones opuestas a
las del glutamato.3m]
g GABA Sorprendentemente el rol de laC m ' ' - n , ¡9 - Glamato neurotransmision GABAerglca en0fl . . .
% dichas cond1c10nes no se encuentraJ .:- profiindamente estudiado, en'O . .
-2 espec1al Sl se lo compara con el
número de trabajos relacionados al
glutamato (figura 8). Más
Figura 8: Númerode trabajospublicadosen los últimos Importante aun es el hecho de que
años hallados en la Biblioteca Nacional de Medicina muchas de las drogas que modulan(http://www.ncbi.nlm.nihgov/entrez) cruzando laspalabras ClaVCSI[hipoxía 0 isquemia Y GABA] 0 la neurotransmisión GABAérgica,[hipoxia o isquemia y glutamato].
ya han sido probadas y utilizadas en
la clínica médica en otros tratamientos (ansiedad, convulsiones, etc.) y se conocen sus
posibles efectos colaterales. Por esto resulta muy atractivo hoy en día ver las alteraciones
producidas en la neurotransmisión inhibitoria con el objetivo de encontrar drogas que
puedan ser neuroprotectoras y aplicables en procesos hipóxicos o isquémicos.
Si bien la mayor parte de los procesos excitotóxicos parecen estar principalmente
mediados por los receptores glutamatérgicos (Meldrum y Garthwaite, 1990), en la
actualidad existen evidencias de muerte celular excitotóxica mediada por
neurotransmisores inhibitorios (Erdó y col., 1991; Chen y col., 1999). Se ha postulado
que luego de una injuria de tipo isquémica el potencial de equilibrio del ión cloruro,
cambia a valores más positivos que el potencial de reposo de la membrana, lo cual induce
al receptor GABAAa mediar una despolarización. Esta hipótesis ha sido demostrada en
experimentos in vitro donde se determinaron los niveles del ión Cl' luego de una isquemia
(Jiang y col., 1992; Inglefield y Schwartz-Bloom, 1998). Que el receptor GABAA actúe
mediando una despolarización no fue sorprendente ya que había sido descripto
previamente para neuronas jóvenes en las cuales las concentraciones del ion cloruro a
ambos lados de la membrana plasmática están invertidas respecto de lo que se encuentra
en neuronas maduras (Obata y col., 1978; Ben-Ari, 2002).
4.2. Factores inducibles por hipoxia
Los organismos multicelulares complejos (como por ejemplo los vertebrados) han
desarrollado un sistema para captar (branquias o pulmones), transportar (sangre) y
distribuir (sistema cardiovascular) el oxígeno. La presión parcial del oxígeno es en sí
misma la principal encargada de regular la homeostasis de dicho gas. Muchos procesos
involucrados en la homeostasis del oxígeno son mediados por factores inducibles por
hipoxia (HIF), los cuales son factores de transcripción que regulan a nivel transcripcional
la expresión de varias docenas de genes. Es así, entonces, que los HIF representan el
punto de conexión entre los sensores de oxígeno y los efectores celulares. Con el tiempo
se descubrió que los sensores de los niveles de oxígeno son un grupo de proteínas con
función prolil-hidroxilasas, que hidroxilan el factor HIP-la. favoreciendo su degradación
en presencia de oxígeno (Masson y col., 2001; Yu y col., 2001).
El primer factor inducible por hipoxia se encontró estudiando el gen de la
eritropoyetina y recibió el nombre de HIF-l (Semenza y Wang, 1992). Estudios
posteriores revelaron que varios factores interactuaban con una porción del ADN,
denominada elemento que responde a hipoxia (HRE, Bunn y Poyton, 1996; Semenza,
1999) y que uno de ellos lo hacía sólo luego de la exposición a un estado hipóxico. Con el
tiempo, se fueron descubriendo nuevos genes que presentan la secuencia HRE, y que
responden luego de una reducción en los niveles de oxígeno, sugiriendo que este
mecanismo es parte de un amplio sistema de censado de oxígeno y posterior transducción
de señales. Hoy en día, los genes identificados que responden a hipoxia han sido
agrupados en tres categorías principales que son:
a) relacionados al transporte de oxígeno: eritropoyesis y metabolismo de hierro
(por ejemplo la eritropoyetina, la transferrina y su receptor);
b) relacionados al transporte de oxígeno: regulación vascular (por ejemplo el
factor de crecimiento del endotelio vascular y su receptor, la sintetasa de óxido nítrico
inducible y el receptor adrenérgico am);
c) relacionados al metabolismo anaeróbico: captación de glucosa y glucólisis (por
ejemplo el transportador de glucosa-l, la fosfofi'uctoquinasa-L y la lactato
deshidrogenasa-A).
Asimismo existen algunos pocos genes regulables por 02, que no entran en
ninguna de estas categorías (por ejemplo el retrotransposon VL3O y la propil-4
hidroxilasa a del colágeno). La descripción completa de estos genes puede encontrarse en
Wegner 2002.
5.- MODELO DE TRABAJO
5.1. La vía visual de las aves
En todos los vertebrados, el mesencéfalo o cerebro medio realiza el nexo entre los
componentes sensoriales, motores y asociativos del cerebro posterior con los del cerebro
anterior. El mesencéfalo comprende tres grandes regiones, el tectum, el tegmentum y el
istmo. Una de las características distintivas del tectum es que recibe proyecciones
topográficamente organizadas de los sistemas visual, auditivo y somatosensorial, los
cuales forman mapas del espacio sensorial del animal. Una segunda característica es la
presencia del núcleo intrínseco a la región a
través del cual pasan tractos de fibras
ascendentes y descendentes (Butler y
Hodos, 1996).
El tectum contiene estructuras
laminadas, particularmente el tectum óptico
y el torus semícularís. En mamíferos estas
Figura 9: Esquema representativo de las dos estructuras son llamadas colículoprincipales estructuras encefálicas en las aves,vista lateral. Se representa un estadio tempranodel desarrollo, en el cual los LO son másprominentes (en . les adultos quedan (Butler y Hodos, 1996). En las aves elmuChOmásalmenos P0rel cerebelo) tectum óptico se encuentra más desarrollado
superior y colículo inferior respectivamente
anatórnicamente, formando dos grandes estructuras globulares a ambos lados de la línea
media del encéfalo (figura 9), cubiertas parcialmente en el animal adulto por los
hemisferios cerebrales y por el cerebelo (La Vail y Cowan, 1971). El lóbulo óptico (LO)
es llamado así debido a que recibe la mayor parte de las aferencias del tracto óptico que es
la continuación central del nervio óptico formado por los axones de las células
ganglionares de la retina. A diferencia del colículo superior de mamíferos, donde cada
uno recibe un número similar de aferencias provenientes de ambos ojos, cada LO de las
aves recibe la mayor parte de las aferencias del ojo contralateral (De Long y Coulombre,
1965, Crossland y col., 1974, O'Leary y col., 1983).
5.2. Neurotransmisión GABAérgica en el lóbulo óptico
Los lóbulos ópticos son una de las estructuras con mayor proporción de sinapsis
GABAérgicas en el SNC de las aves (Dietl y col., 1988; Granda y Crossland, 1989). Hunt
y Künzle inyectaron [3H]GABA en el LO y caracterizaron tres poblaciones de neuronas
de acuerdo a la captación inicial y transporte de este neurotransmisor. El primer sistema
tiene sus somas neuronales en la lámina i del estrato gris y fibroso superficial con sus
axones atravesando el estrato óptico y terminando en el pretectum y el tálamo ventral. Las
dendritas ascendentes y axones colaterales de estas neuronas arborizan en la lámina f del
estrato gris y fibroso superficial. La segunda población de neuronas que se marcó con
[3H]GABA se localizó en la lámina c con dendritas dirigidas local y superficialmente y un
axón dispuesto en forma radial y profunda del cual se origina un sistema importante de
axones colaterales. Esta subpoblación fue tentativamente identificada como las neuronas
estrelladas vistas en la tinción de Golgi. La tercer población de neuronas fue identificada
dentro de la lámina d, orientada en forma horizontal (Hunt y Künzle, 1976).
Diversos trabajos han demostrado que el tipo de receptor que principalmente se
encuentra en los LO es el complejo receptor GABAA, lo cual ha sido demostrado
mediante ensayos de unión de [3H]muscimol (Batuecas y col., 1987) o radioautografia
con [3H]flunitrazepam (Dietl y col., 1988). Asimismo, una serie de estudios han
demostrado la importancia de las neuronas GABAérgicas en el funcionamiento de los
circuitos locales de los LO (Michler, 1990; Diaz de Barboza y col., 2003). La presencia
de receptores GABAA (Flores y col., 1986; Ríos y col., 1987), así como de la enzima
biosintética del GABA, GAD (Sisken y col., 1961; González y col., 1990), han sido
demostradas en distintos tipos de preparaciones de LO a lo largo del desarrollo
ontogenético. Asimismo, durante el desarrollo embrionario, se ha comprobado la
aparición de heterogeneidad en los sitios receptores GABAérgicos, debida a la presencia
de un único sitio de unión en los primero días embrionarios, y de dos poblaciones de
sitios receptores -de alta y baja afinidad- a partir del día embrionarioló (Flores y col.,
1986). La unión de GABA a sus sitios receptores y la actividad de la enzima GAD
alcanzan su pico máximo en el período postnatal, sugiriendo que la maduración sináptica
continúa un tiempo más después de la eclosión, cuando los contactos neuronales ya se han
establecido (Flores y col., 1983).
Los receptores GABAAen el LO presentan asimismo sitios de unión de BZD cuyo
curso de desarrollo durante la ontogenia también ha sido determinado, mediante estudios
Mirna/m r ¡rr/I
con BZD marcadas radioactivamente (Batuecas y col., 1987; Gravielle y Fiszer de Plazas,
1991). El día de la eclosión (dia embrionario 21) corresponde al momento en el cual se
alcanza el máximo número de sitios receptores a BZD (Gravielle y Fiszer de Plazas,
1991). Estos sitios modulatorios presentan heterogeneidad durante el desarrollo,
habiéndose demostrado la existencia de dos poblaciones de sitios receptores a BZD a
partir del nacimiento (Gravielle y Fiszer de Plazas, 1995). Estos sitios receptores a BZD
ejercen una modulación sobre los sitios receptores GABAérgicos (Fiszer de Plazas y
Mitridate de Novara, 1990), tal como se ha observado en otros modelos, presentando un
claro perfil edad-dependiente de dicha modulación.
Los resultados alcanzados hasta el presente sobre los sitios receptores a GABA y
BZD muestran cómo las propiedades bioquímicas de los receptores GABAA varían en el
LO de las aves durante el desarrollo ontogenético estando estas variaciones
correlacionadas con estadios de desarrollo y procesos de maduración neuronal
específicos.
5.3. Morfología del lóbulo óptico
El tecturn óptico es una estructura laminar que presenta altemadamente capas
celulares y plexiformes. Ramón y Cajal numeró 15 estratos en el LO comenzando por el
estrato óptico superficial (Ramón y Cajal, 1911). La manera de clasificar la estratificación
que surge durante el desarrollo puede ser desde la zona ventricular hacia la periferia (La
Vail y Cowan, 1971), o bien en orden de aparición cronológico (Scicolone y col., 1995).
Las láminas que se pueden identificar en el LO de un animal adulto (figura lO), de
la periferia hacia el ventrículo son las siguientes (entre paréntesis, se muestra la
numeración propuesta por Ramón y Cajal):
I. Estrato óptico (l): es la más superficial de todas, y está formada principalmente
por los axones mielinizados que vienen de las células ganglionares de la retina
contralateral.
ll. Estrato gris y fibroso superficial: es una capa heterogénea que presenta cinco
láminas celulares (a, c, e, g, i) y cinco láminas principalmente plexiformes (b, d, f, h, j).
Lámina a (2): es una banda muy estrecha de células con forma estrellada sin
orientación definida de unos 10-15 um de ancho.
Intrm/m-cío’n —BJ
Lámina b (3): está prácticamente libre de células y consiste en los procesos
dendríticos de las capas superficiales y más profundas y fibras de la retina que pasan a
través de ella.
Lámina c (4): esta es una capa celular prominente con neuronas agrupadas
que posee dos tipos celulares principales.Manila“
EO Células pequeñas con dendritas que asciendení a la lámina b y axones que descienden a
Z láminas más profimdas y células de tamaño
E medio con dendritas horizontales o
i"Í ¡GPS descendentes que van a las láminas e y f.Lámina d (5): contiene fibras del
i estrato óptico y la lámina c, además de
dendritas apicales de las células piriformes.
j Lámina e (6): es una capa de una o dos
células de espesor cuyas células piriformes
están agrupadas con sus dendritas ascendiendo
EGC hasta la lámina c y sus axones descendiendo a
capas más profundas.
EAC Lámina f (7): además de las dendritas
de las láminas vecinas esta capa contiene
EGP principalmente los axones de las fibras de la
gp retina que se bifurcan a este nivel y siguenhorizontalmente en esta lámina.
a,7; . y “¡IW Lámina g (8): es la capa más profiinda
Egg: dleoímcï’ágïgiïgü‘:ggmuï°m a la que llegan fibras de la retina, además,
aEdsItlrlïc;ímïnïzamsïgal; contienecélulascon dendritasascendentesyEstrato Gris Central;EGFS: Eslrato Gris .y axones descendentes así como células
53:0E5533; estrelladascondendritasramificadas.Epéndimm Lámina h (9): es una capa celular
grande con neuronas piramidales o fiisiformes y células multipolares grandes con
dendritas profusamente ramificadas.
Lámina i (10): es la lámina celular más grande del LO de unos 300 um de
espesor con dos tipos de neuronas; unas de tamaño mediano orientadas horizontalmente y
otras fusiformes.
Lámina j (12): las células que contiene son parecidas a las de la lámina i,
además de presentar células estrelladas y poseer un aspecto radial estriado.
Ill. Estrato gris central (13): consiste mayormente en una población homogénea
de neuronas multipolares grandes.
IV. Estrato alba central (14): compuesto primariamente por axones tectales
eferentes, sistemas aferentes y una población dispersa de neuronas multipolares grandes.
V. Estrato gris periventricular (15): ima capa celular que se ubica mayormente
en la región dorsal y está compuesta principalmente por células estrelladas.
VI. Estrato fibroso periventricular: son axones tectales eferentes que rodean al
epitelio del ventrículo.
Por último está el epitelio ependirnario que rodea al ventrículo.
5.4. Desarrollo del lóbulo óptico
El desarrollo embrionario del lóbulo óptico puede dividirse en tres fases
principales (La Vail y Cowan, 1971):
lnl Fase 13 a 6 días de incubación): Es el período de máxima proliferación celular,
con un pico en el día 5. Es un neuroepitelio pseudoestratificado, con los núcleos celulares
dispuestos en varias capas; la proliferación progresa rápidamente y decae en estos días,
sin embargo, algunas células de la región ventricular continúan su división hasta el día
embrionario (DE) 12.
2d“Fase (6 a 12 días de incubación): Durante la segunda semana de incubación el
proceso de estratificación comienza a medida que un gran número de células
diferenciadas migran verticalmente del neuroepitelio hacia las meninges. El desarrollo de
la estratificación no es parejo, sino que la porción cefálica está siempre adelantada en
cuanto a diferenciación celular respecto de la porción caudal. Esto genera una polaridad
rostro-caudal. Durante el período de migración el grosor del LO aumenta cinco veces, de
200 um en el DE 6 a l mm en el DE 14. Hasta el DE 12, el LO es independiente de las
influencias tróficas del ojo pero, a partir del día 12 ó 14, la deaferentación unilateral
produce atrofia progresiva en esta estructura.
3ra Fase 112 a 18 días de incubación): Crecen las células de todas las capas y se
completa la diferenciación citoarquitectónica del LO. Entre los días 17 y 18 ocurre el
período crítico para las conexiones provenientes de la retina y otras conexiones sinápticas.
Los primeros registros en el LO, en respuestas a estirnulaciones de la retina, se obtienen
en el día l7 pero recién el día 18 pueden ser evocados consistentemente y con mayor
amplitud. No está claro si esta latencia en la respuesta es debida a un retardo en el
desarrollo de la retina o si es una indicación precisa del momento en que se establecen los
contactos fimcionales entre las fibras de la retina y las células del LO. Lo que es
importante notar es que sólo cuando el desarrollo citoarquitectónico del LO está completo
se obtienen las respuestas funcionales definitivas.
gang
a.
¡oo-cl
EGPS
¡ZAC
Figura ll: Ilustración esquemática del proceso de laminación del lóbulo óptico representado como unproceso dinámicoy continuode segregaciónde compartimentoscelulares transitorios.A: Adulto;Compartimento; CCT: Compartimiento Celular Transitorio; DE: Día Embrionan'o; EAC: Estrato AlbaCentral; EFP: Estrato Fibroso Periventn'cular; EG: Estrato Germinativo; EGC: Estrato Gris Central;EGFS: Estrato Gris y Fibroso Superficial; EGP: Estrato Gris Periventricular; EO: Estrato óptico; Ep:Epéndírno; P: Postnatal; RN: Recién Nacido; ZG: Zona Generativa; ZsV: Zona Subventlicular; ZV: ZonaVentn'cular. (Sacado de Scicolone y col., 1995)
A pesar de que esta división en fases propuesta por La Vail y Cowan termine
arbitrariamente en el DE 18, el crecimiento y la maduración de las células del LO
continúa hasta los primeros días del período postnatal, como puede verse en la figura 11.
OBJETIVOS
El objetivo general del presente trabajo fire diseñar un modelo de hipoxia en aves y
caracterizar las alteraciones producidas en la neurotransmisión inhibitoria en la vía visual
de las aves.
Los objetivos específicos fueron:
l-. Diseñar una cámara hipóxíca hermética que permita realizar una hipoxia hipóxíca
aguda en embriones de aves, en condiciones normales de presión, temperatura y humedad
de incubación de los huevos. Los únicos parámetros modificados fireron las proporciones
de oxígeno (8%) y nitrógeno (92%) de la atmósfera de la cámara de incubación.
2-. Validar el modelo de trabajo por determinación de cambios en los niveles de
lactato como marcador de hipoxia, en cerebro de embriones de pollo.
3-. Caracterizar si se producen alteraciones bioquímicas durante el desarrollo
embrionario en el complejo receptor GABAA en el lóbulo óptico de aves como
consecuencia del tratamiento hipóxico.
4-. Determinar si la hipoxia produce alteraciones en la acción de drogas modulatorias
del complejo receptor GABAA, tales como un neuroesteroide (alopregnanolona) y un
barbitúrico (pentobarbital sódico).
5-. Estudiar posibles cambios producidos por el tratamiento hipóxico en la actividad
del canal de cloruro asociado al receptor GABAA,activado sólo por GABA y modulado por
alopregnanolona o pentobarbital sódico.
6-. Caracterizar la expresión de los ARN mensajeros de las subunidades al, a2, [32y
yz del complejo receptor GABAAdurante el desarrollo normal y luego de la hipoxia.
MATERIALESYm'ronos
l.- ANIMALES Y TRATAMIENTO HIPÓXICO
Se utilizaron embriones de pollos libres de todo patógeno, de la especie Gallus
gallus domesticas, pertenecientes a la raza White Leghom. Los embriones fueron
colocados en una incubadora Franken (fabricación nacional), sin iluminación -excepto
durante su manipulación- a una temperatura constante de 37°C y una humedad ambiente
aproximada del 60%. El volteo automático de los huevos se realizó cada hora, a fin de
permitir un correcto desarrollo de las membranas extraembrionarias (Tazawa, 1980).
La cámara estuvo hecha de plexiglás y a la misma se le incorporaron una boca de
entrada para perfiindir la mezcla de gases deseada, y dos bocas de salida. Una con una
llave para permitir la salida de un flujo abundante de gas (durante el lavado de un minuto
del aire normóxico de la cámara), y otra con una válvula que permite la salida del gas en
exceso cuando la presión interna de la cámara es levemente superior a la atmosférica,
durante el tratamiento hipóxico de 60 minutos. La cámara fire colocada dentro de la
incubadora para tener la temperatura de incubación adecuada (37 °C) con un reservorio de
agua para mantener una humedad relativa del 60%.
En diferentes días embrionarios los huevos fueron colocados en una cámara
plástica con una capacidad aproximada de 10 litros, herméticamente sellada. Dicha
cámara se ubicó dentro de la incubadora manteniendo las mismas condiciones de
temperatura, humedad y presión de incubación. Durante un lapso de un minuto se
perfundíó la cámara con un flujo de 20 l/min de una mezcla de 02 al 8 % y N2 al 92 %,
con las válvulas de escape de gases abiertas, para permitir el lavado del aire normóxico
existente en la cámara. A continuación se redujo el flujo a l l/min, se cerraron las válulas
y se realizó el tratamiento por una hora. El escape del gas en exceso se produjo por una
válvula de retención que permitió la salida del mismo sin la entrada de aire atmosférico, y
sin aumento de la presión interna en la cámara hipóxica. Asimismo un reservorio con
hidróxido de calcio (Rodríguez & Vidal SRL., Bs.As. Arg.) se colocó dentro de la cámara
para absorber el C02 formado durante el tratamiento y así impedir su posible
acumulación.
Luego del tratamiento hipóxico los animales fireron procesados para los estudios
bioquímicos o moleculares o bien dejados en un ambiente normóxico para su
recuperación. Los embriones que sirvieron como controles fiJeron aquellos que no
pasaron por la cámara de hipoxia.
2.- ENSAYOS BIOQUÍMICOS
2.1. Reactivos
Los ligandos radioactivos ácido 4-amino-[2,33H(N)]-butírico ([JH]GABA), con
una actividad específica (AE) de 85-95 Ci/mmol y el H[3°Cl] con una AE de 13,37 mCi/g
fiJeron adquiridos a New England Nuclear, Boston, MA., EEUU.
Los moduladores GABAérgicos pentobarbital sódico (PB) y alopregnanolona (3a
hidroxi-Sa-pregnan-ZO-ona; 3a,5a-P) así como el ácido y-aminobutírico (GABA) y la
picrotoxinina fueron adquiridos a Sigma Chemical Co., St. Louis, MO., EEUU.
Los demás reactivos utilizados en las soluciones de trabajo, fueron adquiridos con
el mayor grado de pureza analítica disponible. En la preparación de las diferentes
soluciones se utilizó agua bidestilada.
2.2. Preparación de membranas sinápticas
Inmediatamente luego del tratamiento hipóxico, los embriones fueron sacrificados
por decapitación, y las cabezas fueron colocadas en hielo para la remoción de los lóbulos
ópticos (LO). Desde aquí todos los pasos se realizaron a 4 °C.
La preparación de membranas sinápticas se llevó a cabo de acuerdo con el
procedimiento descripto por De Robertis y col. (1962), adaptado según Fiszer de Plazas y
Mitridate de Novara (1990). Los LO fueron homogeneizados al lO % p/v en sacarosa 0,32
M, pH 7,4. El procedimiento se realizó en frío en un homogeneizador Potter-Elvehjen de
vidrio con émbolo de teflon en giro moderado (Homogeneizador Tri-R Instruments,
Modelo K4], EEUU, velocidad de giro aproximada 1.500 rpm) durante un minuto. El
homogenato se centrifiigó a 900 g durante lO minutos para sedimentar núcleos, fibras y
restos celulares. El sobrenadante file aspirado cuidadosamente y se centrifugó a 12.000 g
durante 20 minutos. El sobrenadante obtenido se aspiró y descartó, mientras que el
sedimento fiJe resuspendido al 10% p/v en agua bidestilada con pH 7,4 y centrifugado
nuevamente a 20.200 g por 30 minutos. Este último paso denominado “shock” osmótico
produce la ruptura de los sinaptosomas y además una masiva remoción del GABA
llz'IIH/H‘x —3
‘l/¡ÍÏL'Í‘Í'lÍ/le-l. llrllllz/JH
endógeno (McCabe y col., 1987). En el procedimiento de fi'accionamiento subcelular se
utilizó una centrífuga refrigerada Sorvall RCSC (EEUU).
El sedimento final obtenido es una fi'acción mitocondrial enriquecida en
membranas sinápticas. Con el objetivo de remover GABA y otros posibles factores
endógenos, la preparación de membranas sinápticas fue sometida a 3 ciclos de lavado,
mediante resuspensión al 10 % p/v en Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, y posterior
centrifiigación a 100.000 g durante 30 minutos (ultracentrífugas refrigeradas Beckman
modelos L5 y L8, EEUU), seguido de un paso de congelación en suspensión en la misma
solución a -20 °C, hasta el día de uso. En todos los casos, el tiempo mínimo de
congelación fiJe de 48 horas, y en ningún caso se utilizaron para los experimentos tejidos
de más de 20 días de antigüedad desde la preparación de las membranas (Viapiano,
1998).
2.3. Ensayos de unión de radioligando
El día del ensayo de unión de radioligando se descongeló la suspensión y se
realizaron dos lavados con Tn's-HCl 50 mM, pH 7,4 y centrifugación a 100.000 g durante
30 minutos. Todos los pasos detallados a continuación se realizaron a 4 °C. Los
sedimentos finales de cada preparación fueron resuspendidos a una concentración de
proteínas de 400-500 ug/ml, en solución de Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, conteniendo 50
mM de KC], para aumentar el efecto de los moduladores (Viapiano, 1998). El tiempo, la
temperatura de incubación y las concentraciones de las distintas drogas fueron
previamente puestos a punto en nuestro laboratorio (Fiszer de Plazas, 1982). Alícuotas de
membranas fueron incubadas en tubos de polipropileno con [3H]GABA por un lapso de
15 minutos. El volumen final de incubación fiJe de 0.6 ml. Para realizar mediciones en la
población de sitios GABAérgicos de baja afinidad se utilizó una concentración final de
GABA 100 nM. Esta concentración se alcanzó mediante la mezcla de [3H]GABA como
trazador y GABA frío -aportando masa-.
Con el objetivo de determinar la unión inespecífica se preincubaron las muestras
de membrana con l mM de GABA durante 15 minutos previamente al agregado de
[3H]GABA. Los diversos moduladores ensayados (pentobarbital sódico y
alopregananolona) fueron agregados a las muestras de membranas 5 minutos antes del
[3H]GABA. El PB fue preparado por disolución en agua bidestilada a temperatura
l,‘4//¡‘¡','7.//.xy llum/m
ambiente, para evitar su cristalización en agua fría. El neuroesteroide alopregnano lona fire
disuelto en etanol absoluto.
Entre cuatro y seis réplicas se hicieron en cada ensayo, y un mínimo de tres
determinaciones independientes se realizaron para cada experimento.
El ensayo de unión se terminó aplicando una técnica convencional de
centrifirgación, descripta originalmente por Enna y Snyder (1975). Luego de la
incubación, las muestras se precipitaron en una centrífuga refiigerada Sorvall RCSC
(EEUU) en un rotor Sorvall SM24 de ángulo fijo a 20.800 g por 10 minutos, para separar
las fiacciones de radiolígando unido (sedimento) y libre (sobrenadante). El sobrenadante
fue aspirado por vacío y el sedimento fire lavado superficialmente con l ml de solución de
Tris-HCl, 50 mM, pH 7,4 en fiío.
Los sedimentos fireron disueltos con 200 ul de un solvente comercial (Solvable,
fórmula NEF 910, New England Nuclear, EEUU) durante toda la noche en estufa a 37 °C.
Se les agregó luego 3 ml de un líquido de centelleo comercial (Fórmula 989, New
England Nuclear, EEUU) y después de dos horas en oscuridad -para eliminar el efecto de
fluorescencia- la radioactividad retenida fire medida en un contador de centelleo líquido
(Tracor Analytic serie 6892, EEUU) con una eficiencia de 25 a 30 %.
La unión específica de [3H]GABA a sus sitios receptores fire calculada como la
diferencia entre la radioactividad retenida en presencia de [3H]GABA solo (unión total)
menos la radioactividad retenida en presencia del exceso de GABA frío (unión
inespecífica).
2.4. Determinación de los parámetros cinéticos de los sitios receptores
Los parámetros cinéticos determinados para las poblaciones de sitios receptores
GABAérgicos fueron: el número máximo de sitios de unión (Bmx) y la constante de
disociación aparente (Ka). Para ello se realizaron ensayos de saturación, por
desplazamiento de [3H]GABA con concentraciones crecientes de GABA frío. Para el
estudio exclusivo de la población de sitios de unión de baja afinidad el rango de
concentraciones de GABA fire de 20 a 600 nM, mientras que para el estudio de las
poblaciones de sitios de unión de alta y baja afinidad el rango utilizado fire de 2,5 a 600
nM.
Los resultados obtenidos en cada ensayo de saturación, fireron sometidos a un
análisis de regresión no lineal (Leatherbarrow, 1990), utilizando el programa Prism
l/l!/i’/'Í1//i‘\ _1' l/llliH/IH -
(GraphPad Sofiware Inc., San Diego, CA, EEUU). Los resultados experimentales se
ajustaron de acuerdo a las siguientes funciones, tal cual como vienen incluidas en el
programa Prism:
Para una población de sitios receptores:
Bmax. [L]
= Kd +[L]
B= unión de radioligando, pmoI/mgproteina[L] =cancentración total del radioligando, nMBmax= máxima capacidad de unión,pmol/mgproteinaKd= constante aparente de disociación, nM
Para dos poblaciones de sitios receptores:
_ Bmaxl.[L] i Bmax2.[L]Kdl +[L] T Kd2+[L]
B y L representan lo mismo que en la ecuación anterior. Los parámetros de las dos poblaciones de sitiosreceptores son respectivamente (Bmarl, Kdl) y (Bmax2, KdZ)
Los valores obtenidos para cada parámetro fire el promedio de al menos tres
determinaciones experimentales independientes, cada una de ellas medida como mínimo
por cuadruplicado. En las figuras pertenecientes a los ensayos de saturación se incluyen
los gráficos obtenidos luego de la transformación lineal de Scatchard, según la siguiente
ecuación:
É Bmax lKira-E
El análisis de Scatchard no se utilizó en la estimación de los parámetros cínéticos
dado su mayor error (Klotz, 1982; Leatherbarrow, 1990). El mismo se utilizó para ilustrar
gráficamente los resultados por ser mucho más claro para mostrar una o varias
poblaciones de sitios receptores. En el caso de tener más de una población de sitios
receptores, la curva de saturación presenta una forma hiperbólica similar a la curva de
saturación que presenta una única población de sitios receptores (Bürgisser, 1984;
McGonigle y Molinoff, 1989). En donde correspondiese, para confirmar que el modelo de
dos sitios de unión ajustaba mejor que el de un único sitio, los datos obtenidos de los
ensayos de saturación fiieron sujetos a análisis estadísticos para curvas de uno y dos
componentes. El resultado obtenido para el modelo de dos sitios de unión fue considerado
mejor cuando, el ajuste por minimización de la suma de cuadrados para las distancias
l/ili’L’l'Íil/r’s >]' “(VIH/(IK
relativas de los puntos con la curva, fue significativamente menor que el obtenido para el
modelo de un solo sitio (test de F incluido en el programa Prism, considerando un
P<0,05)
En aquellas condiciones en las que fueron reveladas dos poblaciones de sitios
receptores, los parámetros cinéticos fiJeron reajustados mediante un análisis
computarizado aplicando algoritmos iterativos (Feldman, 1972), para considerar el aporte
de cada población de sitios receptores sobre la otra. Este ajuste es necesario aun cuando
se considere a las dos poblaciones como independientes, debido a que el trazador marca a
ambas poblaciones simultáneamente. La omisión de este ajuste lleva a resultados
sesgados, obteniéndose un sitio de baja afinidad con afinidad sobreestirnada y uno de alta
afinidad con mayor capacidad de unión que la real.
2.5. Ensayo de captación de cloruro
Siguiendo el método desarrollado por Allan y Harris (1987), los microsacos se
obtuvieron por disección de los LO y posterior homogeneización al 30% en buffer de
ensayo frío (NaCl 145 mM, KCl 5 mM, MgClz l mM, D-Glucosa 10 mM, CaClz l mM,
HEPES 20 mM, ajustado a pH 7,4 con Tris básico). Se utilizó un homogeneizador Potter
Elvehjen de vidrio con émbolo de teflon en giro moderado (Homogeneizador Tri-R
Instruments, Modelo K4], EEUU) aplicando solamente seis movimientos suaves. El
homogenato se centrífiJgó a 1000 g por 15 min., y el sedimento se rehomogeneizó y
centrifugó como en el primer paso. El sedimento se resuspendió en buffer de ensayo y
alícuotas de 200 ul conteniendo de 1,5 a 2 mg de proteínas, se incubaron por 15 min. a 30
°C antes de la adición de 200 pl de una solución conteniendo 0,5 pCi de 36Cl' y
concentraciones variables de GABA. Luego de 3 seg., la reacción se terminó por dilución
de la mezcla de reacción con 4 ml de buffer fi'ío conteniendo picrotoxinina 100 uM
(bloqueante del canal de cloruro del receptor GABAA)e inmediata filtración por vacío a
través de filtros de microfibra de vidrio (Whatman GF/C), preabsorbidos con
polietilenimína 0,05% para disminuir la unión no específica. Los filtros se lavaron dos
veces con 4 ml de buffer frío conteniendo picrotoxinina (disuelta previamente en etanol),
se dejaron secar y la radioactividad se determinó en un contador de centelleo líquido
(Tracor Analytic serie 6892, EEUU) considerando una eficiencia del 100%. La captación
basal de 36cr se determinó en ausencia de GABA, y se definió la captación dependiente
l— 1
‘li
de GABA como la captación total para cada concentración de ligando menos la captación
basal.
2.6. Determinación del efecto de distintos moduladores sobre la unión
de [JHIGABA a sus sitios receptores
Para determinar el efecto de los distintos moduladores estudiados se realizaron
curvas de concentración-efecto, con una concentración fija de [3H]GABA, siendo la
concentración final de GABA de 100 nM y concentraciones variables del modulador
utilizado. Cada punto de un gráfico fue el promedio de cuatro determinaciones
experimentales independientes, cada una de ellas medida al menos por cuadruplicado.
La representación gráfica de los resultados fue ajustada por análisis computarizado
evaluando en todos los casos la presencia de uno o dos sitios modulatorios, los cuales
producen curvas de concentración-efecto con un doble plateau. Para ello se ajustaron los
datos a las siguientes funciones, tal cual como vienen incluidas en el programa Prism
(Viapiano, 1998):
Para una población de sitios modulatorios:
Emax —Emin
Y= Em'" + l +1oaog EC50 —x).n
Y= efecto obtenido, % de variación sobre el control.Emax: máximo efecto obtenido, % de variación sobre el control.Emin: mínimo efecto obtenido.EC50= concentración de ligando que produce la mitad del máximoefecto.x= log de la concentración del Iigando.n= coeficiente de Hill.
Para dos poblaciones de sitios modulatorios:
(Emax + Emin).fracl + (Emax + Emin).(l —fracl)l +10(log EC50_1—x) l +10(log EC50_2 —x)
Y= Emin+
fi'acl = representa lafracción de sitios correspondientea una de las poblaciones.(l -fracl) = representa lafracción de sitios correspondiente a la otra población.EC50_l y EC50_2: EC50para cada una de las dospoblaciones de sitios.El resto de los parámetros se identifican igual que en la ecuación anterior.
Para determinar si la curva que mejor ajustaba a los datos era la correspondiente a
uno o dos sitios modulatorios se aplicó un test F incluido en el programa Prism
(comparando las sumas de cuadrados de ambas curvas de regresión), considerándose
“(h’i’l‘ÍII/(W >I' Wi'er/IH e Ñ.
mejor el ajuste cuando el modelo de dos sitios arrojó un resultado significativamente
menor (P<0,05).
2.7. Determinación de los niveles de lactato
Inmediatamente después del tratamiento hipóxico, los embriones fiJeron
sacrificados por decapitación, y el cerebro completo, o bien los LO fueron removidos y
congelados en hielo seco. Se descongelaron en hielo y se homogeneizaron en buffer
fosfato 50 mM con NaCl 150 mM (PBS), pH 7,4. Se centrifugaron a 100.000 g por 30
minutos, y la concentración de lactato se determinó en los sobrenadantes de acuerdo al
método de F. Noll (1974), utilizando el kit comercial Lact (Boehringer Mannheim). Cada
muestra se determinó por duplicado.
2.8. Determinación de proteínas
En todos los casos, el contenido de proteínas de las fracciones utilizadas se
determinó por el micrométodo colorimétrico de Lowry y col. (1951) usando seroalbúmina
bovina como standard. La absorbancia de la preparación a 750 nm se midió en un
espectrofotómetro Men‘olab325BD (Argentina).
2.9. Análisis estadísitico de los resultados.
Las comparaciones estadísticas de los resultados se realizaron mediante test t de
Student o ANOVA de l vía con test a posteriori según fiJera requerido. Para las pruebas
de bondad de ajuste se aplicó el test F comparativo, incluido en el programa Prism. En
todos los casos se asumió como significativo un valor P<0,05. En la sección de resultados
se indica en cada caso qué análisis estadístico se aplicó.
Todo el análisis estadístico o de ajuste de curvas se realizó utilizando el siguiente
programa comercial: Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), y algoritmos
diseñados ad hoc para aplicación de ajustes según método de Feldman (Viapiano, 1998).
W
3.- ENSAYO DE HIBRIDACIÓN IN SITU
3.]. Reactivos
El dATPa[3SS] con una AE de 1250 Ci/mmol fue adquirido a New England
Nuclear, Boston, MA., EEUU.
Los oligonucleótidos de secuencia específca para cada subunidad del receptor
GABAA fueron adquiridos a Genset Corp., La Jolla, CA, EEUU.
Todos los reactivos utilizados fiJeron adquiridos a Sigma Chemical Co. (St. Louis,
M0,, EEUU), con excepción de: enzima deoxínucleotidil transferasa terminal (TdT) y su
buffer 5X correspondiente adquiridos a Promega (Promega Corp., Madison, WL, EEUU).
Todas las soluciones utilizadas fueron pretratadas con Dietilpirocarbonato (DEPC)
para inactivar ribonucleasas y posteriormente esterilizadas en autoclave.
La película autorradiográfica BioMax MR, la emulsión NTB3, los reveladores
(GBX y D-l9) y los fijadores utilizados para revelar la marcación radioactiva fueron de
Eastman Kodak Co. (Rochester, NY, EEUU), adquiridos por intermedio de Sigma
Chemical Co. (St. Louis, MO., EEUU).
3.2. Oligonucleótidos utilizados.
Los oligonucleótidos empleados fueron complementarios a las secuencias de los
ARNm específicos de pollo o, complementario a la secuencia de rata, que previamente
demostró reacción crmda con el pollo (Ho y col., 2001). Los oligonucleótidos utilizados
reconocen ambas variantes de procesamiento alternativo de las subunidades beta 2 (BZLy
[325)y gama 2 (yu y 'yzs).A continuación se detalla cada uno:
Subunidad Secuencia Nucleótidos que reconocereconocida
al 5’_l I Iuouu lAAUl lu l mom, ¡356-1400 del ARNm de polloTCTATCGTTGCACTTTTAGCAA _3’ (Bateson y col., l99 l)
a2 S’_TCTCTGGCTÏCTTGÑTGGTTCT ¡2374283 del ARNm de rata (Ho Y
GGAGTAGTTGCACTTTTGGAAA_3’ COL,200])
Bz 5’_GCTCCTAGGUILLLLAAGCCCCA l370-l4l4 del ARNm de polloTCACAGCCTCAGAGGCAGCCAT _3’ (Harvey y co|., l994)
Y: S’_CATTTGAATAGTACGTGATCGAG l820-l864 del ARNm de polloGTCGGATGTCAATTGTGGGTGC _3’ (Glencorse y col., l990)
3.3. Obtención de los cortes.
Los embriones fueron sacrificados por decapitación, las cabezas congeladas sobre
hielo seco y guardadas a —70°C hasta su procesamiento. Las cabezas fueron cortadas en
criostato a —l7 °C, siguiendo el eje mayor de los LO con un grosor de 25 um. Se
recolectaron solamente los cortes que presentaban el ventrículo para garantizar la
presencia de todas las láminas del LO. Los cortes se montaron en portaobjetos
esmerilados recubiertos con Poly-L-Lisina (0,1 mg/ml) y se dejaron secar a temperatura
ambiente. En cada portaobjeto se colocaron dos cortes (quedando así cuatro LO por
porta).
Los cortes se fijaron a 4 °C en parafomialdehído al 4 % con agitación por 5 min.,
se lavaron dos veces en PBS 1X (NazHPO4 7 mM, NaI-lzPO43 mM, NaCl 130 mM) a
temperatura ambiente durante 2 min., se deshidrataron por pasaje por etanol al 75 y 100
% y se dejaron secar a temperatura ambiente. Los cortes se guardaron sumergidos en
etanol absoluto a 4 °C, hasta el día de uso.
3.4. Marcación de los oligonucleótidos
Los oligonucleótidos fueron resuspendidos en agua mili-Q tratada con DEPC a
una concentración final de 5 pg/ml, y a partir de ella se hizo una alícuota de 5 ng/ml que
se utilizó en los ensayos. Ambas soluciones se guardan a —20°C.
A partir de acá todo el trabajo se realizó tras una protección de acrílico, para evitar
la exposición a la radioactividad. La marcación se realizó mezclando 20 pCi de
[3SS]dATP,20 ng del oligonucleótido correspondiente, 15 unidades de la enzima TdT,
1,25 pl buffer 5X correspondiente y agua DEPC en cantidad suficiente para completar
12,5 pl. El volumen de [358]dATP a utilizar en cada experimento, se calculó teniendo en
cuenta el tiempo de decaimiento del isótopo radioactivo, según la siguiente ecuación:
DF1 1-DF
[(AEr)_( 1498 )]
AEt =
AE! = Actividad especifica en el día del experimento (pCi / ,ul).DF = Factor de decaimiento. Relativo al tiempo que pasó respecto del día de calibración del radioisótopo.AEr = Actividadespecifica del día de calibración del radioisótopo.
La mezcla se incubó por 90 min. a 35 °C y la reacción de marcación se frenó por
el agregado de 40 pl de agua DEPC a temperatura ambiente. Luego se agregaron 52,5 pl
de fenol saturado en cloroforrno: alcohol isoamílico (25:2421), se agitó y se dejó reposar 5
min. a temperatura ambiente. Se centrifugó a 12.000 g durante 2 min. y la fase superior se
sembró en una columna de Sephadex G-SO para separar el oligonucleótido marcado del
radioactivo libre. Se centrifugó a 4 °C por 2 min. a 1000 g en una centrífirga refrigerada
Sorvall RCSC (EEUU) en un rotor Sorvall GSA de ángulo fijo.
El eluído se colectó, se midió el volumen y se determinó la radioactividad de dos
alícuotas en un contador de centelleo líquido (Tracor Analytic serie 6892, EEUU) luego
del agregado de 3 ml de un líquido de centelleo comercial (Fórmula 989, New England
Nuclear, EEUU), considerando una eficiencia del 100 %. Se calculó la AE de la sonda
0011101
dpm totalesAE (dpm/pg) = x 1000
20 ng oligo
dpm totales = dpm en el volumen total eluído.
Se utilizaron aquellas sondas que presentaron una AE entre 0,5 - 2 x109 dpm/pg
(Wisden y col., 1991). A continuación se procedió a preparar la mezcla de hibridación
según los siguientes cálculos:
Vr= (200 pl de mezcla por porta + 10% de error) x N° portas
Vf= Es el volumentotal de mezcla de hibridación a preparar para cada sonda.
Mezcla hibridación = buffer hibridación + sonda + DTT 1M + ADNsc
Bufler hibridación = cantidad suficiente para completar el Vfcalculado previamente.Sonda = cantidad suficientepara tener ¡,5 xl 06dpm/ 200 ,ulsolución de hibridaciónDTT lM = se agregaron 20 pl de DTT l M cada I m1de solución de hibridaciónADNsc = se agregaron 82,5 pl de ADN de esperma de salmón simple cadena (hervidopor ¡0 min.) cada I
ml de solución de hibridación.
La composición del buffer de hibridación fire: formamida 50 % (v/v); citrato de
sodio 60 mM con NaCl 0,6 M (SSC 4X); solución de Denhardt 10X; buffer fosfato de
sodio 25 mM, pH 7; ADN de esperma de salmón hidrolizado 200 pg/ml; DTT 20 mM;
ácido poliadenílico 100 ug/ml; pirofosfato tetrasódico l mM; heparina 120 ug/ml y
dextran sulfato sódico 10 % (p/v). Se conservó a 4 °C en oscuridad.
3.5. Hibridación y revelado
Se sacaron los cortes del etanol absoluto y se los dejó secar en la mesada. Se
colocaron 200 ul de la mezcla de hibridación sobre los portaobjetos, se los cubrió con una
película plástica (Parafilm) y se los dejó toda la noche en cámara húmeda a 42 °C. Se
lavaron los portaobjetos con solución SSC 1X con DTT l mM, para retirar las películas
plásticas y se los sumergió en una solución igual a la antedicha en baño térmico con
agitación a 55 °C por 30 min. Se lavaron dos veces con solución SSC IX y 0,1X, se
deshidrataron por pasajes por etanol al 70 y 100 % y se los dejó secar a temperatura
ambiente.
Los cortes y la película BioMax MR se colocaron en un cassette de exposición,
durante una semana, y se reveló la placa autorradiográfica con el revelador y fijador
GBX. Los cortes se sumergieron entonces en la emulsión NTB3, se mantuvieron en
oscuridad a 4 °C por 4 semanas y se revelaron con D-l9. Se les realizó una coloración de
contraste con Cresyl violeta, se deshidrataron por pasajes por etanol creciente, se
aclararon con xilol y montaron con bálsamo sintético.
3.6. Procesamiento y análisis digital de las imágenes
Las imágenes de las placas autorradiográficas se obtuvieron y analizaron
utilizando el programa MCID-Ml V4.2 Rev.l.0 (Imaging Research lnc., Broch
University, St. Catharines, Ontario, Canadá). Los cortes fireron observados en un
microscopio Axiophot (Zeiss) y las imágenes, obtenidas con una cámara de video
conectada en línea con un analizador de imágenes Vidas-Kontron.
Para cada subunidad estudiada, se realizaron entre 4 y 8 determinaciones
independientes. Para minimizar las posibles diferencias entre las hibridaciones cada
determinación incluyó al menos un portaobjeto con cortes control y uno con cortes
provenientes de embriones hipóxicos de cada día embrionario. Las mediciones se
realizaron sobre 2-3 campos en cada capa del LO solamente en la porción cefálica del
mismo. Las diferencias entre los LO derecho e izquierdo no resultaron significativas, por
lo cual se procedió a tormr la media de ambos para cada corte.
Para la cuantificación microscópica las mediciones se realizaron en la porción
cefálica de los cortes. El número de granos por célula marcada fue contado manualmente
pero sin considerar un área determinada. Para cada día embrionario y subunidad se
l/zi/Hi'lzl/rW V!‘l/r'lm/Hx -v
contaron 100 células (marcadas o no). Se graficaron los histogramas de frecuencia y
luego se calculó la media y el error estándar considerando solamente aquellas células que
presentaron marcación, lo cual file analizado estadísticamente. Asimismo se cuantificó el
número de células marcadas / lO4pmz. Dado que el corte en criostato puede desgarrar el
tejido, se consideraron solamente aquellos cortes en los cuales el número total de células
por unidad de superficie era igual.
3.7. Análisis estadístico de los resultados
Las comparaciones estadísticas de los resultados se realizaron mediante test t de
Student o ANOVA de 1 vía con test a posteriori según fuera requerido. En todos los
casos se asumió como significativo un valor P<0,05. En la sección de resultados se indica
en cada caso qué análisis estadístico se aplicó. Todo el análisis estadístico se realizó
utilizando el siguiente programa comercial: Prism (GraphPad Software lnc., San Diego,
CA).
RESULTADOS
1.- PUESTA A PUNTO DEL MODELO
1.1. Diseño de la cámara hipóxica
El cálculo de los parámetros que se detallan a continuación se realizaron con el
objetivo de asegurar que ninguna de las variables fuera limitante durante los 60 minutos
del tratamiento hipóxico.
El flujo de perfiisión de la cámara se calculó sobre la base de una serie de
conceptos teóricos. La capacidad total de la cámara es de 9384 cm3 (24 cm x 34 cm x
11,5 cm). Si dicha cámara se llena con aire normóxico (N2 = 78,09%; 02 = 20,95%;
C02 = 0,03%; gases raros < 1%) 1970 cm3 serán de 02. Horby y col. (Hnrby y col. 1983)
demostraron que el consumo de 02 de un huevo es de 9 ml/h en el día embrionario (DE)
12 y de 23 ml/h en el DE 18. Considerando un estadio embrionario con máximo consumo
como el DE 18, un huevo tardaría 85,7 horas en consumirse todo el oxígeno de la cámara.
Para recambiar ese oxígeno consumido en ese tiempo, habría que pasar un flujo de aire
normóxico de (9384 cm3 / 85,7 h) = 109,5 cm3/h. Teniendo en cuenta que la capacidad
máxima de la cámara es de 40 huevos, el flujo mínimo debería ser de 4380,8 cm3/h = 73
cm3/min. para una cámara llena con huevos embrionados. Con el objetivo de estandarizar
las condiciones para todos los estadios embrionarios, y para asegurar que en el curso del
experimento (60 min.) la concentración de 02 no varía, se fijó el flujo de aire perfundido
en 1000 cmS/min., lo cual asegura que en condiciones normales (normoxia) el
requerimiento mínimo de 02 de un estadio con
máximo consumo está cubierto en exceso.
Dicho flujo fue determinado midiendo el
volumen de agua desplazado por unidad de
tiempo. Para ello se armó un dispositivo como
el que muestra la figura 12, dónde se hizo
burbujear el flujo de aire en una probeta llena
__ELI_F¡ra 122DÍSPOSÍÍÍVOutilizado Para medir de agua, invertida, y colocada en un recipienteel flujo de aire. Vi: Volumen inicial; t¡: _ _’ Otiempoinicial;Vf:Volumenfinal; tf: tiempo con agua. Se Inlle el volumen de líqu1dofinal.
desplazado por unidad de tiempo.
/\)z'\ll/./:[(ÍN"
Si bien el flujo de aire se encuentra en exceso, para evitar un posible aumento en
la concentración de C02 se agregó a la cámara un reservorio de hidróxido de calcio que
tiene la capacidad de captar moléculas de dicho gas. La cantidad de hidróxido de calcio
agregado, se obtuvo a partir de una serie de consideraciones teóricas. Se consideró que el
cociente respiratorio (C02 producido / 02 consumido) de un huevo es de uno. En el DE
18 se producirían 23 cm3 COzlh (0,023 l COzlh). Para conocer el número de moles
correspondientes a ese volumen primero debemos llevarlo a las condiciones normales de
presión (P) y temperatura (T) aplicando la ley universal de los gases:
P1.Vl_P2.V2T1 _ T2
Consideramos que la presión dentro de la cámara durante el experimento es de 1,1
atm (lo cual es un valor exagerado, pero útil a fin de obtener un máximo teórico de C02
producido). En condiciones normales de P y T (CNPT)vale que:
1,1atm . 0,023 IC02_l arm . V2 :> V2 = 0.02228 ¡COz310K 273K
Para cualquier gas, en CNPT vale que:
22,4 l l mol
0,02228 ICO; 1,018 x 10'3moles C02
Lo cual equivale a 0,0448 g de C02. Como en la cámara se pueden colocar hasta
40 huevos la máxima producción sería de 1,79 g COZ/h. El hidróxido de calcio atrapa del
25 al 35% de su peso de C02. Si consideramos que capta sólo un 25% se necesitaría
agregar 7,17 g de Ca(OH)2 en el reservorio. Con el objetivo de que el reservorio de
Ca(OH)2 no fuera limitante se agregaron 30 g. Además, el Ca(OH)2 utilizado, contiene un
indicador colorimétrico que varía su color cuando se satura con coz, y esto nunca ocurrió.
El tiempo de tratamiento file determinado experimentalmente, siendo 60 minutos
el máximo tiempo al cual el 100 % de los embriones continuaban con vida, ya que
tiempos mayores produjeron una alta tasa de mortandad.
1.2. Validación del modelo
Es sabido que los niveles de lactato se encuentran normalmente elevados luego de
un proceso isquémico o hipóxico (Broniszewska-Ardelt y Skorska, 1979; Rehncrona y
col., 1981). Considerando que¡
se trata de un modelo
experimental novedoso paral.
producir una hipoxia, lo
primero que se hizo fueLactato
(umoles/mgproteína)
p
determinar los niveles de0.
lactato en un homogenato totalControl Hipoxia
Figura 13: Aumento en los niveles de lactato en homogenato de cerebro luego del
de cerebro total luego de la hipoxia Cada columnarepresenta tratamiento La figura 13la media i error standard de la media (ESM) de cincodeterminaciones independientes. **: Diferencia significativa muestra que luego de la hipoxiarespecto del control mediante test t de Student, P<0,01.
se produce un aumento de un
125 % en los niveles de lactato respecto del control (control: 0,492 i 0,125; hipoxia:
1,108 2|:0,161 umoles lactato / mg de proteína, P< 0,01).
Cuando la cámara se perfundió por 60 minutos con aire normóxico, el nivel de
lactato de los embriones colocados en la cámara, se mantuvo invariable respecto del nivel
de lactato que presentan los embriones que no fueron colocados en la misma. Es por ello
que a partir de aquí, el término control se aplica a aquellos embriones que no fueron
sometidos a ningún tipo de tratamiento, y fueron sacados directamente de la incubadora
sin pasar por la cámara.
2.- ALTERACIONES PRODUCIDAS POR EL TRATAMIENTO
HIPÓXICO
2.1. Efecto del tratamiento hipóxico sobre el receptor GABAAdurante
el desarrollo embrionario del lóbulo óptico de pollo.
Con el objetivo de caracterizar las alteraciones que se producen en el receptor
GABAA luego del tratamiento hipóxico, se realizaron estudios de unión de ligando en
sucesivos estadios embrionarios. Como puede observarse en la figura 14, cuando se
utilizó una concentración final de GABA de 100 nM los días embrionarios más tempranos
estudiados presentaron una sensibilidad mayor al tratamiento (DE 12, 14 y 16), lo cual se
manifestó como una mayor reducción en los niveles de unión del radioligando. El DE 18
no mostró cambios en los niveles de unión de GABA respecto de su control, mientras que
los niveles de unión del radioligando en el DE 17 fiieron intermedios entre lo observado
enel DE 16y 18.
Día Embrionario
12 14 16 17 18
J.el
control(%) ¿ael
Cambioenlauniónde[3H]GABArespectodel
-30
Figura 14: Disminución en la unión de [3H]GABA en el lóbulo óptico en desarrollo luegodel tratamiento hipóxico. Las comparaciones entre control e hipoxia se realizaron entreembriones en el mismo estadio de desarrollo y se graficó el porcentaje de variación. Cadacolumna representa la media i ESM de cinco determinaciones independientes realizadaspor cuadruplicado. **: Significativamente diferente del control del mismo DE,determinado por ANOVA de una vía y post-test de Tukey (P<0,01).
2.2. Tratamiento hipóxico en el DE 12: caracterización farmacológica
y bioquímica del receptor GABAA
Los estudios subsiguientes se realizaron siguiendo dos líneas de pensamiento. Por
un lado, caracterizar más detalladamente qué ocurría en el DE 12, y por otro estudiar a
qué se debían las diferencias observadas durante el desarrollo embrionario. El DE 12, que
se corresponde con el estadio 38 según la clasificación de Hamburger (Hamburger y
Hamilton 1951) fue elegido debido a que para entonces la membrana corion-alantoidea se
encuentra totalmente desarrollada (Ackerman y Rahn, 1981). Dicha membrana es la que
utiliza el embrión para intercambiar gases con el medio ambiente, y la tasa de intercambio
de 02 es máxima desde el DE 12. A partir del DE 17, debido al crecimiento del embrión
sin el desarrollo paralelo de la membrana corion-alantoidea, se produce un estado de
hipoxia fisiológica (este tema será ampliamente considerado en la discusión).
En el DE 12 se determinaron las constantes cinéticas (Bmx: máximo número de
sitios de unión y Kd: constante de disociación) del receptor GABAAmediante ensayos de
saturación de ligando.Como se demostró anteriormente (Flores y col., 1986.) en el DE 12
solamente se halla presente el sitio de baja afinidad, y como muestra la figura 15 la
reducción observada previamente en el DE 12 en la figura 14 puede ser adjudicada a una
reducción en el Bmaxde 5,48 i 0.20 pmol/ mg proteína en los embriones control a 3,90 i
0.39 pmol/ mg proteína en los embriones hipóxicos (P<0,05 según test t de Student, n=5).
No se observaron cambios significativos en la constante de disociación (control: 329,3 i
21,8 nM; hipoxia: 277,9i 31,8 nM). Luego del tratamiento se determinaron los niveles de
proteínas por el método de Lowry (Lowry y col., 1951) y no se observaron diferencias en
la concentración de proteínas entre los animales hipóxicos y controles (control: 0,57 i
0,02; hipoxia: 0,55 :t 0,02 ug proteina / ul buffer de homogeneización, n=20).
< 4'5- O (,‘óntrol
3 o Hipoxia.52._.. 0
o É 3.0dE n.o unE Eo 2¿É 1-50 n.= Vo
"ED
0.3 r l I200 400 600
GABA(nM)
Figura 15: Disminución en el Bmaxluego del tratamiento hipóxico en el DE 12. Elgráfico muestra una curva representativa del ensayo de saturación utilizando[3H]GABA como trazador. Cada punto se obtuvo incubando las membranassínápticas control e hipóxica por cuadmplicado con concentraciones de ligando de30 a 600 nM El inserto muestra la transformación de Scatchard correspondienteal mismo conjunto de datos.
Para estudiar si los cambios observados en el DE 12 eran o no reversibles, luego
del tratamiento hipóxico en dicho día, un grupo de embriones fue devuelto a una
atmósfera normóxica por diferentes períodos de tiempo. Se encontró que 48 horas post
tratamiento los niveles de unión de [3H]GABA no diferían significativamente de lo
obtenido utilizando membranas de embriones control de DE 14 (figura 16), mientras que
luego de 24 horas presentaban un cierto nivel de recuperación menor al observado en el
DE 14.
DE12 WDEIS -DE14E¿o
3?» oo 09-.¡“83
n I"1::“3:408-98=E(GG0-05.8 -20
\°O
0
Periodo de Recuperación (horas)Figura 16: La unión de [3H]GABA retoma a los valores control luego de 48 hs derecuperación. Los valores de unión de [3H]GABA de los embriones hipóxícos (DE 12) orecuperados (DE 13 y 14) fueron comparados con los de embriones controles en el mismoestadio de desarrollo, y se graficó el porcentaje de cambio. Cada columna representa lamedia i ESM de cinco determinaciones independientes realizadas por cuadruplicado. **:Significativamente diferente del control del mismo DE, determinado por ANOVA de una
vía y post-test de Tukey (P<0,0 l , n=5). ‘
Con el objetivo de caracterizar si existían cambios en las propiedades
farmacológicas del complejo receptor GABAA, se realizaron estudios en el mismo DE 12
utilizando dos moduladores alostéricos positivos de la unión de GABA: el pentobarbital i
sódico (barbitúrico) y la alopregnanolona (neuroesteroide). El pentobarbital sódico (PB)
presentó una curva bifásica deDE 12 ' O
180 estunulacrón para las° - O Control" embran n r l fi ur l
¿“a 150- o Hipoxia I m as co to ( g a 7)U É a 120- consistente con la existencia de¡1: 8 . . .,
n... 5 .2 90- 1 dos Sitios de union para este° E 7’ . , .É 5 '° 60' . ligando como ya habla s1do.— o _ . .
5 É 30 g demostrado prev1amente (FiszerO 0
I I l l l de Plazas y col. 1995). La unión—11 -9 -7 -5 —3 -1
basal de [3H]GABA sin elLog [PB],M
Figura 17: El tratamiento hipóxico aumenta el Em. Las agregado del modulador fue dedeterminaciones se hicieron a una concentración final deGABA 100 nM, mientrasque el PB fue de 2,5 nM a 25 mM 0,951 i 01’96 Y de 0585 iLas curvas bifásicas ajustaron mejor que las monofásicas(COHÍÏOIF032)= F(233)=Los datos están expresados como porcentaje Ide. aumento (P<0,05 según test t de Student,respecto del basal obtemdo en ausencra del barbitúnco. Cadapunto representa la media i ESM de cinco determinaciones n=5) para las membranasindependientes hechas por cuadmplicado.
0,065 pmol/mg de proteína
control e hipóxica
respectivamente. El tratamiento hipóxico produjo un aumento significativo del 33% en la
máxima estimulación (Em) sin cambios en la concentración efectiva 50 (ECso) que es la
concentración requerida para obtener el 50% de la estimulación máxima (figura 17 y tabla
IV). Es importante remarcar que la menor concentración de PB (2,5 nM) produjo un
aumento significativo de la estimulación basal en las membranas obtenidas de embriones
hipóxicos.
Tabla IV: Efecto del PB sobre la unión de [3H]GABA en membranas control e hipóxicade LO de pollo.Tratamiento EC50(alta ECso (baja Emax % de los sitios
afinidad) (nM) afinidad) (mM) (% de aumento) de alta afinidad
Control 0,l3 i 0,08 0,36 i 0,17 109,70i 10,93 26,22 i 5,39
Hipoxia 0,14 i 0,05 0,06 i 0,23 146,60 i 10,63 * 26,65 ir 7,89
Los valores representan la media i ESM de cinco determinaciones independientes realizadas porcuadruplicado.*: Significativamente diferente del valor control determinado por test t de Student (P<0,05): Excluido del análisis estadístico.
Las curvas de estimulación obtenidas por el agregado del neuroesteroide
alopregnanolona (3 0L,50t,P),DE 12
mostraron un aumento en el1201
° 0 Control ’ d ’ '4*g porcentaje e maXImaa 8, loo'j 0 Hipoxia I ' _c, 3 estlmulamón de 60,48 i 2,23 %a SÉ 8°“
"L.É .s: 60_ o en las membranas control ao —u E 0:1 a '° 40_ I 95,42 i 2,97 % en las22 o= e ¡ .¡Dg 20- membranas de embrlones
e g . 1 , l l hipóxicos (P<0,001 según test tJ -8 -7 —6 -5 —4
de Student, n=4, figura 18).Log [3a75a9P19M
F'ggra 18: El tratamiento hipóxico aumenta la Emaxy la ECSO. Asimismo la EC50 tambiénLas determinaciones se hicieron a una concentración final de ,GABA 100 nM, mientras que la 3 oc,50L,Pfue de 8,6 nM a 10,6 mostro un aumentomM. Los datos están expresados como porcentaje de aumento . . . +respecto del basal obtenido en ausencia del neuroesteroide,y Slgmficatlvo de 0’104 “ 0’032se representa la media i ESM de cinco determinaciones M en el control a 0 223 +independientes hechas por cuadruplicado. p ’ _
0,027 uM luego de la hipoxia
(P<0,05 según test t de Student, n=4) , indicando que los receptores de estas últimas
presentan menor sensibilidad.
Para caracterizar la funcionalidad del complejo receptor GABAA se determinó en
microsacos el influjo de Cl' inducido por GABA. Como se ve en la figura 19, la máxima
captación de 36Cl' estimulada por GABA no presentó diferencias luego del tratamiento
hipóxico cuando se lo comparó con los embriones control (15,04 .i 1,66 y 14,01 i 3,04
nmol/ mg proteína para el control y la hipoxia, respectivamente). Asimismo la EC50no se
Vioalterada luego de la injuria (control: 7,05 i 0,94 mM; hipoxia: 5,89 j: 1,19 mM). Sin
embargo, si consideramos que el máximo número de sitios de unión de GABA (Bmax)se
encuentra disminuido luego del tratamiento hipóxico (como se mostró en la figura 15),
haciendo el cociente entre la máxima captación de Cl' y el máximo número de sitios de
unión de GABA, se observó que los sitios de unión remanentes permiten un mayor influjo
de iones (figura 19, inserto).
150 Control
O Hipoxia
ü
(nmol/mgprot)Influjode36cr
MáximoinflqiodeCl
(nmol/(mgprot‘Bmax))
u-IN
6Control Hipoxia
I I I
-6 —5 -4GD
Log [GABA], MFigra 19: El tratamiento hipóxico no alteró la captación de cloruro. El influjo fue determinado enmicrosacos de LO de embriones control e hipóxico. La concentración de GABA fue de l a 100 pM.Los datos están expresados como la media i ESM de seis determinaciones independientes hechas porcuadruplicado. El inserto representa el influjo máximo de Cl' expresado en función del máximo númerode sitios de unión de GABA para cada tratamiento.
Para completar la caracterización de las alteraciones producidas por la hipoxia, se
determinó el influjo de Cl' estimulado por GABA y modulado por el PB o la 3 a,5a,P. El
PB mostró un aumento de un 60% por encima de la Emaxcontrol (P<0,05) en el influjo de
Cl' luego del tratamiento hipóxico, mientras que la EC50se mantuvo constante (figura 20
y tabla V). Por su parte, las curvas obtenidas en presencia de 3 a,5a,P mostraron un 42
% de aumento en la Emax(P<0,001) luego de la hipoxia en comparación con el control
(figura 21 y tabla V). Además la EC50también se vio afectada (aunque debido al error, no
se pudo analizar estadísticamente), siendo las membranas obtenidas a partir de embriones
hipóxicos menos sensibles a la modulación por el neuroesteroide, que las obtenidas de
embriones control. Más aun, el valor de la ECso de los embriones hipóxicos es similar a la
concentración requerida para obtener la Emaxen las membranas control.
DE 12
125 O Control I. . Y.100 Hipoxla
%deaumentorespecto
delvalorbasal
—i0 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
LoglPBMM)
F'ggra 20: La hipoxia aumenta la En“,xdel influjo deCl‘ modulado por PB. La captación se determinó a unaconcentración final de GABA 5 11My de pentobarbitalde 1,25 nM a 1,25 mM Los datos están expresadoscomo porcentaje de aumento respecto del basal,obtenido en ausencia del barbitúrico, y se representa lamedia i ESM de cinco determinacionesindependientes hechas por cuadruplicado.
DE 12100
O Control
O HipoxiaNI (II
°/odeaumentorespecto
delvalorbasal
8
I I l I-8 —7 4; —s 4
Ing [301,501,P], (M)
Figura 21: La hipoxia aumenta la Emaxy la ECso delinflujo de Cl' modulado por 3 oc,5a,P. La captación sedeterminó a una concentración final de GABA 5 uM yde alopregnanolona de 0,25 nM a 2,5 mM. Los datosestán expresados como porcentaje de aumentorespecto del basal, obtenido en ausencia delneuroesteroide, y se representa la media i ESM decinco determinaciones independientes hechas porcuadmplicado.
Tabla V: Efectos del PB y la 3 (l,5(X.,Pen la captación de 36Cl'estimulado por GABA.ECso max
(uM) (% de aumento)
PBControl 16,33 1:6,03 67,47 i 8,29
Hypoxia 5,98 i 5,78 “ 109,10 ¿r 11,87 *
3a,5a,PControl 0,12 ¿r 1,1 64,78 i 2,23
Hypoxia 4,89 i- 1,4 t 95,42 e: 2,97 ***
Los valores representan la media i ESM de cinco determinaciones separadas hechas por cuadruplicado.Diferencia significativa respecto del control determinado por test t de Student (*: P<0.05 y ***: P<0.00l).“ : Excluido del análisis estadístico.
2.3. Caracterización bioquímica del receptor GABAA luego del
tratamiento hipóxico en el lóbulo óptico en desarrollo.
Con el objetivo de estudiar a que' se debían las diferencias observadas en la unión
de GABA luego del tratamiento hipóxico durante el desarrollo embrionario (figura 14), se
realizaron estudios de saturación de ligando en los DE 16, 17 y 18. A partir del DE 16 se
ha comprobado que existen dos sitios de unión para GABA en el complejo receptor
GABAA (Flores y col., 1986). Para descartar el aporte de una población de sitios
receptores sobre la otra, se aplicaron las ecuaciones de Feldman (Feldman, 1972).
En el DE 16 el tratamiento hipóxico no produjo ninguna alteración en las
constantes cinéticas del sitio de alta afinidad, pero produjo una disminución significativa
del 28 % en el Bmx del sitio de baja afinidad, sin alterar la Kd (figura 22A y Tabla VI). De
manera similar la injuria no produjo modificaciones en la Kd del sitio de alta ni de baja
afinidad en el DE 17, así como tampoco modificó el Bmaxdel primero. Sin embargo, el
Bmaxdel sitio de baja afinidad se redujo sólo en un 19 % respecto del control (figura 22B
y Tabla VI). El DE 18 no mostró alteraciones en la Kd ni en el Bmaxde ninguno de los dos
sitios de unión luego de la hipoxia (figura 22C y Tabla VI).
Tabla VI. Efecto del tratamiento hipóxico en el LO durante la embriogénesis.
Tratamiento Sitio de alta afinidad Sitio de baja afinidadBIMX Kd Bmx Kd
(pmol/mg prot) (nM) (pmol/mg prot) (nM)
DE 16
Control 0,266 t 0,122 50 i 16 3,89 i 0,26 465 i 152
Hipoxia 0,197 i 0,085 43 i 14 2,80 i 0,28 * 336 i 88
DE l7Control 0,351 i 0,110 52 i l0 2,93 i 0,06 323 i 56
Hipoxia 0,432 i 0,197 50 i 13 2,38 i 0,04 * 267 ir 40
DE 18Control 0,75] i 0,155 44 i 5 2,97 i 0,12 462 i 127
Hipoxia 0,637 i 0,072 52 i 12 2,87 i 0,27 489 ir 112Los valores representan la media i ESM de cinco determinaciones separadas realizadas por cuadruplicado.Los valores se obtuvieron por regresión no lineal y posterior análisis aplicando las ecuaciones de Feldmanpara descartar la interacción entre sitios. Los valores obtenidos para las membranas controles fueronsemejantes a los descriptos previamente (Viapíano, 1998).*: Diferencia significativa respecto del control determinada por test t de Student (P<0.05). 4
:zi .5, i¿'u"*.¿,HI:’-:‘:JH - 'r
5 DE 16- I Control
8 A4_ 0 Hipoxia Ia g ' I.2 < u.... D.g É M3a o so Es 2_= "L. EÉ eD 1- '
9 l r l l l l fi0 100 200 300 400 500 600 700
GABA, (nM)
BDE 17
3I Contml Io
É (g 0 Hipoxiase < a2g É enn. Ü Em —=g t¿lll? o2 “ É 1= VD
e I I I I I I 10 100 200 300 400 500 600 700
GABA (nM)
CDE 18
l Control
g . H. .S g ipoxnase 4 '52g É ena 9.5o -' el: ME É S2° n. 1' EE V gD
n 2 Ulsdo ‘ l" I I I I I I I
1 100 200 300 400 500 600 700
GABA (nM)
Figura 22: El tratamiento hipóxico produce una disminución edad dependiente del Bm. El gráficomuestra una curva representativa del DE 16 (A), l7 (B) y 18 (C) del ensayo de saturaciónutilizando [3}I]GABAcomo trazador. Cada punto se obtuvo incubando las membranas sinápticascontrole hipóxica por cuadmplicado con concentraciones de ligando de 30 a 600 nM El inserto decada figura muestra la transformación de Scatchard correspondiente al mismo conjunto de datos.En el mismo se puede observar la distribución curvilínea de puntos lo cual es consistente con lacoexistencia de dos sitios de unión.
‘Í‘ t . ' . . .¿tu miimá’m n LJ
2.4. Alteración en los niveles de lactato en el LO durante el desarrollo
en embriones controles e hipóxicos
Como se mencionó en la introducción, a partir del DE 17 se produce en los
embriones de pollo una hipoxia fisiológica, producto del crecimiento del embrión sin un
paralelo desarrollo de la membrana corion-alantoidea. Con el objetivo de estudiar si los
embriones de los estadios embrionarios más desarrollados detectaban el tratamiento
hipóxico externo, o si por el contrario existía algún tipo de adaptación, se determinaron
los niveles de lactato en el LO de embriones controles e hipóxicos de distintos días
embrionarios. La figura 23 muestra que los niveles de lactato en los embriones control se
mantienen constantes durante el desarrollo embrionario sin presentar modificaciones. Por
su parte, los niveles de dicho metabolito se vieron significativamente incrementados
luego del tratamiento hipóxico, en todos los DE. Este incremento resultó ser similar en
todos los estadios estudiados (DE 12: 124 i 21 %; DE 14: 101 i 36 %; DE 16: 164 i 20
%; DE 17: 128 i 13 %; DE 18: 112 i ll %), no evidenciándose diferencias en los
porcentajes de aumento entre los diferentes días de incubación (test de ANOVA de una
vía).
1-2-- Control ***7:? — Hipoxia ** ana
¡E 0 9 * *É . ° s.
E :2.bl)
g E 0.6rJ \—
É1 0.3V
0.012 14 16 17 18
Día EmbrionarioFigura 23: El tratamiento hipóxico aumenta los niveles de lactato en todos los días deldesarrollo estudiados. Los valores representan la media j: ESM de cinco determinacionessepara .Diferencia significativa respecto del control del mismo día embrionario según ANOVA de unavía y post test de Bonferroni (*: P<0,05; **: P<0,01; ***P<0,001).
/\)(l\[’//’ÍÁ/Í)'i —f7}
3.- ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DEL ARN MENSAJERO DE CUATRO
SUBUNIDADES DEL COMPLEJO RECEPTOR GABAÉ MEDIANTEHIBRIDACIÓN IN SITU.
3.1. Expresión de los ARNm de las subunidades a¡, a2, B; y y; en
condicionesnormales durante el desarrollo del LO
Con el objetivo final de estudiar si existen alteraciones en el patrón de expresión
de los ARN mensajeros (ARNm) de algunas subunidades del complejo receptor GABAA
luego del tratamiento hipóxíco y, dada la ausencia de trabajos previos caracterizando la
expresión de estas subunidades en el desarrollo del LO normal, primero se hará una
descripción en los embriones control.
Para estudiar la expresión de las subunidades al, a2, B2y y; del receptor GABAA
durante el desarrollo se determinaron las densidades ópticas (D.O.) en placas
autorradiográficas para: (a) tener un patrón general de expresión temporal y de
distribución anatómica de las poblaciones de neuronas GABAérgicas y, (b) obtener una
estimación semicuantitativa de los niveles de expresión de cada ARNm de cada población
GABAérígca. Si bien la medición de las D.O. debería correlacionarse con el número de
granos de plata presente en cada célula y la cantidad de células marcadas, una descripción
más detallada de la variación de la expresión de las subunidades puede obtenerse
realizando un análisis microscópico. La hibridación in situ isotópica permite estimar tres
parámetros cuantitativos adicionales: a) la densidad de neuronas GABAérgicas (número
de células marcadas / área); b) el promedio de granos de plata por célula, que indica el
nivel de expresión de cada subunidad dentro de la población de neuronas GABAérgicas
en una determinada lámina (número de granos promedio / célula marcada) y c) los
histogramas de fi'ecuencia del número de granos expresados por las neuronas.
A fin de tener un panorama más completo de qué ocurre durante el desarrollo
embrionario el análisis densitométrico de las diferentes subunidades se realizó desde el
DE 10 hasta el 20. Dado que la resolución de la placa autorradiográfica no llega a resolver
todas las láminas presentes en el LO (lo cual sólo puede hacerse realizando un análisis
microscópico), para conocer con qué lámina(s) se correspondía una zona marcada con una
determinada intensidad en la placa, hubo que hacer una correlación con el corte
coloreado. Para cada DE se midieron, exactamente en la misma zona del mismo corte
desde el ventrículo hacia la periferia, el grosor de cada zona marcada en la placa y el
Í\'4'\Il//<l(/IH x 5/
grosor de cada lámina en el corte coloreado de manera tal que pudo establecer la
correlación que se muestra en la tabla VII.
Tabla VII. Correlación entre las placas autorradiográficas y la microscopía óptica.
Zona observada Lámina(s) correspondiente observada en Nomenclatura otorgada a
en la placa el microscopio cada capa en la placa.
l ZV-Ep (según el estadio embrionario) + ZV-Ep
EFP + EGC
II EAC EAC
Ill EGC EGC
1V j j
V i i
VI h h
VII CCT3-4-5- a + b+ c + d + e + f+ g CCT3-5
(según el estadio embrionario)
Los númaos otorgados en la primer columna son arbitrarios y hacen referencia a la posición en que seencuentran la marca desde el ventrículo hacia la periferia En general el término ‘capa’ se utilizará paradescribir lo que se observa en las placas autorradiográficas y que puede corresponder a más de una láminadel lóbulo óptico. El término ‘lámina’ se dejará exclusivamente para hacer referencia a una láminaparticular de acuerdo a lo observado bajo microscopio.
La figura 23_muestra unas fotografias representativas de los DE 12 y 18 de un LO
de embriones control tal como se observa en las placas autorradiográficas, para cada una
de las subunidades estudiadas.
En la figura 24 se puede observar el complejo patrón de expresión en las
diferentes capas durante el desarrollo del LO y para cada una de las cuatro subunidades
analizadas. En todos los días embrionarios y para las cuatro subunidades estudiadas se
observó que, en general, la capa i, que se corresponde con una lámina que contiene
principalmente somas neuronales, fue la que mostró los mayores niveles de expresión; por
su parte, el Estrato Alba Central, que es mayoritariamente fibroso, fire el que mostró los
niveles más bajos. Con la excepción de la subunidad yz, los mayores cambios observados
para el resto de las subunidades se dieron en las capas i, h y CCT3-5, por ello la siguiente
descripción va a hacerse principalmente tomando en consideración estas tres capas. La
subunidad a. (figura 24 A) exhibió niveles moderados y relativamente constantes de
expresión en los primeros días estudiados (DE 10-14), un pico de expresión en el DE 16 y
luego una leve disminución hacia los últimos días de incubación, siendo más pronunciado
el descenso en la capa i. Las capas más internas del LO presentaron en general niveles
bajos de expresión, con una tendencia general a aumentar gradual y levemente hacia el
DE 20. La subunídad a2 (figura 24 B) presentó niveles elevados de expresión en la capa i
desde los estadios más tempranos estudiados y una tendencia al aumento lenta pero
constante hacia el día previo a la eclosión. En los últimos dos DE estudiados la marca de
la capa i fire tan alta que saturó la placa, observándose una zona completamente negra e
incluso en algunos cortes se hacía imposible la determinación de las láminas adyacentes,
presentando un grosor mucho mayor que el esperado para esta capa (figura 23). Las capas
h y CCT3-5 presentaron niveles bajos en el DE lO, los cuales aumentaron en el DE 12 y
se mantuvieron constantes en los DE 14-16. Luego se observó un nuevo aumento en el
DE18 el cual se mantuvo en el DE20. Tanto el EGC como la capaj presentaron un
aumento sostenido durante el desarrollo embrionario, alcanzando los niveles máximos en
el DE 18 y 20 respectivamente. La subunídad [32(figura 24 C) mostró en los primeros días
en la lámina i, niveles superiores a los de al pero inferiores a los de a2, los cuales se
mantuvieron relativamente estables hasta el DE 16 y en los últimos dos días estudiados
exhibió una tendencia al incremento. La expresión en las capas h y CCT3-5 de [32mosuó
un patrón que difiere de las demás subunidades. Se observaron niveles altos relativamente
altos de expresión los dos primeros días estudiados, seguidos por una disminución en los
DE 14-16, y luego un aumento en el DE18. Por su parte, el EGC presento niveles estables
durante todo el desarrollo, y a partir del DE 18 comenzó a aumentar. Por su parte, la
subunídad yz (figura 24 D) presentó niveles bajos durante todos los DE estudiados con
variaciones muy leves como ser una marca menor en el DE 14 y luego un pequeño
incremento hacia el DE20. Las capas h y CCT3-5 mostraron a partir del DE 16 niveles
comparativamente altos en relación al nivel encontrado en la capa i.
Ram/rudos - 56
Fggg'ra 23 (hoja siguiente): Hibridación in situ: Auton'adiografias de LO de embriones
control. Fotografias representativas de las placas autorradiográficas luego de um semana de
exposición,deunLOdepollodeDE 12y 18de lassubunidadesabaz, Bzyyz. Lalínea
equivaleame.
Día Embrionario
Alfa 1
Alfa 2
Beta 2
Gama 2 1
Subunidadal Subunidada2
Día Embrionario Día Embrionario
Subunidad B; Subunidad 72
10 12 14 16 18 20 10 12 14 16 18 20
Dia Embrionario Dia Embrionario
Figura 24: Densitometría de cuatro subunidades del complejo receptor GABAA durante el desarrolloembrionario del LO del pollo. La medición de los niveles de expresión de a] (A), a2 (B), B; (C) y yz (D) serealizaron en placas autorradiográficas y se expresan como unidades de densidad óptica (D.O.). Para cadadía embrionario, de izquierda a derecha las columnas corresponden a las siguientes capas: ZV-Ep, EAC,EGC, j, i, h, CCT3-5, y representan la media :t ESM. Las determinaciones se hicieron en la porcióncefálica de al menos 10 LO de tres experimentos independientes. Dado que no se observaron diferenciasentre los LO derechos e izquierdos ambos datos fueron agrupados.
Con el objetivo de determinar a qué se debían las variaciones observadas, se
realizaron cuantificaciones a nivel microscópico en la lámina i, por haber sido la que
mayor marcación presentó para todas las subunidades. Las cuantificaciones se realizaron
solamente en los DE 12, 16 y 18, por ser éstos los de mayor importancia para comparar
con los resultados obtenidos luego de la hipoxia y relacionarlos con los estudios
bioquímicos y farmacológicos previamente presentados.
De manera representativa la figura 25 muestra para los DE 12 y 18 la distribución
y abundancia de granos de plata para las subunidades al y a2.
Fgfl’n 25 (hoja siguiente): Hibridación in situ: Granos de plata en la lámina i del LO de
embriones control. Las fotografias muestran la distribución y abundancia relativa de los
granosdeplatapamlassubunidadesa.yazenlosDE 12y lSenlaregíóncefilicadelLO.
Enmaracas?
unum
sumaH''
WHmeI
Para la subunidad al en el DE 12 las células que mostraron 1 grano de plata eran
un poco menos del 30% (figura 26 A), presentando el histograma de distribución de
frecuencias un pico en esta zona. Para este DE no se encontraron células que expresen
más de 8 granos. En el DE 16 el número de células con solamente un grano disminuyó, y
aparecieron células que exhiben hasta 10 granos de plata (figura 26 B). Esto resultó en un
corrimiento del pico del histograma hacia la derecha. El DE 18 mostró que las células con
más de 7 granos disminuyen y aumentan las que presentan 1 ó 2 granos, lo cual se
A Subunidad a1
Frecuencia
_.
¡.__,s 6 7 8 v ll ll ¡1
Número de granos
Frecuencia
u
1; r' H M.- ,9.u u u n u u n v . I r ul z a l s s 1 n y u u n
Número de granos
Frecuencia
Número de granos
Figura 26: Cuantificación de laexpresión de la subunidad 0.1 enembriones control en la lámina i del LOen los DE 12, 16 y 18. A-C:Histogramas de frecuencia y curva dedistribución de probabilidades.
evidencia como un corrimiento de la curva de
probabilidad hacia la izquierda. Para poder comparar
estos datos estadísticamente se calculó el número de
granos promedio, considerando únicamente las
células marcadas (figura 27 A) presentando el DE 16
un valor significativamente mayor que los DE 12 y
18 (P<0,001 y P<0,01 respectivamente). Sin
embargo, estos resultados no explican claramente lo
observado en la densitometría (figura 24 A), ya que
allí se observó que la marca presente en el DE 18 fiie
superior a la del DE 12. Cuando se cuantificó el
número de células marcadas por unidad de superficie
(figura 27 B), el DE 18 presentó un número de
células marcadas levemente superior a los otros dos
DE estudiados.
> UU Subunidad a1300 '
Númerodegrano“
célulamarcada
Numerodecélulas marcada:l10‘um:
DiaEmbrlomrlo DíaEmbriomrlo
Figura 27: A: Número de granos promedio por célula marcada luegode contar un total de 100 células. B: número de células marcadas en
104um2, que se obtuvo midiendo al menos 5 campos en lóbulosópticos diferentes de 2 o más determinaciones independientes,Diferencias significativas según ANOVA y post test decomparaciones múltiples de Bonferroni (*:P<0,05; **: P<0,01;***:P<0,001).
La subunidad a2 exhibió en el DE 12, valores similares de células con 1 ó 2
granos de plata (figura 28 A), sumando entre ellas más del 40 % del total de las células
cuantificadas. En días posteriores, se observó un corrimiento de la curva de
probabilidades hacia la derecha producto del aumento de células con 4 y 5 granos en el
DE 16, y por la aparición de células exhibiendo hasta 9 y 10 granos de plata (figura 28 B,
C). Asimismo, la curva de distribución de frecuencias, se file achatando debido a una
distribución levemente más homogénea de probabilidades, ya que en ningún caso se
A Subunidad a2
Frecuencia
Número de granos
Frecuencia
a ‘r ÉLJ. w Wu t. . . . . . . . . . . .l 1 3 4 5 l ’I 8 1 ll ll ll
Número de granos
Frecuencia
w.545 ¡anulaNúmero de granos
Figura 28: Cuantificación de laexpresión de la subunidad a2 enembriones control en la lámina i del LOen los DE 12, 16 y 18. A-C:Histogramas de frecuencia y curva dedistribución de probabilidades.
observaron más de 20 células con un determinado
número de granos. Cuando se comparó el número
de granos por célula marcada, se observó un
incremento del DE 12 al 16 y de este último al DE
18 (figura 29 A). Si bien este aumento entre los días
16 y 18 no file tan notable en las placas
autorradiográficas esto puede deberse a que la
marca obtenida alcanzó el límite máximo de
sensibilidad de la placa. Al estudiar el número de
células marcadas por superficie, se observó una
disminución significativa de los DE 16 y 18
respecto de lo observado en el DE 12 (figura 29 B).
En el caso de a2 la presencia de mayor marca que
oc] es debida a un mayor número de células
marcadas en el DE 12 y a una mayor marca por
célula en el DE 18.
> W Subunidad az(II 300
‘
Númerodegranos!
célulamarcada
NU
Númerodecélula: marcada“104umz
0 UIIZ i 16 lá l
DíaEmhrlonarlo
Figura 29: A: Número de granos promedio por célula marcadaluego de contar un total de 100 células. B: número de célulasmarcadas en 104 umz, que se obtuvo midiendo al menos 5 camposen lóbulos ópticos diferentes de 2 o más determinacionesindependientes. Diferencias significativas según ANOVA y post testde comparaciones múltiples de Bonferroni (*:P<0,05; ***:P<0,001).
Día Embrlomrio
í.’.'7l’-"x-’;’é.‘zñ - 'lï‘Í
La subunidad [32presentó, al igual que la subunidad a2, histogramas de frecuencia
en los que se podía observar que en el DE 12 la mayor parte de las células expresaban 1 ó
2 granos de plata, y que existía un corrimiento hacia la derecha y hacia abajo de la curva
de probabilidades a lo largo del desarrollo encontrándose células que presentan hasta 10
granos de plata (figura 30 A-C). Entre los DE 16 y 18 se observa un aumento importante
del número de células que presentaron más de 7 granos. Si bien aparecen células con
mayor número de granos y la densitometría muestraA Subunidad [32 _
una tendenc1a al aumento de la marca, cuando se
calculó el número de granos promedio por célula
marcada, no se observaron diferencias significativas
durante el desarrollo (figura 31 A), a pesar de queFrecuencia
parecería existir un leve aumento hacia el DE 18.‘' * ’ ‘ ’ ' ’ ' ' " “ “ Cuando se contabillzó el número de células
Número de granos
marcadas por unidad de superficie, se observó unaBdisminución durante el desarrollo, resultando
significativa la diferencia entre los DE 12 y 18
É (figura 31 B).É
¿”
Número de gnnos
C
A B Subunidad B;g 5 300 .
« Se4
SÉ! 2 E 3
É g l É a ¡oo
Numero de granos U0 0
_ 12 16 isFigura 30: CuantificaCIÓn de la DíaEmbrlomrlo DíaEnhrlomrloexpresión de la subunidad [32 en Figura 31: A: Número de granos promedio por célula marcada luegoembriones control en la lámina i del LO de contar un total de 100 células. B: número de células marcadas en
en 108 DE 12, 16 y 18- A-CI 104 urnz, que se obtuvo midiendo al menos 5 campos en lóbulosHistogl’amas de frecuencia y curva de ópticos diferentes de 2 o más determinaciones independientes.distribución de probabilidades. Diferencias significativas según ANOVA y post test de
comparaciones múltiples de Bonferroni (*:P<0,05).
La subunidad y; presentó en los tres DE estudiados casi un 50 % de sus células
con l ó 2 granos (figura 32 A-C), encontrándose por lo general la mayor parte de las
células con l grano en los DE 12 y 18, y con 2 en el DE 16. En ninguno de esto DE se
observaron células con más de 6 granos de plata. Cuando se analizó el número de granos
promedio por célula marcada, no se observaron diferencias entre los diferentes días
embrionarios (figura 33 A), y para todos los DE estudiados presentaron los valores más
A Subunidad y;
Frecuencia
Frecuencia
l
Número de granos
Frecuencia
123456719nunNúmero de granos
Figura 32: Cuantificación de laexpresión de la subunidad yz enembriones control en la lámina i del LOen los DE 12, 16 y 18. A-C:Histogramas de frecuencia y curva dedistribución de probabilidades.
bajos de todas las subunidades estudiadas. El
número de células marcadas por unidad de
superficie mostró una reducción que resultó
significativa entre los DE 12 y 18 (figura 33 B).
Es interesante remarcar que en el DE 12 el
número de células marcadas por unidad de
superficie fue significativamente superior al que se
observó para la subunidad al (según test t de
Student, P<0,05), aunque esta última presentó un
número de granos por célula mayor que yz (según
test t de Student, P<0,001).
> W Subunidad y;UI
g
Númerodegranos!
celdamarcada
NEn!
Núnerodecélulas mareathsl10‘tun2¡
12 DíaEmlÏionarlo ls
F'ggra 33: A: Número de granos promedio por célula marcadaluego de contar un total de 100 células. B: número de célulasmarcadas en 104m2, que se obtuvo midiendo al menos 5 camposen lóbulo óptico diferentes de 2 o más determinacionesindependientes. Diferencias significativas según ANOVA y posttest de Bonferroni (*:P<0,05).
DíaEmbrionrio
3)\
3.2. Modificaciones en los niveles de expresión de los ARNm producto
del tratamiento hipóxico.
Las hibridaciones hechas sobre cortes obtenidos de embriones hipóxicos fueron
analizadas de la misma manera que se explicó para los cortes control. El análisis
densitométrico realizado en las placas autorradiográficas para las diferentes subunidades
A y DE, en general nopresentó diferencias
significativas cuando, para
la misma zona se comparó
control e hipoxia. A modo
de ejemplo, la figura 3416 18 16Díathrlonarlo DíaEmbrioon
muestra los resultado s
C D obtenidos del análisisControl BETA 2 E17}Colltml GAMA 2
,5 mmm“ 25 L'ïïï""’°"‘ densitométrico cuando se
analizó la zona que
corresponde a la capa i. Se
eligió presentar solamente12 16 18 16
DiaEmbrlonarlo Díathrlonarlo
Figura 34: Densitometría de cuatro subunidades del complejo cuantificaciones de losreceptor GABAA en la zona correspondiente a la lamma 1 en
embriones COHÍI'OICSe hÍpÓXlCOS,en lOS 12, y La granos de plata se realizaronmedición de los niveles de expresión de al (A), a2 (B), [32(C) y . _yz (D) se realizaron en placas autorradiográficas y se expresan eXCluswameme en la láminacomo unidades de densidad óptica (D.O.). Cada barra representala media i ESM. Las determinaciones se hicieron en la porción
cefálica de al menos 10LO de tres experimentosindependientes. figura 34 no existen
estos resultados ya que las
i. Como se observa en la
diferencias significativas luego del tratamiento hipóxico. En algunos casos, se observan
tendencias de cambio, pero las mismas no resultaron significativas luego del análisis
estadístico.
A pesar de la aparente ausencia de cambios luego del tratamiento hipóxico en los
niveles de expresión de los ARNm de las subunidades del receptor GABAAestudiadas, se
realizaron las cuantificaciones microscópicas, anteriormente descriptas. Si bien la
determinación del número de granos se realizó igual que para los embriones control, los
histogramas no se presentan ya que el análisis estadístico para poder comparar entre
hipóxico y control, se realizó en fimción del número de granos promedio. Solamente en el
caso que file necesario se recurrió a estos gráficos para comprender mejor los resultados.
\ r .;H Í r Jh, Haehmilñ «-5 ,
En primer término se analizó el número de granos promedio y los resultados se
presentan en la tabla VIII. Como puede observarse las subunidades a2, [32 y yz no
presentaron variaciones luego del tratamiento hipóxico en ninguno de los DE estudiados.
A su vez tampoco hubo variaciones en los niveles de expresión de ninguna de las
subunidades en el DE 18 luego de la injuria. Por su parte, la subunidad on presentó una
reducción significativa en el número de granos luego de la hipoxia en los DE 12 y 16.
Tabla VIII: Cambios en el número de granos por célula luego del tratamiento hipóxico.
ALFA l ALFA 2 BETA 2 GAMA 2DE 12
Control 2.85 0,20 2.59 4' 0. lo 3.0] 0,20 2.12 ? (l,l2
Hípoxía 2,33 i O,l7* 2,57 i 0,14 2,81 i 0,20 1,93 j: 0,12
DE 16
(‘ontrol 4,3 J 77'0.20 3,32 4 0,18 3.2| L 0,20 2,38 (l. 14
Hipoxía 3,47 i 0,22* 3,25 i 0,23 3,53 i 0,21 2,26 t 0,16
DE 18
(‘onll‘ol 2.00 >0.29 3,25 023 3,67 0,28 3,17 * 0,13
Hipoxia 3,33 i O,l7 2,93 ir.0,20 3,56 i 0,22 2,22 i 0,15
Número de granos promedio por célula marcada obtenido a partir del conteo de 100 células totales. Elpromedio se obtuvo considerando solamente aquellas que presentaron marca. “: Diferencia significativasegún ANOVA y post test de comparaciones múltiples de Bonferroni (P<0,05).
La tabla IX presenta los datos obtenidos cuando se cuantificó el número de células
marcadas por cada lO4umz. Nuevamente la subunidad a2 no presentó cambios luego del
tratamiento hipóxico en ninguno de los DE estudiados, como tampoco se evidenciaron
cambios en ninguna de las subunidades en el DE 18 luego de la hipoxia. Por su parte la
subunidad [32que no presentó cambios en el número de granos, disminuyó el número de
células que expresan dicha subunidad en el DE 12. A su vez, la subunidad y; que tampoco
mostró cambios en el número de granos de plata por célula, también mostró una
reducción en el número de células marcadas por 104 ¡,Lm2en el DE 12. El resultado más
llamativo es, probablemente, el obtenido para la subunidad al, ya que en los DE 12 y 16
exhibió un aumento en el número de células marcadas que expresan dicha subunidad.
Para comprender un poco mejor qué es lo que ocurre con esta subunidad, en la figura 35
se representan los histogramas de los DE 12 y 16 controle hipóxico.
HX‘5‘iz‘i'1!!«'í:m u fi)
Tabla IX: Cambios en el número de células marcadas por lO4um2 luego de la hipoxia.
ALFA 1 ALFA 2 BETA 2 GAMA 2
DE 12
Control 125 i 14 250 i 21 244 i 3o 220 i 22
Hipoxia 186i18M 215: 13 163¿22* 147i19*DE 16
Control mas 158i8 ¡80:9 1410:15
Hipoxia 181i18* 192i33 215i21 173i 13DE 18
Control 176i12 180i ló 166i4 122i8
Hipoxia 215 ¿21 206i20 151i 15 129i 10
Número de células marcadas / 104 umz. Diferencia significativa seg’m ANOVA y post test decomparaciones múltiples de Bonferroni (*: P<0,05; **:P<0,0]).
SUBUNIDADal
A DE 12 DE 16
5. Control s. Conlrol
4. II
g SO .2 u
S au 2| g 2|É r:
l. l.
O0123.567I91011u 011345.7I9101112Nin-erode gano: Númerode ganas
5° Hipoxia llipoxia
4. 4|
1':
g sc É!»o 0
¡ii z. 220ll IO
O¡[28456789101112 0123.55739101112Ninel-o de grana Númerode gallos
Figura 35: Cuantificación de laexpresión de la subunidad a] membriones control e hipóxico enla lámina i del lóbulo óptico.l-Iistogramas de frecuencia ycurva de distribución deprobabilidades en el DE 12 (A)y en el DE 16 (B) mostrando unaumento de la fi'ecuencia deaparición de células con l ó 2granos y una disminución de lascélulas no marcadas.
Si se compara el gráfico superior de la figura 35 A con el inferior, vemos que en el
DE 12 existe una disminución del número de células que no expresan ningún grano de
plata (barra 0) y que existe un aumento de las células que expresan 1 ó 2 granos, mientras
que las que expresan 3 o más granos están en general disminuidas luego del tratamiento
hipóxico. La figura 35 B muestra algo similar para el DE 16, una disminución del número
de células sin marca, un aumento del número de células que expresan entre 1 y 3 granos yé
Raw/lados - (m
en generaL una disminución de las que expresan cuatro o más granos de plata. Estos
cambios explican que haya en ambos DE un aumento del número de células que expresan
la subunidad al del receptor GABAA ¡mientras que el promedio de granos por célula
marcada disminuye.
CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN
1.- MODELO DE TRABAJO - zPOR QUÉ EMBRIONES DE AVES?
Los modelos de hipoxia hipóxica prenatal-perinatal en mamíferos son escasos por
varias razones como ser: i) complejidad operativa para manipular los embriones intra
útero, lo cual puede ocasionar diferencias en los procedimientos quirúrgicos, ii) la
presencia de la placenta que juega un papel regulador de la tensión de gases y iii) la
presencia de factores maternos que pueden influenciar los cambios observados en los
embriones. En cambio, las especies ovíparas se presentan como un modelo muy atractivo
para estudiar fenómenos hipóxicos, ya que la condición hipóxica “prenatal” (tratándose
de aves, lo correcto sería hablar de pre-eclosión) puede inducirse mucho más fácilmente
simplemente por cambio en las condiciones atmosféricas en que son incubados los huevos
(Rahn y col., 1987; Wagner-Amos y Seymour, 2002). La posibilidad de contar con un
modelo de hipoxia prenatal ayudaría a dilucidar el papel que el proceso hipóxico puede
tener en las alteraciones de la neurotransmisión en un estado de desarrollo en el cuál se
están estableciendo las sinapsis neuronales, es decir, en una etapa crítica de la formación
de los circuitos neurales.
En esta Tesis se ha demostrado que el modelo experimental propuesto funciona
correctamente, ya que luego del tratamiento se observó un aumento de lactato tanto en
homogenatos de cerebro total (figura 13) como de lóbulos ópticos (LO) exclusivamente
(figura 23) y que dichas variaciones se producen solamente cuando se perfimde la cámara
con una mezcla de gases de concentración reducida de Oz. Además, para garantizar que la
única variable introducida fuera el 02, el resto de los parámetros (flujo de aire perfimdido,
presión, humedad y temperatura dentro de la cámara de incubación, posible acumulación
de C02) fiJeron exhaustivamente controlados. Todo esto permitió decir que las
alteraciones observadas en el complejo receptor GABAAson atribuibles directamente al
tratamiento hipóxico y que son producto de la respuesta del embrión ante dicha injuria.
Dado que el interés principal radicó en estudiar las posibles alteraciones en la vía
inhibitoria, en las aves los LO han sido ampliamente descriptos como una fiJente rica en
receptores GABAA (Flores y col., 1986; Batuecas y col., 1987; Diet] y col., 1988; Rios y
col., 1987), habiéndose caracterizado las variaciones que presenta dicho sitio receptor a lo
largo del desarrollo embrionario (Flores y col., 1986), asi como también las
modificaciones en la acción de diferentes moduladores de la unión de GABA (Batuecas y
col., 1987; Gravielle y Fiszer de Plazas, 1991; Fiszer de Plazas y col, 1995; Viapiano y
col., 1998) y la funcionalidad del canal de cloruro asociado al receptor (Gravielle y col.,
1998).
2.- ALTERACIONES EN LOS PARÁMETROS FARMACOLÓGICOS Y
BIOQUÍMICOS DEL COMPLEJO RECEPTOR GABAÉ
2.1. Reducción de la unión de GABA edad dependiente.
Un tratamiento hipóxico de una hora ha demostrado que produce diferentes tipos
de modificaciones en la unión de [3H]GABA a lo largo del DE, siendo los estadios más
tempranos (DE 12, 14 y 16) más vulnerables, mientras que los embriones que se
encuentran más cercanos al día de la eclosión (DE 18) no se ven afectados por el
tratamiento. Por tal motivo, se decidió investigar qué ocurría en el DE l7 y se encontró un
cambio intermedio a lo observado entre los DE 16 y 18.
Durante los primeros días de desarrollo embrionario normal (DE 3-4), la
membrana corion-alantoidea comienza a desarrollarse por debajo de la cáscara, y
continúa su crecimiento hasta el DE 11-12 (Hamburger y Hamilton 1951; Lillie 1952;
Romanoff 1960; Ackerman y Rahn, 1981). Esta membrana, ricamente vascularimda es
utilizada por los embriones para intercambiar gases con el medio ambiente a través de la
cáscara. Si bien para ese momento del desarrollo (DE 11-12) la capacidad de intercambio
de gases es máxima, recién entre los DE 15 y 16 esta membrana alcanza su máxima tasa
de intercambio dada la demanda de 02 del embrión en crecimiento (Horby y col., 1983).
Desde este momento y hasta poco antes de la eclosión, la capacidad de intercambio de la
membrana corion-alantoidea trabaja al máximo. Debido a que el crecimiento del embrión
es constante y el crecimiento de esta membrana se detuvo en el DE 11-12, a partir del DE
17 el embrión recibe menos 02 que el necesario. Horby y colaboradores han demostrado
que a partir del DE l7 existe una reducción en el 02 consumido por unidad de peso, así
como también una disminución de la tasa metabólica por unidad de peso del embrión,
seguramente como consecuencia de la disminución de 02 consumido. En ese trabajo
también se demuestra que, si se colocan los embriones en un ambiente con una
concentración de 02 superior a la atmosférica (hiperoxia), el consumo de 02 es
significativamente superior a partir del DE 16. Algo similar ocurre si se abre una ventana
en la cáscara en los últimos cinco días de incubación. Por otra parte, se vio que la tasa de
crecimiento del embrión es alta hasta 5 días antes de la eclosión (Romanoff, 1960) y que
existe un aumento en la concentración de 2,3-difosfoglicerato en el último período de
incubación (Baumann y col., 1986). Todos estos resultados indican que la membrana
corion-alantoidea provee al embrión todo el oxígeno que éste necesita durante los
primeros períodos de desarrollo, pero a su vez, están sugiriendo que el embrión se
encuentra en un estado de “hipoxia fisiológica” debido a su desarrollo normal a partir del
DE 17. La ausencia de cambio en los ensayos de unión de [3H]GABA en el DE 18 podría
estar relacionada con este estado de hipoxia fisiológica que prevalece desde el DE l7.
Con lo cual, en principio, no se podría descartar que desde este DE los embriones se
encuentren de alguna manera preparados o bien, sean menos sensibles a una injuria
hipóxica producida experimentalmente.
Para estudiar qué parámetros bioquímicos se encontraban alterados, se realizaron
ensayos de saturación de ligando, para los DE 12, 16, 17 y 18 por ser estos días los ma's
interesantes en cuanto a los resultados hasta aquí obtenidos. El DE 12 presenta ciertas
características embrionarias particulares que lo hacen interesante dentro del modelo. Si
bien aún existe migración celular de las células originadas en el epitelio ependimario
hacia su destino final en las diferentes láminas del LO, ya no existe proliferación en la
zona ependimaria, observándose todas las características del epéndimo definitivo con
alguna imagen mitótica ocasional (La Vail y Cowan, l97l). A su vez las fibras
provenientes de la retina contralateral ya invadieron el estrato óptico (EO) para el DE 12
aunque el desarrollo de proyecciones y sinapsis de las neuronas del tecturn óptico y de las
fibras que comienzan a entrar desde el EO continúa hasta después de la eclosión. Además,
la remoción de un ojo temprano en el desarrollo embrionario provoca que el patrón de
laminación a partir del DE 12 se altere, o se encuentre severamente limitado (Lavail y
Cowan, 1971). Es por ello que entre el DE 12 y 16 existe una ventana temporal en la cual
todas las neuronas definitivas ya se formaron, las aferencias retinianas ya entraron al LO
y, dado que la membrana corion-alantoidea se encuentra completamente desarrollada, el
embrión toma del medio ambiente todo el 02 que necesita.
En el DE 12 se observó una reducción del B"m sin cambios en la Kd. Varias son
las explicaciones posibles para dicha reducción, alguna de las cuales no son mutuamente
excluyentes entre sí: (a) intemalización y 'modificación' del receptor. La intemalización
del receptor ha sido demostrada que puede darse por un aumento en la concentración de
GABA en el espacio extracelular durante un proceso hipoxico-isquémico (Hagberg y col.,
I’m ¡mm
1987; Saransaari y col., 1998), que produce una disminución de los receptores expuestos
en la membrana (Barnes, 1996). La 'modificación' del receptor podría ser, por ejemplo,
degradación del receptor ya que por el tipo de metodología utilizada en el presente
trabajo, las membranas se recuperan y en el caso de tratarse únicamente de una
internalización, estos receptores hubieran estado igualmente presentes en la preparación;
(b) muerte celular por apoptosis o necrosis de (al menos) las neuronas GABAérgicas; (c)
modificaciones post-traduccionales, como por ejemplo fosforilación de alguna subunidad
por alguna proteína quinasa. Si bien en esta Tesis no se estudiaron estos puntos, los
mismos serán discutidos más adelante en relación con el resto de los resultados obtenidos.
Otros modelos de trabajo han obtenido resultados diferentes cuando estudiaron el
receptor GABAA. Por ejemplo se observó un aumento del Bm“ sin alteración de la K4 en
corteza cerebral de tortugas, luego de 12 ó 24 horas de anoxia, (Lutz y Leone-Kabler,
1995). Este resultado no es del todo inesperado ya que las tortugas son capaces de
sobrevivir largos períodos de anoxia sin que se produzcan alteraciones patológicas. En
estos casos, una depresión profunda del metabolismo del cerebro ha sido demostrada, con
lo cual se postuló que un aumento de la neurotransmísión inhibitoria es necesaria para
lograrlo (Lutz, ¡992). Por otro lado, ratas sometidas a 3, 6 ó 12 horas de hipoxia
normobárica también mostraron un aumento del Bm tanto de [3H]muscimol como de
[3H]flunitrazepam, asociados a una disminución de la actividad de la GAD en la
presinapsis (Ninomiya y col., 1988). Esto ha sido interpretado como un aumento de los
sitios receptores debido a una disminución del GABA liberado por la presinapsis. Pero,
cuando las membranas utilizadas fueron tratadas con el detergente Triton X-lOO dichas
diferencias desaparecieron. Dado los resultados obtenidos con el detergente, es muy
probable que dichos cambios se deban a la asociación de algún factor endógeno que
provoque un cambio en el receptor, exponiendo un mayor número de sitios de unión, y no
que sean consecuencia de una modificación de tipo covalente, como podría ser una
fosforilación. Contrariamente a estos resultados, una hipoxia hipobárica en ratones
adultos, provocó una reducción del Bm sin alterar la K4 (Viapiano y col., 2001). Si bien
previamente se había demostrado que existía una disminución de los receptores expuestos
en la membrana luego de una proceso hípóxico-isquémico de corta duración (Alicke y
Schwartz-Bloom, 1995), en este caso dada la duración del tratamiento (21 días), es
probable que exista además una disminución de los niveles de transcripción de los genes
de las diferentes subunidades del receptor GABAA.
Í’ÍM‘IIVÚII - _/
Por otra parte, nuestro laboratorio ha demostrado, en este mismo modelo de
hipoxia, que existe también una reducción del número máximo de sitios de unión para
MK-801 en el receptor glutamatérgico de tipo NMDA (N-metil-D-aspartato) en el DE 12
(Vacotto y col., 2002). Con lo cual en el LO de pollos, tanto la neurotransmisíón
inhibitoria como la excitatoria están alteradas luego del tratamiento hipóxíco.
En nuestro modelo, en los últimos DE donde se había observado algún cambio
(DE 16 y 17) se demostró que, luego de la hipoxia existía una reducción del Bm“ del sitio
de baja afinidad sin cambio en la Kd, mientras que el sitio de alta afinidad no mostró
alteraciones por la injuria en ninguna de sus dos constantes cinéticas. Nuevamente el DE
18 no mostró ningún tipo de cambio. A pesar de que son necesarias metodologías
relativamente drásticas para exponer los sitios receptores de alta afinidad, como serl " J l
Üexhaustivos lavados o " ñ los mismos no son un artefacto ya
que pueden ser selectivamente bloqueados por tiocianato de amonio sin afectar la unión
del sitio de baja afinidad (Browner y col., 1981). Basándose en datos bioquímicos se ha
demostrado que el sitio de unión de GABA de baja afinidad parece ser esencial para la
apertura del canal (Sieghart 1995). Además, recientemente se ha sugerido que el sitio de
alta afinidad en el receptor GABAAes requerido para estabilizar el estado desensibilizado
del receptor una vez que éste se ha formado (Newell y Dunn, 2002). Sin embargo, hasta la
fecha existen aún controversias en cuanto al rol exacto del sitio de alta afinidad. Por todo
esto es probable que los cambios en el sitio de baja afinidad observados en trabajos
previos sean los responsables de las alteraciones en la neurotransmisión inhibitoria luego
del trauma hipóxíco. Asimismo es posible que sean partícipes de los procesos
excitotóxicos donde la transmisión excitatoria e inhibitoria no se encuentran en equilibrio
ya que, en principio, serían estos sitios de baja afinidad los que median la respuesta
inhibitoria.
Si bien ha sido ampliamente demostrada la aparición de muerte celular luego de
un proceso hipóxico (Hill y col., 1995; Oo y col., 1995; Walton y col., 1997;
Bossemneyer y col., 1998), podría suponerse que si ésta es la causa de la disminución de
la unión máxima de GABA, en nuestro modelo las células de los DE más tempranos
serían más sensibles que las de los DE más desarrollados. Aunque en esta Tesis no se ha
estudiado si la muerte celular se encuentra aumentada especialmente en las neuronas
GABAérgicas, es muy probable que la reducción observada en los ensayos de unión no se
deba a una muerte celular. Dado que solamente el sitio de baja afinidad se ha visto
afectado luego de la injuria se puede decir que el cambio observado es específico y no
generalizado. Considerando que el sitio de alta afinidad es requerido para estabilizar el
estado desensibilizado del receptor una vez que éste se ha formado (Newell y Dunn,
2002), se puede suponer que ambos sitios de unión se encuentran en el mismo receptor,
con lo cual algo que afecte a la célula en su totalidad, como por ejemplo la muerte,
afectaría a ambos sitios de unión de GABA por igual, lo cual no se observó en el presente
trabajo.
Como se dijo anteriormente, los embriones del estadio más avanzado del
desarrollo no mostraron diferencias luego del tratamiento hipóxico en las constantes
cinéticas. Con el objetivo de estudiar si los embriones se encontraban adaptados al
ambiente hipóxico que se genera normalmente como consecuencia del desarrollo, se
determinaron los niveles de lactato en homogenatos de LO. Los embriones control no
mostraron diferencias entre ellos durante el desarrollo embrionario en los niveles del
metabolito. Este resultado no es inesperado, ya que si bien en los últimos días
embrionarios estudiados se desarrolla un proceso de hipoxia fisiológica, como lo
demostraron anteriormente Horby y col., existe a su vez una reducción en la tasa
metabólica (Harby y col., 1983) con lo cual no es de extrañar que el producto de la
fermentación no se encuentre aumentado. Cuando se compararon los niveles de lactato
luego del tratamiento hipóxico se observó un aumento en todos los DE, siendo este
incremento similar en todos los días estudiados. Este resultado resultó en principio
sorprendente a la luz de los resultados de unión de GABA. Sin embargo esto implica que
los embriones están detectando el tratamiento hipóxico externo aún cuando no se vean
diferencias en los ensayos de saturación de GABA en el DE 18. Una explicación posible
es que el tiempo del tratamiento hipóxico no sea suficiente para producir una reducción
en la tasa metabólica del embrión, ya que por ejemplo cuando se colocan los embriones
en un ambiente hiperóxico el aumento en el consumo de 02 se detecta recién a las dos
horas de tratamiento (Harby y col., 1983). Otra explicación plausible es que los
embriones no pueden reducir más su metabolismo, lo cual es muy probable especialmente
si se toma en cuenta que en nuestro modelo, tratamientos superiores a 60 minutos
indujeron una alta tasa de mortandad entre los embriones, lo cual (esto file observado
durante la puesta a punto del modelo).
El resultado obtenido a partir de la medición de los niveles de lactato, no aclara el
por qué de la ausencia de cambios en la unión de GABA en el estadio de desarrollo más
tardío estudiado. Dado que no existe una adaptación general del embrión, es entonces
posible que exista un cambio en la composición de subunidades del complejo receptor
GABAAdurante la ontogenia hacia una conformación que sea más resistente a una injuria
hipóxica, como resultado de una preparación de las células al proceso de hipoxia
fisiológica que sufre el embrión durante el desarrollo. Este punto volverá a ser
considerado más adelante en la discusión (sección 3.1).
2.2. Alteraciones en la modulación de la unión de GABA en el DE 12 y
en la funcionalidad del canal de Cl'.
Los estudios llevados a cabo en el DE 12 fueron realizados con el objetivo de
determinar los cambios que se producen a nivel farmacológico y funcional en el complejo
receptor GABAA luego del tratamiento hipóxico. El análisis del efecto de dos
moduladores positivos de la unión de GABA, el pentobarbital sódico (PB) y la
alopregananolona (3a,5a-P) mostraron en ambos casos un aumento de la estimulación
máxima (Em) en membranas hipóxicas respecto de las membranas control. Como se
señaló en la introducción de esta Tesis, en general luego de un proceso hipóxico se
produce un desbalance en la liberación de aminoácidos lo que trae aparejado un proceso
excitotóxico. Los procesos hipóxicos no solamente producen una alteración en los niveles
de neurotransmisor liberado (Cataltepe y col., 1996; Rego y col., 1996; Saransaari y Oja
1998), sino que también produce un aumento en la concentración de Cl' intracelular
(Inglefield y Schwartz-Bloom, 1998) y un incremento del Ca2+y el Na+ por activación de
los receptores glutamatérgicos de tipo NMDA y AMPA (ácido a-amino-3-hidroxi-5
metil-4-isoxazolepropiónico) (Bickler y Hansen, 1994). A pesar de que la excitotoxicidad
se asoció en un principio con receptores glutamatérgicos (Meldrum y Garthwaite, 1990)
se ha demostrado que los neurotransmisores inhibitorios también pueden mediar la muerte
celular excitotóxica (Erdó y col., 1991; Chen y col., 1999). Se ha postulado que, luego de
un proceso isquémico el potencial de equilibrio del ion cloruro cambia a valores más
positivos que el potencial de reposo de la membrana, con lo cual los receptores GABAA
permiten una salida de iones Cl' cuando unen GABA produciendo en este caso una
despolarización. Esta hipótesis ha sido demostrada por experimentos in vitro en los cuales
se midió la concentración intracelular de Cl' luego de una isquemia (Jiang y col., 1992;
Inglefield y Schwartz-Bloom, 1998). Los resultados farmacológicos obtenidos en el DE
12 son importantes ya que, si en el futuro se busca modular el daño producido por la
injuria hipóxica en este modelo, el mayor efecto presentado por el barbitúrico y el
neuroesteroide debe ser considerado a fm de no producir mayor daño.
Las alteraciones observadas en la neurotransmisión GABAérgica han sido
adjudicadas en algunos trabajos en cultivos celulares a una disminución en la corriente de
entrada del ion Cl' luego del incremento de los niveles intracelulares de Ca2+ (Inoue y
col., 1986, Llano y col., 1991). Martina y col. le atribuyeron dichas modificaciones a una
reducida afinidad del receptor GABAApor el GABA (Martina y col., 1994). Sin embargo
nosotros no observamos cambios en la afinidad del GABA luego de la hipoxia, y para
probar si existían cambios en la fimcionalidad del receptor luego de la injuria se midió el
influjo de Cl' en el DE 12. Llamativamente no se encontraron diferencias en la captación
de este ion entre las membranas obtenidas de embriones hipóxicos y controles. Sin
embargo, si se considera que el número máximo de sitios de unión en este día
embrionario se encuentra disminuido, y si se expresa el máximo influjo de Cl' en función
del Bm, se puede observar que los sitios de unión remanentes producen un influjo
proporcionalmente mayor (figura 19, inserto). Dada la metodología utilizada no es posible
discriminar si el aumento en la corriente de Cl' se produce como consecuencia de un
aumento en el tiempo de apertura, en la fi'ecuencia o en ambos del receptor GABAA.
Ahora bien, a la luz de los resultados de influjo de Cl' es posible plantearse la posibilidad
de que los sitios de unión de GABA que se pierden no pertenezcan a receptores
funcionales, sino a receptores “de reserva” (“Spare receptors”), con lo cual, el influjo de
Cl' no se encontran'a modificado.
Cuando se determinó el influjo de Cl' estimulado por GABA y modulado por PB o
3a,5a-P se observó un aumento en los valores máximos de estimulación en ambos casos,
sin poderse analizar los valores de ECso debido a la magnitud de los errores obtenidos, a
pesar de que dichos experimentos se repitieron cinco veces y cada punto se determinó por
cuadruplicado. El aumento en la estimulación puede deberse, en ambos casos, a dos
cosas: l) es producto del aumento que producen de la unión máxima de GABA ambos
moduladores positivos (figuras 17 y 18) o bien, 2) sabiendo que tanto los barbitúricos
como los neuroesteroides pueden abrir el canal del receptor GABAA, es posible que,
alguna modificación en el receptor luego de la hipoxia les permita a ellos per se abrir el
canal más eficientemente que en las membranas control, sumándose este efecto al que
produce el mismo GABA. Recientemente se ha demostrado que la acción del
neuroesteroide 3a,5a-P, como modulador alostérico del receptor GABAA en el
hipotálamo, es dependiente del estado de fosforilación del receptor. El receptor es
sensible a la acción del neuroesteroide sólo si existe una actividad fosfatasa mayor que la
actividad de la proteína quinasa C (PKC) (Brussaard y Koksma., 2003)
Existe mucho interés hoy en día en dilucidar los mecanismos por los cuales las
neuronas regulan la fimcionalidad del receptor GABAA. Muchos trabajos se han
concentrado en la composición de subunidades del receptor y en el estado de fosforilación
del mismo. Experimentos llevados a cabo in vitro de co-expresión de varias subunidades
del receptor asociados a estudios posteriores de propiedades farmacológicas sugieren que,
probablemente, la organización predominante en el SNC sea producto de la combinación
de subunidades de la clase a, B y y (Rabow y col., 1995; Bonnert y col., 1999), y que las
diferencias entre distintas áreas se deba a la expresión de diferentes isoformas de dichas
subunidades. Por otro lado, se ha demostrado que la concentración intracelular de Ca2+
modifica la neurotransmisión GABAérgica (Inoue y col., 1986, Llano y col., 1991,
Martina y col., 1994) y que también activa enzimas como la fosfolipasa A2, que genera
ácido araquidónico, el cual reduce la unión al receptor GABAA (Samochocki y
Strosznajder 1993), o como PKC y la quinasa dependiente de Ca2+-calrnodulina
(CamKIl), las cuales modifican el estado de fosforilación del receptor. Muchos trabajos in
vitro han demostrado que las subunidades [3y y pueden ser substrato de varias proteínas
quinasas. Así, la subunidad B puede ser fosforilada por PKC, proteína quinasa A (PKA),
CamKII y proteína quinasa dependiente de GMPc (PKG), mientras que la subunidad y es
substrato para PKA, PKC y CamKII (Browning y col., 1993, McDonald y Moss 1994,
Connolly y col., 1999). La fosforilación de diferentes subunidades del receptor GABAA
provoca cambios muy diferentes, cuyos efectos van desde un aumento hasta una
inhibición de la unión, de acuerdo al tipo de subunidades que forman el receptor, al
modelo de estudio y al modo de activación de las quinasas (McDonald y col., 1998; Lin y
col., 1996; Smart, 1997).
En nuestro modelo de trabajo la disminución observada en la unión de GABA es
transitoria, recuperándose los niveles normales luego de 48 horas en una atmósfera
normóxica, con lo cual los cambios observados en la unión, la modulación y la
funcionalidad podrían ser atribuidos a una respuesta de tipo adaptativa a la injuria más
que a un daño de tipo patológico. Sin embargo, no pueden descartarse efectos a largo
plazo ya que no se ha determinado qué ocurre con la funcionalidad del receptor a tiempos
más largos en este modelo; además, otros autores han demostrado que los efectos luego
de un injuria isquémica pueden observarse inclusive meses después de producida la
injuria (Luhmann y col., 1995; Mittmann y col., 1998). Por todo lo anteriormente
expuesto, una hipótesis probable es que las alteraciones observadas luego del tratamiento
IU»: via/m
hipóxico se deban a cambios, por acción de proteínas quinasas o fosfatasas, en los niveles
de fosforilación de las subunidades del receptor. Esta teoría está respaldada por diversos
experimentos in vitro algunos de los cuales se mencionan a continuación en orden
cronológico:
- la activación de PKA produce in vitro un aumento en los niveles de fosforilación
de la subunidad [31y una reducción de la amplitud de la respuesta del receptor GABA
compuesto de subunidades al, Bl y yz. Un resultado similar se observó en cultivos de
neuronas embrionarias de rata (Moss y col., 1992).
- la activación de PKC produjo un aumento en la corriente máxima de receptores
compuestos por las subunidades ou, B; y yz. La mutación de los sitios de fosforilación en
la subunidad [32o yz, hizo a estos receptores insensibles a la acción de PKC (Lin y col.,
1996).
- aumento en las corrientes inducidas por GABA luego de la activación de PKA en
neuronas de hipocampo (Kapur y Macdonald, 1996).
- el número de receptores expuestos en la membrana citoplasmática de ovocitos de
Xenopus laevis disminuyó luego de la activación de PKC (Chapel! y col., 1998).
- células embrionarias de riñón humano transfectadas con las subunidades al, [32,
725y yn, presentaron, luego de la activación de PKC, una disminución de los receptores
expuestos en la membrana plasmática sin posterior degradación del receptor, y un
bloqueo de la recirculación del receptor a la membrana citoplasmática, especialmente de
aquellos receptores conteniendo la subunidad yz (Connolly y col., 1999). Este trabajo
demostró que la endocitosis ocurría de manera constitutiva, mientras que la fosforilación
por PKC impedía el retorno de dichos receptores a la membrana plasmática.
- la activación de PKC produjo un aumento de la función del receptor GABAA en
neuronas olfatorias y de hipocampo (Brunig y col., 1999; Poisbeau y col., 1999).
- la activación de PKC aumenta el nivel de fosforilación basal de la subunidad [33
del receptor y reduce la corriente a través del receptor en cultivos de neuronas corticales
embrionarias de rata (Brandon y col., 2000). A diferencia de lo observado por Connolly y
col., no se pudo detectar una endocitosis constitutiva del receptor en este modelo
(Connolly y col., 1999). Es muy probable que las diferentes proteínas del citoesqueleto de
las neuronas y de los tipos celulares utilizados para la transfección hagan que este proceso
sea diferente. Más aún, en neuronas, la intemalización de los receptores se ha demostrado
luego de la ocupación del receptor GABAApor agonistas, siendo parte de estos receptores
degradados posteriormente (Barnes, 2000).
- aumento en el nivel de fosforilación de la subunidad [31por una vía dependiente
de la activación de PKC, lo que se tradujo en un aumento en la modulación de la
funcionalidad del receptor (Brandon y col., 2002).
- la defosforílación de las subunidades B¡ y [33transfectadas en células HEK,
mostraron una disminución en la corriente de entrada y menor desensibilización del
receptor (Hinkle y MacDonald, 2002)
- la actividad del receptor GABAA presentó un aumento de las corrientes
inhibitorias seguidas de una prolongada depresión, luego del agregado del factor
neurotrófico derivado del cerebro. Esto se asoció con una fosforilación mediada por PKC
seguida de una defosforilación mediada por una proteína fosfatasa 2A (Jovanovic y col.,
2004)
Como puede observarse los resultados son diferentes entre si de acuerdo al modelo
utilizado, a las subunidades del receptor estudiadas y a las proteínas quinasas o fosfatasas
analizadas. Algunos de los efectos obtenidos en los trabajos mencionados, son similares a
los obtenidos en la presente Tesis, con lo cual es posible que al tratarse el LO de una
estructura compleja con diferentes tipos celulares en las distintas láminas, los cambios
observados sean una sumatoria compleja de lo que ocurre en particular en cada tipo
celular. Un estudio más detallado de qué subunidades del receptor se expresan, qué ocurre
con las diferentes quinasas y fosfatasas y con el estado de fosforilación de las
subunidades en el tectum óptico luego del tratamiento hipóxico es necesario para entender
un poco mejor los resultados bioquímicos y farmacológicos descriptos.
3. ESTUDIO DE LA EXPRESIÓN DE CUATRO SUBUNIDADES DEL
COMPLEJO RECEPTOR GABAAEN EL LÓLULO OPTICO DEL POLLO.
3.1. Caracterización durante el desarrollo embrionario normal.
El conocimiento de la composición molecular del complejo receptor GABAA ha
aumentado notablemente en los últimos años. Actualmente varias subunidades han sido
caracterimdas, entre las que se incluyen am, BH, y“, 6, e y n (Mehta y Ticku, 1999). Si
bien el objetivo final fue el de estudiar si existen modificaciones en los niveles de
expresión de los ARNm de las subunidades al, a2, [32y y; del complejo receptor GABAA
luego del tratamiento hipóxico, la ausencia de trabajos previos caracterizando cómo es la
expresión de estas subunidades en el desarrollo del LO normal hizo que primero debamos
estudiar su expresión en embriones control.
Se ha demostrado en ensayos de receptores recombinantes que al menos tres
subunidades de las clases a, B y y son necesarias para conferir todas las propiedades
farmacológicas del receptor GABAA (Rabow y col., 1995, Bonnert y col., 1999). Las
subunidades de tipo a. están involucradas en determinar la afinidad de las BZD en el
receptor GABAAestando el sitio de unión en la interfase entre una subunidad y y una a.
Se ha probado que la subunidad (1| forma el sitio de alta afinidad, mientras que las
subunidades az, a3 y a5 determinan el sitio de baja afinidad (Pritchett y col., 1989;
Pritchett y Seeburg, 1990). Sin embargo, algunos trabajos más recientes han postulado
que las subunidades 0.2y a3 forman un sitio de unión de afinidad intermedia mientras que
a5 muestra un sitio de muy baja afinidad para algunas benzodiazepinas en particular
(Ruano y col., 1992; Benavides y col., 1993). Previamente ha sido demostrado que el sitio
de unión de alta afinidad para benzodiazepínas también llamado tipo I (BZD I), se forma
cuando la subunidad al se asocia con subunidades B"y yz (siendo n cualquier isoforma de
dicha clase), mientras que el sitio de unión de baja afinidad o de tipo II (BZD II) se forma
por la coexpresión de a2 o a3 más B" y yz (Pritchett y col., 1990; Pritchell y col., 1989).
De acuerdo con los resultados obtenidos en las placas autorradiográficas (figura 24), el
nivel de expresión de la subunidad a2 es remarcablemente superior que el nivel de ou
entre los DE 10 y 14 pero, un rápido aumento en la expresión de esta última ocurre entre
los DE 14 y 16 principalmente en la capa i. Se podría postular entonces que la expresión
diferencial de a. y 0.2durante el intervalo DE 10 —16 puede modificar las proporciones
de subunidades a disponibles para armar el receptor y, de esa manera, cambiar el
porcentaje relativo de dichas subunidades que forman el receptor expuesto en las sinapsis
alterando sus propiedades. Trabajos previos de nuestro laboratorio han demostrado la
existencia de dos sitios de unión para el flunitrazepam en el LO del pollo, con un patrón
de aparición dependiente del desarrollo. Mientras que los sitios BZD II se detectan
temprano en el desarrollo embrionario, los sitios de unión de tipo BZD I aparecen más
tardíamente (Gravielle y Fiszer de Plazas, 1995). Tomando en conjunto los resultados
bioquímicos y el patrón de expresión de on y a2 en los LO y lo que previamente fue
expuesto por otros autores, se puede postular que los cambios observados a nivel
bioquímico durante el desarrollo embrionario, son producto de un cambio en los niveles
relativos de expresión de las subunidades a.
Trabajos previos han mostrado que, de acuerdo al área y al estadio de desarrollo,
algunas subunidades son reempleadas por otras durante el desarrollo embrionario y
postnatal del cerebro de ratas, mientras que otras subunidades mantienen niveles
relativamente constantes de expresión. Laurie y col. han postulado que en la mayoría de
las áreas cerebrales de la rata, la subunidad a2 se expresa mayoritariamente en etapas
embrionarias y perinatales, mientras que la subunidad a. aparece principalmente en el
cerebro adulto (Laurie y col., 1992). En particular, cuando en dicho trabajo se describen
las variaciones observadas en los colículos sin discriminar en superiores o inferiores
(siendo los superiores el análogo en mamíferos al tectum óptico de las aves), se detalla
que a2 aparece en niveles bajos o moderados en el DE 14 e incrementa hacia el DE 19;
luego decae hasta niveles muy bajos. A su vez, on es indetectable para el DE 14 y
comienza a incrementarse hasta alcanzar los niveles que se encuentran en el adulto para el
día postnatal 12. Nosotros hemos encontrado que durante el desarrollo embrionario al
presenta un pico de expresión en el DE 16 y una posterior disminución leve hacia el DE
20, mientras que los niveles de a2 se mantienen constantes sin evidencias de decaimiento.
Estas diferencias podrían ser atribuidas a diferentes tiempos de maduración de ambos
tipos de cerebros, especialmente si se toma en consideración por ejemplo, el hecho de que
al momento de la eclosión los pollos presentan un alto grado de maduración, mientras que
las ratas aun presentan un alto grado de inmadurez.
Desde el año 1978 en que apareció uno de los primero trabajos sugiriendo que el
GABA podía actuar como factor trófico (Wolff y col., 1978), posteriormente muchos
trabajos han reforzado esta idea, y en la actualidad se ha demostrado ampliamente que el
GABA puede estimular positivamente varias funciones esenciales para el desarrollo,
incluyendo migración neuronal, división celular y crecimiento neurítico (Owens y
Kriegstein, 2002). Más aún, es probable que dichas acciones sean el resultado del efecto
despolarizante que presenta el GABA en neuronas inmaduras. Laurie y col. postularon
que, dado que en el cerebro de las ratas las sinapsis maduras se forman entre las semanas
3ay 4° después del nacimiento, la mayoría de los receptores presentes antes de esta edad
serían extrasinápticos. Para lograr que el GABA ejerza su efecto neurotrófico, los
receptores GABAA deberian tener una mayor sensibilidad durante el desarrollo
embrionario, ya que las concentraciones del neurotransmisor serían probablemente más
bajas que las que se encuentran luego en las sinapsis. Esto coincidiría con los mayores
niveles de expresión de a2, a3 y a5 pre- y peri-natales y los niveles de ou post-natales
(Laurie y col., 1992). En nuestro laboratorio se ha probado que hasta el DE 14 sólo puede
ser detectado el sitio de unión de baja afinidad para el GABA, mientras que desde el DE
16 en adelante tanto el sitio de baja como el de alta afinidad coexisten (Flores y col.,
1986). Es interesante notar que la aparición del sitio de alta afinidad coincide con el
aumento rápido en la expresión de la subunidad al, lo cual fue observado tanto en las
placas autorradiográficas, como en el número de granos de plata expresado por las
neuronas GABAérgicas. Este resultado sería opuesto a lo propuesto por Laurie y col.,
aunque es muy probable que no sólo las subunidades estudiadas en el presente trabajo
estén comprometidas en determinar la afinidad del receptor GABAApor el GABA (Laurie
y col., 1992). Las subunidades a3 y a5 no han sido caracterizadas en esta Tesis y
previamente se ha demostrado in vitro que los receptores formados por 0.3B2'Yzy (158272
presentaron una sensibilidad mayor por el GABA que los receptores formados por alfizyz
(Malherbe y col., 1990; Sigel y col., 1990).
Por experimentos previos se ha sugerido que la conformación preferencial del
receptor GABAA incluye dos subunidades a, una [3 y dos y, ZaanZyn (Backus y col.,
1993) o bien dos a, dos B y una y, ZanZBnyn(Chang y col., 1996). La abundancia relativa
de cada subunidad estudiada, sugiere que la última podría ser la configuración más
frecuente en el LO, debido al nivel relativamente bajo de expresión de la subunidad y. La
expresión de otras isoforrnas de la subunidad y no se descarta, pero por ejemplo
Glencorse y col. han demostrado niveles muy bajos de la subunidad yl en pollos
postnatales de un día (Glencorse, y col.,. 1993), mientras que Harvey y col. demostraron
niveles muy bajos de expresión de la subunidad 74en el DE 18 (Harvey y col.,. 1993). La
metodología utilizada para realizar la hibridación in situ fiie básicamente igual en nuestro
trabajo y en los dos mencionados arriba, pero la detección de la marca en las placas
autorradiográficas en ambos trabajos se logró luego de tiempos de exposición mucho más
largos que los utilizados por nosotros (150 días para yl, y 14 días para 74), sugiriendo que
los niveles de expresión de ambas subunidades son mucho menores que los de yz.
Desgraciadamente no existen trabajos de este tipo que caractericen la expresión de la
subunidad y; en LO de pollos. En los colículos de la rata todas las isoformas de la
subunidad y presentaron niveles bajos (yl, yz) o muy bajos (73) durante el período
embrionario (Laurie y col., 1992), siendo y; la única que aumenta recién luego del
l’Í-\L ¡MM/1 —N/
nacimiento. La subunidad 74 ha sido encontrada únicamente en pollos por ahora (Harvey
y col., 1993).
3.2. Cambios en la expresión de los ARNm de algunas subunidades del
receptor GABAApor hipoxia.
Muy pocos trabajos han sido publicados hasta la fecha en relación a cambios en
los niveles de ARNm de diferentes subunidades del complejo receptor GABAA luego de
un proceso hipóxico o isquémico. En general, las dos técnicas más utilizadas para
determinar cambios en los patrones de expresión son: a) densitometría en placas
autorradiográficas luego de una hibridación in situ o b) transcripción reversa combinada
con reacción en cadena de la polirnerasa (RT-PCR). Ambas técnicas permiten estimar los
niveles de expresión de una determinada subunidad en cantidad total, pero ambas técnicas
presentan ciertas limitaciones. La densitometría no permite detectar pequeñas variaciones
en los niveles de expresión de un determinado ARNm dado el grado de resolución de la
misma. En nuestro caso en particular, si bien demostramos que cuando se realizó un
análisis microscópico se observaron cambios en la expresión de algunas subunidades
luego del tratamiento hipóxico (Tablas VIII y IX), los mismos no pudieron ser detectados
en el análisis densitométrico a pesar de que en algunos casos se observó una tendencia.
Por su parte, la técnica de RT-PCR puede detectar reducidas variaciones dada la
sensibilidad de la misma, pero como se parte de un homogenato total de un área particular
del SNC, es probable que cambios como los observados para la subunidad al en nuestro
caso (esto es, disminución en el número de granos por célula marcada y aumento en el
número de células marcadas por umz) no se perciban por compensación, ya que podría
ocurrir que la cantidad total de ARNm de partida sea la misma en el control y en los
animales tratados, independientemente de cual sea el tratamiento. Es por ello que
cualquiera de los dos tipos de análisis debería ir acompañado de un estudio microscópico
donde se pueda cuantificar el número de células marcadas por unidad de superficie y/o la
cantidad de marca por célula.
Los cambios observados luego del tratamiento hipóxico en la expresión de los
ARNm refiierzan la idea de que las alteraciones observadas probablemente no se deban a
una muerte celular de las neuronas GABAérgicas, sino más bien a una respuesta a la
injuria provocada ya que los cambios fueron específicos para cada subunidad y para cada
día embrionario. De haber ocurrido una muerte celular hubiera sido esperable una
disminución general de todas las subunidades. En un modelo en ratas con epilepsia
crónica del lóbulo temporal donde se demostró que ocurre una degeneración masiva en
las áreas CA3 y CAl del hipocampo, se observó disminución de la expresión de las
subunidades a2 y a. en dichas áreas pero, según los autores, el solo aumento de los
niveles de expresión de [33es indicativo de cambios en las neuronas que sobreviven y la
disminución de las subunidades alfa no es un reflejo de la muerte celular (Lauren y col.,
2003).
En nuestro trabajo, para evitar posibles diferencias debido por ejemplo a un
artefacto de técnica producto del corte hecho en el criostato, primero se consideraron para
cada DE, los cortes control que presentaron el mismo número de células (marcadas o no)
por unidad de superficie en la porción cefálica del LO. Los cortes provenientes de
embriones hipóxicos no presentaron diferencias en cuanto al número de células por
unidad de superficie respecto de los embriones control. Por esto los cambios en el número
de células marcadas reflejan directamente un cambio en el número de neuronas
GABAérgicas.
Luego del tratamiento hipóxico se observó que la subunidad a. presentó
disminución en el número de granos de plata por neurona GABAérgica, y un aumento en
el número de células expresando dicha subunidad. Es interesante notar que cuando se
produce la hipoxia fisiológica durante el desarrollo nonml a partir del DE l7, esta
subunidad presenta el mismo tipo de cambio. Esto es, reducción del número de granos de
plata por neurona GABAérgica entre los DE 16 y 18 y aumento en el número de células
positivas en los mismos días, aunque este último cambio resultó significativo sólo cuando
se compararon los DE 12 y 18. Cuando se consideró la variación observada en el nivel de
expresión de la subunidad BZluego de la hipoxia, se detectó una reducción en el número
de células GABAérgicas, lo cual también fue observado en los embriones control durante
el desarrollo normal del DE 12 al DE 18. Un patrón similar al de B2se detectó cuando se
analizó la subunidad yz luego del tratamiento hipóxico y durante el desarrollo normal.
Ninguna de estas dos subunidades presentaron cambios en el número de granos de plata
por neurona marcada luego de la injuria hipóxica ni durante el desarrollo. Es posible
hipotetizar entoncm, que al menos estas tres subunidades presentan algún tipo de
regulación por los niveles bajos de oxígeno. Se sabe que existen una serie de factores que
se activan luego de un proceso de hipoxia, denominados factores inducibles por hipoxia o
HIF (Wegner 2002). Como se mencionó en la introducción de esta Tesis, estas proteínas
son factores de transcripción y su activación permite su translocación al núcleo y
posterior aumento en la transcripción de determinados genes. Dichos genes presentan una
secuencia denominada HRE (elemento que responde a hipoxia), a la cual se pegan estos
factores (Bunn y Poyton, 1996; Semenza 1999). Dentro de HRE existe una zona,
denominada “sitio de unión al ADN de HIP-l” (HBS), cuya secuencia de nucleótidos es
(A/G)CGTG. Esta secuencia es necesaria pero no suficiente para una eficiente activación
de los genes por una injuria hipóxica. Dado que los HlF actúan aumentando la
transcipción de determinados genes y ya que en nuestro caso solamente a. mostró un
aumento de la transcipción (mayor número de células GABAérgicas), buscamos en las
bases datos disponibles en Internet si existía una secuencia HBS en la zona promotora de
dicho gen del receptor GABAA de la especie Gallus gallus (número de acceso
NM_204318). Si bien dicha secuencia no se encontró, no se puede descartar que no exista
ya que la secuencia 5’ no codificante disponible en las bases de datos hasta el momento
para este gen en pollos es muy corta, con lo cual si se encuentra o no río arriba de esta
porción no se conoce aún.
Es interesante remarcar que al menos para las subunidades al, [32y yz, los cambios
que se observan luego de la injuria son similares en algunos aspectos a lo que se produce
durante la embriogénesis cuando un proceso hipóxico fisiológico normal se presenta en el
desarrollo. Dados los cambios que se presentan durante el desarrollo normal en los
niveles de expresión de cada subunidad, es muy probable que las subunidades que forman
el receptor en el DE 12 no sean las mismas o al menos que no se encuentren en la misma
proporción que en el DE 18. Esto no se puede asegurar ya que no medimos niveles de
proteínas sino de ARNm. Como se demostró para el DE 12 con los estudios bioquímicos,
éste es más sensible a la injuria que el DE 18. Esto sumado a los cambios observados en
los patrones de expresión de las subunidades, hacen posible postular que durante el
desarrollo normal existe un cambio en la conformación del receptor hacia una forma más
estable para resistir un proceso hipóxico, el cual se producirá normalmente a partir del DE
17. Esta hipótesis también se plantea tomando en consideración que los embriones de los
días 17 y 18 detectan la injuria producida externamente, lo cual se evidenció como un
aumento significativo en los niveles de lactato.
Numerosos trabajos han demostrado que pequeños o moderados tratamientos de
tipo hipóxico o isquémico pueden conducir a una regulación metabólica o molecular
denominada fine-condicionamiento” (Chen y Simon, 1997; Rejdak y col., 2001), que
protege al SNC de posteriores injurias del mismo estilo. Se ha demostrado que dicho pre
condicionamiento se debe a un aumento en los niveles de HlF-la y HIP-IB (Bergeron y
col., 2000). Por lo tanto, es posible que la hipoxia fisiológica que se produce a partir del
DE 17 esté actuando como pre-condicionamiento en nuestro modelo, haciendo que las
modificaciones observadas luego del tratamiento hipóxico externo sean menores. Un
estudio detallado de los niveles de expresión de los HIF durante el desarrollo ayudarían a
corroborar o no esta hipótesis.
Las alteraciones en los niveles de ARNm de diferentes subunidades del receptor
GABAA han sido demostradas en trabajos experimentales previos. Se ha observado por
ejemplo:
- aumento en los niveles de al y a2 luego de una lesión isquémica cortical en
ratas, ipsilateral al sitio de la lesión (Neumann-Haefelin y col., 1999). Sin embargo a
pesar de haber tenido un aumento de tres veces por sobre los niveles control de cada
ARNm, el mismo grupo de investigadores había demostrado previamente que los niveles
de la proteína al se encontraban disminuidos (no significativamente) y los de a2
pemianecían constantes en el mismo modelo experimental (Neumann-Haefelin y col.,
1998)
- reducción generalizada luego de una isquemia cortical localizada de las proteínas
de las subunidades al, a2, a3, a5, y yz a diferentes tiempos post injuria (l, 7 y 30 días). En
algunas áreas contralaterales a la herida se observó un aumento de la expresión de la
proteína correspondiente a la subunidad a3 (Redecker y col., 2002).
- descenso de la expresión de los ARNm de las subunidades a2 y a4 y aumento de
la expresión de B3en las áreas CA3 y CAl del hipocampo en ratas con epilepsia crónica
del lóbulo temporal (Lauren y col., 2003).
- disminución general de los ARNm de las subunidades al, a2, a5, [32y yz, a
distintos tiempos post-hipoxia, en cultivos celulares de neuronas derivadas de un tumor
humano luego de 8 horas de hipoxia (Gao y col., 2004)
Si bien en algunos modelos se observaron cambios en los niveles de expresión de
las proteínas, no se conoce con exactitud si en todos los casos la pérdida de expresión de
los ARNm luego de una injuria hipóxica o isquémica conducen a un déficit funcional de
receptores GABAA.Existen reportes de pacientes con epilepsia del lóbulo temporal en los
cuales se detectaron niveles reducidos de proteínas de las subunidades (1., a3, B3y yz en el
área CA] del hipocampo en pacientes que además presentaron esclerosis de esta región.
I’fn'lH/¡Án —(‘
Contrariamente, en el resto del hipocampo se observó un aumento de la expresión de las
tres isoformas de la subunidad [3 y de los ARNm de B; y B3 (Pirker y col., 2003). En
muestras obtenidas de autopsias de pacientes con enfermedad de Huntington se observó
un aumento de la expresión de las proteínas ou y y; (Thompson-Vest y col., 2003). Por lo
tanto, existe una correlación entre algunas patologías y alteraciones en la expresión de las
subunidades del receptor GABAA. Si, como se supone, la pérdida de los ARNm altera la
neurotransmisión inhibitoria, entonces dicho proceso contribuiría al desarrollo de una
degeneración neuronal y sería de relevancia para la recuperación fimcional post-injuria.
a.Lic. Diego Javier Rodríguez Gil Dra. Sara Fiszer de azas
H
La mayor parte de los resultados presentados en esta Tesis han sido publicados en revistas
internacionales con rclcrato:
“l'lypoxia dil‘ferenlially reduccs Bum in GABAA receptor during embryonic chick
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![Alteraciones Electroliticas en Diarrea Aguda[1]](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/54655e08b4af9fda3f8b4b41/alteraciones-electroliticas-en-diarrea-aguda1.jpg)
