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Análisis de la composición de la leche. Análisis de lípidos.
Mora, C. Rojas, C.
Laboratorio de Bioquímica
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Escuela de Química, Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica
[email protected], [email protected]
Resumen: Los lípidos son biomoléculas de muy baja solubilidad en agua y que pueden extraerse de los materiales biológicos con solventes orgánicos. En la práctica se realizó un análisis cualitativo para los extractos alcalino, acuoso, metanólico y etéreo con el fin de identificar carbohidratos, lípidos y proteínas en muestras de leche evaporada, descremada, semidescremada y deslactosada. Posteriormente se procedió a fermentar 6 muestras de las distintas leches, deteniendo la cinética de la reacción de una muestra por día. Finalmente se cuantificaron los distintos componentes en todas las muestras con el fin de observar la tendencia en las concentraciones de los mismos. Palabras clave: Leche, carbohidratos, proteínas, lípidos, extractos.
Introducción.
La leche es un líquido de composición compleja, blanco y opaco, de sabor dulce y pH cercano a neutro.
La leche es un producto de origen animal, propia de los mamíferos, cuyo fin es ser el alimento en el periodo critico después del nacimiento, y suple todas las necesidades nutritivas de las crías en esta etapa del desarrollo, de ahí deriva la complejidad de su composición.
Los cuatro componentes más importantes de la leche son:
A) Lípidos componentes esenciales de las grasas (triglicéridos).
B) Proteínas: Caseínas, albúminas y globulinas.
C) Glucósidos: Esencialmente la lactosa.
D) Las sales.
Las principales características físico-químicas de la leche son:
Densidad a 15°C: 1,027-1,040.
pH: 6,5-6,7.
Calor específico: 0,93.
Punto de congelación:- 0,55°C
Desde el punto de vista químico la composición de la leche de vaca por lo general es de alrededor de 87% de agua. Un 3,5% de grasas finamente subdivididas –gotitas de 1 a 10 micrones de diámetro - confiere opacidad. Cuando la leche queda en reposo por largo tiempo, parte de la grasa se acumula en la superficie constituyendo la nata.
Casi el 4% corresponde a los péptidos (sustancias orgánicas nitrogenadas) entre los que predomina la caseína. Menos importantes son la lacto-albúmina (albúmina de la leche) y la lacto-giobulina. Cuando la leche se acidifica, se "corta": los prótidos
coagulan dando grumos semisólidos.
Un 4,5% de lactosa (azúcar de leche), disuelta en agua, este es el sabor dulce. Son escasas las sales Inorgánicas con un 0,5% aprox. Finalmente, en baja proporción pero cumpliendo funciones biológicas, se encuentran las vitaminas A y D, esta última decisiva para la fijación del fosfato de calcio en dientes y huesos.
Una composición tan diversificada, con grasas, péptidos y glúcidos, de-termina que la leche sea un alimento muy completo. Un niño debería beber, mínimo, medio litro diario.
Distintas denominaciones distinguen numerosas variedades comerciales de leche, como las siguientes:
Leche homogeneizada:
La leche homogeneizada fue sometida a algún tratamiento físico, antes o después de la pasteurización, para romper los glóbulos de grasa que, una vez subdivididos, no se separan con facilidad del resto del líquido. La leche homogeneizada no acumula nata en la superficie, aunque quede en reposo durante 48 horas.
Leche condensada:
Se elimina agua operando a presión reducida (aproximadamente medio atm) hasta obtener un líquido espeso, de densidad: 1,3 g/ml. Se le agrega 30% de azúcar si la materia prima es leche entera, porcentaje que se eleva al 50% para leche descremada. La disolución en agua de 350 - 400 g de leche condensada regenera un litro de leche líquida.
Leches modificadas:
Procedimientos químicos y biológicos provocan cambios en la composición de la leche.
Las leches maternizadas y los alimentos para lactantes son hidro-lizados con fermentos especiales que desdoblan químicamente a la caseína y los restantes péptidos, que de esta manera son digeridos sin dificultad.
El yogur ha experimentado una deliberada coagulación debido a la incorporación de bacilos lácticos seleccionados. En esta categoría se han incorporado las leches cultivadas
Lactobacillus helveticus es una bacteria utilizada en producción de ácido láctico, del género Lactobacillus. Es más utilizado en la producción de queso suizo y queso Emmental, pero a veces también es utilizado para la elaboración de otros estilos de queso, como el cheddar, parmesano, romano, provolone, mozzarella y. La función principal del cultivo de L. helveticus es para evitar la amargura y producir sabor a nuez en el queso final.(Aihara)
El nombre de la bacteria proviene del referente específico de "Helvetia", el nombre latino de la región ocupada por la antigua Helvetii actual Suiza.
La fermentación es un proceso catabólico en el que un compuesto orgánico actúa como dador de electrones, y un producto de éste es el aceptor final. Por esto se dice que hay un aceptor interno de electrones. También se da una fosforilación a nivel de sustrato, en
la que la cesión de un grupo fosfato a la molécula de ADP para formar ATP no requiere la presencia de la cadena de electrones. Es un proceso anaerobio, independientemente de que el organismo que la realice sea aerobio o anaerobio. Aunque también se fermenten aminoácidos, la fermentación más habitual es la de azúcares. En la fermentación de glucosa, el primer paso es llegar a la molécula de piruvato. La ruta más frecuente por la que se consigue es la glucólisis. Con este proceso, el rendimiento energético obtenido es de 2 ATP por glucosa, lo que indica la baja rentabilidad energética de la fermentación. Una vez formado el piruvato tiene lugar la reoxidación del NADH,H+ a NAD, necesaria para proseguir la glucólisis, ya que el NAD se encuentra en cantidad limitada y es preciso que se regenere. Para ello, el piruvato o alguno de sus productos actúa como aceptor de electrones, permitiendo la formación de moléculas de NAD. Los productos derivados de la fermentación son muy variados dependiendo del tipo de fermentación.
Es frecuente que en algunas reacciones se desprendan gases y ácidos. Estas características permiten identificar bacterias en el laboratorio.
Grafico 1. Ciclo de vida de una bacteria. [8]
Sección Experimental
• Reactivos
Acido tricloroacético al 9% m/v Acido tricloroacético al 6% m/v Hexano Hidróxido de sodio 0.33M Hidróxido de sodio 0.1M Hidróxido de sodio 1.0M Metanol Leche evaporada Leche descremada Leche semidescremada Leche deslactosada Acido fosforito 85% m/m Acido sulfúrico concentrado Patrón de acido oleico Reactivo de antrona Reactivo de Lugol Reactivo de Molish Reactivo de Nelson Reactivo de Somogyi Reactivo de Orcina Reactivo de Seliwanoff Reactivo vainillina Reactivo del Biuret Reactivo de Lieberman
• Equipo Vortex Estufa Baño de agua Láminas de cromatografía
• Resultados
Determinación de la concentración de
proteina soluble en el extracto acuoso
de una muestra de leche descremada
por el Método de Biuret
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 50 100 150 200
Horas
Concentración
mg/ml
Gráfico 2.
Determinación de proteina insoluble del
extracto alcalino de una muestra de
leche descremada por el método de
Biuret
0
1
2
3
4
5
0 50 100 150 200
Horas
Concentración
mg/ml
Gráfico 3.
Determinación de azúcares reductores
del extracto acuoso de una muestra
de leche descremada por el método de
Somogyi-Nelson
0
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
0 50 100 150 200
Horas
Absorbancia
Gráfico 4.
Determinación de la concentración de
proteina soluble del extracto acuoso de
una muestra de leche evaporada por el
método de Biuret
0
1
2
3
4
5
0 50 100 150 200
Horas
Concentración mg/ml
Gráfico 5.
Determinaion de la concentracion de
proteina insoluble en el extracto alcalino de
una muestra de leche evaporada por el
metodo de Biuret
0
1,5
3
4,5
6
7,5
0 50 100 150 200
Horas
Concentración
mg/ml
Gráfico 6.
Determinaion de la concentracion de
azucares reductores en el extracto
acuoso de una muestra de leche
evaporada por el metodo de Somogyi-
Nelson
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0 50 100 150 200
Horas
Absorbancia
Gráfico 7.
Determinación de concentración de
proteina soluble en el extracto acuoso
de una muestra de leche deslactosada
por el método de Biuret
0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
0 50 100 150 200
Horas
Concentración
mg/ml
Gráfico 8.
Determinación de la concentración de
proteina insoluble en el extracto alcalino de
una muestra de leche deslactosada por el
método de Biuret
0
2
4
6
8
10
0 50 100 150 200
Horas
Concentración mg/ml
Gráfico 9.
Determinación de la concentración de
proteina insoluble en el extracto alcalino de
una muestra de leche semidescremada por
el método de Biuret
0
1,2
2,4
3,6
4,8
6
7,2
0 50 100 150 200
Horas
Concentración mg/ml
Gráfico 10.
Determinación de la concentración de
proteina soluble del extracto acuoso de
una muestra de leche semidescremada
por el método de Biuret
0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
0 50 100 150 200
Hora
Concentración mg/ml
Gráfico 11.
Determinación de azúcares reductores
del extracto acuoso de una muestra de
leche semidescremada por el método
Somogyi-Nelson
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 50 100 150 200
Horas
Absorbancia
Gráfico 12. Discusión de resultados En el laboratorio se realizó la inoculación de cuatro distintos tipos de leche con un cultivo microbiano iniciador, lactobacillus helveticus. Posteriormente se procedió a la incubación a temperatura ambiente y se tomó una muestra cada 24 horas para proceder al enfriamiento y detener el crecimiento del organismo. Para cada tipo de leche se obtuvo un extracto alcalino, acuoso, metanólico y etéreo, los cuales se utilizaron para la cuantificación de azúcares y proteínas.
En el extracto acuoso estaban presentes los carbohidratos y las proteinas solubles. La presencia de carbohidratos es debido a que estos son solubles en el ácido tricloroacético ya que forman puentes de hidrógeno, entre los grupos hidroxilo de los carbohidratos y los del grupo carboxílico. La presencia de carbohidratos en el extracto acuoso fue confirmada con la Prueba de Molish. El extracto alcalino contenía las proteínas insolubles. La leche contiene tres tipos de caseina pero en este ensayo no se hizo ninguna diferencia entre ellas y se cuantificó en forma general la concentración de caseína. En el extracto metanólico se encontró azúcares con la prueba de somogyi-nelson. Por último, el extracto etéreo contenía los lípidos, tales como el colesterol y ácido oléico. La prueba de vainillina dio positivo para este extracto dando una coloración rojiza. Como resultados generales se obtuvieron datos de absorbancias muy variables y algo discordantes que se pueden justificar con las condiciones de trabajo durante la práctica. Cabe destacar que la temperatura apta del microorganismo es de 40°C, con un pH de 5,9. Sin embargo las condiciones de trabajo no fueron las optimas (aproximadamente 25°C) y el pH de la leche no se midió. Los lactobacillus, son bacterias que utilizan la fermentación láctica para obtener energía; estos organismos transforman la
lactosa de la leche en glucosa y posteriormente en ácido láctico. El objetivo final es conseguir que el ácido generado por la actividad bacteriana actúe como desnaturalizador proteico. En el gráfico 2 se observa la concentración de proteína soluble en el extracto acuoso de la leche descremada. Se puede observar que desde la hora cero hasta la 36 hay un intervalo constante en la concentración y luego hay un incremento muy grande en la misma. En el gráfico 3 se ve un marcado descenso en la concentración de la caseína. Esta tendencia se da por que la bacteria se alimenta de la caseína presente en la muestra en las primeras horas, esto para desarrollar su crecimiento. Luego se ve una zona de crecimiento de caseína donde se supone que la bacteria ha muerto y parte de su biomasa es proteína. En el gráfico 4 se observa la absorbancia de los azúcares presentes en la leche descremada. En las primeras horas hay una marcada disminución de azúcares en la muestra, esto se debe a que la bacteria consume primero los azúcares para crecer y desarrollarse. Luego se ve un incremento que de igual forma se ve asociado a la muerte de la bacteria. En el gráfico 5 se representa la tendencia de proteína soluble para la leche evaporada. Igual que en el gráfico anterior se ve una zona de descenso y luego de crecimiento, que se dan por las mismas razones ya comentadas.
En el gráfico 6 se ven dos campanas de Gauss señalando el aumento y disminución de la caseina en la muestra. Esto se asocia al ciclo de vida de la bacteria. Se puede asumir que mientras unas bacterias mueren otras empiezan a crecer y por eso del ascenso en el gráfico sigue una caída y nuevamente se incrementa. En el gráfico 7. se observan las absorbancias para la relación de azúcares reductores con respecto al tiempo de fermentación, y se ve una tendencia que, nuevamente muestra dos crestas y dos valles. Aunque la leche se identifique como deslactosada, en la misma existe la presencia de azúcar, ya que el tratamiento de deslactosado, lo que hace es romper la molécula de lactosa en glucosa y galactosa por ruptura enzimática, para así ayudar a su digestión, las personas intolerantes a la lactosa, por lo tanto la identificación de carbohidratos es positiva. [6].
Por lo tanto como la bacteria sembrada necesita de glucosa para subsistir, esta puede crecer en el medio. Sin embargo en los resultados no se presenta ninguna gráfica para los azúcares de esta leche, esto debido a que en la práctica los resultados de absorbancia dieron valores negativos. A estos resultados se le puede atribuir un error humano a la hora de realizar la prueba. Lo más recomendable hubiera sido repetir la prueba para muestras en las que la cinética se midiera en intervalos más cortos de tiempo, es decir, en lugar de días tal vez horas.
La determinación de proteína soluble confirma el hecho anterior, debido al comportamiento de la curva, donde la concentración de proteína soluble aumentó. Esto porque al desarrollarse la bacteria sintetiza proteínas a partir de la existente en la leche y de los carbohidratos que consume (gráfico 9 y 10). Al cumplir su ciclo de vida la bacteria muere y sus proteínas se degradan, de ahí el descenso en la concentración. Otro hecho importante de este fenómeno es que la proteína soluble propia de la leche, precipita por la acción en el pH del acido láctico, este acidifica el medio llevando a la caseína a la insolubilidad en el medio, esto contribuye a la caída en la concentración de proteína soluble en la leche. Esto ocurre en los todos los tipos de leches analizados. Conclusiones A la hora de trabajar con un microorganismo es recomendable averiguar las condiciones aptas para el desarrollo del mismo y así poder obtener mejores resultados. Al agregar este tipo de bacterias a un medio, estas se alimentaran primeramente de los azúcares presentes en la muestra y posteriormente de las proteínas.
Las pruebas cualitativas permitieron la identificación del tipo de biocompuesto presente en cada extracto.
La leche es una excelente fuente de nutrientes para el crecimiento y desarrollo de niños tanto como
para la conservación de la salud de los adultos. Bibliografía
[1] Alais C, Lacasa A. Ciencia de la leche: Principios de técnica lechera. 4ta Edición illustrated. Reverte, Barcelona, 1985.
[2] Murray R., Mayes P., Granner D., Rodwell V. Bioquímica de Harper. 14° Edición. Editorial Manual Moderno. México. 1997 pp 177-
[3] Mathews, C., Van Holde, K. y Ahern, K. Bioquímica. Tercera edición. Pearson Education. España. 2002. Pp 353-354
[4]Lípidos y grasas (http://www.todo-medicinas.com.mx)
[5] Aihara K, Kajimoto O, Hirata H, Takahashi R, Nakamura Y. Effect of powdered fermented milk with Lactobacillus helveticus on subjects with high-normal blood pressure or mild hypertension.
[6] Proceso de deslactosado consultado en:
http://www.nutrar.com/detalle.asp?ID=6727, el 8 mayo de 2009.
[7] Manual de bioquímica.
[8] Imagen del ciclo de vida. Del 8 de mayo de 2009.
http://www.botanica.cnba.uba.ar/Pakete/3er/Ciclo-Vida/bacterias.htm
[9]Tipos de leches comerciales. 8 de mayo de 2009.
http://www.companiamedica.com/salud_&_belleza/tipos_de_leche.html
![Universidad de Córdoba - EFECTO DEL USO DEL SUBPRODUCTO ...1].._colgar.pdf · 1.1. Composición de la leche de oveja La composición de la leche presenta notables diferencias entre](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/5eb8a56a226827144a01c981/universidad-de-crdoba-efecto-del-uso-del-subproducto-1-11-composicin.jpg)
