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Anche i batteri fannosesso…
(cioe’ si scambiano geni!)
LA GENETICA DEIMICRORGANISMI
ovvero
La coltivazione dei batteri
Una colonia è formata dacirca 107cellule.
Clone = discendenti diun’unica cellula.
Mappatura nei procariotiStrategie analoghe
Incroci tra ceppi che differiscono per marcatori genetici e identificazione e conta dei ricombinanti
Differenze
Eucarioti: scambio tra cromosomi appaiati alla meiosi che produce 2 prodotti reciproci
Procarioti: no meiosi, ricombinazione non reciproca e prodotti non reciprociTrasferimento unidirezionale
Scambi mai tra cromosomi interi matra il cromosoma principale di un ceppo (ricevente)
e frammenti di DNA dell’altro (donatore)
Meccanismi mediante i quali avvienescambio di materiale genetico tra batteri:
Marcatori genetici? Capacità di crescere
MutantiResistenza agli antibiotici o ai virus
Nutrizionali (auxotrofi)
Fonte di carbonio
Forma delle colonie
TrasformazioneDNA libero
Coniugazionecontatto cellule
Trasduzionemediato da fagi
La trasformazione
Trasferimento di materale genetico da un batterioall’altro mediato da frammenti di DNA extracellulare.
scoperta da F. Griffith nel 1928 in Streptococcus pneumoniae.
Nella trasformazione frammentiisolati di DNA vengono assorbitidall’esterno all’interno dellacellula
La trasformazione a livellomolecolare
La mappa pertrasformazione
Con latrasformazione èpossibile mapparei geni: quanto piùdue marcatorisono vicini, tantopiù probabile è lalorocotrasformazione.
ordini possibili: p-q-o e p-o-q
La scopertadella
coniugazione - 1Nel 1946 Joshua Lederberg eEdward Tatum dimostraronoche due ceppi di E.coliauxotrofi (E. coli A met- bio-
thr+ leu+ thi+ ed E. coli B met+
bio+ thr- leu- thi-), posti acontatto, possono scambiarsimateriale genetico e crearedei batteri prototrofi.Colonie prototrofe: 1x10-7
La scoperta della coniugazione - 2
Alla fine degli anni ‘40Bernard Davis scopreche se i due ceppisono separati da unfiltro attraverso cuipossono passare
molecole (ma non batteri) non siha la formazione di prototrofi: ilcontatto fisico tra i due ceppi èindispensabile!
Il fattore di fertilità (F)W. Hayes (1953): il trasferimento genico avviene inuna sola direzione: da un donatore (maschio) ad unricevente (femmina).
Hayes trovò un donatore “sterile” (cioè incapace ditrasferire l’informazione) che si era trasformato inun ricevente.
Ceppi con F sono donatori (F+), quelli senza F sono riceventi (F-).
Fattore F: plasmide che si replica nel citoplasma batterico in modo autonomo.
Ipotesicapacità di fungere da donatore è una condizione ereditaria
determinata da una fattore di fertilità F.
La scoperta dellaconiugazione - 3
I ceppi HfrLuca Cavalli Sforza scoprì un nuovo ceppoderivato da un F+ chiamato high frequency ofrecombination (Hfr). L’incrocio HFR x F- dava1000 volte più ricombinanti dell’incrocio F+ xF-, ma nessuna cellula F- diventava F+.
Quando si mescolano cellule F+ con cellule F-:il fattore F si integra nel cromosoma batterico con una bassa frequenza.
I geni batterici si trasferiscono ma con bassa frequenza.
Il ceppo Hfr si forma in seguito all’integrazione di F nel cromosoma batterico.
Nell’incrocio Hfr x F- invece:tutti i batteri donatori hanno F integrato, frequenza di ricombinanti è alta.
L’integrazionedi F
Ricombinazione tra due anelli diDNA, in seguito ad un singolocrossing over, con formazione diun anello unico che è la sommadei due precedenti.In questo modo un ceppo F+ (conF plasmide libero) diventa HFR.Una volta inserito, il plasmide Fmantiene la sua capacità diriconoscere un batterio F- e diiniziare la coniugazione.
Il trasferimento di HFR - 1Il trasferimento di F integrato (HFR) comincia sempre a partiredall’origine di replicazione O. Quindi il ricevente, per poterdiventare F+, dovrebbe ricevere tutto il cromosoma battericodel donatore.
HfrH
Othr
pro
lacpur gal
hisgli
thithr
pro
lacpur gal
O
il fattore F
Il trasferimentodi HFR - 1
Poiché il pilo sessuale è instabile,il trasferimento non è mai completo, per cui il ricevente resta F- ma riceve una parte di DNA batterico donatore che può eventualmente essere integrata dal ricevente.
HfrH
Othr
pro
lacpur gal
hisgli
thi thrpro
lacpur gal
Il trasferimento di HFR - 2A questo punto, il ricevente non ha ricevuto un DNA circolare, malineare! Questo potrà eventualmente essere integrato nelgenoma del ricevente per ricombinazione sfruttando l’omologiadel DNA batterico, e solo in seguito ad un numero pari dicrossing over.
La coniugazione interrottaElie Wollman e François Jacob, 1957
Si può sfruttare la labilità delpilo e l’inserzione di F permappare i geni di uncromosoma batterico.
Le inserzioni di F sono casualisia come punto di inserzione, sia come orientamento, quindi ogni ceppo batterico HFR trasferirà geni nel ricevente con un ordine che riflette la disposizione dei geni lungo il cromosoma.
La proceduraEsempio: donatore HfrH thr+leu+aziRtonR
lac+gal+strS ricevente: F- thr leu aziStonS lac galstrR
I due tipi di cellule vengonomescolate in gran quantità inun terreno liquido a 37°C. Avari tempi vengono prelevatidei campioni della coltura,vengono agitati (perinterrompere artificialmentela coniugazione) e piastrati suterreni selettivi contenentistreptomicina per uccidere lecellule Hfr. Quello che siottiene è una mappa a tempodel cromosoma battericodonatore.
Le mappe a tempo
Wollman e Jacob scoprirono che:
Ogni allele del donatore appariva nel ricevente F- dopo unintervallo di tempo ben preciso dall’inizio della coniugazione.
Gli alleli del donatore si presentavano sempre in una specificasequenza.
I marcatori che entravano più tardi comparivano in un numerominore di cellule.
Da queste osservazioni dedussero che il trasferimento avviene apartire da un punto ben preciso sul cromosoma del donatore chiamatoorigine O e prosegue secondo modalità lineare.
Il gradiente di trasferimento
Anche se la coniugazione non vieneinterrotta il ponte di coniugazionesi rompe spontaneamente. Pertantosolo di rado il cromosoma vienetrasferito per intero.
La rottura spontanea puòverificarsi in qualsiasi momento.Ciò determina un gradiente ditrasferimento
il marcatore più vicino all’origine(es. met) verrà trasferito con lafrequenza più alta
Costruzione dellamappa
Come unità di misura si usa la distanzadi tempo (in minuti) impiegato daglialleli del donatore ad entrare nelricevente.
Solo dopo 2 ore i riceventi diventano F+il fattore F entra per ultimo.
Il cromosoma batterico è circolare
Usando vari ceppi Hfr ed ottenendo mappe diverse, Campbell ipotizzòche il cromosoma batterico fosse circolare.
Il saggio a tre punti nei batteri
La sesduzione,ovvero F’
Nel 1959 E. Adelberg, in un ceppoHfr il fattore F può excidersi egenerare un ceppo F+.Se però siexcide in maniera errata puòincorporare il gene battericoaccanto al quale era inserito. Inquesto caso prende il nome di F’. Ilplasmide F’ può coniugare einserire il gene che ha incorporatoin un batterio ricevente(sesduzione) che diventa F+
trasferimento di genibatterici mediato da
batteriofagi
La trasduzione
Ciclo dicrescita delfago temperatolambda
Trasduzione generalizzata etrasduzione specializzata
I fagi che effettuano la trasduzione generalizzataveicolano qualsiasi porzione del genoma dell’ospite
I fagi che effettuano la trasduzione specializzatatrasferiscono solo porzioni specifiche
La trasduzione generalizzata
Salmonella typhymurium phe+trp+tyr+ met-his- x phe-trp-tyr- met+his+
vettore della ricombinazione: il fago P22
ricombinanti prototrofi anche se messi in un tubo ad U
(Joshua Lederberg e Norton Zinder 1951)
Il meccanismo della trasduzionegeneralizzata è stato chiarito da
Ikeda e Tomizawa con il fago P1 nel1965
Trasduzionegeneralizzata
NB nella testa del fago nonrestano geni fagici!!
Con la trasduzione generalizzata si possonostabilire relazioni di associazione tra i geni
La cotrasduzione: il trasferimento di duegeni batterici (molto vicini) ad opera dellostesso fago
donatore leu+thr+aziR x ricevente leu-thr-aziS
thr leu azi
thr leu azi thr azi leuoppure
Come si calcola lafrequenza di cotrasduzione?
donatore a+b+ x ricevente a b
frequenza dicotrasduzione =
numero dei trasduttantiper entrambi i marcatori
numero di trasduttanti totali
x 100%
a+b
a b+
a+b+
trasduttanti
selezionando per a+freq. di cotrasduzione = (a+b+)
(a+b)+(a+b+)x 100%
selezionando per b+ (a+b+)(a b+)+(a+b+)
freq. di cotrasduzione = x 100%
Trasduzione specializzata
Il profago λ si integra con un crossing over alivello del sito di attacco di lambda tra i geni gal ebio
Meccanismo della trasduzione specializzata
Riassunto
Mappatura del genoma fagico
Fenotipi fagici : placche di lisi e specificitàd’ospite (ceppo batterico che un fago è ingrado di lisare)
Marcatori del fago T2:
h+ lisa il ceppo B di coli ma non il ceppoB/2
h lisa sia il ceppo B che il B/2
r+ placche piccole con margini indistinti
r placche grandi con margini netti
quando fagi h+ crescono su unostrato misto di cellule B e B/2formano placche torbide perchèlisano solo B e i batteri B2 crescononelle placche provocando torbiditàdelle placche. I fagi h formanoinvece placche chiare
ceppo B
Il lisato si piastra su unamiscela di ceppi B e B/2
Frequenza diricombinazionetra h ed r =
placche (h+ r+) + (h r )
placche totalix 100
