ANKARA ÜNİVERSİTESİ SONUÇ RAPORUacikarsiv.ankara.edu.tr/browse/27324/rapor.pdf · 5 oynamaktadırlar. Vücut savunmasında rol alan immün ve enflamatuar hücrelerin çok yönlü

1

ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ

SONUÇ RAPORU

TİP 2 DİYABET HASTALIĞI KOMPLİKASYONLARININ GELİŞİMİNDE ROL OYNAYAN SİTOKİN GEN POLİMORFİZMLERİNİN ARAŞTIRILMASI

Doç. Dr. İlker ATEŞ (Proje Yürütücüsü)

Yardımcı Araştırmacılar: Prof. Dr. Asuman KARAKAYA

Prof. Dr. H. Sinan SÜZEN Doç. Dr. Durdu ALTUNER

Uzm. Dr. Serap BAYDUR ŞAHİN

Proje Kodu:12B3336005

Başlangıç Tarihi: 30.01.2012 Bitiş Tarihi: 30.01.2015

Rapor Tarihi: 29.04.2015 Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - " 2015 "

2

I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri

Tip 2 diyabet hastalığı komplikasyonlarının gelişiminde rol oynayan sitokin gen polimorfizmlerinin

araştırılması

Investigation of the cytokine gene polymorphisms playing role on the development of the complications

of Type 2 diabetes

Özet

Diabetes Mellitus (DM), insülin eksikliği sonucunda ortaya çıkan karbonhidrat, protein ve yağ

metabolizmasında bozukluklar ile seyreden kronik seyirli endokrin ve metabolik bir hastalıktır. DM,

akut komplikasyonlarının yanı sıra uzun vadede lipit metabolizması bozukluğunun endotel üzerinde

yaptığı hasar sonucunda oluşturduğu aterosklerotik kalp ve damar hastalıkları, retinopati, nefropati,

nöropati gibi makro ve mikro vasküler komplikasyonlar nedeniyle giderek önem kazanan küresel bir

sağlık sorunu haline gelmiştir.

Diyabet komplikasyonlarının gelişiminde genetik ve çevresel pek çok faktör rol oynamaktadır.

Araştırmalara göre enflamasyon oluşumu ile Tip 2 diyabet komplikasyonlarının oluşumu ve gelişimi

arasında ilişki olduğu öne sürülmektedir. Bilimsel çalışmalardan elde edilen verilere göre, Tip 2

diyabette görülen insülin salgısının azalmasına neden olan muhtemel bir mekanizma lipit

metabolizmasının bozulmasıyla ortaya çıkan oksidatif strestir. Oksidatif stres sonucu Reaktif Oksijen

Türleri (ROS) artar ve aktive olmuş makrofaj ve monositlerden sitokinlerin yüksek miktarlarda

salgılanmaları ile insülin rezistansı artmaktadır.

Sitokinler hücreler arası iletisimde önemli rol oynayan hormon benzeri protein veya glikoproteinlerdir.

Hem dogal, hem de spesifik inflamatuar yanıtta önemli rol oynamaktadırlar. Kemokinler ise

inflamasyonda ve homeostazda lökositlere ve stem hücrelere kemotaksi yaptıran sitokinlerdir. Bundan

dolayı sitokinlerin düzeyleri (kantitatif) ve yapılarında ki (kalitatif) varyasyonlar çeşitli hastalıkların

oluşumuna neden olmaktadırlar. Sitokin genlerinde ortaya çıkabilecek polimorfizmlerin çoğu

düzenleyici bölgelerde tek nükleotid değişimi (SNP) şeklinde olmaktadır. Bu varyasyonlar sitokin

genlerinin ekspresyon düzeylerini etkileyerek çeşitli hastalıklara karşı hassasiyeti arttırmaktadırlar.

Yapılan çalışmalar sonucu Tümör nekroz faktör-alfa (TNF-α), İnterlökin 1-beta (IL-1β), İnterlökin-6

(IL-6), İnterlökin-18 (IL-18) ve Monosit kemotaktik protein-1 (MCP-1) gibi sitokin ve kemokin gen

polimorfizmlerinin diyabetlilerde komplikasyon gelişimi ile bağlantılı olduğu öne sürülmektedir.

Bu verilerden hareketle bu çalışmada; diyabet komplikasyonlarının gelişiminde pay sahibi olduğu

düşünülen TNF-α (-308), IL-1β (+3953), IL-6 (-174), IL-18 (-607) ve MCP-1 (-2518) sitokin ve

3

kemokinlerin belirtilen bölgelerindeki gen polimorfizmlerinin araştırılarak Türk popülasyonunda

diyabet komplikasyonları oluşumu ve gelişimi üzerindeki etkileri araştırılmıştır.

Summary

Diabetes mellitus (DM), is a chronic metabolic disease related with deficiency of insulin. This

deficiency destroys the carbohydrate, protein and lipid metabolisms. DM, gets important day by day

because of its macro and micro vascular complications such as atherosclerosis, vascular diseases,

retinopathy, nephropathy, and neuropathy. These complications are due to the harm of the lipid

metabolism on the endothelium.

Several genetic and environmental factors are playing role on development of the complications. Due to

the recent studies, there is a relation between the formation of inflammation and development of the

Type 2 diabetes complications. In regards of the data from the researches, a possible mechanism

decreasing the levels of insulin is oxidative stress following the impairment of lipid metabolism. After

oxidative stress, the levels of Reactive Oxygen Species (ROS) are increased and following the activation

of macrophages and monocytes, cytokines are secreted with high levels hence. These mechanisms are

resulted in the enhancement of insulin resistance.

Cytokines are the counterparts of hormones or glycoproteins that are important in intercellular

communication. They are playing role in both natural and specific inflamatuar response. Chemokines

are also involved in inflammation and homeostasis. Therefore, the qualitative (structural) and

quantitative (levels) variations of the cytokines resulted in several diseases. The possible polymorphisms

occurring in the genes of cytokines are almost placed in the regulatory regions as single nucleotide

polymorphisms (SNPs). These variations increase the susceptibility against the diseases by affecting the

expression levels of the cytokine genes. The recent studies showed that several cytokine and

chemokines such as tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin 1-beta (IL-1β), interleukin 6 (IL-

6), interleukin 18 (IL-18) and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) gene polymorphisms are related

with the development of the diabetic complications.

In this study, (TNF-α), (IL-1β), (IL-6), (IL-18) and (MCP-1) gene polymorphisms are aimed to

investigated in a group of Turkish diabetic patient population whether they have possible effect on the

development of the diabetes complications or not.

4

II. Amaç ve Kapsam

Diabetes Mellitus, insidansı giderek artan, epidemik bir halk sağlığı problemi olup; en sık rastlanan

endokrin ve metabolik hastalıktır. Diyabet; etiyoloji, patojenez ve genetik temeli bakımından

farklılıklara sahip olup, kronik hipergliseminin yol açtığı bir dizi metabolik bozuklukla karakterize,

birden fazla hastalık tablosu içeren bir hastalıktır (Bouhaha ve ark., 2010; Jing ve ark., 2011).

Diyabet insülinin tam eksikliğine, kısmi eksikliğine veya periferik dokulardaki insülin direncine bağlı

olarak hiperglisemi ataklarıyla seyreder (Ruotsalainen ve ark., 2010). Hiperglisemi, karbonhidrat,

protein ve lipit metabolizmasındaki değişiklikler, kapiller membran duvarlarında plaklarının oluşumu,

arteriosklerotik değişikliklerin gelişimi ve diğer birçok etken diyabetin kronik makro ve mikrovasküler

komplikasyonlarından sorumludur. Majör kardiyovasküler, serebrovasküler ve nefrotik komplikasyonlar

diyabetin en önemli mortalite ve morbidite nedenleri arasındadır. Diyabetteki makrovasküler

komplikasyonlara, endotel hasarı, dislipoproteinemi ve bozulmuş hemostaz neden olmaktadır.

Diyabetlilerin yaklaşık %85-90’nını oluşturan tip 2 diyabetli hastalarda gerek koroner kalp hastalığı,

serabrovasküler hastalık ve periferik arter hastalığı gibi gelişimi diyabet süresine bağlı makrovasküler

komplikasyonların gelişimi olsun, gerekse retinopati, nefropati ve nöropati gibi gelişimi diyabet süresine

kısmen bağlı olan mikrovasküler komplikasyonlar olsun, temelde insülinin periferik dokulardaki

etkisizliği sonucu gelişir (Sherwin R., 2006).

Yapılan bilimsel çalışmalar sonucu, diyabet ve komplikasyonlarının oluşumu ve gelişimi üzerinde

oksidatif stres ve ROS oluşumu gibi çeşitli mekanizmalar ile sitokin üretimi ve salınımındaki artış

sonucu oluşan enflamasyonun çok büyük bir önemi vardır. Elde edilen verilere göre, Tip 2 diyabette,

oksidatif stres ile ilişkili olarak enflamasyon ve monositlerin aktivasyonu insülin rezistansını arttırmakta

ve pankreatik ada hücrelerinin yıkımına neden olarak insülin salgısını azaltmaktadır. Oksidatif stres

sonucu ROS miktarı artar ve aktive olmuş makrofaj ve monositlerden sitokinlerin yüksek miktarlarda

salgılanmaları ile insülin rezistansı gelişmektedir (Navarro-Gonzalez and Mora-Fernandez, 2008;

Elmarakby and Sullivan, 2010).

Sitokinler, hücre içi sinyalleri gönderen, spesifik hücre yüzey reseptörleri sayesinde biyolojik

fonksiyonlarını gösteren ve çeşitli hücre tipleri tarafından üretilen, hormonlara benzeyen peptid veya

glikoprotein yapısındaki medyatörlerdir (Kishimoto ve ark., 1994). Hedef hücrelere spesifik sitokin

reseptör ligandlarından bağlanmak sureti ile hücrede sinyal iletişimini ve ikincil mesaj taşıyıcı yolakları

başlatarak o hücrede mitotik bölünmeye yol açan gen aktivasyonu, büyüme ve farklılaşma, göç ve

apoptoza neden olur. Gerek doğal gerek spesifik immünitenin etkin bir şekilde fonksiyon

görebilmesinden sorumlu olup doku homeostazında olduğu gibi enflamatuar proseslerde de önemli rol

5

oynamaktadırlar. Vücut savunmasında rol alan immün ve enflamatuar hücrelerin çok yönlü iletişim ve

etkileşiminden de sorumludurlar. Görüldüğü gibi sitokinler çeşitli biyolojik faaliyetlerde çok

fonksiyonlu olarak yer alırlar (Schins and Borm, 1999; Opal and De Palo, 2000).

Sitokinler ismi altında interlökinler, monokinler, lenfokinler, büyüme faktörleri, interferonlar ve

kemokinlerden oluşan çeşitli gruplar bulunmaktadır. Enflamasyonda ve infeksiyonlara karşı konakçı

cevabında lökositlerin dokulara yerleşimi önemli bir basamağı teşkil etmektedir. Bu süreç kemotaktik

sitokinler olarak bilinen kemokinler tarafından kontrol edilmektedir. Kemokinler, inflamasyonda ve

homeostazda lökositlere ve stem hücrelere kemotaksi yaptıran sitokinlerdir. Kemokinler, heparin

bağlayan proteinlerdir ve lökosit migrasyonunu düzenlemek, anjiyogenez ve lökosit degranülasyonunun

gerçekleşmesi ve bunun gibi organizmada gerçekleşen birçok biyolojik süreçte önemli rolleri

bulunmaktadır (Çağlar ve Kansu, 2004; Tesch, 2008).

IL-1, IL-6, TNF-α ve IL-18 gibi sitokinler proenflamatuar sitokinler olarak adlandırılırlar ve

enflamatuar yanıtta temel rolü üstlenirler. Sitokinlerin enflamatuar reaksiyonlarda önemli bir görev

üstlendiği bilinen bir gerçektir ama denge olması için enflamatuar sitokinlerin yanında bu enflamasyonu

baskılayacak ve nötralize edecek pek çok da antienflamatuar sitokin mevcuttur. Bu zıt etkili iki grup

sitokin arasında muazzam bir denge mevcuttur. Ancak bu dengenin herhangi bir nedenle bozulması

sonucu (enflamatuar sitokinlerin miktarının artması veya antienflamatuar sitokinlerin etkilerinin

azalması) problemler başlamakta ve hastalıklara yol açacak zincirleme reaksiyonlar ortaya çıkmaktadır.

Yapılan çalışmalar sonucu, çoğu enfeksiyöz, malignant, mesleksel veya otoimmün hastalığın klinik

sonuçları, bu hastalıkların sitokinler ile yakın ilişkili olduğunu göstermektedir (Nishimoto ve ark.,

1999).

IL-1, IL-6, TNF-α ve IL-18 gibi proenflamatuar sitokinlerin diyabetik hastalarda miktarlarının artan

komplikasyonlarla ilişkili olduğu yapılan çeşitli çalışmalar ile belirtilmiştir (Dalziel ve ark., 2002; Lee

ve ark., 2004; Yu ve ark., 2004; Herbert ve ark., 2005; Lee ve ark., 2005; Wang ve ark., 2005; Fontaine-

Bisson ve ark.,2007; Oberbach ve ark., 2008; Hivert ve ark., 2009; Luotola ve ark., 2009; Szoke ve ark.,

2009; Huang ve ark., 2010).

TNF-α, makrofaj ve T lenfositlerden salınan tip 1 proinflamatuar sitokinler arasında yer alan potent bir

sitokindir. İnsülin direnci gelişiminde baskın bir rol almaktadır. Tip2 DM ve onun mikrovasküler

komplikasyonlarında; TNF-α’nın büyümeyi uyarma, sitotoksisite ve anjiyogenez gibi önemli

fonksiyonları vardır. Ateroskleroz patojenezinde rolü olduğunu gösteren veriler bulunmaktadır (Tracey

ve Cerami, 1994). İnterlökin-1 ve İnterlökin-6 aktivasyonuyla immun yanıtı yönetir. İnsülinin

indükledigi glukoz utilizasyonunu glukoz transportörü olan GLUT 4 sentezini inhibe ederek azaltır

6

(Besedovsky ve del Rey, 2010). Kanser, endotoksemi, travma veya TNF’nin arttıgı herhangi bir

durumda periferik insülin rezistansı görülür. Karacigerde lipogenezi ve VLDL yapımını artırır ve

hipertrigliseridemiye neden olur (Vendrell ve ark., 2005).

IL-1, baslıca makrofaj hücreleri tarafından üretilmekte olup nöroendokrin ve metabolik fonksiyonları

etkiler. IL-1 in sistemik etkileri arasında insülin miktarında artış da bulunmaktadır. In vitro koşullarda,

IL-1; lenfokinlerin (IL-2, IL-3, IL-4 ve IL-6) miktarında artış, ve pıhtı oluşumuna yol açar. Ayrıca

histamin ve prostoglandin E2 salınımını artırır (Douglas, 2003). IL-1α ve IL-1β olmak üzere iki formu

vardır. İnsan pankreas adacık hücrelerinin yüksek glikoza uzun süre maruz kalmasının, bu hücrelerden

IL-1β yapımını uyardığı, bununda NF-kB (nuclear factor-kB) aktivasyonu ve Fas sinyalinin up-

regülasyonuna yol açtığı ve sonuçta otokrin apopitozu tetiklediği bulunmuştur (Schrijvers ve ark.,

2004).

IL-6, immün sistem dışı çoğu hücrede ve immünregulasyonda anahtar bir rol oynayan pleotropik bir

sitokindir. IL-6; immün sistemin çoğu hücresinde, endotelyal hücreler, iskelet ve düz kas hücreleri, yağ

hücreleri, beta adacık hücreleri başta olmak üzere pekçok hücrede üretilmektedir. Adezyon

moleküllerinin indüksiyonu, monosit endotel ilişkisi ve enflamasyona bağlı hasarda olası rolü olması

nedeniyle aterojenez ve vasküler enflamasyonun gelişiminde ilişkisi olabileceği düşünülmektedir (Ohno

ve ark., 1993; Rader, 2000). Farelerde, IL-6 düzeyinin lipid peroksidasyon ve enflamasyon ile pozitif

ilişkili olduğu bildirilmiştir (Castelnau ve ark., 1998). Yapılan bazı çalışmalar sonucunda IL-6’nın Tip 2

diyabette artmış olduğu gözlenmiştir (Morohoshi ve ark., 1995). Ayrıca hipofiz bezinden ACTH

üretiminin stimülasyonu gibi diyabetojenik role sahiptir. Ek olarak insülin direnci sendromunun

özellikleri olan hastalarda IL-6’nın artmış olduğu görülmüştür.

IL-1 sitokin süper ailesinin üyesi olan IL-18; aktive monosit/makrofajlardan salgılanan, otoimmün,

enflamatuar ve enfeksiyöz hastalıklarda önemli rol oynayan ve son yıllarda üzerinde çok durulan bir

sitokindir. Hem TH1 hem de TH2 hücreleri stimüle etme kapasitesine sahip olan tek sitokindir

(Dinarello, 1999). IL-18, proinflamatuar etki göstererek TH1 lenfositlerin gelişimini, T hücreleri ve

Natural Killer hücrelerini indükleyerek interferon-gama (IFN-γ) üretimini artırır. Aynı zamanda NK

hücreleri ve adhezyon moleküllerinin ekspresyonunu regüle eder. Ayrıca makrofajlardan TNF-α ve IL-1

salınımını ve NO üretimini artırır (Reddy, 2004). IL-18 düzeyindeki değişikliklerin diyabet gibi

immünoenflamatuar hastalıklara yol açabileceği bildirilmektedir (Nicoletti ve ark., 2001). IL-18’in tip 2

diyabetli hastalarda yapılan çalışmalarda diyabetik nefropati ile ilişkili olduğu bildirilmiştir (Moriwaki

ve ark., 2003; Nakamura ve ark., 2005).

7

MCP-1; monositler, endotel hücreler, fibroblastlar ve yağ dokusundan sentezlenir. Bazofil

degregasyonu, monosit, T hücreleri, bazofiller, eozinofiller ve mast hücreleri için kemotaksis ve

makrofaj aktivasyonunu sağlar. Yağ dokusunun miktarına bağlı olarak adipoz dokunun monosit

ihtiyacını karşılar (Robker ve ark., 2004; de Carvalho ve ark., 2006). İnsan ve farelerin mezenkimal

hücrelerinde, yüksek miktarda glikoz seviyesinin NF-kB (nuclear factor-kB) aktivasyonununu ve

oksidatif stres düzeyini arttırmak suretiyle MCP-1 üretimini stimüle ettiği belirtilmiştir (Ihm ve ark.,

1998; Ha ve ark., 2002; Zhang ve ark., 2007).

Sitokinlerin immün cevap, enflamasyon, akut faz cevabı ve doku onarımı gibi homeostatik

mekanizmaların kilit düzenleyicileri olmaları nedeniyle düzeyleri (kantitatif) ve yapılarında ki (kalitatif)

varyasyonların hastalık ve hassasiyet ile bağlantılı olmaları şaşırtıcı değildir. Polimorfizm, poli ve

morfos kelimelerinin biraraya gelmesiyle oluşmuştur ve “çok şekillilik” anlamına gelmektedir. Genetik

polimorfizm ise, birey, gruplar ve popülasyonlarda DNA dizilimindeki farklılıktır veya aynı

popülasyonda bir lokusta iki veya daha fazla alelin belli frekansta görülmesidir veya başka bir deyimle

mutasyonlara bağlı olarak popülasyonda yüksek sıklıkta görülen (>%1) stabil bireyler arası alelik

varyantlardır. Bu genel varyantlar, genellikle tek bir baz çiftinin değişimi (tek nükleotid

polimorfizmleri, SNPs) sonucu oluşur. SNP, DNA’daki tek bir baz mutasyonu olup genomdaki

değişimlerin kaynağıdır. Yani insan genomundaki genetik polimorfizmlerin en yaygın olanı (insan

genetik polimorfizmlerinin %90’ı) ve en basit formudur. Sitokin genlerinde ortaya çıkabilecek bu

varyasyonlar, sitokinlerin ekspresyon düzeylerini etkileyerek çeşitli hastalıklara karşı hassasiyeti

arttırmaktadırlar (Ollier, 2004). Yapılan son çalışmalar sonucu TNF-α (-308), IL-1β (+3953), IL-6 (-

174), IL-18 (-607) ve MCP-1 (-2518) sitokin gen polimorfizmlerinin diyabetli hastalarda komplikasyon

gelişimi ile bağlantılı olduğu gösterilmiştir (Dalziel ve ark., 2002; Kubaszek ve ark., 2003; Vozarova ve

ark., 2003; Illig ve ark., 2004; Lee ve ark., 2005; Sookoian ve ark., 2005; Wang ve ark., 2005; Libra ve

ark., 2006; Oberbach ve ark., 2008; Ahluwalia ve ark., 2009; Hivert ve ark., 2009; Luotola ve ark.,

2009; Huang ve ark., 2010; Jing ve ark., 2011).

Bu verilerden hareketle bu projede; diyabet komplikasyonlarının gelişiminde pay sahibi olduğu

düşünülen TNF-α (-308), IL-1β (+3953), IL-6 (-174), IL-18 (-607) ve MCP-1 (-2518) sitokinlerinin

belirtilen bölgelerindeki gen polimorfizmlerinin araştırılarak Türk popülasyonunda diyabet

komplikasyonları oluşumu ve gelişimi üzerindeki etkileri irdelenmiştir. Yapılan bu projeyle birlikte

çeşitli enflamatuar sitokin ve kemokinlerin belirlenen genleri üzerindeki polimorfik varyantlarının

diyabet gelişimi ve komplikasyonlarının oluşumundaki olası etkinliği saptanmıştır.

8

III. Materyal ve Yöntem

Projede, çalışma grubu olarak 3 grup seçilmiştir. Bunlardan birincisi, diyabet tanısı konulmamış sağlıklı

bireylerden oluşan bir kontrol grubu, ikincisi, WHO tanı kriterlerine göre diyabet hastalığı olan ancak

diyabete bağlı oluşan herhangi bir komplikasyon tanısı konulmamış komplikasyonsuz tip 2 diyabet

hasta grubu ve üçüncü olarak da yine WHO tanı kriterlerine göre diyabete bağlı oluşabilecek retinopati,

nöropati, nefropati veya kardiyovasküler komplikasyonlardan en az biri görülen komplikasyonlu tip 2

diyabetli hasta grubudur. Proje çalışma grubu içinde yer alan Prof. Dr. Asuman Karakaya’nın daha

önceden yürütücülüğünü yaptığı 2001-08-03-032 nolu “Paraoksonaz gen polimorfizminin Tip-2 diyabetli

hastalarda komplikasyon gelişimi ve lipit metabolizması ile ilişkisinin araştırılması” başlıklı proje, BAP projesi

olarak desteklenmiş ve tamamlanmıştır (Altuner ve ark., 2011a; Altuner ve ark., 2011b). Belirtilen

projede, Sağlık Bakanlığı Ankara Hastanesi Diyabet Kliniğinde yatan 50 kontrol ve 100 Tip 2 diyabet

hastasından alınan ve saklanan numunelere ek olarak planlanan bu projede “n” sayısını arttırmak için

Rize Üniversitesi Tıp Fakültesi Eğitim ve Araştırma Hastanesi Endokrinoloji Kliniği’nde yatan ve

demografik olarak aynı özelliklere sahip hastalar ile proje daha da genişletilmiştir.

Projede yer alan kontrol ve hasta gruplarına dahil olan bireylerin “Bilgilendirilmiş gönüllü onay

formları” ve anket formları kendilerine doldurulduktan sonra kan numuneleri Rize Üniversitesi Tıp

Fakültesi Eğitim ve Araştırma Hastanesi Endokrinoloji Kliniği’nde alınmış ve orada uygun koşullar

altında numunelerin DNA’ları zaman geçirilmeden uygun yöntem ile izole edilmiş ve bu DNA örnekleri

soğuk zincir içinde analizlerinin yapıldığı “Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik

Toksikoloji Anabilim Dalı Araştırma Laboratuarına” nakledilmiştir. Laboratuarımıza getirilen DNA

örnekleri genotipleme çalışmaları yapılana kadar -20ºC’de saklanmıştır.

Projede yer alan kontrol ve hasta gruplarına dahil olan her bir bireyin DNA’sı üzerinde genotipleme

analizleri yapılmıştır. Bu amaçla, yukarıda belirtilmiş sitokin gen polimorfizmlerinin (IL-18 ve MCP-1

sitokin genleri için ayrıca yöntem kurulacaktır) genotiplemeleri için daha önceden laboratuarımızda

yapılmış çalışmalarda (Ates ve ark., 2008; Ates ve ark., 2011) optimize edilmiş PCR (Polymerase Chain

Reaction) ve RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) teknikleri kullanılmıştır.

Genotipleme analizlerini takiben elde edilen veriler toparlanıp uygun SPSS istatistik analizleri ile

sonuçlar yorumlanmış ve proje çalışmaları tamamlanmıştır.

9

IV. Analiz ve Bulgular

Analiz

Kontrol grubu olarak daha önce BAP tarafından desteklenen 2001-08-03-032 nolu proje kapsamında

toplanan 50 bireyden alınan ve saklanan numuneler kullanılmıştır. Hasta grubu olarak ise 2001-08-03-

032 nolu proje kapsamında toplanan 100 Tip2 diyabetli hastanın saklanan numunelerine ek olarak, Rize

Üniversitesi Tıp Fakültesi Eğitim ve Araştırma Hastanesi Endokrinoloji Kliniği’nde başvuran 169 Tip2

diyabetli hastadan numuneler toplanmıştır. Bu 169 hastanın kanları aynı klinikte uygun şartlar altında ve

standartlara uygun olarak alınmıştır. Vakit kaybetmeden numunelerin DNA’ları, Promega A1125

Wizard Genomic DNA Purification kiti ile izole edilmiş ve elde edilen bu DNA örnekleri, soğuk zincir

altında analizlerin yapılacağı Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Toksikoloji Anabilim

Dalı Araştırma Laboratuarı’na nakledilmiştir. DNA numuneleri, genotipleme deneyleri yapılana kadar

-200C’de saklanmıştır.

Proje kapsamındaki kontrol ve hasta gruplarında yer alan tüm bireylerin DNA numuneleri elde

edildikten sonra genotipleme çalışmalarına geçilmiştir. Genotipleme çalışmaları, diyabet hastalığı ve

komplikasyonları üzerinde etkisi olduğu düşünülen TNF-α (-308), IL-1β (+3953), IL-6 (-174), IL-18

(-607) ve MCP-1 (-2518) sitokin ve kemokinlerin belirtilen bölgelerindeki gen polimorfizmlerinin

saptanması amacıyla yapılmıştır. Bu amaçla, yukarıda belirtilmiş sitokin gen polimorfizmlerinin

genotiplemeleri için daha önceden laboratuarımızda yapılmış çalışmalarda (Ates ve ark., 2008; Ates ve

ark., 2011) optimize edilmiş PCR (Polymerase Chain Reaction) ve RFLP (Restriction Fragment Length

Polymorphism) teknikleri kullanılmıştır (IL-18 ve MCP-1 gen polimorfizmleri için PCR-RFLP

teknikleri optimize edilecektir). Çalışılan sitokin gen polimorfizmleri için kullanılan PCR-RFLP

yöntemleri aşağıdaki gibidir:

TNF-α (-308) polimorfizmi: TNF-α genindeki -308 polimorfizm analizleri, PCR ve RFLP yöntemleri

kullanılarak yapılmıştır.

50 μl toplam reaksiyon karışımı, 5 μl 10x PCR buffer, 100 mM MgCl2, 100μmol dNTP karışımı, 77

pmol TNF-α primerleri sense-ileri (5’-AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT-3’) ve antisense-geri

(5’-TCC TCC CTG CTC CGA TTC CG-3’), 5 000U Taq DNA polimeraz, ve 50 ng DNA içermektedir.

PCR koşulları ise, denatürasyon basamağı (950C 1 dakika, 1 döngü), primerlerin yapışma basamağı

(940C 1 dakika, 600C 1 dakika, 720C 1 dakika, 35 döngü) ve sentez basamağı (720C 5 dakika, 1 döngü)

olacak şekilde ayarlandı. PCR ürünü %10’luk TBE içeren hazır jelde PAGE elektroforezine tabi

tutulmuştur. Ürün ise 107 bç (baz çifti)’de bant vermiştir.

10

PCR reaksiyonunu takiben 370C’de gece boyu NcoI restriksiyon enzimi ile kesilerek RFLP yöntemi

uygulanmıştır. Enzimle kesim işleminden sonra PAGE elektroforez işlemine geçilmiş ve analiz

sonucunda gözlenen 87 ve 20 bç’lik iki bant, yabanıl tip (wild type) genotipini (G/G), 87 ve 107 bç’lik

iki bant, heterozigot genotipini (G/A) ve 107 bç’lik tek bant ise homozigot mutant genotipi (A/A)

varlığını göstermiştir.

IL-1β (+3953) Polimorfizmi: IL-1β genindeki +3953 polimorfizm analizleri, PCR ve RFLP yöntemleri


50 μl toplam reaksiyon karışımı, 5 μl 10x PCR buffer, 100 mM MgCl2, 100 μmol dNTP karışımı, 65

pmol IL-1β primerleri sense-ileri (5’-ATG GTT TTA GAA ATC ATC AAG CCT AGG GCA-3’) ve

antisense-geri (5’-AAT GAA AGG AGG GGA GGA TGA CAG AAA TGT-3’), 5 000 U Taq DNA

polimeraz, ve 50 ng DNA içermektedir.


(950C 1 dakika, 67,50C 1 dakika, 720C 1 dakika, 35 döngü) ve sentez basamağı (720C 5 dakika, 1

döngü) olacak şekilde ayarlandı.

PCR ürünü %10’luk TBE içeren hazır jelde PAGE elektroforezine tabi tutulmuştur. Ürün ise 182 bç

(baz çifti)’de bant vermiştir.

PCR reaksiyonunu takiben 650C’de gece boyu TaqI restriksiyon enzimi ile kesilerek RFLP yöntemi


sonucunda gözlenen 97 ve 85 bç’lik iki bant, yabanıl tip (wild type) genotipini (C/C), 182, 97 ve 85

bç’lik üç bant, heterozigot genotipini (C/T) ve 182 bç’lik bant ise homozigot mutant genotipi (T/T)


IL-6 (-174) Polimorfizmi: IL-6 genindeki -174 polimorfizm analizleri, PCR ve RFLP yöntemleri


50 μl toplam reaksiyon karışımı, 5 μl 10x PCR buffer, 100 mM MgCl2, 100 μmol dNTP karışımı, 77

pmol IL-6 primerleri sense-ileri (5’-TTG TCA AGA CAT GCC AAG TGC T-3’) ve antisense-geri (5’-

GCC TCA GAG ACA TCT CCA GTC C-3’), 5 000 U Taq DNA polimeraz ve 50 ng DNA

içermektedir.


(950C 1 dakika, 600C 1 dakika, 720C 1 dakika, 35 döngü) ve sentez basamağı (720C 5 dakika, 1 döngü)

olacak şekilde ayarlandı.

11



PCR reaksiyonunu takiben 370C’de gece boyu NlaIII restriksiyon enzimi ile kesilerek RFLP yöntemi


sonucunda gözlenen 227, 59 ve 13 bç’lik üç bant, yabanıl tip (wild type) genotipini (G/G), 227, 118,

109, 59 ve 13 bç’lik beş bant, heterozigot genotipini (G/C) ve 118, 109, 59 ve 13 bç’lik dört bant ise

homozigot mutant genotipi (C/C) varlığını göstermiştir.

IL-18 (-607) Polimorfizmi: IL-18 genindeki -607 polimorfizm analizleri, PCR ve RFLP yöntemleri


30 μl toplam reaksiyon karışımı, 5 μl 1x PCR buffer, 100 mM MgCl2, 100 μmol dNTP karışımı, 0,2 µM

IL-18 primerleri sense-ileri (5’-GTT GCA GAA AGT GTA AAA ATT AGT A-3’) ve antisense-geri

(5’-TAA CCT CAT TCA GGA CTT CC-3’), 0.2 U Taq DNA polimeraz ve 50 ng DNA içermektedir.


(940C 10 saniye, 550C 30 saniye, 720C 30 saniye, 35 döngü) ve sentez basamağı (720C 10 dakika, 1

döngü) olacak şekilde ayarlandı.



PCR reaksiyonunu takiben 370C’de 60 dakika RsaI restriksiyon enzimi ile kesilerek RFLP yöntemi


sonucunda gözlenen 196 bç’lik bant, yabanıl tip (wild type) genotipini (C/C), 301 ve 196 bç’lik iki bant,

heterozigot genotipini (C/A) ve 301 bç’lik bant ise homozigot mutant genotipi (A/A) varlığını

göstermiştir.

MCP-1 (-2518) Polimorfizmi: MCP-1 genindeki -2518 polimorfizm analizleri, PCR ve RFLP

yöntemleri kullanılarak yapılmıştır.

20 μl toplam reaksiyon karışımı, 2 μl 10x PCR buffer, 1,625 mM MgCl2, 150 μmol dNTP karışımı, 0,25

µM MCP1 primerleri sense-ileri (5’-CCG AGA TGT TCC CAG CAC AG-3’) ve antisense-geri (5’-

CTG CTT TGC TTG TGC CTC TT-3’), 1 U Taq DNA polimeraz ve 300 ng DNA içermektedir. PCR

koşulları ise, denatürasyon basamağı (940C 5 dakika, 1 döngü), primerlerin yapışma basamağı (940C 45

saniye, 610C 45 saniye, 720C 45 saniye, 32 döngü) ve sentez basamağı (720C 7 dakika, 1 döngü) olacak

şekilde ayarlandı.

12



PCR reaksiyonunu takiben 370C’de 16 saat PvuII restriksiyon enzimi ile kesilerek RFLP yöntemi


sonucunda gözlenen 930 bç’lik bant, yabanıl tip (wild type) genotipini (A/A), 222, 708 ve 930 bç’lik üç

bant, heterozigot genotipini (A/G) ve 708 ve 222 bç’lik bant ise homozigot mutant genotipi (G/G)


Bulgular

-Çalışma grubunun genel özellikleri

Projemizde kontrol grubu olarak kullanılan ve diyabet tanısı konulmamış sağlıklı bireylerden oluşan 50

birey ile Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tanı kriterlerine göre diyabet hastalığı olan ancak diyabete bağlı

oluşan herhangi bir komplikasyon tanısı konulmamış 135 komplikasyonsuz tip 2 diyabet hasta grubu ve

yine WHO tanı kriterlerine göre diyabete bağlı oluşabilecek retinopati, nöropati, nefropati veya

kardiyovasküler komplikasyonlardan en az biri görülen 134 komplikasyonlu tip 2 diyabetli hasta

grubuna ait genel demografik özellikler ile klinik bulgulara ait veriler Tablo 1’de gösterilmiştir.

Komplikasyonlu ile komplikasyonsuz hasta grubu arasındaki olası istatistiksel ilişkiler ise P değeri

olarak belirtilmiştir.

Tablo 1. Çalışma gruplarının demografik özellikleri ve klinik bulgu verileri*

Kontrol grubu

Komplikasyonsuz

diyabet hastaları

Komplikasyonlu

diyabet hastaları P değeri**

Cinsiyet (erkek/kadın) 50 (21/29) 135 (67/68) 134(58/76) 0.955

Yaş (yıl) 44.04±1.14 50.24±1.33 58.35±1.62 0.365

Vücut kitle indeksi (kg/m2) 26.43±0.62 28.95±0.56 28.82±0.45 0.991

Total kolesterol (mg/dL) 191.59±5.97 205.04±9.11 207.98±9.44 0.889

Trigliseritler (mg/dL) 118.37±10.19 187.56±25.77 215.45±17.57 0.002

HDL-kolesterol (mg/dL) 46.30±1.26 49.45±1.78 48.85±1.70 0.875

LDL-kolesterol (mg/dL) 117.30±5.79 129.35±6.24 130.54±6.87 0.191

VLDL-kolesterol (mg/dL) 24.30±2.07 28.81±2.14 29.11±2.27 0.115

Açlık kan şekeri (mg/dL) 85.83±1.41 181.01±11.12 240.79±15.22 0.001

Sigara (n (%)) 20 (40.00) 55 (40.74) 61 (45.52) 0.077

Sistolik kan basıncı (mmHg) 121,80±1,68 134.80±2.21 145.60±2.74 0.025

Diastolik kan basıncı (mmHg) 73,80±0,93 82.90±1.25 88.70±1.31 0.049

Nabız (atım sayısı/dakika) 72,90±0,93 74.80±1.14 79.55±1.25 0.042

* Toplam denek sayısı ve sigara içimi değerleri dışında çalışma grubunun klinik bulgularına ait tüm

değerler ortalama±SD olarak verilmiştir.

** Komplikasyonlu hastalar ile komplikasyonsuz Tip 2 diyabet hastaları arasındaki karşılaştırmadır.

13

Tip 2 diyabet hastalığının gelişiminde rol oynayabilecek risk faktörlerinin analizleri çoklu lojistik

regresyon analiz yöntemi ile yapılmıştır. Risk faktörleri ile hastalık arasındaki istatistiksel ilişki P değeri

ile, hastalıkların gelişimi üzerine olan etkileri ise odds oranları olarak Tablo 2’de belirtilmiştir. Odds

oranı değerleri, %95lik güven aralığı ile birlikte hesaplanmıştır.

Tablo 2. Tip 2 diyabet komplikasyon gelişimi için olası risk faktörlerinin çoklu lojistik regresyon analiz

sonuçları

P değeri OR (%95 CI)

Vücut kitle indeksi (kg/m2) 0.224 0.71 (0.53-1.71)

Diyabet süresi <0.05 1.44 (1.09-2.66)

Total kolesterol (mg/dL) 0.777 0.60 (0.41-1.37)

Trigliseritler (mg/dL) <0.01 1.70 (1.32-4.60)

HDL-kolesterol (mg/dL) 0.602 0.82 (0.64-1.78)

LDL-kolesterol (mg/dL) 0.085 1.14 (0.95-2.55)

VLDL-kolesterol (mg/dL) 0.073 1.08 (0.86-1.58)

Açlık kan şekeri (mg/dL) <0.001 2.44 (1.57-7.22)

Sistolik kan basıncı (mmHg) <0.01 1.83 (1.20-4.15)

Diastolik kan basıncı (mmHg) <0.05 1.29 (1.08-3.24)

Nabız (atım sayısı/dakika) <0.01 1.55 (1.17-5.19)

Sigara <0.05 1.88 (1.24-4.29)

Elde edilen sonuçlar çerçevesinde diayabet süresi, diastolik kan basıncı, sigara içimi (P<0.05),

trigliseritler, sistolik kan basıncı, nabız (P<0.01) ve açlık kan şekeri (P<0.001) ile hastalık gelişimi

arasında istatistiksel olarak anlamlılık vardır. Odds ratio açısından ele alındığında ise diyabet süresinin

Tip 2 diyabet gelişimi üzerinde 1.44 kat etkisi saptanmışken, trigliseritlerin 1.70 kat, açlık kan şekerinin

2.44 kat, sistolik kan basıncının 1.83 kat, diastolik kan basıncının 1.29 kat, nabız atışının 1.55 kat ve

sigara içiminin ise 1.88 kat etkisi bulunmuştur.

TNF-α (-308), IL-1β (+3953), IL-6 (-174), IL-18 (-607) ve MCP-1 (-2518) sitokinlerinin genotipleme

çalışmaları sonucunda elde edilen veriler Tablo 3’de gösterilmiştir. Çalışılan sitokin gen

polimorfizmlerinin hastalık ve komplikasyonların gelişimi üzerindeki olası etkileri Odds oranı ve % 95

güven aralığı ile birlikte tabloda verilmiştir.

14

Tablo 3. Çalışılan sitokinlerin genotipik dağılımları

1/1 aleli

(%) 1/2 aleli

(%) 2/2 aleli,

(%) Alel 2

frekansı n

Odds Ratio* (95% CI)

TNF-α (-308)

Kontrol

Komplikasyonsuz hastalar

Komplikasyonlu hastalar

Tüm hastalar

42 (84.0)

93 (68.9)

84 (62.7)

177 (65.8)

7 (14.0)

37 (27.4)

42 (31.3)

79 (29.4)

1 (2.0)

5 (3.7)

8 (6.0)

13 (4.8)

0.10

0.17

0.20

0.19

50

135

134

269

1.00

2.37 (1.02-5.49)a

3.13 (1.36-7.19)a

2.73 (1.23-6.05)a

IL-1β (+3953)

Kontrol



Tüm hastalar

33 (66.0)

67 (49.6)

60 (44.8)

127 (47.2)

14 (28.0)

56 (41.5)

58 (43.3)

114 (42.4)

3 (6.0)

12 (8.9)

16 (11.9)

28 (10.4)

0.20

0.30

0.34

0.53

50

135

134

269

1.00

1.97 (1.01-3.87)a 2.39 (1.22-4.71)a

2.17 (1.15-4.08)a

IL-6 (-174)

Kontrol



Tüm hastalar

30 (60.0)

78 (57.8)

72 (57.7)

150 (55.8)

17 (34.0)

44 (32.6)

47 (26.9)

91 (33.8)

3 (6.0)

13 (9.6)

15 (15.4)

28 (10.4)

0.23

0.26

0.29

0.27

50

135

134

269

1.00

1.10 (0.57-2.12)

1.29 (0.67-2.50)

1.19 (0.64-2.20)

IL-18 (-607)

Kontrol



Tüm hastalar

20 (40.0)

33 (24.4)

29 (21.6)

62 (23.0)

23 (46.0)

81 (60.0)

82 (61.2)

163 (60.6)

7 (14.0)

21 (15.6)

23 (17.2)

44 (16.4)

0.37

0.46

0.48

0.47

50

135

134

269

1.00

2.06 (1.04-4.10)a

2.41 (1.20-4.86)a

2.23 (1.18-4.19)a

MCP-1(-2518)

Kontrol



Tüm hastalar

26 (52.0)

80 (59.2)

75 (56.0)

155 (57.6)

17 (34.0)

41 (30.4)

44 (32.8)

85 (31.6)

7 (14.0)

14 (10.4)

15 (11.2)

29 (10.8)

0.31

0.26

0.28

0.27

50

135

134

269

1.00

0.74 (0.39-1.43)

0.85 (0.44-1.63)

0.80 (0.44-1.46)

a P<0,01 kontrole göre

Genotipleme çalışmaları sonunda;

TNF-α (-308) gen polimorfizmi açısından bakıldığında hem komplikasyonsuz hastalarda hem de

komplikasyonlu hastalarda kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (P<0,01).

Özellikle Tip 2 diyabet komplikasyonu gelişiminde TNF-α sitokin varyantı 3,13 katlık bir risk

oluşturmakta iken komplikasyonsuz hastalarda da bu rakam 2.37 olarak saptanmıştır. Tüm hastalar

dikkate alındığında da hastalık gelişimi üzerine bu sitokin varyantının 2.73 katlık bir risk meydana

getirdiği bulunmuştur.

IL-1β (+3953) gen polimorfizmi datalarına baktığımızda, TNF-α (-308) gen polimorfizmi ile benzer

sonuçlar bulunmuştur. Hem komplikasyonsuz hastalarda hem de komplikasyonlu hastalarda kontrol

15

grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (P<0,01). Özellikle Tip 2 diyabet komplikasyonu

gelişiminde IL-1β sitokin varyantı 2,39 katlık bir risk oluşturmakta iken komplikasyonsuz hastalarda da

bu rakam 1.97 olarak saptanmıştır. Tüm hastalar dikkate alındığında da hastalık gelişimi üzerine bu

sitokin varyantının 2.17 katlık bir risk meydana getirdiği bulunmuştur.

IL-18 (-607) gen polimorfizmi verilerine baktığımızda, yukarıda belirtilen diğer iki sitokin polimorfizmi

gibi hem komplikasyonsuz hastalarda hem de komplikasyonlu hastalarda kontrol grubuna göre

istatistiksel olarak anlamlılık vardır (P<0,01). Komplikasyon gelişiminde IL-18 varyantı 2,41 katlık bir

risk oluşturmakta iken komplikasyonsuz hastalarda da bu rakam 2.06 olarak bulunmuştur. Tüm hastalar

irdelendiğinde ise bu varyant hastalık gelişiminde kontrol grubuna göre 2.23 katlık bir risk

oluşturmaktadır.

Yukarıda belirttiğimiz sitokin gen polimorfizmlerinin dışında projemiz kapsamında üzerinde

çalıştığımız diğer gen polimorfizmleri olan IL-6 (-174) ve MCP-1 (-2518) varyantları ne hastalık ne de

komplikasyon gelişimi üzerine kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı bir etki oluşturmamıştır.

V. Sonuç ve Öneriler

Ciddi bir metabolizma hastalığı olan diyabet; tedavi edilmediği zaman vücudun hemen hemen bütün

organlarını etkileyebilmektedir. Tip 2 diyabet eğer kontrol altına alınamazsa kardiyovasküler hastalıklar,

nefropati, nöropati ve retinopati gibi majör komplikasyonların oluşumuna neden olur. Bu

komplikasyonların sonucunda ise körlük, kalp ve damar hastalıkları, felç, böbrek yetmezliği, retina

hasarı ve sinir sistemi harabiyeti gibi önemli sağlık sorunları ortaya çıkabilir. Bu kadar ciddi

komplikasyonları olan diyabet hastalığının tanısını erken koymak ve tedavisine erken başlamak daha

sonra gelişecek sağlık problemlerini önleyebilir.

Dünya Sağlık Örgütü’nün (WHO) verilerine göre, dünya genelindeki ölümlerin %5’i diyabetten

olmaktadır. Örgütün değerlendirmelerine göre eğer gelecek 10 yıl içinde ciddi önlemler alınmazsa

diyabetten kaynaklanan ölüm oranı %50den fazla artacaktır.

Günümüzde tüm dünyayı tehdit edici boyutlara ulaşan Tip 2 diyabet, dünyanın farklı bölgelerinde

değişik sıklıkta gözlenmektedir. Örneğin Kuveyt, Bahreyn, Birleşik Arap Emirlikleri gibi körfez

ülkelerinde %20 civarında diyabet görülürken ülkemizde bu oran %7.2 olarak bildirilmektedir.

Türkiye’de yaklaşık 5 milyon diyabet hastası olup; bu kişilerin 1.5 milyonu diyabet hastası olduklarının

farkında değildir.

16

Yapılan bilimsel çalışmalar sonucu, diyabet ve komplikasyonlarının oluşumu ve gelişimi üzerinde

oksidatif stres ve ROS oluşumu gibi çeşitli mekanizmalar ile sitokin üretimi ve salınımındaki artış

sonucu oluşan enflamasyonun çok büyük bir önemi vardır. Elde edilen verilere göre, Tip 2 diyabette,

oksidatif stres ile ilişkili olarak enflamasyon ve monositlerin aktivasyonu insülin rezistansını arttırmakta

ve pankreatik ada hücrelerinin yıkımına neden olarak insülin salgısını azaltmaktadır. Oksidatif stres

sonucu ROS miktarı artar ve aktive olmuş makrofaj ve monositlerden sitokinlerin yüksek miktarlarda

salgılanmaları ile insülin rezistansı gelişmektedir. (Navarro-Gonzalez and Mora-Fernandez, 2008;

Elmarakby and Sullivan, 2010). IL-1, IL-6, TNF-α ve IL-18 gibi proenflamatuar sitokinlerin diyabetik

hastalarda miktarlarının artan komplikasyonlarla ilişkili olduğu yapılan çeşitli çalışmalar ile

belirtilmiştir (Dalziel ve ark., 2002; Lee ve ark., 2004; Yu ve ark., 2004; Herbert ve ark., 2005; Lee ve

ark., 2005; Wang ve ark., 2005; Fontaine-Bisson ve ark.,2007; Oberbach ve ark., 2008; Hivert ve ark.,

2009; Luotola ve ark., 2009; Szoke ve ark., 2009; Huang ve ark., 2010; Altuner ve ark., 2011a; Altuner

ve ark., 2011b; Karadeniz ve ark., 2014; Raina ve ark., 2014, Dabhi ve Mistry, 2015).

Yapılan son çalışmalar sonucu TNF-α (-308), IL-1β (+3953), IL-6 (-174), IL-18 (-607) ve MCP-1

(-2518) sitokin gen polimorfizmlerinin diyabetli hastalarda komplikasyon gelişimi ile bağlantılı olduğu

gösterilmiştir (Dalziel ve ark., 2002; Kubaszek ve ark., 2003; Vozarova ve ark., 2003; Illig ve ark.,

2004; Lee ve ark., 2005; Sookoian ve ark., 2005; Wang ve ark., 2005; Libra ve ark., 2006; Oberbach ve

ark., 2008; Ahluwalia ve ark., 2009; Hivert ve ark., 2009; Luotola ve ark., 2009; Huang ve ark., 2010;

Karadeniz ve ark., 2010; Altuner ve ark., 2011a; Altuner ve ark., 2011b; Jing ve ark., 2011; Karadeniz

ve ark., 2014; Raina ve ark., 2014; Dabhi ve Mistry, 2015).

Biz de bu kapsamlı projemiz kapsamında üzerinde çalışmış olduğumuz bu 5 sitokin gen polimorfizmi

ile ilgili olarak yapmış olduğumuz genotipleme çalışmaları sonucunda TNF-α (-308), IL-1β (+3953) ve

IL-18 (-607) sitokin gen polimorfizmlerinin hem Tip 2 diyabet oluşumunda hem de diyabet

komplikasyonlarının gelişiminde risk faktörü olduklarını bulduk.

Bütün bu verilerin ışığında diyabet ve diğer hastalıkların gelişimi ve dünyadaki dağılımında bireysel,

çevresel ve etnik farklılıkların önemli bir rol oynadıkları düşünüldüğünde Türk toplumunda belirtilen

sitokin gen polimorfizmlerinin diyabet gelişimi ve komplikasyon oluşumundaki etkileri üzerine

yapılmış olan bu çalışma önem ve orijinallik kazanmıştır.

17

VI. Geleceğe İlişkin Öngörülen Katkılar

Çalışmış olduğumuz bu proje, Anabilim Dalımızda daha önce proje çalışma grubumuzun yapmış olduğu

sitokin polimorfizmi çalışmalarında elde edilen verilere yeni katkılar sağlamış ayrıca daha önce bu

konuyla ilgili olarak incelenmemiş yeni sitokin bölgelerinin Tip 2 diyabet hastalarını içeren bir Türk

popülasyonunda araştırılmasıyla bir adım daha ileri gidilmiştir.

Bu geniş kapsamlı proje sonunda elde edilen veriler Türk toplumunda yapılmış olması nedeniyle çok

büyük değer kazanmakta olup çalışmaya orijinallik getirmiştir. Dolayısıyla ileride planlanacak olan yeni

çalışmaları kurgularken elde ettiğimiz bu veriler bize çıkış noktası oluşturacaktır. Ayrıca bu projenin

dataları yurtdışı SCI kapsamına giren dergilerde tarafımızdan makaleler şeklinde değerlendirilecek ve

yurtiçi ve yurtdışı bilimsel kongre ve sempozyumlarda bildiriler halinde diğer bilim insanlarına

sunulacaktır.

Bu proje ile sağlanan cihaz ve malzeme altyapısıyla anabilim dalımızda yeni proje ve çalışmalar

rahatlıkla planlanabilecektir. Ayrıca anabilim dalımız lisansüstü öğrencileri de bu altyapı sayesinde tez

çalışmalarını yürütebilecek ve bu bağlamda gerekebilecek cihaz ihtiyaçlarını karşılayabileceklerdir..

VIII. Sağlanan Altyapı Olanaklarının Bilim Alanındaki Katkıları

Projemiz için talep ettiğimiz cihaz ve malzeme olanakları ile Anabilim Dalımızda 1 adet yüksek lisans

tezi tamamlanırken, bir adet de yüksek lisans tezi yapılacaktır. Ayrıca 2 adet bildiri 2 farklı uluslar arası

kongrelerde de sunulacaktır.

Biten yüksek lisans tezi:

Enflamatuar sitokin gen polimorfizmlerinin Tip 2 diyabet ve komplikasyonları üzerine olan etkilerinin

araştırılması (2014/Ankara) Tez sahibi: Ayşegül GÜVENÇ, Danışman: Prof. Dr. Asuman KARAKAYA

Başlanan yüksek lisans tezi:

TNF-α enflamatuar sitokin gen polimorfizmlerinin diyabet hastalığı gelişimi üzerine etkisinin

araştırılması Tez sahibi: Emre Umut GÜRPINAR, Danışman: Prof. Dr. Asuman KARAKAYA

18

Uluslararası sunulacak olan bildiriler:

- Correlation between some cytokine gene polymorphisms and susceptibility to type 2 diabetes. 11th

International Symposium on Pharmaceutical Sciences (ISOPS-11), 9-12 Haziran 2015, Ankara-Türkiye

- Genetic polymorphisms in the cytokine genes and risk of type 2 diabetes and its complications in a

group of Turkish population. 51th Congress of the European Societies of Toxicology (EUROTOX), 13-

16 Eylül 2015, Porto- Portekiz (Özet gönderildi).

IX. Kaynaklar

Ahluwalia, T.S., Khullar, M., Ahuja, M., Kohli, H.S., Bhansali, A., Mohan, V., Venkatesan, R.,

Rai, T.S., Sud, K., Singal, P.K. (2009). Common variants of inflammatory cytokine genes are associated

with risk of nephropathy in Type 2 Diabetes among Asian Indians. PLoS ONE, 4: 1-10.

Altuner, D., Ates, I., Suzen, S.H., Koc, G.V., Aral, Y., Karakaya, A. (2011b). The relationship of

PON1 QR 192 and LM 55 polymorphisms with serum paraoxonase activities of Turkish diabetic

patients. Toxicol. Ind. Health 27:873-878.

19

Altuner, D., Suzen, S.H., Ates, I., Koc, G.V., Aral, Y., Karakaya, A. (2011a). Are PON 1 Q/R 192

and M/L 55 polymorphisms risk factors for diabetes complications in Turkish population? Clin.

Biochem. 44: 372-376.

Ates, I., Suzen, S.H., Yucesoy, B., Tekin, I.O., Karakaya, A. (2008). Association of Cytokine

Gene Polymorphisms in CWP and Its Severity in Turkish Coal Workers Am. J. Ind. Med. 51: 741-747.

Ates, I., Yucesoy, B., Yucel, A., Suzen, S.H., Karakas, A., Karakaya, A. (2011). Possible effect of

gene polymorphism on the release of TNFA and IL1 cytokines in coal workers' pneumoconiosis. Exp.

Toxicol. Pathol. 63: 175-179.

Besadovsky, H.O. and del Rey, A. (2010). Interleukin-1 resets glucose homeostasis at central and

peripheral levels: Relevance for immunoregulation. Neuroimmunomodulation, 17: 139-141.

Bouhaha, R., Baroudi, T., Ennafaa, H., Vaillant, E., Abid, H., Sassi, R., Vatin, V., Froguel, P.,

Benammar-el Gaaied, A., Meyre, D., Vaxillaire, M. (2010). Study of TNFα -308G/A and IL6 -174G/C

polymorphisms in type 2 diabetes and obesity risk in the Tunisian population. Clin. Biochem., 43: 549-

552.

Castelnau, P.A., Garrett, R.S., Palinski, W., Witztum, J.L., Campbell, I.L., Powell, H.C. (1998).

Abnormal iron deposition associated with lipid peroxidation in transgenic mice expressing interleukin-6

in the brain. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 57: 268-282.

Çağlar, M. and Kansu, E. (2004). Kemokinler, kemokin reseptörleri ve inflamasyon. Ankem Derg.,

18: 164-168.

Dabhi, B., Mistry, K.N. (2015). Oxidative stres and its association with TNF-α 308 G/C and IL-

1α-889 C/T gene polymorphisms in patients with diabetes and diabetic nephropathy. Gene 562: 197-

202.

Dalziel, B., Gosby, A.K., Richman, R.M., Bryson, J.M., Caterson, I.D. (2002). Association of the

TNF-alpha -308G/A promoter polymorphism with insulin resistance in obesity. Obes. Res., 10: 401-

407.

de Carvalho, M.H., Colaço, A.L., Fortes, Z.B. (2006). Cytokines, endothelial dysfunction, and

insulin resistance. Arq. Bras. Endocrinol. Metab., 50: 304-312.

Dinarello, C.A. (1999). IL-18: A TH1-inducing, proinflammatory cytokine and new member of the

IL-1 family. J. Allergy Clin. Immunol. 103: 11-24.

20

Douglas, D. (2003). Inflammatory cytokines tied to risk of Type 2. Diabetes, 52: 812-817.

Elmarakby, A.A. and Sullivan, J.C. (2010). Relationship between oxidative stress and

inflammatory cytokines in diabetic nephropathy. Cardiovasc. Ther., 00: 1-11.

Fontaine-Bisson, B., Wolever, T.M.S., Chiasson, J.L., Rabasa-Lhoret, R., Maheux, P., Josse, R.G.,

Leiter, L.A., Rodger, N.W., Ryan, E.A., El-Sohemy, A. (2007). Tumor necrosis factor α -238G>A

genotype alters postprandial plasma levels of free fatty acids in obese individuals with type 2 diabetes

mellitus. Metabolism, 56: 649-655.

Ha, H., Yu, M.R., Choi, Y.J., Kitamura, M., Lee, H.B. (2002). Role of high glucose-induced

nuclear factor-kappaB activation in monocyte chemoattractant protein-1 expression by mesengial cells.

J. Am. Soc. Nephrol., 13: 894-902.

Herbert, A., Liu, C., Karamohamed, S., Schiller, J., Liu, J., Yang, Q., Wilson, P.W.F., Cupples,

L.A., Meigs, J.B. (2005). The -174 IL-6 GG genotype is associated with a reduced risk of type 2

diabetes mellitus in a family sample from the National Heart, Lung and Blood Institute’s Framingham

Heart Study. Diabetologia, 48: 1492-1495.

Hivert, M.F., Sun, Q., Shrader, P., Mantzoros, C.S., Meigs, J.B., Hu, F.B. (2009). Circulating IL-

18 and risk of type 2 diabetes in women. Diabetologia, 52: 2101-2108.

Huang, Y., Xu, M., Hong, J., Gu, W., Bi, Y., Li, X. (2010). -607 C/A polymorphism in the

promoter of IL-18 gene is associated with 2 h post-loading plasma glucose level in Chinese. Endocr.,

37: 507-512.

Ihm, C.G., Park, J.K., Hong, S.P., Lee, T.W., Cho, B.S., Kim, M.J., Cha, D.R., Ha, H. (1998). A

high glucose concentration stimulates the expression of monocyte chemotactic peptide 1 in human

mesengial cells. Nephron, 79: 33-37.

Illig, T., Bongardt, F., Schopfer, A., Muller-Scholze, S., Rathmann, W., Koenig, W., Thorand, B.,

Vollmert, C., Holle, R, Kolb, H., Herder, C. (2004). Significant association of the interleukin-6 gene

polymorphisms C-174G and A-598G with type 2 diabetes. J. Clin. Endocrinol. Metab. 89: 5053-5058.

Jing, Y., Zhu, D., Bi, Y., Yang, D., Hu, Y., Shen, S. (2011). Monocyte, chemoattractant protein 1-

2518 A/G polymorphism and susceptibility to type 2 diabetes in a Chinese population. Clinica Chimica

Acta, 412: 466-469.

21

Karadeniz, M., Erdogan, M., Berdeli, A., Yilmaz, C. (2014). Association of interleukin-6 -174

G>C promoter polymorphism with increased risk of type 2 diabetes mellitus patients with diabetic

nephropathy in Turkey. Genet Test Mol Biomarkers 18: 62-65.

Kishimoto, T., Taga, T., Akira, S. (1994). Cytokine signal transduction. Cell 76: 253-262.

Kubaszek, A., Pihlajamaki, J., Komarovski, V., Lindi, V., Lindstorm, J., Eriksson, J., Valle, T.T.,

Hamalainen, H., Ilanne-Parikka, P., Keinanen-Kiukaanniemi, S., Tuomilehto, J., Uusitupa, M., Laakso,

M. (2003). Promoter polymorphisms of the TNF-α (G-308A) and IL-6 (C-174G) genes predict the

conversion from impaired glucose tolerance to type 2 diabetes: the Finnish Diabetes Prevention Study.

Diabetes, 52: 1872-1876.

Lee, S.H., Ihm, C.G., Sohn, S.D., Lee, T.W., Kim, M.J., Koh, G., Oh, S.J., Woo, J-T., Kim, S.W.,

Kim, J.W., Kim, Y.S., Lee, B.C., Kim., S.D., Cho, B.S., Lee, H-J., Chung, J-H. (2004). Polymorphisms

in Interleukin-1β and Interleukin-1 receptor antagonist genes are associated with kidney failure in

Korean patients with Type 2 Diabetes mellitus. Am. J. Nephrol., 24: 410-414.

Lee, S.H., Lee, T.W., Ihm, C.G., Kim, M.J., Woo, J.T., Chung, J.H. (2005). Genetics of diabetic

nephropathy in type 2 DM: candidate gene analysis for the pathogenic role of inflammation.

Nephrology, 10: S32-S36.

Libra, M., Signorelli, S.S., Bevelacqua, Y., Navolanic, P.M., Bevelacqua, V., Polesel, J.,

Talamani, R., Stivala, F., Mazzarino, M.C., Malaponte, G. (2006). Analysis of G(-174)C IL-6

polymorphism and plasma concentrations of inflammatory markers in patients with type 2 diabetes and

peripheral arterial disease. J. Clin. Pathol., 59: 211-215.

Luotola, K., Paakkönen, R., Alanne, M., Lanki, T., Moilanen, L., Surakka, I., Pietila, A., Kahönen,

M., Nieminen, M.S., Kesaniemi, Y.A., Peters, A., Jula, A., Perola, M., Salomaa V. (2009). Association

of variation in the Interleukin-1 gene family with diabetes and glucose homeostasis. J. Clin. Endocrinol.

Metab., 94: 4575-4583.

Moriwaki, Y., Yamamoto, T., Shibutani, Y., Aoki, E., Tsutsumi, Z., Takahashi, S., Okamura, H.,

Koga, M., Fukuchi, M., Hada, T. (2003). Elevated levels of interleukin-18 and tumor necrosis factor-

alpha in serum of patients with type 2 diabetes mellitus: relationship with diabetic nephropathy.

Metabolism, 52: 605-608.

22

Morohoshi, M., Fujisawa, K., Uchimura, I., Numano, F. (1995). The effect of glucose and

advanced glycosylation end products on IL-6 production by human monocytes. Ann. N. Y. Acad. Sci.,

748: 562-570.

Nakamura, A., Shikata, K., Hiramatsu, M., Nakatou, T., Kitamura, T., Wada, J., Itoshima, T.,

Makino, H. (2005). Serum interleukin-18 levels are associated with nephropathy and atherosclerosis in

Japanese patients with type 2 diabetes. Diabetes Care, 28: 2890-2895.

Navarro-Gonzales, J.F. and Mora-Fernandez, C. (2008). The role of inflammatory cytokines in

diabetic nephropathy. J. Am. Soc. Nephrol., 19: 433-442.

Nicoletti, F., Conget, I., Di Marco, R., Speciale, A.M., Morinigo, R., Bendtzen, K., Gomis, R.

(2001). Serum levels of the interferon-gamma-inducing cytokine interleukin-18 are increased in

individuals at high risk of developing type I diabetes. Diabetologia, 44: 309-311.

Nishimoto, N., Kishimoto, T., Yoshizaki, Y. (1999). Anti-cytokine therapy in autoimmune

diseases. Intern. Med. 38:178-182.

Oberbach, A., Lehmann, S., Kirsch, K., Krist, J., Sonnabend, M., Linke, A., Tönjes, A., Stumvoll,

M., Blüher, M., Kovacs, P. (2008). Long-term exercise training decreases interleukin-6 (IL-6) serum

levels insubjects with impaired glucose tolerance: effect of the -174G/C variant in IL-6 gene. Eur. J.

Endocrinol., 159: 129-136.

Ohno, Y., Aoki, N., Nishimura, A. (1993). In vitro production of interleukin-1, interleukin-6, and

tumor necrosis factor-alpha in insulin-dependent diabetes mellitus. J. Clin. Endocrinol. Metab. 77:

1072-1077.

Ollier, W.E.R. (2004). Cytokine genes and disease susceptibility. Cytokine 28: 174-178.

Opal, S.M., De Palo, V.A. (2000). Anti-inflammatory cytokines. Chest 117: 1162-1172.

Rader, D.J. (2000). Inflammatory markers of coronary risk. N. Engl. J. Med., 343: 1179-1182.

Raina, P., Matharoo, K., Bhanwer A.J. (2014). Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) g. -

2518 A>G polymorphism and susceptibility in type 2 diabetes (T2D) and end stage renal disease

(ESRD) in the North-West Indian population of Punjab. Ann Hum Biol. 26:1-7.

Reddy, P. (2004). Interleukin-18: Recent advances. Curr. Opin. Hematol., 11: 405-410.

23

Robker, R.L., Collins, R.G., Beaudet, A.L., Mersmann, H.J., Smith, C.W. (2004). Leukocyte

migration in adipose tissue of mice null for ICAM-1 and Mac-1 adhesion receptors. Obes. Res., 12: 936-

940.

Ruotsalainen, E., Stancakova, A., Vauhkonen I., Salmenniemi, U., Pihlajamaki, J., Punnonen K.,

Laakso, M. (2010). Changes in Cytokine levels during acute hyperinsulinemia in offspring of Type 2

diabetic subjects. Atherosclerosis, 210: 536-541.

Schins, R.P.F., Borm, P.J.A. (1999). Mechanisms and mediators in coal dust induced toxicity: a

review. Ann. Occup. Hyg. 43: 7-33.

Schrijvers, B.F., De Vriese, A.S., Flyvbjerg, A.A. (2004). From hyperglycemia to diabetic kidney

disease: The role of metabolic, hemodynamic, ıntracellular factors and growth factors/cytokines.

Endocr. Rev., 25: 971-1010.

Sherwin, R. (2006). Type II Diabetes Mellitus. In: Cecil Textbook of Medicine. Eds: Coldman, L.,

Ausiello, D., 22nd Edition, Philadelphia, PA: W.B. Saunders Company, USA.

Sookoian, S.C., Gonzalez, C., Pirola, C.J. (2005). Meta-analysis on the G-308A tumor necrosis

factor alpha gene variant and phenotypes associated with the metabolic syndrome. Obes. Res., 13: 2122-

2131.

Szoke, D., Molnar, B., Solymosi, N., Racz, K., Gergics, P., Blasko, B., Vasarhelyi, B., Vannay,

A., Mandy, Y., Klausz, G., Gyulai, Z., Galamb, O., Spisak, S., Hutkai, B., Somogyi, A., Berta, K.,

Szabo, A., Tulassay, T., Tulassay, Z. (2009). Polymorphisms of the ApoE, HSD3B1, IL-1β and p53

genes are associated with the development of early uremic complications in diabetic patients: Results of

a DNA sequencing array study. Int. J. Mol. Med., 23: 217-227.

Tesch, G.H. (2008). MCP-1/CCL2: a new diagnostic marker and therapeutic target for progressive

renal injury in diabetic nephropathy. Am. J. Physiol. Renal Physiol., 294: F697-F701.

Tracey, K.J., Cerami, A. (1994). Tumor necrosis factor: a pleiotropic cytokine and therapeutic

target. Annu. Rev. Med., 45: 491-503.

Vendrell, J., Broch, M., Fernandez-Real, J.M., Gutierrez, C., Simon, I., Megia, A., Gallart, L.,

Ricart, W., Richart, C. (2005). Tumour necrosis factor receptors (TNFRs) in Type 2 diabetes. Analysis

of soluble plasma fractions and genetic variations of TNFR2 gene in a case-control study. Diabet. Med.,

22: 387-392.

24

Vozarova, B., Fernandez-Real, J.M., Knowler, W.C., Gallart, L., Hanson, R.L., Gruber, J.D.,

Ricart, W., Vendrell, J., Richart, C., Tataranni, P.A., Wolford, J. K. (2003). The interleukin-6 (-174)

G/C promoter polymorphism is associated with type-2 diabetes mellitus in Native Americans and

Caucasians. Hum. Genet., 112: 409-413.

Wang, Y., Ng, M.C.Y., So, W-Y., Ma, R., Ko, G.T.C., Tong, P.C.Y., Chan, J.C.N. (2005).

Association between tumour necrosis factor-α G-308A polymorphism and risk of nephropathy in obese

Chinese type 2 diabetic patients. Nephrol. Dial. Transplant., 20: 2733-2738.

Yu, H.I., Sheu, W.H., Song, Y.M., Liu, H.C., Lee, W.J., Chen, Y.T. (2004). C-reactive protein and

risk factors for peripheral vascular disease in subjects with Type 2 diabetes mellitus. Diabet. Med. 21:

336-341.

Zhang, Z., Yuan, W., Sun, L., Szeto, F.L., Wong, K.E., Li, X., Kong, J., Li, Y.C. (2007). 1,25-

Dihydroxyvitamin D3 targeting of nF-kappaB suppresses high glucose-induced MCP-1 expression in

mesengial cells. Kidney Int., 72: 193-201.

X. Ekler

Mali Bilanço ve Açıklamaları

25

26

Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar

Proje kapsamında alınmış olan thermal cycler, mini yatay elektroforez, spin santrifüj ve DNA

spektrofotometresi Anabilim Dalımız araştırma laboratuarında konuşlandırılmış olup çalışmalar

sırasında verimli olarak kullanılmış ve deneyler tamamlanmıştır. Bundan sonra planlanacak olan proje

ve diğer çalışmalarda da bu makine ve teçhizatlar rahatlıkla kullanılabilecektir.

Sunumlar (bildiriler)

Proje çalışmaları tamamlandıktan sonra elde edilen verilerden oluşturulan iki (2) adet bildiri, poster

olarak 2 ayrı uluslararası kongrede sunulacaktır. Bundan sonra düzenlenecek olan ulusal ve uluslararası

kongrelerde de proje çalışmalarına ait sunumlar planlanmaya devam edilecektir.

Bildirilerin isimleri ve sunulacak olan kongre bilgileri aşağıdaki gibidir:

1) Correlation between some cytokine gene polymorphisms and susceptibility to type 2 diabetes. 11th

International Symposium on Pharmaceutical Sciences (ISOPS-11), 9-12 Haziran 2015, Ankara-Türkiye

2) Genetic polymorphisms in the cytokine genes and risk of type 2 diabetes and its complications in a

group of Turkish population. 51th Congress of the European Societies of Toxicology (EUROTOX), 13-

16 Eylül 2015, Porto- Portekiz

27

Yayınlar ve Tezler

Proje çalışmalarından elde edilen sonuçlar makaleler haline getirilmektedir. Proje sonuç raporunu takip

eden ay içinde hazırlanarak uluslararası saygınlığı olan ve SCI kapsamına giren dergilere yayınlanmak

üzere gönderilecektir.

Proje çalışmaları sırasında proje çalışma grubunda olan Anabilim Dalımız öğretim üyelerinden Prof. Dr.

Asuman KARAKAYA'nın yüksek lisans öğrencilerinden Ayşegül GÜVENÇ çalışmalarımızla bağlantılı

olan yüksek lisans tezini tamamlamıştır. Prof. Dr. Asuman KARAKAYA'nın diğer yüksek lisans

öğrencisi olan Emre Umut GÜRPINAR'ın da yüksek lisans tezi proje ile bağlantılı olarak tasarlanmış ve

çalışmalara başlanmıştır. Biten ve devam etmekte olan yüksek lisans tezlerinin başlıkları ve diğer

bilgileri aşağıdaki gibidir:

Biten yüksek lisans tezi:

Enflamatuar sitokin gen polimorfizmlerinin Tip 2 diyabet ve komplikasyonları üzerine olan etkilerinin

araştırılması (2014/Ankara) Tez sahibi: Ayşegül GÜVENÇ, Danışman: Prof. Dr. Asuman KARAKAYA

Başlanan yüksek lisans tezi:

TNF-α enflamatuar sitokin gen polimorfizmlerinin diyabet hastalığı gelişimi üzerine etkisinin

araştırılması Tez sahibi: Emre Umut GÜRPINAR, Danışman: Prof. Dr. Asuman KARAKAYA

Documents

ANKARA ÜNİVERSİTESİ SONUÇ RAPORUacikarsiv.ankara.edu.tr/browse/27324/rapor.pdf · 5 oynamaktadırlar. Vücut savunmasında rol alan immün ve enflamatuar hücrelerin çok yönlü