I BIOSENSORI

Sono dei dispositivi analitici costituiti

da 3 componenti principali

Funzionamento

processi di “bio-reconoscimento” che produce risultati trasferiti ad

un trasduttore

Proprietà

I biosensori sono caratterizzati da:

•alta selettività, basata sul riconoscimento bio-specifico;

•alta sensibilità, fino alle parti per miliardo (ppb);

•ridotte dimensioni: possibilità di analisi in situ.

La componente biologicaPuò essere costituita da:

Enzima

• Anticorpo

• DNA

• Recettore

• Cellule intatte

• Tessuti

E’ importante l’intimo contatto tra il bioelemento ed il trasduttore per:

•Diminuire il tempo di risposta

•Ridurre l’effetto degli interferenti

•Minimizzare la quantità del biocomponente

Chimici:

• Trasformazione chimica

• Trasformazione fisica

• Processo elettrochimico

• Spettroscopia

• Altro

Biologici:

• Trasformazione biochimica

• Trasformazione fisica

• Effetto su organismo di test

• Spettroscopia

• Altro

Fisici:

• Termoelettrico

• Fotoelettrico

• Fotomagnetico

• Elettromagnetico

• Termoelastico

• Elettroelastico

• Termomagnetico

• Termoottico

• Fotoelastico

• Altro

Principio di trasduzione/effetto fisico-chimico

Variabile misurata

Acustici

• Ampiezza e fase di un’onda

• Spettro

• Velocità dell’onda

Biologici

• Biomassa (tipo, concentrazione)

Chimici

• Componenti, concentrazione

Magnetici

• Ampiezza e fase campo magn.

• Conducibilità

• Permittività

Ottici

• Ampiezza e fase di un’onda

• Velocità dell’onda

• Indice di rifrazione

• Emissività, riflettività

Meccanici

• Posizione (lineare, angolare)

• Accelerazione

• Forza

• Sforzo/tensione (Stress), pressione

• Deformazione (Strain)

• Massa, densità

• Momento, torsione

• Velocità di flusso, rate di massa

• Forma, ruvidezza

• Rigidità, cedevolezza

• Viscosità

• Cristallinità, struttura

Radiazione

• Tipo

• Energia

• Intensità

Termici

• Temperatura

• Flusso

• Calore specifico

• Conducibilità termica

Segnale

secondario

Segnale

Primario

Meccanico Termico Elettrico Magnetico Radiazione Chimico

Meccanico(Fluidi) Effetti

meccanici e acustici:

Diaframma, sonde

eco

Attrito (Calorimetro

da attrito)

Raffreddamento

(thermal mass flow

meter)

Piezoelettricità

Piezoresistività

Resistenza, capacità ed

effetti induttivi

Effetti

magnetomeccanici:

Es.

piezomagnetismo

Sistemi fotoelastici

(Stress-induced

birefringence)

Interferometri, effetti

Segnac e Doppler

TermicoEspansione termica

(strisce bimetalliche,

termometri con liquidi

e gas)

Effetto radiometrico

Effetto Seebeck

Termoresistenze

Piroelettricità

Rumore termico

Effetti termoottici

(Es. in cristalli

liquidi), emissione di

radiazione

Attivazione di

reazioni: Es.

Dissociazione

termica

ElettricoEffetti elettrocinetici

ed elettromeccanici:

Piezoelettricità,

elettrometri, legge di

Ampere

Effetto Joule

Effetto Peltier

Collettori di cariche,

Langmuir Probe

Legge di Biot-Savart Effetti elettroottici:

Effetto Kerr

Effetto Pockels

Elettroluminescenza

Elettrolisi

Elettromigrazione

MagneticoEffetti

magnetomeccanici:

Magnetocontrazione

magnetometria

Effetti termomagnetici

effetto Righi-Leduc

Effetti termomagnetici

Effetto Ettinghausen

Effetto Ettinghausen-

Nerst

Eff.Galvanomagnetici

Effetto Hall,

magnetoresistenze

Effetti magnetoottici:

Effetto Faraday

Effetto Cotton-

Mouton

Radiazione Pressione da

radiazione

Bolometri, termopile Effetti fotoelettrici:

Effetti fotovoltaici e

fotoconducibilità

Effetti di

fotorifrangenza:

bistabilità ottica

Fotosintesi,

dissociazione

ChimicoIgrometri, cella di

elettrodeposizione,

effetto fotoacustico

Calorimetro,

conducibilità termica,

Celle

Potenziometria,

conduttimetria,

amperometria, ionizzazione

a fiammma, effetto Volta,

Effetto di campo (rivelazione

di gas)

Risonanza

magnetica nucleare

(Emisssione ed

assorbimento)

Spettroscopia

Chemiluminescenza

Principi fisici e chimici di trasduzione

Altre classificazioni

Materiale

• Inorganico / organico

• Conduttore / isolante

• Semiconduttore

• Liquido, gas o plasma

• Sostanze biologiche

Dimensioni

• Microsensori

• Nanosensori

Campo di applicazione

• Agricoltura

• Ingegneria civile

• Distribuzione, commercio

• Energia

• Medicina, salute

• Settore manifatturiero

• Militare

• Ricerca

• Trasporti

• Automotive

• Applicazioni domestiche

• Ambiente, meteorologia

• Informatica, telecomunicazioni

• Marina

• Tempo libero

• Spazio

Alcuni dati di mercato

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

Mil

iard

i d

i d

oll

ari

Senso

ri di fl

usso

Senso

ri di p

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Senso

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Senso

ri chim

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Senso

ri binar

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Senso

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Senso

ri di te

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ratura

Senso

ri di p

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one

Senso

ri gas

di s

caric

o

Senso

ri ottic

i

Mercato mondiale per i sensori più diffusi

1988

1995

Oggi si stima un mercato complessivo dell’ordine dei 20 miliardi di dollari

2005

Problemi

•Perdita delle funzionalità nel tempo;

•Il tessuto biologico è fortemente influenzato dalla temperatura e dal pH (forza

ionica, parti acide/basiche);

•La forza ionica modifica il sito recettore;

•Il tempo di vita del sensore è breve

•Il tempo di risposta è determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione

(lento).

Due classi di processi bio-ricognitivi:

•Riconoscimento bioaffine:

il trasduttore percepisce il legame fra recettore e ligando come variazione

di dimensione / forma: es.: reazioni anticorpo-antigene;

•Riconoscimento biometabolico:

il trasduttore percepisce le alterazioni chimiche dovute alla reazione,

come cambi della concentrazione dei prodotti e dei reagenti, o come

calore specifico di reazione: es.: reazioni enzima-substrato.

Esempio: reazione antigene-anticorpo

Cinetica delle reazioni di bioaffinità:

La reazione che regola il legame anticorpo, Ab, (specie reagente) al suo antigene,

Ag, (specie attiva) è descritta dalla seguente reazione:

RICONOSCIMENTO BIO-AFFINE

Esempio: reazione enzima-ricettore

Cinetica delle reazioni di riconoscimento bio-metabolico:

Il substrato, S, presente in soluzione, entra in contatto con l’enzima, E, sulla

membrana per creare un complesso intermedio S·E che darà origine al prodotto

della reazione, P.

RICONOSCIMETO BIO-METABOLICO

Cinetica non lineare: non usata direttamente per rilevare la concentrazione del

prodotto di reazione

Cinetica descritta da eq. Michaelis-Menten:

Immobilizzazione dei bio-elementi

Legame biotina-avidina

La componente elettronica

È costituita da:

•Sistema di condizionamento del segnale

•Display

•Data processor

•Sistema di memorizzazione

Biosensori basati su enzimi

• Buona sensibilità

• Buona stabilità

• Elevata attività e selettività

• Risposta lineare

• E’ necessario purificare l’enzima

Metodi amperometrici

I metodi amperometrici consistono nella misura, attraverso una cella elettrochimica,

della corrente, che è proporzionale alla concentrazione della specie attiva.

3 generazioni di biosensori amperometrici:

1.Elettrodo in Pt, adatto solo per 02, H2, H2O2;

2. Mediatori, ovvero altre sostanze (enzimatiche) che vengono ossidate o

ridotte e reagendo con la specie chimica attiva danno un segnale (es:

ferrocene, quinones, etc..);

3. Elettrodi modificati, dotati di sostanze organiche, o sali, che interagiscono

direttamente con la specie attiva.

1.Trasduttori amperometrici

➢Risposta lineare

➢Facilità di costruzione

➢Strumentazione a basso

costo

➢Sensibilità ridotta

➢Soggetti ad interferenze

➢Consumo di reagenti

La concentrazione di glucosio può essere stimata attraversouna misura

➢dell’ossigeno consumato (inversamente prop.)

➢l’acqua ossigenata prodotta (direttamente prop.)

Clark Oxygen Electrode

-+

Platinum cathode

Polyethylene membrane

Silver anode

Electrode body

KCl soln.

a +650mV vs riferimento Ag/AgCl

in corrispondenza della superfice

metallica H2O2, è ossidata:

H2O2 →2H + +O2 +2e−

Sensore ad ossigeno

Accoppiamento con un gran numero di enzimi ossidasi.

La glucosio ossidasi catalizza la seguente reazione in due passaggi:

Glucosio + H2O ----GOD----> Acido gluconico + H2O2

La glucosio ossidasi è immobilizzata sulla membrana a gas del sensore:

Si misura la corrente dovuta alla riduzione di O2 o ossidazione H2O2 varia linearmente

con concentrazione del glucosio in soluzione.

Biosensore commerciale per misurare glucosio nel sangue

➢Strips usa e getta

➢Costo limitato

➢Numero molto elevato di determinazioni

➢Risposta del biosensore in presenza di glucosio

Elettrodi a NADH

Il NADH è una molecola coinvolta in circa 250 reazioni che utilizzano enzimi

deidrogenasi.

Questo cofattore enzimatico in presenza dell'enzima e del substrato passa

dalla forma ossidata NAD+ alla forma ridotta NADH.

Questa forma ridotta viene riossidata per via elettrochimica utilizzando un

sensore amperometrico a grafite.

2. Biosensori amperometrici di seconda

generazione

➢Prevedono la presenza di

un mediatore di trasferimento

elettronico che accetta gli

elettroni dall’enzima e li

trasferisce all’elettrodo ad un

potenziale vicino allo zero

➢Sono meno soggetti alle

interferenze

➢ Richiedono una minore

quantità di bioelemento

Reazioni nel sensore:

Fc Fc+ + e- (measurato)

GOR + 2 Fc + --> GOox + 2 Fc

ferrocene

3. Elettrodi modificati, dotati di sostanze organiche, o sali, che interagiscono

direttamente con la specie attiva non soltanto fornendo elettroni, ma anche liberando

ioni

Limite di rilevazione: da 10-9a 10-8 Molare

Limite di linearità: da 10-7a 10-3 Molare

E : enzima S : substrato da analizzare P: prodotto di reazione CR: co-reattante Med: mediatore

Sono utilizzati per seguire reazioni enzimatiche che producono:ioni idrogeno,

ammoniaca,

anidride carbonica,

cianuro,

Ioduro.

Proprietà➢Piccole dimensioni

➢Costo esiguo

➢Risposta non lineare

➢Selettività limitata

La relazione tra potenziale misurato e la concentrazione della specie in esame non

è di tipo logaritmico:

➢espande considerevolmente il "range" di misura (range ristretto a 1-2 decadi di

concentrazione nella misura amperometrica)

➢diminuisce la sensibilità della misura non consentendo un certo numero di

applicazioni

Biosensore per la determinazione della formaldeide

• La formaldeide in aria viene trasferita in fase acquosa

• La sua determinazione avviene in seguito alla produzione di acido formico da parte

della formaldeide deidrogenasi

Biosensore per la determinazione dell’urea

➢•L’ureasi catalizza la reazione di idrolisi dell’urea

➢La produzione di NH4+ e HCO3- è rilevata per via conduttimetrica

Esempi

Urea + H2O + H+ ureasi

2NH4+

+ HCO3-

Creatinina + H2O creatinasi

N-metildantoina + NH4+

Penicillinapenicillinasi

Acido Penicillonico

In contatto con electrodo pH.

Determinazione dell'urea

Come il glucosio, l'urea è un metabolita importante per il quale si utilizza un

biosensore.

L'enzima usato per la determinazione dell'urea è l'ureasi :

Urea + H2O -------> 2 NH3 + CO2

Poiché CO2 è endogeno nel sangue, si misura ammoniaca utilizzando o un

sensore ad ammonio o un sensore ad ammoniaca (gas).

Sensore ad NH3 accoppiato con l'enzima ureasi immobilizzato su di un

supporto poroso a base di allumina.

l'enzima immobilizzato catalizza la trasformazione di urea in ione ammonio

(optimo pH e temperatura) convertito poi in ammoniaca (sulla superficie del

sensore dà un segnale proporzionale alla concentrazione di urea).

La determinazione della azotemia e glicemia è una delle analisi più

frequenti nel laboratorio medico.

Sensori per misurare entrambi i metaboliti contemporaneamente:

cella per la misura dell'ossigeno e della CO2 nel sangue all'interno

della quale sono stati inseriti un sensore a glucosio ed uno ad urea

Sensore conduttometrico basato su tirosinasi

Il substrato è ridotto elettrochimicamente a catecolo e si misura la corrente prodotta

detection limits ≈1 ppb

dynamic range 2.3–2330 ppb

Tyr

Tyr

Biosensori elettrochimici per gli inibitori della acetilcolinesterasi ( AchE)

Tecniche di analisi per la determinazione dei pesticidi

Determinazione dell'attività dell'inibizione dell'acetilcolinesterasi da parte di

insetticidi carbammati organofosfati e tiofosfati:

•limiti di rilevabilità (DL) inferiori ai limiti imposti dalla comunità europea,

•minime procedure di estrazione del campione

•apparecchiature portatili accoppiate ad elettrodi miniaturizzati (screen printed

electrodes).

Misuratori del glucosio nel sangue

The first practical blood glucose meter was invented in 1968 by Tom Clemens and eventually produced by Bayer Corporation

[10]. Since then the glucose meter has been developing rapidly. Over the past 40 years, it has undergone five phases (Fig. 1).

The 1st generation meter was what we call the washed blood glucose meter. It was developed by Bayer in 1970. It was

used in the same way as pH test paper, relying on colorimetric cards for color contrast. As it required the operator to wipe

the blood off, it was not very user-friendly. Also, when the color fell in between colors on the cards, the reading was potentially

inaccurate and could easily result in errors.

To solve this problem, Bayer developed the 2nd generation meter in 1980, the so called wiped blood glucose meter, which

was small and easy to use, but still required the wiping process. To completely solve the problem, the Johnson & Johnson

Group introduced One Touch in 1987, a colorimetry glucose meter which did not need the wiping process [11]. The

aforementioned three generations of blood glucose meters were photoelectric-type meters in principle.

In contrast, electrode-type glucose meters were smaller in size, quicker in reaction, and easier to use.

Therefore, Abbott introduced the 4th generation meter, an electrochemical blood glucose meter, in 1986, which soon

became the mainstream blood glucose meter in the 1990s [12].

Then, in order to solve the problem of blood collection volume and realize micro and multiple site blood collection,th Sense

developed the 5th generation blood glucose meter which enabled micro and multiple site blood collection, and thus

advanced the technical quality of blood glucose meters to a new height [13].

Currently, the most common portable blood glucose meter is the electrode-type glucose meter, which is a current mode

enzyme sensor. Its working mechanism is described as follows.

First, with disposable enzyme-modified screen-printed electrodes as the sensor, glucose interacts with an enzyme.

The electrons produced are transferred by the conducting mediums to electrodes. The electrodes then produce a current

under constant voltage. There is generally a linear relationship between the magnitude of current and concentration of

glucose, so glucose concentration in the blood can be obtained indirectly [14–16].

The most common enzymes are GOx and glucose dehydrogenase (GDH). The two enzymes are different in reduction

potentials, stability, turnover rate, and affinity and selectivity for glucose [17]. Recently two enzymes in the GDH family, NAD-

GDH and flavin adenine (FAD)-GDH, which are not only highly specific to glucose but also insusceptible to oxygen, were

developed and are promising in terms of future potential applications [18, 19].

The current instruments have been able to meet the detection requirements of sugar content in diabetic patients.

ISO15197 also has strict standards for the accuracy of blood glucose meters. This can help patients master their own

conditions at any time, receive treatments immediately, and ultimately improve the living conditions of patients with diabetes,

nephropathy, and other diseases.

Evoluzione nel tempo dei misuratori del glucosio nel sangue

Immunosensori

➢Ottima sensibilità e selettività

➢Risposta non lineare

➢Tempo di risposta lungo

Possono essere utilizzati per un rapido

screening del rischio ecologico per

sostanze affini agli acidi nucleici (e

perciò potenzialmente pericolose)

sfruttando il riconoscimento molecolare

di filamenti di DNA immobilizzati su un

trasduttore elettrochimico)

Biosensori basati sul DNA

➢Sfruttano le proprietà di ibridazione specifica dei singoli filamenti di DNA

➢Sono stati messi a punto sensori per la rivelazione di DNA ed RNA di batteri e

virus

Analisi di addotti con DNA

Xenobiotici Metabolitaprimario

Fase I

OssidazioniRiduzioniIdrolisi

Fase II

ConiugazioniMetabolitasecondario

Bioattivazione:

formazione di addotti con DNA e proteine

Molte sostanze esogene (IPA) diventano dannose solo dopo il loro

metabolismo.

,

E’ dimostrato che il primo passaggio del processo che porta a mutagenesimutagenesi e

cancerogenesicancerogenesi di xenobioti è la formazione di addotti con DNA.

Studio degli addotti al DNA per individuare sostanze tossiche

Formazione di metaboliti elettrofili e nucleofili nell’ossidazione di idrocarburi saturi e insaturi.

Biosensore a DNA per applicazioni ambientali

elettrodo

e-

elettrodo

Analita

Sistema di riconoscimento

molecolare: DNA a doppia

elicaL’analita produce una modificazione

chimico fisica del DNA immobilizzato,

che causa una diversa ossidabilità

della base guanina.

0.8 1.0 1.2 1.4

0

2

4

6

8i / A

E / V

DNA alone Sb

DNA + analyte Ss

Convenzione:

S > 85% no tossico

50 % < S < 85 % moderatamente tossico

S < 50 % molto tossico

Indice Tossicità

Segnale % = (Ss/Sb) 100

Sb: picco guanina dopo

l’interazione con il bianco

Ss: picco guanina dopo

l’interazione con il campione

Biosensori basati su cellule e tessuti

➢ Basso costo

➢ Grande varietà di enzimi

➢ Possibilità di usare cellule modificate

➢ Lungo tempo di risposta

➢ Contaminazioni

➢ Bassa attività e selettività

•Le cellule presentano un

potenziale di membrana dato

dalla differenza di

concentrazione delle specie

ioniche attraverso la membrana

cellulare : ΔV di circa 40 mV.

•Questo potenziale, detto

potenziale di azione, cambia

in funzione della composizione

dell’ambiente circostante la

cellula

•Il potenziale di azione può

essere registrato attraverso

opportuni elettrodi.

Biosensori basati su cellule

Potenziale di azione di una cellula cardiaca

dove sono evidenziati i 4 canali ionici.

Potenziale di azione

Strutture biomimetiche

Le strutture biomimetiche sono strutture artificiali costruite per mimare i processi

che avvengono nelle membrane cellulari: uno dei più sofisticati sistemi

biosensore/attuatore.

Modello classico di membrana cellulare: soluzione all’esterno (mezzo

extra-cellulare) separata dalle diverse specie presenti all’interno (citoplasma)

grazie alla forte polarità delle molecole fosfolipidiche che compongono la

membrana cellulare.

La membrana deve essere resistente ma non rigida, e consentire la diffusione delle

specie interessate attraverso se stessa.

Le membrane artificiali (BLM, Bilayer Lipid Membrane), risultano essere sempre

molto fragili.

Vi sono 2 tecniche principali per realizzarle

•depositandole da soluzione;

•mediante la tecnica di Langmuir-Blodgett(LBM–Langmuir-Blodgett Membrane)

Biosensore per Triazina ed erbicidi Fenilurea

➢Cianobacterio termofilico isolato da Synechococcus elongatus immobilizzato su sensore

elettrodo di lavoro di graffite ed elettrodo di riferimento Ag/AgCl depositati su supporto

polimerico.

➢Gli erbicidi inibiscono la fotosintesi bloccando l’attività del sistema proteico Fotosistema II

➢Una misura amperometrica registra la variazione dell’attività di trasporto di elettroni del

Fotosistema II che risulta dipendente dalla concentrazione di erbicida.

LOD≈10-9M

Misura dell’estensione del potenziale ad un elettrodo dopo l’aggiunta in soluzione di

tetrodotossina, tossina del pesce palla (100nM)

La tossina agisce sui canali ionici delle cellule nervose inibendone il funzionamento.

Misura dell’attività di un agente tossico

Biosensori basati su recettori

➢Elevata sensibilità e selettività

➢Tempo di risposta breve

➢Ampio intervallo dinamico

➢Piccole dimensioni

➢Fragilità

➢Breve tempo di vita

Recettori Biomimetici

Recettori sintetici selettivi basati sul mimicking dei siti di legame dei

recettori biologici.

• oligopeptidi sintetici mimando i siti attivi dei recettori biologici per analiti di

evidente tossicità come insetticidi, tossine o diossine e diossine-simili.

•trappole biomimetiche inserite in sensori di affinità per xenobiotici

Interazione tra il peptide Asn-Phe-Gln-Gly-Ile (peptide selezionato con approccio computazionale) e la diossina 2,3,7,8-TCDD attraverso due legami idrogeno.

Sensori a fibre ottiche

Questi sensori sfruttano le fibre ottiche per portare il segnale di eccitazione anche

in zone limitate. Le sorgenti ottiche utilizzate sono: LED, diodi laser (Ga-Al-As).

I sistemi di rilevazione si basano su fotodiodi, fototransistor, photo multiple tubes.

I fenomeni grazie ai quali si ha il segnale sono fenomeni di chemiluminescenza o di

bioluminescenza.

I limiti di rilevazione sono di ordine picomolecolare

Applicazioni di Biosensori

Per verificare la presenza di tossine o agenti patogeni su alimenti.

Dispositivi costituiti da anticorpi specifici fissati al trasduttore in grado di

generare onde elettromagnetiche.

Quando avviene la reazione tra anticorpo e antigene bersaglio (virus,

batteri, molecole), si verifica una modificazione dell’onda che si trasforma

in un segnale elettrico facilmente rilevabile.

In campo medico nel dosaggio di molecole usate nella diagnostica.

Si possono realizzare diagnosi e misurazioni in tempo reale, con ingombri

minimi e facilmente interpretabili.

Sono quasi sempre monouso, in alcuni casi riutilizzabili per un certo

periodo di tempo e assicurano la riproducibilità delle misurazioni.

Alcuni sono già in uso e commercializzati (kit di diagnosi immunologica,

biosensori per monitorare la qualità delle acque) altri ancora in fase di

sviluppo.

Applicazioni in campo medico

Pressione sanguigna, temperatura, potenziali

elettrici, respirazione, movimento

Variabili chimiche: glucosio, elettroliti, PO2, PCO2

Variabili emodinamiche (pressione, flusso)

Radiazioni, ultrasuoni

Determinazione da effettuare in vivo:

➢Acido glutammico

➢Glucosio

➢Acido lattico

➢Acido ascorbico

➢Acetilcolina

➢D-Lactic Acid

➢L-Lactic Acid

➢L-Malic Acid

➢Glucose

➢Ethanol

➢Glucose +Fructose

Miniaturizzazione per effettuare determinazioni in vivo:

•Acido glutammico

•Glucosio

•Acido lattico

•Acido ascorbico

•acetilcolina

Prospettive future dei biosensori