EXTRACCION Y PURIFICACION

DE ENZIMAS Y OTRAS PROTEINAS A GRAN

ESCALA

ESTRUCTURA

Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos.

LISIS CELULARPara obtener proteínas intracelulares de los

microorganismos existen tres métodos generales; enzimáticos, químicos o físicos. No todas las metodologías pueden ser utilizadas en procesos a gran escala. Quizás el ejemplo mas destacado es la sonicación, que es el método más empleado en la obtención de proteínas en el laboratorio.

EXTRACCION POR METODOS QUIMICOS

Álcali.Este método ha sido utilizado con considerable éxito para la extracción de proteínas bacterianas a pequeña y gran escala. Por ejemplo la enzima terapéutica L-asparaginasa.  Detergentes.Los detergentes iónicos son más reactivos que los detergentes no-iónicos y pueden ocasionar la desnaturalización de muchas proteínas. La presencia de detergentes puede afectar también a las etapas posteriores de purificación, en particular a la precipitación proteica por tratamiento con sales. Esto puede superarse en muchos casos con el uso de cromatografía de intercambio iónico o por ultrafiltración

EXTRACCION POR METODOS FISICOS Choque osmótico. El choque osmótico ha sido utilizado en la extracción de enzimas hidroliticas y proteínas ligadas del espacio periplásmico de cierto número de bacterias Gram-negativas, incluyendo la E. coli. El empleo del choque osmótico se está viendo favorecido con el incremento en el número de proteínas recombinantes que se secretan al periplasma.

Tamización sólidaEl método implica la extrusión del material celular congelado a través de un orificio de pequeño diámetro y a una presión elevada, manteniendo la temperatura próxima a -20°C.

Tamización líquida Este es ahora el método de ruptura celular de elección utilizado

en la lisis a gran escala de microorganismos, estando muy extendida su aplicación tanto en procesos industriales como de investigación

PURIFICACIÓN INICIALCROMATOGRAFIA

La purificación de enzimas por cromatografía ha sido una práctica de laboratorio durante muchos años. Estos mismos procedimientos cromatograficos pueden ser empleados de forma similar para el aislamiento de cantidades muy superiores de proteínas

La cromatografía es la única metodología con la selectividad suficiente para purificar una proteína de una mezcla proteica compleja con un grado de purificación final superior al 99,8%.

Optimización del salto de escala y de la calidad del proceso

El salto de escala en la separación cromatografía es, en principio, sencillo, ya que la teoría de esta metodología señala que el diámetro de la columna no presenta un efecto importante sobre la resolución, de forma que bastaría con incrementar el diámetro de la columna para provocar el salto de escala.

En principio, estos procesos de salto de escala deben repetirse hasta alcanzar la escala de operatividad deseada.

Selección de la metodología

Para obtención y separación de proteínas a gran escala se puede emplear cualquier de las técnicas cromatrograficas disponibles: filtración a través de geles, intercambio iónico, interacción hidrofóbica , afinidad, inmunoafinidad, y electroenfoque.

Métodos cromatografico para la purificación de proteínas a gran escala

Característica molecular aprovechada

Tipo de cromatografía

Características Aplicación

Tamaño Gel filtración Resolución moderada para el fraccionamiento y buena para tampones intercambiadores. Capacidad limitada por el volumen de la muestra.

El fraccionamiento es mejor en las últimas etapas de la purificación. En cualquier momento puede ser utilizado los tampones intercambiadores y podrá existir una limitación respecto al volumen de la muestra.

Carga Intercambiador iónico

La resolución puede ser alta. Capacidad alta no limitada por el volumen de la muestra. La velocidad puede ser muy elevada dependiendo de la matriz.

Es más efectiva en las primeras fases del fraccionamiento cuando se van a manipular grandes volúmenes.

  Cromatoenfoque La resolución puede ser alta. La capacidad puede ser alta. La velocidad puede ser alta.

Es mejor usarla en una purificación posterior, ya que las matrices son caras.

Polaridad Interacción hidrofobica

Resolución buena. Capacidad muy alta y no limitada por el volumen de la muestra. Velocidad alta.

Puede ser utilizado en cualquier fase, pero es mejor aplicarla cuando la fuerza iónica es alta tras la precipitación con sales o después de un intercambio iónico.

Afinidad biológico afinidad La resolución puede ser elevada. Capacidad puede ser alta o baja, dependiendo de ligando y no limitada por el volumen de la muestra. Velocidad elevada.

Puede emplearse en cualquier etapa, aunque normalmente no es recomendable en las primeras fases.

Gel filtraciónÉste tipo de separación se basa en el tamaño molecular. La fase estacionaria esta formada por bolas porosas rodeadas de una fase solvente móvil. Cuando se añade la muestra, las moléculas de la mezcla se reparten entre los poros del gel del solvente.

Cromatografía de intercambio iónicoTradicionalmente para el fraccionamiento de proteínas se han empleado los intercambiadores iónicos basados en compuestos de celulosa con diversos sustituyentes.

Tabla 2. Sustituyentes en intercambiadores iónicos

Intercambiador anionico

Amina cuaternaria (Q) -CH2-N+-(CH3)3

Amino etilo cuaternario (QAE)

-O-CH2-CH2-N+-

(C2H5)3

Dietilaminoetilo (DEAE)-O-CH2-CH2-N+-

(C2H5)2

Los intercambiadores celulósicos iónicos son ideales para diversas operaciones como primera etapa en varios procesos. No es posible usar habitualmente en procesos a gran escala estas columnas de celulosa, debido a que no pueden soportar grandes velocidades de flujo y a que sufren cambios de volumen si se producen cambios de pH o fuerza iónica siendo muy complicado regenerarlas sin volver a empaquetar la columna.

CROMATOGRAFIA DE AFINIDADLa cromatografía de afinidad es quizá el método de

purificación más elegante para obtener una proteína a partir de una mezcla compleja. Aunque se usa ampliamente en el laboratorio, solo en los últimos años parece aceptable en purificaciones a escala industrial.

Esta metodología se basa en la interacción de una proteína con un ligando inmovilizado. El ligando puede ser bastante especifico para una proteína particular. La cromatografía de afinidad con nucleótidos inmovilizados es escasamente usada en procesos de purificación a gran escala quizá debido a su inestabilidad, corte, baja capacidad y las dificultades de su incorporación a una matriz solida.

Para la purificación a gran escala de muchas enzimas, se ha empleado colorantes inmovilizados, puesto que poseen ventajas tales como facilidad de unión a un soporte matriz, estabilidad, alta capacidad y económicos.

Tabla 3. Ejemplos de enzimas purificadas a gran escala por cromatografía de afinidad con colorantes.

Enzima Colorante EluyenteGliceroquinasa Proción azul-MX-3G 5 mM ATPGlucoquinasa Proción marrón H-3R 2 mM ATPGlicerol deshidrogenasa Proción rojo HE-3B 2 mM NADMetionil- tRNA sintetasa Proción verde HE-4BD Gradiente de fosfato

Triptofanil tRNA sintetasaProción marrón MX-5BR

50 mM triptófano

3-hidroxibutirato deshidrogenasa

Proción rojo H-3B1 M KC1

Malato deshidrogenasaProción azul MX -4GDProción rojo H-3B

1 M KC1 + 2 mM NADH1 M KC1 + 2 mM NADH

Carboxipeptidasa G2

Proción azul MX-4GDGradiente 0-0,7 mM KC1

Proción rojo H-8BN

Adsorbido en presencia de 0,2 mM Zn2+ y tris C1H 0,1 M, eluido con 10 mM EDTA pH 5,8y después, con tris-C1H 0,1 M pH 7.3

Albumina de suero bovino Cibracron azul F3-GA20 mM octanoato sódico

Albumina de suero bovino Cibracron azul F3-GA 3 M NaCl, pH 8,6

ULTRAFILTRACIONLa ultrafiltración ha sido una técnica de uso corriente en el

laboratorio para la concentración de soluciones proteicas en condiciones muy suaves. También es una alternativa para la diálisis y filtración a través de geles para la eliminación de sales o los cambios de tampones.

CONCLUSION La electroforesis constituye parte importante del procedimiento rutinario

del análisis de los ácidos nucleicos y proteínas.  

El principio básico de la electroforesis consiste en la migración de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular.

Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples bandas las cuales serán posteriormente analizadas e interpretadas.

  En biología molecular, la mayoría de los estudios básicos y aplicados

requieren el uso de la electroforesis; sin embargo, este procedimiento presenta variaciones de acuerdo al tipo de estudio que se piensa ejecutar. En la electroforesis de tipo vertical, se analizan tanto moléculas de ADN como proteínas, mientras que en la electroforesis horizontal generalmente se trabaja con ADN o ARN.

MUCHAS GRACIAS POR SU ATENCION