Ảnh hưởng của quá trình lên men lên tính chất chống oxy hóa của

một số loại ngũ cốc và các loại giả ngũ cốc

Tóm tắt (Abstract)

Sự ảnh hưởng của quá trình lên men do hai loại vi sinh vật (vi khuẩn lactic acid

Lactobacillus rhamnosus, và nấm men Saccharomyces cerevisiae) lên hoạt tính chống oxy

hóa và tổng hàm lượng phenol của 4 loại ngũ cốc, cụ thể là kiều mạch, lúa mì, lúa mạch và lúa

mạch đen, đã được xác định và so sánh với các hoạt động chống oxy hóa và tổng hàm lượng

phenol của 4 loại ngũ cốc trên mà không lên men. Tổng hàm lượng phenol (TPC), được xác

định theo phương pháp Folin-Ciocalteu, tăng khi lên men. Hoạt tính chống oxy hóa (AOA)

được đánh giá bằng các phương pháp như khả năng khử 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl

(DPPH), năng lực chống oxy hóa bằng phương pháp khử ion Fe3+(FRAP), và phương pháp

thiobarbituric acid (TBA). Sự có mặt của những vi sinh vật là quan trọng ít hay nhiều đến mức

độ tăng lên của hoạt tính chống oxy hóa. Như vậy quá trình lên men lá một phương pháp làm

tăng khả năng hoạt tính sinh học của các sản phẩm ngũ cốc.

1. Giới thiệu (Introduction)

Mặc dù chất chống oxy hóa tổng hợp như butylated hydroxytoluene (BHT), butylated

hydroxyanisole (BHA) và tert-butylhydroquinone (TBHQ), cũng như propyl gallate (PG), đã

được sử dụng rộng rãi trong việc làm chậm quá trình oxy hóa lipid, nhưng gần đây tính an

toàn của chúng đã được đặt nghi vấn do độc tính và có thể gây ung thư (Shahidi, 2000). Như

vậy, việc phát triển của chất chống oxy hóa tự nhiên, an toàn hơn, từ chiết xuất của các loại

thực vật có thể thay thế chất chống oxy hóa tổng hợp, đã được quan tâm (Branen, 1975). Chất

chống oxy hóa thực phẩm như acid amin, peptide, protein, chất flavonoid và các hợp chất

phenol khác có thể đóng một vai trò quan trọng như là chất chống oxy hóa sinh lý và dinh

dưỡng, do đó làm tăng sức đề kháng tự nhiên của cơ thể để giảm đi tác hại của oxy hóa

(Shahidi, 2000).

Mức độ quan trọng của các chất chống oxy hóa đã được phát hiện trong các loại ngũ

cốc và các sản phẩm của các ngũ cốc trên (Baublis, Decker, & Clydesdale, 2000; Emmons,

Peterson, & Paul, 1999). Ngũ cốc và các loại giả ngũ cốc là một nguồn quan trọng của chất

dinh dưỡng. Hạt ngũ cốc cung cấp một lượng lớn năng lượng, protein và vi chất dinh dưỡng

thiết yếu trong chế độ ăn uống của động vật và con người. Thành phần hóa học và sinh khả

dụng của các chất dinh dưỡng thì khác nhau giữa các loài và giống cây ngũ cốc, và cũng có

thể bị ảnh hưởng bởi các hình thức chế biến làm ra thức ăn và thực phẩm (Senter, Horvat, &

Forbus, 1983). Ngũ cốc cũng chứa một loạt các chất hóa học với hoạt tính chống oxy hóa

(Adom & Liu, 2002). Ngũ cốc rất giàu axit phenolic và saponins, trong khi phy-toestrogens và

flavonoids có mặt với số lượng nhỏ (Senter et al., 1983). Chiết xuất từ lúa mì như là các

phenol lúa mì đã thể hiện tiềm năng chống oxy hóa như một chất chống oxy hóa mạnh mẽ,

thông qua việc khử triệt để hay đào thải ion kim loại (LiyanaPathirana, Dexter, & Shahidi,

2006; Liyana-Pathirana & Shahidi, 2006), trong khi lúa mạch có chứa một lượng đáng kể các

hợp chất phenol chống oxy hóa, khử hiệu quả các peroxyl, DPPH, và các gốc hydroxyl, và

kiểm soát hiệu quả quá trình oxy hóa của LDL cholesterol, do đó có một tiềm năng rất lớn

trong sự phát triển của các chất dinh dưỡng giàu chất chống oxy hóa (Madhujith & Shahidi,

2006, 2007). Chất chống oxy hóa từ thực phẩm ngữ cốc được xem như có lợi cho sức khỏe do

giảm tỷ lệ mắc các bệnh mãn tính liên quan đến lão hóa bao gồm cả bệnh tim và một số loại

ung thư (Miller, Rigelhof, Marquart, Prakash, & Kanter, 2000).

Mặt khác, các loại ngũ cốc được biết đến có chứa một lượng nhất định các thành phần

phi dinh dưỡng, như muối của axit phytic (hexakisphosphates myoinositol, phytates),mà

chúng khó tiêu hóa và không dễ hòa tan (Guenter, 1997), cũng như chứa các hemicellulose

được liên kết với cellulose và các chất pectic, và bao gồm nhiều polysaccharides không phải

tinh bột, cellulose, như xylans (arabinoxylans và glucuronoxylans 4-0-methyl),

galactomannans, glucomannans, ß-D-glucans (3 và 4 liên kết), ß-D- glucan-callose (3 liên

kết ), và xyloglucans (4-liên kết ß-D-glucans với mạch phân nhánh) (Chesson, 1987). Các ß-

glucans và arabinoxylans đã được công nhận là yếu tố phi dinh dưỡng trong ngũ cốc (Bedford,

1995).

Trong suốt lịch sử, quá trình lên men đã được sử dụng để cải thiện tính chất sản phẩm.

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các vi sinh vật bắt đầu thay đổi thành phần thực vật

trong quá trình lên men (Katina, Liukkonen et al., 2007). Nhiều thay đổi sinh hóa xảy ra trong

quá trình lên men, dẫn đến thay đổi tỉ lệ của các thành phần dinh dưỡng và phi dinh dưỡng của

thực vật, làm ảnh hưởng đến đặc tính sản phẩm như hoạt tính sinh học và khả năng tiêu hóa

(Heiniö et al 2003,;.. Katina, Laitila et al, 2007). Vì vậy mục tiêu của đề tài này là để thử

nghiệm ảnh hưởng của các quá trình lên men khác nhau (lên men nấm men và lên men axit

lactic) vào hoạt tính chống oxy hóa và tổng hàm lượng hợp chất trong ngũ cốc được lựa chọn.

2. Vật liệu và phương pháp

2.1 Vật liệu

Các mẫu ngũ cốc được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm lúa mạch(Fagopyrum

esculentum) được sản xuất bởi Organic Biopharm, Trung Quốc và lúa mì chưa xát vỏ

(Triticum aestivum), lúa mạch đen(Secale cereale) và lúa mạch(Hordeum vulgare) được sản

xuất từ KLAS, Sarajevo. Các hợp chất 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), acid

thiobarbituric (TBA) và axit gallic được mua từ Sigma–Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen,

Đức), thuốc thử Folin-Ciocalteu đã được mua từ Merck & Co., Inc (New York, Mỹ), tất cả các

hóa chất và dung môi khác có chất lượng cao nhất mua từ Lachema Ltd (Brno, Cộng hòa Séc)

và Fluka Chemie GmbH (Buchs, Thụy Sĩ) và sử dụng ngay không cần tinh chế thêm. Vi sinh

vật được sử dụng trong nghiên cứu này (Lactobacillus rhamnosus A71 và Saccharomyces

cerevisiae) đến từ một bộ sưu tập của Phòng thí nghiệm Vi sinh của Khoa Công nghệ và

Luyện kim, Belgrade. Môi trường nuôi cấy MRS và Tryptic soy được mua từ Merck & Co.,

Inc. (New York, Mỹ).

2.2. Tách chiết và chuẩn bị mẫu

2.2.1. Chuẩn bị giống nuôi cấy vi sinh

Giống nuôi cấy vi sinh Lactobacillus rhamnosus A71 đã được giữ ở dạng đông khô và

kích hoạt trong 10 ml MRS 1% và giống vi sinh vật Saccharomyces cerevisiae nuôi trong

thạch agar ở 4oC và kích hoạt ở 10ml Tryptic soy 1%. Ủ trong 24 giờ được thực hiện 37oC cho

L.rhamnosus và 30oC cho S.cerevisiae. Sau 3 bước, giống vi sinh vật mới thu được sử dụng để

cấy vào mẫu ngũ cốc xay.

2.2.2. Chuẩn bị chiết xuất ngũ cốc

Mẫu ngũ cốc được chuẩn bị thành ba mẫu. Hạt ngũ cốc (100 g) được ngâm trong nước

cất trong 24 giờ, sau đó được lọc và nghiền với 400 ml nước cất. Ngũ cốc nghiền sau đó được

vô trùng trong nồi hấp trong 1 giờ và làm mát bằng nước. Mẫu đầu tiên của mỗi ngũ cốc đã

được thêm L. rhamnosus (5 ml sinh khối), mẫu thứ hai được cấy vào S. cerevisiae (5 ml sinh

khối), và mẫu thứ ba là mẫu không cấy. Tất cả ba mẫu của từng loại được cho lên men ở 30 oC

trong 24 giờ. Các mẫu được chiết xuất với 70%(v/v) ethanol (700ml) trong 3 giờ trên các

khuấy từ (Heidolph MR 3001, Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Đức) và sau đó ly

tâm ở 3060g (4500rpm) trong 10 phút bằng cách sử dụng máy ly tâm đa năng SIGMA 2-16

(MBI, Dorval, Canada). Chất chiết xuất được đổ vào đĩa thí nghiệm và lượng dư đã được tái

chiết với 70% (v / v) ethanol (300 ml) trong 3 giờ bằng khuấy từ và và ly tâm ở 3060g (4500

rpm) trong 10 phút. Các dịch trích được trộn lại. Lượng chất chiết xuất được khoảng 1.200ml

và giữ trong tủ lạnh cho đến khi làm khô. Trước khi sấy, mẫu được cô đặc tới 100ml bằng

Buchi rotavapor R 210/215 (Buchi Labortechnik AG, Flawil, Thụy Sĩ) (nhiệt độ 50o C, áp suất

50-150 mbar). Dịch chiết cô đặc đã được sấy khô bằng cách sử dụng Máy sấy phun Buchi

B290 loại nhỏ(Buchi Labortechnik AG, Flawil, Thụy Sĩ) sau khi hòa tan trong nước để thu

được thấp hơn 20% (v / v) nồng độ ethanol, đó là điều kiện làm việc cho máy này. Nhiệt độ

đầu vào và bơm được điều chỉnh tương ứng là 120-125oC và 15-20%, dẫn nhiệt độ đầu ra là

60-63oC.

Mẫu khô được lưu giữ trong các đĩa được bịt kín trong tủ lạnh cho đến khi phân tích

thêm.

2.2.3. Xác định tổng hàm lượng phenol

Hàm lượng tổng phenol thông qua chiết xuất được xác định bằng phương pháp Folin-

Ciocalteu đã được chỉnh sửa (Singleton & Rossi, 1956). Một cách ngắn gọn, 100µl của từng

dịch trích được lắc trong 1 phút với 500 µl thuốc thử Folin-Ciocalteu và 6 µl nước cất. Sau khi

hỗn hợp được lắc, 2 ml 15% Na2CO3 được thêm vào và hỗn hợp được lắc một lần nữa trong

0,5 phút. Sau cùng, dung dịch được thêm nước cất lên đến 10 ml. Sau 2 giờ, độ hấp thu đo

được bằng máy quang phổ UV/nhìn thấy (Ultrospec 3300 pro, Amersham Bioscience, Thụy

Điển) tại bước sóng 750 nm (25oC) sử dụng cuvettes chống khoảng trắng (100 µl nước cất

thay cho mẫu thử nghiệm). Chuẩn TPC được thẩm định bằng cách vẽ các đường chuẩn axit

gallic (1-1500 lg / ml) và diễn tả như miligam tương đương axit gallic (GAE) mỗi gram chiết

xuất khô. Các phương trình cho đường cong hiệu chuẩn axit gallic là Y = 1,34577×X 0,07823 (trong đó X = nồng độ tương đương axit gallic (GAE) diễn tả như milligram GAE

mỗi gram của chiết xuất khô; Y = hấp thụ đo được) và hệ số tương quan là R2 = 0,9897.

2.2.4. Xác định hoạt động loại bỏ gốc tự do DPPH

Hoạt động chống oxy hóa của các chiết xuất bằng ethanol khô(ethanol không có nước)

được đo trên cơ sở hoạt động loại bỏ của sự ổn định gốc 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl

(DPPH) (Cuendet, Hostettmann, & Potterat, 1997). Trong một đĩa thí nghiệm chứa 50 µl mẫu

thử ở các nồng độ khác nhau được thêm vào: 3,95 ml methanol và 1 ml 0,2 mM dung dịch

DPPH methanol. Sau 30 phút ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng, độ hấp thụ đo được trừ đi

mẫu trắng (methanol) tại bước sóng 517 nm bằng cách sử dụng máy quang phổ UV/nhìn

thấy(Ultrospec 3300 pro, Amersham Bioscience, Thụy Điển). Sự ức chế gốc DPPH được tính

toán là một tỷ lệ phần trăm (%) bằng công thức:

Tỷ lệ ức chế(%) = [(Acontrol – Asample)/Acontrol]×100

Trong đó, Acontrol là độ hấp thụ của các phản ứng điều khiển (có chứa tất cả các chất

phản ứng trừ hợp chất thử nghiệm), Asample là độ hấp thụ của hợp chất thử nghiệm. Giá trị IC50

(nồng độ của mẫu cần thiết để loại bỏ 50% của các gốc tự do) được tính toán từ phương trình

hồi quy, chuẩn bị từ nồng độ mẫu và tỷ lệ ức chế sự hình thành các gốc tự do (tỷ lệ ức chế

DPPH được khảo nghiệm). Acid L-ascorbic tổng hợp được có hoạt tính chống oxy hóa sử

dụng kiểm soát tốt và tất cả các thử nghiệm đã được tiến hành ba lần.

2.2.5. Phương pháp FRAP

Trong phương pháp FRAP màu vàng của phức hợp Fe3+ -TPTZ giảm xuống thay bằng

màu xanh của phức hợp Fe2+ -TPTZ bởi các chất nhường điện tử (electron-donating

substances) trong điều kiện có tính acid. Bất kỳ chất nhường điện tử với một nữa phản ứng

của thế oxi hóa khử thấp hơn so với Fe3+/Fe2+ -TPTZ sẽ điều khiển phản ứng và sự hình thành

của các phức hợp chuyển tiếp màu xanh. Để chuẩn bị thuốc thử FRAP, một hỗn hợp của

300mmol/l dung dịch đệm acetate pH 3.6 (bao gồm 6,4 ml dung dịch 2M Natri acetate và 93,6

ml 2M dung dịch acid acetic pha loãng trong bình định mức 1 lít), 10 mmol/lít TPTZ (trong

40 mmol/lít HCl) và 20 mmol/lít sắt clorua (10: 1: 1, v: v: v) được làm trước. 150µl dịch chiết

thực vật được pha trộn với 4.5ml thuốc thử FRAP. Việc đọc độ hấp thu được bắt đầu sau 5

phút và chúng được thực hiện ở bước sóng 593nm bằng máy quang phổ UV/nhìn thấy

(Ultrospec 3300 pro, Amersham Bioscience, Thụy Điển). Mẫu trắng gồm thuốc thử FRAP. Độ

hấp thu chính thức của từng mẫu được so sánh với đường cong tiêu chuẩn thu được từ sắt

sunfat(FeSO4×7H2O) (200-1000µmol/l). Kết quả được thể hiện trong nmol Fe2+/mg chiết xuất

khô.

2.2.6. Kiểm tra acid Thiobarbituric (TBA)

Xét nghiệm axit Thiobarbituric được thực hiện theo phương pháp của Afanas'ev,

Dorozhko, Brodskii, Kostyuk, và Potapovitch (1989) để xác định các chất phản ứng TBA

(TBARS) từ lipid peroxy. Lipid peroxy được đo trong liposome rimifon Lipotech 10 (0,3 g

lecithin/ml). Hỗn hợp chứa 20µl FeSO4 (0,075 M), 50µl liposome, 10µl mẫu thử nồng độ

khác nhau (1-10% w/v), 20µl axit L-ascorbic (0,1 M) và 3,9 ml đệm phosphate pH 7.4 (chứa 5

ml 0,2 mol/l dung dịch KH2PO4 và 3,91 ml 0,2 mol/l dung dịch NaOH pha loãng trong bình

định mức (20 ml)). Hỗn hợp này được duy trì ở mức 37oC trong 1 giờ ở máy điều nhiệt và sau

đó trộn với 0.2ml acid axit ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (0,1 M) và 1.5ml thuốc thử

TBA(3g axit thiobarbituric, 120g axit trichloroacetic và 10,4 ml axit pecloric trong 800 ml

nước đã khử khoáng). Sau khi làm nóng ở 100oC trong 15 phút và ly tâm ở 1107g (3000 rpm)

trong 10 phút bằng máy ly tâm SIGMA 2-16 Versatile (MBI, Dorval, Canada), độ hấp thụ của

bề mặt được đo ở bước sóng 532 nm so với mẫu trắng (nước cất) bằng cách sử dụng máy

quang phổ UV/nhìn thấy (Ultrospec 3300 pro, Amersham Bioscience, Thụy Điển). Sự ức chế

peroxy lipid đã được tính toán bằng phần trăm (%) theo công thức:

Tỷ lệ ức chế(%) = [(Acontrol – Asample)/Acontrol]×100

Trong đó, Acontrol là độ hấp thụ của các phản ứng điều khiển (có chứa tất cả các chất

phản ứng trừ hợp chất thử nghiệm), Asample là độ hấp thụ của hợp chất thử nghiệm.

2.2.7. Phân tích thống kê

Tất cả các phân tích để xác định các hoạt động chống oxy hóa và thử nghiệm để xác

định tổng hàm lượng phenol (TPC) đã được thực hiện trong ba lần. Các giá trị trung bình và

độ lệch chuẩn được tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel (Microsoft Corporation,

Redmond, WA). Phân tích phương sai (ANOVA) được sử dụng để đánh giá sự khác biệt đáng

kể giữa các phương pháp xử lý khác nhau với các tiêu chí P <0,05.

3. Kết quả và thảo luận

3.1 Tổng lượng phenol và hoạt tính chống oxy hóa của các thực vật

Hoạt tính chống oxy hóa và tổng phenol của 4 loại ngũ cốc tự nhiên được kiểm tra trình bày

trong bảng 1.

Bảng 1: Tổng số phenol và hoạt tính chống oxy hóa của nguyên liệu thực vật tự nhiên và

được lên men.

Tên mẫu TPCA (mg GAE/g

dried extract)*

DPPHB

(IC50) (lg/ml)*

FRAPC (nmol

Fe2+/mg dried

extract)*

TBARS

inhibitionD

(%)*

Kiều mạch

(Fagopyrum

esculentum)

Tự nhiên 50.7 ± 0.04a 76.7 49.43 ± 0.49a 45.6 ± 0.55a

Lên men

với L. rhamnosus59.4 ± 0.06b 63.4

51.54 ± 0.65a 50.2 ± 0.45b

Lên men

với S. cerevisiae

53.2 ± 0.02c 66.3 49.76 ± 0.62a 49.1 ± 0.85a

Lúa mạch

(Hordeum

vulgare)

Tự nhiên 16.4 ± 0.04a >200 15.56 ± 0.67a 50.8 ± 0.75a

Lên men với

L. rhamnosus20.1 ± 0.08b >200 20.0 ± 0.54b 60.9 ± 0.75b

Lên men

với S. cerevisiae

18.5 ± 0.09c >200 19.83 ± 0.51b 52.4 ± 0.50a

Lúa mì (Triticum

durum)

Tự nhiên 16.2 ± 0.07a >200 12.15 ± 0.60a 55.2 ± 0.35a

Được lên men

với L. rhamnosus

20.7 ± 0.06b >200 15.11 ± 0.57a 61.7 ± 0.75b

Được lên men

với S. cerevisiae

18.4 ± 0.08c >200 12.25 ± 0.62a 56.5 ± 0.70a

Lúa mạch (Secale

cereale)

Tự nhiên 13.2 ± 0.06a >200 8.94 ± 0.86a 57.6 ± 0.45a

Được lên men

với L. rhamnosus18.4 ± 0.06b 196.3 13.94 ± 0.91a 62.4 ± 0.60a

Được lên men

với S. cerevisiae

16.2 ± 0.04c >200 10.68 ± 0.83a 60.0 ± 0.65a

A Tổng số hàm lượng phenol (TPC) theo phương pháp Folin-Ciocalteu.B Hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH

C Khả năng khử sắt của plasma (FRAP).D Phương pháp Thiobarbituric (TAB).* Những giá trị có những chữ cái viết ở trên khác nhau (a,b,c) thì bên trong mỗi loại ngũ cốc

riêng thì khác nhau đáng kể ( P =0.05)

Tất cả thực vật cho thấy tổng lượng phenol đáng kể và hoạt tính chống oxy hóa hiệu

quả (Bảng 1). Bột kiều mạch có lượng phenol cao nhất với hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH

và khả năng khử Fe3+ cao nhất, nhưng khả năng ức chế quá trình peroxide lipid thấp nhất.

Những số liệu thí nghiệm này cho thấy trong việc làm chậm quá trình peroxide lipid thì nó

ngăn chặn giai đoạn bắt đầu của các chuỗi phản ứng gốc tự do hơn là chấm dứt hay di chuyển

gốc tự do sinh ra trong chuỗi truyền phản ứng của gốc tự do (Yu, Haley, Perret, & Harris,

2002). Những thực vật khác thì tương tự TPC và AOA.

Quá trình lên men dẫn đến tăng hàm lượng phenol, được đo bằng phương pháp TPC, và

hoạt tính chống oxy hóa cao hơn hay thấp hơn , được đo bằng 3 phương pháp. Hoạt tính chống

oxy hóa được nghiên cưú trong mẫu được lên men với L. rhamnosus cao hơn so với mẫu

được lên men với S.cerevisiae ( Bảng 1). Phenol liên kết- sự quan trọng của nó trong tổng

thành phần phenol (TPC) được công nhận bởi một trong những nghiên cứu rất sớm của Naczk

và Shahidi (1989)- có lẽ bị thất thoát bởi alkali, acid hay cách xử lí enzyme của mẫu trước khi

trích ly (Krygier, Sosulski, & Hodge, 1982a,b; Bartolome & Gomez- Cordoves ,1999), điều

này có thể được sử dụng để giải thích bằng quá trình lên men tự phát làm tăng TPC dẫn đến

khả năng chống oxy hóa của dịch chiết ngũ cốc được lên men cao hơn.

3.2 Tổng hàm lượng phenol

Như được trình bày ở bảng 1, tổng hàm lượng phenol trong ngũ cốc và giả ngũ cốc thì

cao nhất là ở trong bột kiều mạch, 50.7 mg GAE/g dịch chiết khô. Hàm lượng phenol của bột

kiều mạch tương tự được báo cáo bởi Velioglu, Mazza, Gao, và Oomah (1998). Tổng hàm

lượng phenol thấp hơn có trong lúa mì và lúa mạch ( tương ứng với 16.2 và 16.4 mg GAE/g

dịch chiết khô) và thấp nhất là trong lúa mạch đen 13.2 mg GAE/g dịch chiết khô. Những số

liệu thí nghiệm được báo cáo bởi Zhou và Yu (2004) cho thấy tổng hàm lượng phenol trong

hạt lúa mì và lúa mạch bị tác động bởi dung môi trích ly theo thứ tự giảm dần như sau:

acetone > ethanol > methanol , điều này có thể được giải thích bởi lượng phenol thấp hơn có ở

những thực vật này (Bảng 1). Thông qua Zielinski và Troszynska ( 2000), thời gian trích ly và

phương pháp trích ly làm ảnh hưởng đến TPC trong lúa mạch đen, vì vậy thật khó có thể so

sánh kết quả của chúng tôi với những người khác. Thông thường, khó có thể so sánh số liệu

thí nghiệm của chúng tôi với các văn bản thí nghiệm khác bởi vì phương pháp dùng để trích ly

khác nhau, cách xác định AOA khác nhau và cách giải thích số liệu khác nhau bởi các tác giả

khác nhau.

Quá trình lên men ảnh hưởng đến thành phần có hoạt tính sinh học (Bảng1). Trong bột

kiều mạch, TPC tăng từ 50.7 mg GAE/g dịch chiết khô trong mẫu không lên men đến 53.2

mg GAE/g dịch chiết khô trong mẫu lên men với S.cerevisiae và 59.4 mg GAE/g dịch chiết

khô với mẫu được lên men với L.rhamnosus. Trong lúa mì, TCP biến đổi từ 16.2 mg GAE/g

dịch chiết khô đến 18.4 và 20.7 mg GAE/g dịch chiết khô, tương ứng với 3 mẫu như trên;

trong lúa mạch tương ứng giá trị 16.4, 18.5, 20.1mg GAE/g dịch chiết khô. Lúa mạch đen cho

thấy TPC thấp nhất của 13.3 mg GAE/g dịch chiết khô trong mẫu không lên men, 16.2 mg

GAE/g dịch chiết khô trong mẫu được lên men với S.cerevisiae và 18.4 mg GAE/g dịch chiết

khô trong mẫu được lên men với L.rhamnosus. Những kết quả này có thể được giải thích rằng

lượng hợp chất có hoạt tính sinh học có thể bị biến đổi trong suốt quá trình lên men do hoạt

động trao đổi chất của các vi khuẩn. Ngoài ra, thành tế bào hạt ngũ cốc bị phá vỡ cấu trúc

trong quá trình lên men, dẫn đến sự phân giải và/ hay tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh

học đa dạng (Katina, Liukkonen et al., 2007). Trong suốt quá trình lên men, enzymes như

amylase, xylanases và proteases từ hạt và vi khuẩn sẽ đóng góp vào sự biến đổi các thành

phần của hạt (Katina, Laitila et al.2007; Loponen, Mikola, Katina, Sontag-Strohm,

&Salovaara,2004), và như được đề cập, phenol liên kết có lẽ bị thất thoát trong cách xử lí

enzyme của mẫu trước khi trích ly (Bartolome & Gomez-Cordoves, 1999; Krygier et al.,

1982a,b). Loại lên men xác định mức độ biến đổi các hợp chất có hoạt tính sinh học trong các

ngũ cốc thí nghiệm. Điều này là do sự khác nhau về pH của các quá trình lên men khác nhau,

pH tối ưu tác động đến sự phá hủy thành tế bào sẽ làm giảm sự hình thành enzyme từ hạt ngũ

cốc (Boskov-Hansen et al.,2002). Những tác giả khác cũng đã chứng minh rằng quá trình lên

men có tác động xác thực vào TPC và hoạt tính chống oxy hóa của ngũ cốc, nhưng mức độ tác

động phụ thuộc vào loại vi sinh vật (Kariluoto et al. 2006). Nhiều nghiên cứu chi tiết về sự

thay đổi số lượng vi khuẩn và hoạt động của enzyme thích hợp trong suốt quá trình lên men

của ngũ cốc thì được yêu cầu phải xác định được cơ chế chính xác gây ra sự cải thiện giá trị

dinh dưỡng của các ngũ cốc được lên men, đặc biệt được biết đến là phương pháp Folin-

Ciocalteu (được sử dụng để xác định tổng lượng phenol) thì không có nguyên nhân rõ ràng và

còn hạn chế khi được nghiên cứu lên men. Được biết là các hợp chất hữu cơ không phải

phenol , phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu bao gồm adenine, adenosine, alanine, aniline,

aminobenzoic acid, ascorbic acid, benzaldehyde, creatinine, cysteine, cytidine, cyto- sine,

dimethyaniline, diphenylamine, EDTA, fructose, guanine, gua- nosine, glycine, histamine,

histidine, indole, methylamine, nitrilo- acetic acid, oleic acid, phenylthiourea, proteins,

pyridoxine, sucrose, sulfanilic acid, thiourea, thymine, thymidine, trimethyla- mine,

tryptophan, uracil, uric acid, and xanthinethe, lượng amino acids và acids hữu cơ được hình

thành trong suốt quá trình lên men có thể tăng hàm lượng phenol biểu kiến (Prior, Xianli, &

Schaich, 2005).

3.3 Hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH

Gốc tự do DPPH được sử dụng nhiều để đánh giá hoạt động loại bỏ gốc tự do bởi sự dễ

dàng và thuận tiện của phương pháp . Hiệu quả loại bỏ của dịch chiết từ thực vật được sử

dụng với hàm lượng mẫu cao nhất thì thấp cho dịch chiết từ lúa mì , với chỉ 31% sự ức chế

gốc tự do DPPH (200 µg/ml) (như được trình bày ở bảng 2).

Bảng 2

Hoạt động loại bỏ gốc DPPH cho thực vật tự nhiên và được lên men.

Tên mâu4

Sự ức chế gốc DPPH(%)*

s. c.A 10 lg/ml s. c. 20 lg/ml s. c. 50 lg/ml s. c. 100 lg/ml s. c. 200

lg/ml

Kiều mạch(Fagopyrum

esculentum)

Tự nhiên 11.6 ± 0.55a 21.6 ± 0.50a 34.8 ± 0.65a 63.3 ± 0.50a 82.5 ± 0.45a

Được lên men với L.

rhamnosus

14.7 ± 0.65a 23.5 ± 0.70a 42.4 ± 0.55b 70.1 ± 0.95b 86.0 ± 0.45b

Được lên men với S.

cerevisiae

12.6 ± 0.95a 22.0 ± 0.85a 42.4 ± 0.55b 65.4 ± 0.65a 85.3 ± 0.55a

Lúa mạch (Hordeum

vulgare)

Tự nhiên 6.5 ± 0.45a 12.5 ± 0.65a 17.9 ± 0.75a 28.0 ± 0.75a 36.6 ± 0.95a

Được lên men với L.

rhamnosus

15.5 ± 0.80b 16.1 ± 0.75a 23.2 ± 0.45b 35.4 ± 0.65b 42.9 ± 0.90b

Được lên men với S.

cerevisiae

12.5 ± 0.55b 14.3 ± 0.65a 22.0 ± 0.80a 28.0 ± 0.95a 41.7 ± 0.65a

Lúa mì (Triticum durum)

Tự nhiên 6.7 ± 0.55a 12.2 ± 0.60a 15.6 ± 0.55a 23.4 ± 0.50a 31.0 ± 0.65a

Được lên men với L.

rhamnosus

10.1 ± 0.60a 15.9 ± 0.85a 18.5 ± 0.65a 28.2 ± 0.55b 35.9 ± 0.55b

Được lên men với S.

cerevisiae

8.2 ± 0.70a 13.4 ± 0.60a 16.9 ± 0.65a 27.4 ± 0.55b 34.3 ± 0.45a

Lúa mì (Secale cereale)

Tự nhiên 10.6 ± 0.65a 18.9 ± 0.65a 25.8 ± 0.55a 32.7 ± 0.60a 45.0 ± 0.80a

Được lên men với L.

rhamnosus

15.1 ± 0.65b 24.6 ± 0.50b 31.5 ± 0.55b 39.2 ± 0.65b 50.4 ± 0.65b

Được lên men với S.

cerevisiae

13.6 ± 0.65a 22.2 ± 0.65a 30.0 ± 0.95b 35.2 ± 0.55a 48.8 ± 0.65a

A Nồng độ mẫu.

* Các giá trị có các chữ khác nhau (a, b) trong mỗi loài ngũ cốc riêng lẻ là sự khác biệt đáng

kể (P = 0,05)

Trong các nghiên cứu khác, những dich chiết lúa mì cũng đã chứng minh hoạt tính loại

bỏ gốc tự do DPPH yếu trong hàm lượng mẫu này (Yu, Perret, Davy, Wilson & Melby, 2002).

Hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH mạnh hơn được tìm thấy trong lúa mạch và lúa mạch đen

(tương ứng với 36.6% và 45%)(Bảng 2). Những kết quả của việc cho thấy khả năng ức chế

đáng kể gốc tự do DPPH của lúa mạch thì phù hợp với số liệu thí nghiệm được báo cáo bởi

các người khác, ngoại trừ sự khác nhau về việc giải thích số liệu thí nghiệm. Madhujith và

Shahidi (2006) đã chứng minh rằng lúa mạch chứa lượng lớn những chất chống oxy hóa

phenol có hiệu quả loại bỏ các gốc tự do đặc biệt là peroxyl, DPPH, và những gốc tự do

hydroxyl. Hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH mạnh nhất được tìm thấy trong dịch chiết bột kiều

mạch (82.5%)(Bảng 2). Hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH được nghiên cứu và báo cáo số liệu

thí nghiệm bởi Sun và Ho (2005).

Quá trình lên men với L.rhamnosus có một tác động xác thực vào hiệu quả ức chế

DPPH trong mỗi loại ngũ cốc (Bảng 2). Về bột kiều mạch, hiệu quả loại bỏ gốc tự do tăng từ

82.5% trong mẫu không được lên men đến 86% trong mẫu được lên men với L.rhamnosus,

dẫn đến IC50 tương ứng giá trị của 76.7 và 63.4 µg/ml (Bảng 1, bảng 2). Tương tự tăng sự loại

bỏ gốc tự do DPPH sau khi lên men với L.hramnosus thì cũng được báo cáo trong lúa mạch

đen (tương ứng 45% và 50.4%), lúa mạch (36.6% và 42.9%), lúa mì (31% và 35.9%).Sự lên

men với S.cerevisiae không có tác động đáng kể vào hiệu quả ức chế DPPH trong loại ngũ cốc

được thí nghiệm (Bảng 2). Phần trăm ức chế trong mẫu được lên men với S.cerevisiae là

85.3% cho bột kiều mạch (với IC50 giá trị 66.3 µg/ml), 48.8% cho lúa mạch đen, 41,7% cho

lúa mạch và 34.3% cho lúa mì. Những kết quả này thì phù hợp với số liệu thí nghiệm được

báo cáo bởi Moore et al. (2007) - ông là người báo cáo một vài sự tăng hoạt động loại bỏ gốc

tự do DPPH của lúa mì sau khi lên men nấm men với nhiều loại nấm men , trái lại khả năng

này giảm với các loại nấm men khác , điều này cho thấy nấm men có lẽ có năng lực loại bỏ

DPPH khác nhau. Không có sự tương quan tồn tại giữa TPC và hoạt động loại bỏ gốc tự do

DPPH trong ngũ cốc (Bảng 1). Những ngũ cốc có giá trị TPC cao hơn thì chưa chắc ức chế

DPPH tốt hơn. Thông qua Brand-Williams, Cuvelier, và Berset (1995), acid ferulic (loại acid

phenolic chính có trong hạt ngũ cốc) cho thấy hiệu quả chống gốc tự do yếu trong những thí

nghiệm với gốc tự do DPPH, điều này có thể giải thích sự không thống nhất này. Bên cạnh đó,

mặc dù phương pháp Folin-Ciocalteu thì được sử dụng phổ biến để xác định tổng thành phần

phenol trong các mẫu thực vật học và sinh vật học nhưng nó vẫn có những mặt hạn chế. Các

tác nhân khử khác như acid L-ascorbic và sulphur dioxide có lẽ cũng phản ứng với thuốc thử

Folin –Ciocalteu và đóng góp vào tổng năng suất hấp thụ theo phổ, điều này thường dẫn đến

kết quả tổng lượng phenol được đánh giá quá cao. Ngoài ra, các thành phần phenol riêng có lẽ

có phản ứng với thuốc thử Folin- Ciocalteu khác nhau, điều này có thể dẫn đến sự sai sót trong

sự đo lường tổng thành phẩn phenol (Yu, Perret et al, 2002).

Thường có một vài sự giải thích về mối quan hệ mơ hồ giữa hoạt tính chống oxy hóa và

tổng phenol: (1) Tổng thành phần phenol không bao gồm tất cả các chất chống oxy hóa như

acid ascorbic, carotenoid và tocopherols ; (2) Sự kết hợp giữa các chất chống oxy hóa trong

hỗn hợp làm hoạt tính chống oxy hóa không chỉ phụ thuộc vào hàm lượng chất chống oxy

hóa, cấu trúc mà còn phụ thuộc vào sự tương tác lẫn nhau giữa các chất chống oxy hóa. Đó là

tại sao mà các mẫu có hàm lượng tổng phenol tương tự nhau mà lại có hoạt tính chống oxy

hóa khác nhau rõ rệt ; (3) Những phương pháp khác nhau được sử dụng để đo lường hoạt tính

chống oxy hóa dựa vào các cơ chế khác nhau có lẽ dẫn đến những lời nhận xét khác nhau (Sun

& Ho, 2005).

3.4 Phương pháp FRAP

Khả năng chống oxy hóa bằng cách khử sắt của ngũ cốc được khảo sát trong bảng 1,có

liên quan đến tổng thành phần phenolic.Giá trị FRAP cao nhất,thể hiện trong nmol của

Fe2+/mg chiết suất khô,được tìm thấy trong kiều mạch (49.43nmol Fe2+ / mg chiết suất khô),

tiếp theo FRAP giá trị thấp nhất trong lúa mạch và lúa mì (lần lượt là 15.56 và 12.15).Và khả

năng chống oxy hóa bằng cách khử sắt được tìm thấy trong lúa mạch đen (8.94).

Sự khó khăn trong giải thích về sự so sánh của dữ liệu thì thậm chí còn rõ ràng hơn với

phương pháp FRAP.Trong công việc của chúng ta,những kết quả được thể hiện trong nmol

của Fe2+/mg chiết suất khô,tuy nhiên những tác giả khác báo cáo rằng những kết quả trong

nmol hoặc mmol Fe2+ trong mg hoặc g của ngũ cốc hay bột mì (Xand và Chang năm

2007).Bên cạnh đó,dung môi chiết xuất và những phương pháp của sự chuẩn bị mẫu sử dụng

trong những nghiên cứu khác thì khác nhau,và cả hai đều cho thấy là có ảnh hưởng lên FRAP

(Xand và Chang năm 2007).

Thật ấn tượng là trong lúa mạch đen, có vai trò đáng kể trong hoạt đông ức chế gốc tự

do DPPH, cho thấy khả năng khử sắt thấp nhất (bảng 1). Phải thận trọng trong việc thu nhận

khi sử dụng những gốc tự do như là cơ sở cho những thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bởi

vì hoạt tính chống oxy hóa được đo của mẩu sinh học phụ thuộc vào gốc tự do và chất oxy hóa

đươc sử dụng trong phân tích (Cao,Sofic,& Prior năm 1996). Những gốc tự do khác nhau

được sử dụng và mức độ chất chống oxy hóa được tính toán hoàn thành bởi Cao et al.(1996)

hoặc tốt nhất bằng phương pháp phân tích FRAP,đây chỉ là một phân tích về đo chất oxy hóa

và chất khử một cách trực tiếp trong 1 mẫu được thực hiện bởi Halvorsen et al (2002).

Lên men bằng vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi thì không tìm

thấy có bất kỳ ảnh hưởng đáng kể nào đến chất khả năng oxy hóa khử sắt III của các loại ngũ

cốc đã kiểm tra (Bảng 1). Chỉ có trong lúa mạch, các mẫu lên men với L. rhamnosus cho thấy

một sự gia tăng trong FRAP cao hơn so với mẫu chưa lên men (20,00 nmol Fe2+/chiết xuất mg

khô so với 15,56 nmol Fe2+/mg chiết xuất khô), trong khi sự khác biệt là không đáng kể trong

lúa mì, lúa mạch đen và kiều mạch (Bảng 1). Sự khác biệt trong giá trị FRAP giữa các mẫu

lên men với S. cerevisiae và mẫu chưa lên men cũng không đáng kể (Bảng 1). Có những dữ

liệu khoa học không đủ để so sánh ảnh hưởng của quá trình lên men trên FRAP nhưng, như thí

nghiệm của chúng tôi sử dụng một thời gian ủ 24 h, các dữ liệu thu được là tương thích với

những báo cáo của Hubert, Berger, Nepveu, Paul, và Daydé (2008), họ chỉ ra rằng khả năng

giữ sắt III ban đầu ,được duy trì cho đến 6 giờ, tiếp theo là sự sụt giảm đáng kể cho đến 48 giờ

trong thời gian ủ. Nghiên cứu thêm là cần thiết để chứng minh ảnh hưởng của thời gian ủ lên

khả năng khử sắt III cho các nhà máy kiểm tra.

Bảng 3 :Khả năng ức chế lipid peroxy cho thực vật tự nhiên và lên men

Tên mẫu Sự ức chế lipid peroxide ( % ) *

s. c.A 25 µg/ml

s. c. 125 µg/ml

s. c. 250 µg/ml

Kiều mạch

( Chi Kiều

mạch

esculentum )

Tự nhiênLên men với L. rhamnosusLên men với S. cerevisiae

37.4 ± 0.65a

41,3 ±0.50b

39.5 ± 0.65a

40.8 ± 0.65a

46.9 ±0.85b

44.5 ±0.55b

45.6 ± 0.55a

50.2 ±0.70b

49.1 ± 0.95a

Lúa mạch

( Hordeum

vulgare )

Tự nhiênLên men với L. rhamnosusLên men với S. cerevisiae

43.1 ± 0.65a

48.4 ±0.50b

45.5 ± 0.80a

46.3 ± 0.50a

52.6 ±0.75b

48.1 ± 0.60a

50.8 ± 0.75a

60.9 ±0.90b

52.4 ± 0.50a

Lúa mì

( Triticum

durum )

Tự nhiênLên men với L. rhamnosusLên men với S. cerevisiae

43.0 ± 0.55a

52.3 ±0.65b

46.6 ± 0.75a

51.0 ± 0.45a

55.2 ±0.65b

53.1 ± 0.65a

55.2 ± 0.35a

61.7 ± 0.70b

56.5 ± 0.65a

Lúa mạch đen

( Secale

cereale )

Tự nhiênLên men với L. rhamnosusLên men với S. cerevisiae

50.5 ± 0.55a

55.8 ±0.50b

53.2 ± 0.60a

53.1 ± 0.95a

59.2 ±0.95b

56.8 ± 0.95a

57.6 ± 0.45a

62.4 ± 0.75b

60.0 ± 0.60a

A Nồng độ mẫu.

* Các giá trị có các chữ khác nhau (a, b) trong mỗi loài ngũ cốc riêng lẻ là sự khác biệt đáng

kể (P = 0,05).

3.5. Kiểm tra acid Thiobarbituric (TBA)

Như thể hiện trong Bảng 1, có sự thiếu tương quan giữa TPC và khả năng ức

chế lipid peroxy trong ngũ cốc. Các loại ngũ cốc với giá trị TPC cao hơn thì không

nhất thiết rằng sự ức chế lipid peroxy tốt hơn. Giải thích về điều này có thể trong

cơ chế phức tạp của sự ức chế lipid peroxy hóa, trong đó bao gồm không chỉ

phenol đơn giản mà còn polyphenol cao phân tử và chất chống oxy hhoaskhoong

phải là phenolic. Theo kết quả , lúa mạch đen có khả năng ức chế peroxy lipid hóa

tốt nhất trong tất cả các loại ngũ cốc được kiểm tra ( 57,6 % ) , tiếp theo là lúa mì

và lúa mạch (tương ứng là 55,2 % và 50,8 % ) , trong khi kết quả thấp nhất trong

các kiểm tra TBA là kiều mạch (45,6 %) (Bảng 1) . Bên cạnh đó , chiết xuất lúa mì

, được chứng minh có một khả năng cao để ức chế lipid peroxy trong liposome ,

nhưng cho thấy khả năng thấp nhất để phản ứng trực tiếp và dập tắt gốc tự do

DPPH (Bảng 1). Như đã đề cập, những số liệu thí nghiệm này gợi ý rằng nó có thể

là vấn đề then chốt hơn để ngăn chặn sự khởi đầu của chuỗi phản ứng gốc tự do,

kết thúc nó bằng cách loại bỏ các gốc tự do sinh ra trong quá trình truyền các chuỗi

phản ứng gốc tự do.

Các kết quả được trình bày trong Bảng 1 và 3 chỉ ra rằng quá trình lên men

với L. rhamnosus ảnh hưởng đến khả năng ức chế lipid peroxy hóa trong ngũ cốc ,

trong khi lên men với S. cerevisiae không có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng đó.

Tỷ lệ lipid peroxy ức chế trong liposome là 57,6 % trong chưa lên men mẫu lúa

mạch đen , 60,0 % cho các mẫu lúa mạch đen lên men với S. cerevisiae và 62,4 %

cho các mẫu lúa mạch đen lên men với L. rhamnosus. Cho lúa mì , những giá trị

lần lượt là 55,2 % , 56,5 % và 61,7 % , cho lúa mạch 50,8 % , 52,4 % và 60,9 % ,

tương ứng, và cho kiều mạch 45,6 % , 49,1 % và 50,2 % , tương ứng. Có những tài

liệu khoa học không đủ để so sánh ảnh hưởng của quá trình lên men trên khả năng

ức chế lipid peroxy. Điều hiển nhiên là hoạt tính chống oxy hóa của các chất chống

oxy hóa tự nhiên thì phụ thuộc vào hệ thống rất nhiều và một phạm vi rộng các

hoạt tính có thể được nghiên cứu phụ thuộc vào hệ thống lipid (được xem như là

chất nền).

4. Kết luận

Nghiên cứu này chỉ ra rằng các loại ngũ cốc, được sử dụng rộng rãi cho người tiêu dùng, thể hiện hoạt tính loại bỏ đáng kể các gốc tự do, khả năng khử của sắt II, khả năng ức chế sự peroxy lipid và tổng số thành phần phenolic. Những yếu tố này cho thấy khi sử dụng mình ngũ cốc là thực phẩm nó có thể chứa chất chống oxy hóa quan trọng trong khẩu phần và do đó đảm bảo nghiên cứu thêm để xác định xem liệu các chế độ ăn uống chất chống oxy hóa có thể có lợi cho sức khỏe con người hay không. Một số khác biệt đáng kể được tìm thấy trong các loại ngũ cốc có liên quan đến những đặc điểm này, nó đảm bảo cho việc nghiên cứu, đặc biệt là trong tác động đối với sức khỏe con người. Việc sử dụng quá trình lên men là một quy trình riêng biệt có thể nâng cao mức độ của nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học trong ngũ cốc và có thể được sử dụng để cải thiện tính chất sản phẩm bằng cách thay đổi tỷ lệ dinh dưỡng và các thành phần phi dinh dưỡng của thực vật. Các loại lên men rõ ràng có hiệu lực trên các thành phần có tiềm năng hoạt tính sinh học của các loại ngũ cốc, bằng cách xác định mức độ thay đổi của hầu hết các hợp chất có hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, các nghiên cứu chi tiết hơn về sự biến đổi mật độ vi sinh vật và các hoạt độ của enzym có liên quan trong quá trình lên men ngũ cốc đã được yêu cầu để xây dựng chính xác các cơ chế gây ra các ngũ cốc lên men để nâng cao giá trị dinh dưỡng của chúng. Cần nghiên cứu thêm để làm rõ đầy đủ các thành phần chiết xuất từ ngũ cốc lên men, để xác định các hợp chất chống oxy hóa trong những chất chiết xuất, và để đánh giá khả năng sử dụng của các sản phẩm ngũ cốc như chất chống oxy hóa tự nhiên và, như là thực phẩm chức năng. Ngoài ra, sự xác định của cả sinh học (ví dụ, tiêu hóa) và điều kiện chế biến thực phẩm có tác động đến sự phân bố, sự ổn định và hoạt độ của các chất chống oxy hóa của ngũ cốc là cần thiết để có thể sản xuất tối đa thực phẩm có lợi cho sức khỏe. Như vậy, hoạt tính sinh học tự nhiên của các loại ngũ cốc mì có thể được tăng thêm bằng cách sử dụng thiết kế Xử Lý Sinh Học để tạo ra bữa ăn sáng bằng ngũ cốc có nguồn dinh dưỡng cao, mà có thể được sử dụng như một chất gia tăng chất lượng trong bánh mỳ, ngũ cốc ăn sáng và thức ăn nhẹ. Để kết luận, nó dường như có lợi thế để chọn môi trường nuôi cấy vi sinh vật lên men cho các loại ngũ cốc dựa trên mối tương quan tích cực của họ với tổng hàm lượng chất chống oxy hóa.