Analisi Biochimico-Cliniche Fattori pre- analitici

Analisi Biochimico-

Cliniche

Analisi Biochimico-

Cliniche

Fattori Fattori pre-pre-

analiticianalitici

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La fase preanaliticaLa fase preanaliticaSerie di procedimenti:Serie di procedimenti: preparazione del paziente raccolta trasporto conservazione manipolazione del campione

biologico, trasferimento di una sua

aliquota nella miscela di reazione.

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La fase preanaliticaLa fase preanalitica

A questi procedimenti partecipano più operatori, spesso eterogenei, appartenendo in parte ai reparti di degenza o al personale addetto agli ambulatori, in parte al personale del laboratorio.

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Preparazione del paziente

Preparazione del paziente

Possono influenzare la concentrazione di alcuni analiti: il tipo d’alimentazioneil tipo d’alimentazione

l’assunzione di bevande l’assunzione di bevande alcoliche alcoliche

di farmacidi farmaci lo stress lo stress

l’affaticamento l’affaticamento

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L’alimentazioneL’alimentazioneInfluenza assunzione di

carboidraticarboidrati nei giorni precedenti sulla prova di tolleranza al glucosio:tolleranza al glucosio: una dieta ricca in carboidrati è

causa di un appiattimento della curva glicemica;

viceversa, una dieta povera di carboidrati la esalta.

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L’alimentazioneL’alimentazioneIl tenore in grassigrassi della dieta

può influenzare la concentrazione plasmatica dei componenti lipidici del sangue. Pasto ricco in trigliceridi trigliceridi può fortemente

influenzare la trigliceridemia fino ad aumentarla del 100%, anche dopo un digiuno di 12 ore, tempo normalmente sufficiente per portare tutti gli analiti in condizioni basali.

Pasto ricco di colesterolocolesterolo influenza poco la colesterolemia misurata il giorno dopo: non più del 2-3%.

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L’alimentazioneL’alimentazione

Incremento fosfatasi alcalinafosfatasi alcalina da 2-4 ore dopo il pasto, dovuto ad un dell’isoenzima intestinaledell’isoenzima intestinale. .

Alto consumo di acidi grassi acidi grassi insaturiinsaturi dà luogo ad una colesterolemiacolesterolemia (applicazioni terapeutiche).

Escrezione urinaria di acido 5-5-idrossiindolacetico idrossiindolacetico nel caso di ingestione di abbondati quantità di banane, pompelmi e dolcibanane, pompelmi e dolci contenenti vaniglia.

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Assunzione di bevande alcoliche

Assunzione di bevande alcoliche

L’alcolL’alcol ha l’effetto di , anche a breve termine, lattato, acidolattato, acido uricourico e a lungo termine l’attività di diversi enzimi plasmatici come la AST e la AST e la --GTGT (dopo 60 ore ancora valori elevati).

Anche la trigliceridemiatrigliceridemia e l’HDLl’HDL aumentano considerevolmente nell’abuso cronico di alcol.

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I farmaciI farmaciFarmaco può avere attività attività

biologiche collateralibiologiche collaterali che causano modificazioni della concentrazione di uno o più analiti, oltre all’effetto che il farmaco si prefigge.

I metabolitimetaboliti possono essere causa di interferenze biologiche.

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I farmaciI farmaciInterferenza di natura fisico-Interferenza di natura fisico-

chimicachimica sul procedimento analitico. Farmaco, o suo catabolita, si combina all’analita da misurare, oppure vera e propria interferenza verso le reazioni del procedimento analitico Le attività degli enzimi plasmaticienzimi plasmatici, e così

pure i procedimenti analitici basati su reazioni enzimatiche, sono particolarmente esposte alla interferenza da farmaci.

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L’esercizio muscolareL’esercizio muscolareSe intenso e su individui non allenati,

causa modificazioni della concentrazione di molti parametri di laboratorio. Questi effetti possono essere transitori transitori

rapida diminuzione, e seguente aumento, nella concentrazione degli acidi grassi liberi, marcato aumento dell’alanina e dell’acido lattico (triplicato).

duraturiduraturivariazioni a carico degli enzimi plasmatici: CK,

aldolasi, LDH, transaminasi; l’attività della CK può risultare raddoppiata nelle 12-30 ore dopo attività sportiva intensa e ancora dopo 50 ore si può riscontrare un aumento fino al 40%.

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L’esercizio muscolareL’esercizio muscolare

Altre modifiche dovute ad esercizio prolungato si riferiscono agli ormoni ormoni sessualisessuali: dopo 6 mesi di allenamento il testosterone, l’androstenedione e l’LH aumentano del 20-25%.

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DigiunoDigiunoDigiuno prolungatoDigiuno prolungato, più di 24

ore, può determinare inaspettate variazioni dei dati di laboratorio: la bilirubina aumenta di due volte

dopo un digiuno di 48 ore, la glicemia dopo tre giorni si

attesta su valori sotto i 50 mg/dL, la concentrazione di trigliceridi,

acidi grassi e glicerolo aumenta senza contemporanei aumenti del colesterolo.

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Effetto della posturaEffetto della posturaPassaggio dalla

posizione supina alla posizione eretta ha come conseguenza la fuoriuscita di acqua e componenti filtrabili dal compartimento vascolare a quello interstiziale;

Componenti non filtrabili, (proteine, enzimi, calcio, il ferro legati alle proteine ecc.) divengono più concentrati nel plasma. Significative variazioni tra i pazienti ambulatoriali e quelli in regime di degenza

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Modalità del prelievoModalità del prelievoTra i liquidi biologici, il sanguesangue è di

gran lunga il più comunemente usato nel laboratorio di analisi. Le procedure per ottenerne un campione sono tre: puntura venosa, puntura arteriosa e puntura della pelle, quest’ultima per ottenere il cosiddetto sangue "capillare”capillare”

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Raccolta e trattamento dei campioni: sangue venoso

Raccolta e trattamento dei campioni: sangue venoso

Sangue venosoSangue venoso:: Usato per le indagini chimico cliniche. Povero in O2 e differisce nella concentrazione di CO2 e nel pH; glucosio, ammonio e glucosio, ammonio e lattatolattato variano a seconda delle necessità dei tessuti irrorati da cui il sangue deriva.

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Modalità del prelievo: prelievo venoso


La stasi venosastasi venosa mediante laccio emostatico, necessario per evidenziare le vene e facilitare il prelievo, può essere causa di errori preanalitici, se la stasi si protrae per > 1-2 minuti:> 1-2 minuti:

fuoriuscita di acqua e di sostanze filtrabili, secondaria all’aumento della pressione nel vaso, e l’ipossia.

Stasi prolungata, associata ad esercizio fisico della mano, aggiunge a emoconcentrazione effetto metabolico (di ioni idrogeno del 30%, di acido lattico di oltre il 100%, di sodio del 3%, di potassio del 15%)

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Limitare a non oltre un minuto Limitare a non oltre un minuto la stasi venosa!! la stasi venosa!! (segnalare al laboratorio le situazioni di prelievo difficoltoso).

Campione di sangue prelevato dalla vena mediana o dalla vena cubitale profonda, o in caso di necessità da una vena del dorso della mano.

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Raccolta e trattamento dei campioni: sangue arteriosoRaccolta e trattamento dei campioni: sangue arterioso

Sangue arteriosoSangue arterioso: ossigenato, usato per lo studio dei parametri dell’equilibrio acido-base e della tensione dei gas presenti nel sangue (ossigeno, anidride carbonica) per aver informazioni preziose sulla funzionalità respiratoria. Composizione costante in tutti i distretti del corpo.

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Raccolta e trattamento dei campioni: sangue arteriosoRaccolta e trattamento dei campioni: sangue arteriosoL’esecuzione del prelievo è molto più laboriosa (e anche più dolorosa) di quella del sangue venoso personale addestrato.Deve essere conservato nella stessa

siringa del prelievo, con l’ago tappato per evitare modificazioni del contenuto dei gas presenti nel sangue a causa di scambi con l’aria. Evitare che all’interno del campione vi siano bolle d’aria.

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Modalità del prelievo: prelievo arterioso

Modalità del prelievo: prelievo arterioso

Immediatamente dopo il prelievo, la siringa o il capillare contenente il campione devono essere inviati al laboratorio in un contenitore con acqua e acqua e ghiaccioghiaccio, allo scopo di rallentare il metabolismo delle cellule del sangue che in breve tempo altererebbe sia il pH sia il contenuto dei gas del sangue.

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Raccolta e trattamento dei campioni: sangue

"capillare“

Raccolta e trattamento dei campioni: sangue

"capillare“ Sangue "capillareSangue "capillare“:“: Ottenuto per

puntura della pelle ai bambini piccoli, ai soggetti con profonde ustioni, ai soggetti obesi e a diabetici sono sottoposti a continui prelievi.

Negli adulti può essere ottenuto dal lobo dell’orecchio o dal polpastrello di un dito, nei neonati dal calcagno.

Miscela di sangue di derivazione arteriolare, venulare e capillare, oltre alla presenza di liquido interstiziale.

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DisinfezioneDisinfezione

Indispensabile per la parte ove avverrà il prelievo: sostanze efficaci e che non diano luogo a fenomeni di interferenza per l’esame richiesto. Alcol al 70% si è dimostrato

efficace e viene ampiamente usato anche se presenta qualche rara limitazione, come nel caso di dosaggio dell’alcolemia.

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Strumenti per il prelievo di sangue

Strumenti per il prelievo di sangue

Lancette, aghi, siringhe, cannule, cateteri, pipette, provette di vetro e di plastica, sistemi sistemi siringa-contenitore a siringa-contenitore a circuito chiuso sotto circuito chiuso sotto vuoto (tipo vuoto (tipo vacutainer).vacutainer). Devono essere sterili, chimicamente inerti, molto efficienti per quanto riguarda la penetrazione attraverso la cute e, conseguentemente, poco traumatizzanti.

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SieroSieroSieroSieroSangue intero senza senza anticoagulantianticoagulanti.

La coagulazione coinvolge la parte corpuscolata e i fattori plasmatici della coagulazione

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SieroSieroSieroSieroCellule inglobate nel coagulo

subiscono danni e inducono la liberazione di parte del contenuto cellulare. Variazione significativa di alcuni parametri biochimici nel siero rispetto al plasma.

Concentrazione del potassiopotassio, fosfatasi acida e la lattico fosfatasi acida e la lattico deidrogenasideidrogenasi >rispetto a quella del plasma.

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PlasmaPlasmaSangue intero con con anticoagulantianticoagulanti contiene il fibrinogeno e i fattori della coagulazione. Non risente del trauma della coagulazioneno emolisi.

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PlasmaPlasmaIndispensabile per la misura dei

fattori della coagulazionefattori della coagulazione e per l’esame emocromocitometrico e la velocità di eritrosedimentazione.

Più adatto nell’urgenza,nell’urgenza, ottenuto rapidamente per centrifugazione del campione senza attendere il tempo necessario alla coagulazione.

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Anticoagulanti e conservanti


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EparinaEparinaMucopolisaccaride acido il cui PM varia moltissimo a seconda della preparazione. Esiste come sale di potassio e di sodio,di litio o di ammonio. Inibisce la trombina e altri fattori della coagulazione.

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EparinaEparinaDotata di un PM elevato è

l’anticoagulante ideale qualora si voglia misurare la osmolalità plasmatica o studiare la fragilità osmotica eritrocitaria.

Non utilizzabile per indagini coagulative, dosaggio del litio o dell’ammonio, calcio e magnesio. Forma complessi non rilevabili dagli elettrodi ionosensibili.

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EDTAEDTAAcido etilendiamminotetraaceticoAcido etilendiamminotetraacetico

il più frequentemente usato. Azione anticoagulante: sequestra lo ione calcio che diventa indisponibile per le reazioni della cascata coagulativa che rimane così inibita.

Pur essendo l’anticoagulante di scelta per l’emocitometria, già dopo 3-4 ore dal prelievo, il sangue raccolto su EDTA non è più idoneo per studi morfologici.

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EDTAEDTAPotente inibitore di molti

enzimi eritrocitari, leucocitari, piastrinici e plasmatici, non consente misure dell’attività di questi come pure dell’attività piastrinica.

Non usare per la determinazione degli elementi pesanti come ferro e rame perché anch’essi vengono sequestrati.

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Altri anticoagulantiAltri anticoagulanti

Citrato.Citrato. Il citrato di sodio viene impiegato per la misura della VES, per lo studio dei fattori della coagulazione e della funzionalità piastrinica.

OssalatoOssalato. Ossalato doppio di ammonio e di potassio, è il chelante del calcio usato più raramente.

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Altri anticoagulantiAltri anticoagulanti

Sostanze stabilizzantiSostanze stabilizzanti. Mantengono inalterata nel tempo la concentrazione di sostanze da dosare. Per esempio, i fluoruri o fluoruri o il monoiodioacetato, il monoiodioacetato, che inibiscono la glicolisi, trovano impiego quando non si possa dosare il glucosio in tempi brevi dal prelievo.

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La presenza dell’anticoagulante in soluzione, diluisce il campione: rispettare sempre il

rapporto raccomandato tra volume di anticoagulante e volume di campione.

Diffusione di prelievo con contenitori sotto vuoto ha contribuito in maniera sostanziale alla risoluzione di questi problemi.

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Anticoagulanti e conservantiUso di gel separatori,

che con la centrifugazione del campione si interpongono tra il siero e la parte corpuscolata del sangue, migliora la conservazione degli analiti e previene interferenze dovute al contatto delle cellule con alcuni analiti del plasma,glucosio che viene

consumato dal metabolismo cellulare e per il potassio che può aumentare nel plasma per la fuoriuscita dagli elementi cellulari.

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Trasporto e conservazione


Dalla sede di raccolta al laboratorio, è importante rispettare le esigenze del tempo di conservazione degli tempo di conservazione degli analitianaliti, e delle condizioni fisico-chimiche che possono alterarne la concentrazione.

All’interno dell’ospedale il trasferimento avviene ad opera di infermieri o di personale specificamente incaricato dei trasporti interni.

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I materiali provenienti dai reparti arrivano direttamente ai singoli laboratori oppure in una sede centralizzatasede centralizzata per il processo iniziale dicentrifugazione distribuzione ai laboratori di analisi.

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CentrifugazioneCentrifugazione

La separazione del siero e del separazione del siero e del plasma dalla parte corpuscolataplasma dalla parte corpuscolata è essenziale per la conservazione degli analiti che possono subire alterazioni in presenza delle cellule.fuoriuscita di potassiopotassio dalle

cellule, dove si trova alla concentrazione di circa 150 mEq/L, al plasma, dove la sua concentrazione è di circa 4 mEq/L.

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CentrifugazioneCentrifugazione

Se non di separa immediatamente plasma o siero dalla parte corpuscolata è preferibile conservare il campione a temperatura ambiente piuttosto che in frigorifero. bassa temperatura rallenta i processi

metabolici cellulari che mantengono attivamente il gradiente del potassio e di altri componenti tra il compartimento intracellulare e quello extracellulare.

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EmolisiEmolisiRottura dei globuli rossi: Rottura dei globuli rossi:

liberazione del loro contenuto nel siero o nel plasma che di conseguenza assume una colorazione dal rosato al rosso in funzione della quantità di emoglobina liberata. Visibile per Hb> 200-300 mg/L.

Normalmente Hb libera nel siero <50 mg/L e nel plasma <20 mg/L.

Uno dei più importanti fattori che causano interferenze nelle determinazioni su campioni di siero e di plasma.

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Cause di emolisiCause di emolisi biologica biologica

anemie emoliticheanemie emolitiche: fragilità corpuscolare, difetti della normale morfologia eritrocitaria (sferocitosi), deficienze di enzimi eritrocitari (glucoso-6-fosfato deidrogenasi, piruvico chinasi), emoglobinopatie, anticorpi acquisiti in seguito a trasfusioni (emolisine), eritroblastosi fetale, anemie emolitiche autoimmuni; infezioni, assunzione di farmaci ed effetto di agenti fisici (ustioni, protesi intracardiache, ecc.)

meccanicameccanica aghi da prelievo troppo sottiliaghi da prelievo troppo sottili, aspirazione eccessiva durante

il prelievo di sangue, pressione troppo elevata sullo stantuffo al momento dell’espulsione del sangue dalla siringa quando non si toglie l’ago, agitazione troppo vigorosa della provetta

chimica od osmoticachimica od osmotica presenza sulla pelle al momento del prelievo, nell’ago della

siringa o nei contenitori di disinfettantidisinfettanti, detergenti, acqua o altre sostanze chimiche

fisicafisica conservazione del campione in condizioni non idonee: il

congelamentocongelamento provoca la cristallizzazione dell’acqua endoeritrocitaria la rottura delle membrane e quindi la lisi degli eritrociti

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TorbiditàTorbiditàPercepibile quando la concentrazione dei trigliceridi > i 400 mg/dL trigliceridi > i 400 mg/dL (lattescenza).

Interferenza di natura natura spettrofotometricaspettrofotometricaassorbimento ottico aspecifico delle particelle in sospensione.

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TorbiditàTorbiditàInterferenza specifica in diversi procedimenti analitici particolarmente quelli che fanno uso di enzimi. trigliceridi possono inibire l’attività dell’ureasi e dell’ureasi e dell’uricasidell’uricasi enzimi impiegati nel dosaggio dell’azotemia e dell’uricemia.

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EvaporazioneEvaporazioneEvaporazioneEvaporazioneCausa aumento della concentrazione degli analiti: campione, separato dalla parte corpuscolata, viene trasferito in contenitori o coppette sullo strumento e rimane esposto all’aria: evaporazione!evaporazione!

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Temperatura e umidità Temperatura e umidità relativarelativa

Temperatura e umidità Temperatura e umidità relativarelativa

TemperaturaTemperatura ambiente(21°-23°C), umidità relativaumidità relativa (60-70%), evitare eccessiva ventilazione dei locali. Per urine, abbassamento da 37°C

alla T ambiente, e modificazioni del pH, causa precipitazione di saliprecipitazione di sali come urati e fosfati che trascina altre sostanze e componenti cellulari.

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Altri fattori preanaliticiAltri fattori preanalitici

COCO22 evapora dal plasma (campione tappato!)diminuzione di 5 mMol/L in

un’ora, aT ambiente.

Perdita CO2 causa un pH del siero (pH8.5 in 2 h) e distruzione della fosfatasi fosfatasi acidaacida.

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Conservazione campioniConservazione campioniMetodo ideale di conservazione:

separazione dai globulirapido raffreddamento a -80°C-80°Ca -20°C-20°C dà identici risultati per un

periodo di almeno 6 mesi.Alterata permeabilità delle membrane

degli eritrociti portano ad un aumento della potassiemia potassiemia quando il sangue non è separato dai globuli. Sangue a 4°C la perdita di potassio da

eritrociti sarà maggiore per rallentamento pompa sodio-potassio.

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Criteri di non accettabilità dei campioni biologici


Identificazione assente Identificazione incompleta Mancanza di informazioni necessarie

per l’esecuzione dei test Contenitore inidoneo (non conforme

alle indicazioni o necessità del laboratorio, non sterile e/o a imperfetta chiusura, non esente da metalli in tracce, ecc)

Contenitore non integro Prelievo non corretto (effettuato

durante terapia infusionale, senza impiego di terreni di trasporto, ecc)

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Quantità insufficiente Rapporto sangue/anticoagulante

inadeguato o scorretto Mancata aggiunta di idoneo

conservante Presenza di coaguli (per esempio

emocromo, test coagulativi) Emolisi evidente Conservazione a temperatura non

corretta (emogasanalisi, ammoniemia, ecc)

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Esposizione a luce solare diretta Congelamenti e scongelamenti

ripetuti Paziente non a digiuno per esami

come glicemia e/o lipidemia Paziente non sottoposto al

previsto regime dietetico (per esempio sangue occulto)

Pazienti non a riposo per test in cui il riposo è indispensabile (per esempio dosaggio renina)

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Accettazione e centrifugazioneAccettazione e

centrifugazioneAll’arrivo in laboratorio, il materiale è

controllato per verificare se sono state adottate tutte le misure preanalitiche necessarie alla sua integrità. In caso contrario i campioni saranno respinti

Il reparto di provenienza deve essere prontamente avvisato della inidoneità del materiale e della necessità di un altro campione.

Il campione di sangue va quindi centrifugato per ottenere il siero (dopo 30’ a T ambiente) o plasma.

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La centrifugazioneLa centrifugazione

Eseguita a 1100 x g1100 x g per 15' per 15' oppure a 3000 x g3000 x g per 10’. per 10’. Il numero dei giri per minuto da impostare sulla centrifuga può essere calcolato per ogni centrifuga con la formula:

g = 1.118 x 10-5 x r x n2g = 1.118 x 10-5 x r x n2 ove : r = raggio in cm del

braccio della centrifuga; n = numero di giri per minuto

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La centrifugazioneLa centrifugazione

Le provette vanno tenute obbligatoriamente tappate,tappate, per motivi di sicurezza, in ogni fase della manipolazione del campione. Al momento opportuno il tappo va tolto con molta precauzione per evitare sia spargimenti di materiale potenzialmente dannoso per l’operatore, sia il rimescolamento delle fasi separate.

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La centrifugazioneLa centrifugazione Migliore separazioneMigliore separazione dei

globuli da siero o plasma, si possono usare delle barriere fisiche che si interpongono tra le due fasi: da granuli o granuli o gelgel già presenti nelle provette, o aggiunti prima della centrifugazione, costituiti di materiale con una densità intermedia, che durante la centrifugazione vanno a disporsi tra i globuli e la parte liquida. La presenza di questi separatori migliora indirettamente la conservabilitàconservabilità del campione.

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