MARCO TEORICO

EL METODO DE KJELDAHL

El Metodo de Kjeldahl se emplea para la determinación del nitrógeno total y la posterior cuantificación de proteína bruta o verdadera de una muestra. Se basa en la digestión del analito en ácido sulfúrico concentrado a ebullición, con la adición de un catalizador. La muestra se digiere hasta disolución y oxidación de la misma. El nitrógeno contenido en la muestra se convierte en sulfato de Amonio.

Añadiendo un exceso de solución de sodio hidróxido, el ion amonio es liberado , destilado y recogido sobre una solución de ácido bórico. El borato acido de amonio producido se titula con una solución de un acido fuerte como el HCl previamente valorado. Este método fue desarrollado en 1883 por el investigador Johann Kjeldahl.

REACCIONES EN LA PAGINA 132

METODO DE BIURET

Este método se emplea para la cuantificación de proteínas ya que los compuestos que contienen enlazes peptidicos al formar complejos de coordinación con los iones cúpricos y 4 atomos de nitrógeno provenientes de los péptidos, producen un color violeta-rosado bajo condiciones alcalinas. la intensidad del color (absorbancia) es proporcional al contenido protéico de la muestra. se cuantifica espectrofotométricamente a (540nm).

el reactivo incluye sulfato de cobre, naoh, y tartrato de sodio y potasio el cual se utiliza para estabilizar el ión cobre en la solución alcalina

METODO DE BRADFORD

Este método se basa en la reacción de la forma anionica de residuos de arginina, lisisna histidina, triptófano tirosina y fenilalanina de la proteína, con la forma cationica del reactivo azul de comassie G-250; SE ADHIERE A LA PROTEÍNA y vira DE un color ROJIZO A AZUL al encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de la proteína, EL MÁXIMO DE ABSORCIÓN DEL COLORANTE se presenta A 595nm. La mayor interferencia que se puede presentar son los detergentes como el sds y el triton x-100.

METODO DE ABSORCIÓN EN EL ULTRAVIOLETA

las proteínas muestran un fuerte grado de absorción a 280nm en uv, principalmente debido a los residuos de aminoácidos aromaticos como el triptófano, la tirosina y fenilalanina, dado que cada proteína tiene una compoasición única de aminoácidos aromáticos, el coeficiente de absorcion molar deben ser determinados para proteínas individuales para la estimación del contenido protéico.

La absorción esta relacionada linealmente con la concentración, de acuerdo con la ley de Lambert-Beer

(PAG 133: ECUACION)

TABLAS DE DATOS Y RESULTADOS

Harina empleada: arveja

Metodo de Kjeldahl

Peso de la harina: 40 mg

EXTRACCION DE FRACCIONES PROTEICAS

Peso de la harina para la extracción: 2,006 g

Volumen de cada ext: 25,0 ml

Vol. Alícuota analizada: 5,0 ml

Blanco de reactivos: Volumen de HCl: 3,68 M HCL: 0,0106 M

Muestra vol HCl%Nitrogeno

%de proteina en la muestra

Harina 1 5,60 0,712 4,45Harina 2 12,90 3,42 21,38Albuminas 20,75 1,37 3,95Globulinas 16,45 0,47 2,95Prolaminas 7,90 0,16 0,98Glutelinas 29,65 0,96 6,00

MUESTRA DE CALCULOS

a) Para la harina completab) Para una de las fracciones

Metodo de Biuret

Curva de calibración concentración del patrón: 5mg/ml

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.60.0

0.1

0.2

0.3f(x) = 0.166934235976789 x + 0.0367059961315281R² = 0.967839529489238

Metodo de Biuret

[Proteina]

Abso

rban

cia 5

40 n

m

Tubo Concentracion Abs 540 nm1 0,1 0,0432 0,3 0,0783 0,5 0,1244 0,7 0,1645 0,9 0,2156 1,2 0,2247 1,5 0,277

MUESTRASALBUMINAS

GLOBULINAS

GLUTELINAS

PROLAMINAS

ABS 0,092 0,072 0,107 0,03%PROT 4,129 1,420 2,625 0,839

Preparacion de tubos:

Prolaminas y albuminas: (tubo 8) vol. Extracto: 0,5 mL Vol. Final: 5 ml

Globulinas y glutelinas: (tubo 9) vol. Extracto: 1,0 mL Vol. Final: 5 ml

(MUESTRA DE CALCULOS METODO DE BIURET)

METODO DE BRADFORD

Curva de calibración concentración del patrón: 1mg/ml

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.350

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

f(x) = 0.13198820509467 ln(x) + 0.634101332527071R² = 0.952103312541384

Metodo de Bradford

[Proteina] (mg/ml)

Abso

rban

cia 5

95 n

m

TuboConcentracion

Abs 280 nm

1 0,032 0,1532 0,064 0,3073 0,12 0,3534 0,16 0,4125 0,24 0,4176 0,32 0,485

muestra *Abs 5950 nm % ProteinaProlaminas 0,058 0,40Glutelinas 0,316 2,80

*Factor de dilución 25. (respecto a la solución original)

(muestra de cálculos)

METODO DE ABSORCION EN EL ULTRAVIOLETA

Curva de calibración concentración del patrón: 5mg/ml

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.40

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

f(x) = 0.792142857142857 x + 0.036R² = 0.994425503612054

Absorcion U.V

[Proteina] mg/ml

Abso

rban

cia 2

80 n

m

Tubo Concentracion

Abs 280 nm

1 0,2 0,1912 0,4 0,3423 0,6 0,5064 0,8 0,6955 1,0 0,8546 1,2 0,955

F. proteica*Abs 280

nm % Proteinaalbuminas 2,623 20,35Globulinas 2,018 15,59Prolaminas 1,056 8,02Glutelinas 1,898 14,65

*Factor de dilución: 5. (respecto a la solución original)

(muestra de cálculos)

RESUMEN DE RESULTADOS

MUESTRA KJELDAHL BIURET BRADFORD UV LITERATURA*HARINA 21,38 ND ND ND 21-26%

ALBUMINAS 3,95 4,129 ND 20,35 4,5

GLOBULINAS 2,95 1,420 ND 15,59 14,1

PROLAMINAS 0,98 0,839 0,40 8,02 0,2

GLUTELINAS 6,00 2,625 2,80 14,65 2,6

*http://www.samconet.pe/productos/producto7/descripcion7.htm. A partir de estas referencias se calcula el porcentaje de proteína presente en la harina de arveja. Tomando como el 100% el valor hallado por el método de kjeldahl; ya que el reportado en la literatura no es un valor exacto sino un intervalo el cual contiene el valor determinado experimentalmente.

DISCUSION DE RESULTADOS Y CONCLUSIONES

El principal objetivo de la practica realizada fue cuantificar la proteína total y parcial; (albuminas, globulinas, glutelinas, prolaminas) presentes en la harina de arveja, por medio de cuatro diferentes métodos para luego compararlos entre sí.

El primero de ellos es el método de kjeldahl, en el se debe emplear un blanco con solo reactivos para sustraer el nitrógeno reactivo del nitrógeno de la muestra. Con este método se obtuvo un valor de proteína total, bastante preciso si se compara con el reportado en la literatura: (21,38% pertenece al intervalo [21-26%]), con este primer valor se puede afirmar que el método es bastante exacto si se tiene en cuenta cada factor influyente en los resultados. No obstante, al realizar los cálculos respectivos a las fracciones extraídas de la harina se puede notar que los valores difieren de los esperados, mucho más en las muestras de glutelinas y globulinas.

Antes de continuar vale la pena resaltar prioritariamente el método de absorción U.V ya que fue el que mayor discrepancia presenta con respecto a los valores teóricos y en cada una de las fracciones arroja valores muy superiores, sin embargo no se tiene una idea clara del porque

de este hecho, siendo que la curva de calibración y los tubos de las muestras se realizaron siguiendo estrictamente lo señalado en la bibliografía y los cálculos fueron revisados minuciosamente, este incidente obliga a descartar las medidas realizadas en esta prueba para la comparación y análisis de resultados.

Ahora, para las albuminas se verifica que se cuantifico relativamente lo mismo en los tres métodos en cuestión, y estos valores son bastante cercanos a los esperados, la pequeña diferencia pudo ser evitada probablemente con una extracción mas con agua desmineralizada realizada al residuo obtenido después de la centrifugación. Análogamente en el análisis de globulinas (métodos de kjeldahl y Biuret) la diferencia del valor experimental es desmesurado respecto al valor teórico; este hecho se puede justificar fácilmente afirmando que en el momento de la extracción esta fracción proteica no fue aislada completamente ya que los dos ensayos arrojan valores muy bajos (1,42-2,95), siendo que el porcentaje real está alrededor del 14%. Sin embargo esta hipótesis no es del todo viable puesto que las globulinas son muy solubles en soluciones salinas diluidas y se habrían extraído escasamente el 20% de la proteína. Por otro lado, las glutelinas el porcentaje se mantiene casi constante en los métodos de Biuret y Bradford y aumenta drásticamente en el kjeldahl, lo que sugiere un error netamente experimental en este método, posiblemente se deba a que en el momento de darle paso al NaOH al 50 % a través del embudo se filtro un poco de base hacia el erlenmeyer que contenía el destilado, siendo así el volumen de HCl gastado al titular la muestra seria mucho mayor al que gastaría el NH4+ generado por la proteína, afectando de esta forma los resultados. Por último las prolaminas, se cuantificaron alrededor de [0,44-0,98] valores bajos pero cercanos al teórico ya que el contenido de esta proteína en la arveja es bastante bajo con respecto a las demás.

Se puede concluir entonces que:

El contenido total de proteína en la harina de arveja es 21,38% El método que mayor inconvenientes o margen de error presento fue el de absorción

U.V. Se obtiene un porcentaje promedio de 3,97% de albuminas, y 2,65% de glutelinas,

siendo esta la cuantificación mas exacta.