ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------------------------------------

TRẦN MẠNH CƢỜNG

ÁP DỤNG PHƢƠNG PHÁP

SẮC KÝ CỘT VÀ SẮC KÝ LỚP MỎNG

VÀO GIẢNG DẠY HOÁ HỌC PHỔ THÔNG

Chuyên ngành: Hoá phân tích

Mã số: 60 44 29

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. ĐÀO HỮU VINH

HÀ NÔI – 2011

1

MỤC LỤC Trang

Mở đầu 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 3

1.1. Sơ lƣợc về lịch sử phát triển sắc ký 3

1.2. Định nghĩa, nguyên tắc của sắc ký và phân loại các phƣơng pháp

sắc ký 4

1.2.1. Định nghĩa 4

1.2.2. Nguyên tắc của sắc ký 4

1.2.3. Phân loại các phương pháp sắc ký 4

1.3. Cơ sở lý thuyết về sắc ký 7

1.3.1. Các khái niệm cơ bản 7

1.3.2. Thuyết đĩa 11

1.3.3. Thuyết tốc độ 14

1.4. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography) 16

1.4.1. Các chất hấp thụ dùng trong sắc ký lớp mỏng 17

1.4.2. Dung môi khai triển và thuốc thử hiện màu 18

1.5. Sắc ký giấy (paper chromatography) 18

1.5.1. Kỹ thuật tiến hành sắc ký giấy 19

1.5.2. Giấy sắc ký 19

1.5.3. Dung môi trong sắc ký giấy 20

1.5.4. Ứng dụng của sắc ký giấy 21

1.6. Sắc ký hấp phụ lỏng (trên cột) 21

1.6.1. Nguyên tắc 21

1.6.2. Ứng dụng của sắc ký hấp phụ lỏng 24

1.7. Khái quát về chất diệp lục (chlorophyl) và carotenoit 24

1.7.1. Chất diệp lục (diệp lục tố, chlorophyl) 24

1.7.2. Carotenoit 26

1.7.3. Các phương pháp sắc ký đã được dùng để tách các diệp lục

và carotenoit. 28

1.8. Khái quát về ion Co2+

, Cu2+

, Fe3+

, Ni2+

và muối của chúng 29

1.8.1. Sơ lược về muối sắt(III) và ion Fe3+

29

1.8.2. Sơ lược về muối đồng(II) và ion Cu2+

31

1.8.3. Sơ lược về muối coban(II) và ion Co2+

32

1.8.4. Sơ lược về muối niken(II) và ion Ni2+

33

1.8.5. Các phương pháp sắc ký đã được dùng để tách các ion Fe3+

,

Cu2+

, Co2+

và ion Ni2+

34

2

Trang

CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 35

2.1 Các hoá chất và thiết bị cần thiết 35

2.2. Chế tạo bản mỏng từ tinh bột sắn dây 36

2.3. Chiết dịch từ lá xanh 36

2.4. Tiến hành sắc ký cột 37

2.5. Tiến hành sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography) 38

2.6. Tiến hành sắc ký giấy (paper chromatography) 39

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 40

3.1. Sắc ký cột 40

3.1.1. Tách chất màu trong lá xanh 40

a) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi ete dầu

hoả - axton. 40

b) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi

toluen - axeton. 41

c) Pha tĩnh là bột canxi cacbonat, pha động là hệ dung môi

ete dầu hoả - axeton 42

d) Pha tĩnh là bột canxi cacbonat, pha động là hệ dung môi

toluen - axeton. 43

e) Pha tĩnh là glucozơ, pha động là hệ dung môi

ete dầu hoả - axeton. 45

f) Pha tĩnh là glucozơ, pha động là hệ dung môi

toluen - cồn etylic nguyên chất. 46

3.1.2. Tách các ion Fe3+

, Cu2+

, Co2+

46

a) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi

NH4NO3 4M - NH3 4M 46

b) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi

CH3COONH4 1,5M -CH3COOH 1,5M 48

c) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi

Axeton – HCl đặc 49

d) Pha tĩnh là bột canxi cacbonat, pha động là hệ dung môi

NH4NO3 4M - NH3 4M 49

e) Pha tĩnh là silicagel, pha động dung dịch axit axetic 49

f) Pha tĩnh là tinh bột sắn dây 49

2.7.3. Kết luận 49

3.2. Sắc ký lớp mỏng 50

3

Trang

3.2.1. Tách chất màu trong lá xanh 50

a) Bản mỏng của hãng Merck, hệ dung môi

ete dầu hoả - axeton 50

b) Bản mỏng sắc ký tự chế tạo từ tinh bột sắn dây, hệ dung

môi ete dầu hoả - axeton 52

3.2.2. Tách các ion kim loại Fe3+

, Cu2+

, Co2+

, Ni2+

54

a) Bản mỏng của hãng Merck, hệ dung môi

NH3 4M – NH4NO3 4M 54

b) Bản mỏng chế tạo từ tinh bột sắn dây, hệ dung môi

axeton - HCl đặc 56

3.2.3. Kết luận 58

3.3. Sắc ký giấy 59

3.3.1. Tách chất màu trong lá xanh 59

a) Giấy sắc ký loại 3S, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton 59

b) Giấy sắc ký là giấy lọc, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton 61

c) Giấy sắc ký là loại 3S, hệ dung môi toluen - cồn etylic

tuyệt đối 63

d) Giấy sắc ký là giấy lọc, hệ dung môi toluen - cồn etylic

tuyệt đối 65

3.3.2. Tách các ion Fe3+

, Cu2+

và Co2+

66

a) Giấy sắc ký loại 3S, hệ dung môi axeton - HCl đặc 66

b) Giấy sắc ký là giấy lọc, hệ dung môi axeton - HCl đặc 68

3.3.3. Kết luận 68

KẾT LUẬN CHUNG 70

KIẾN NGHỊ 71

Tài liệu tham khảo 72

I. Tiếng việt 72

II. Tiếng Anh 73

4

MỞ ĐẦU

1/Lý do chọn đề tài

Sắc ký được ra đời từ năm 1903 bởi nhà thực vật học người Nga Mikhail

Tsvet (Mikhail Semyonovich Tsvet), đến nay sắc ký đã phát triển mạnh mẽ trở

thành môn học quan trọng của hoá phân tích hiện đại và được ứng dụng rộng rãi

trong nhiều lĩnh vực.

Nhờ có khả năng tách riêng rẽ các chất cho kết quả phân tích định tính

hoặc định lượng đều rõ ràng. Sắc ký tham gia vào phân tích các mẫu phức tạp

trong các lĩnh vực từ sản xuất nông nghiệp, công nghiệp đến các hoạt động phục

vụ đời sống như chữa bệnh, điều tra hình sự. Ngoài ra sắc ký còn là công cụ

phục vụ đắc lực cho nghiên cứu khoa học.

Thí dụ trong sản xuất nông nghiệp, sắc ký góp phần tách và định lượng

các chất dinh dưỡng trong sản phẩm, phân tích các độc tố, như các hóa chất bảo

vệ thực vật, các kim loại nặng trong thực phẩm, nước uống…

Trong chữa bệnh, sắc ký góp phần xét nghiệm mẫu bệnh phẩm, thí dụ

phân tích thuốc kháng sinh, phân tích các dược phẩm, dược liệu…

Sắc ký cũng phục vụ đắc lực trong quan trắc môi trường, đánh giá tác

động của môi trường tới đời sống con người. Thí dụ tách và định lượng hàm

lượng các chất độc hại trong không khí.

Vậy dạy cho học sinh THPT kiến thức về sắc ký là rất cần thiết, tuy nhiên

chương trình môn Hoá Học ở bậc học phổ thông của nước ta hiện nay chưa có

phần nào nói về sắc ký. Có lẽ khó khăn là các thí nghiệm thực hành về sắc ký

thường khó làm, cần nhiều máy móc hỗ trợ hiện đại đắt tiền, thời gian làm thí

nghiệm lâu có trường hợp diễn ra trong thời gian dài, nhiều hoá chất khó kiếm

đắt tiền không phù hợp với trường THPT.

Với mong muốn có thể đưa nội dung sắc ký vào chương trình Hoá Học

phổ thông ở nước ta Phó giáo sư - Tiến sĩ, Nhà giáo ưu tú Đào Hữu Vinh, đã

trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện luận văn “Áp dụng phƣơng pháp sắc ký cột

và sắc ký lớp mỏng vào giảng dạy hoá học phổ thông”.

2/ Mục đích nghiên cứu

Khảo sát để lựa chọn ra những thí nghiệm sắc ký có thể áp dụng dạy cho

học sinh phổ thông. Nghĩa là thiết bị, hoá chất, đơn giản, ít hoặc không độc hại,

dễ tìm kiếm ở phòng thí nghiệm của một trường THPT ở Việt Nam. Chọn thành

phần pha động, pha tĩnh và chất phân tích sao cho thí nghiệm dễ làm, thời gian

cho một nghiệm chỉ khoảng từ 5 đến 15 phút nhưng vẫn đảm bảo chuyển tải

5

được cho học sinh những kiến thức cơ bản nhất về bản chất, nguyên lý và ứng

dụng của sắc ký.

3/ Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

Kiến thức về sắc ký là khá rộng, nhưng do mục tiêu đã nêu trên hơn nữa

thời gian nghiên cứu và khả năng của bản thân có hạn, nên tôi chỉ tập trung

nghiên cứu khảo sát việc thay đổi các hoá chất dụng cụ để thực hiện thí nghiệm

sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy ở mức tách định tính các chất màu

trong lá xanh (chlorophyl, carotenoit), một số ion kim loại thông dụng có màu

đặc trưng (Fe3+

, Cu2+

, Co2+

, Ni2+

).

4/ Phƣơng pháp nghiên cứu

Nghiên cứu các tài liệu về cơ sở lý thuyết chung của sắc ký, tài liệu hướng

dẫn thực hành sắc ký.

Làm thực nghiệm với sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy; nghiên

cứu sự thay đổi thành phần pha động, pha tĩnh và chất phân tích để tìm ra những

thí nghiệm phù hợp với mục đích đã nêu.

6

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Sơ lƣợc về lịch sử phát triển sắc ký [15, 18, 19]

Năm 1903 nhà thực vật học người Nga Michael Tsvet đã dùng cột nhôm

oxit (có tài liệu nói cột canxi cacbonat) làm pha tĩnh và pha động là ete dầu hoả

tách thành công chlorophyl từ lá cây. Ông đã giải thích hiện tượng bằng ái lực

hấp phụ khác nhau của các sắc tố và đặt tên phương pháp này là phương pháp

sắc ký (chromatography), sắc ký nghĩa là ghi màu vì đã tách được những chất có

màu.

Tuy nhiên phát minh của Tsvet gần như bị lãng quên trong một thời gian

dài. Mãi tới năm 1931 sau khi Vinterstin và Lederer dùng phương pháp của

Tsvet tách caroten thô thành và caroten và nhận thấy giá trị của phương

pháp về phương diện điều chế, phương pháp sắc ký mới bắt đầu được chú ý

đúng mức và phát triển nhanh chóng. Đặc biệt trong những năm 30 của thế kỷ

XX, nhu cầu về phân tích và tách hỗn hợp các chất trở nên rất cấp thiết nên sắc

ký phát triển nhanh chóng. Năm 1938 Izmailov và Shraiber đặt nền móng đầu

tiên cho sắc ký lớp mỏng và sau đó những công trình của Stahl đã làm cho sắc

ký lớp mỏng phát triển nhanh chóng và ứng dụng rất rộng rãi. Năm 1941

Tiselius phát triền các kỹ thuật tách sắc ký và chỉ ra các phương pháp phân tích

tiền lưu, phân tích thế đẩy và phân tích rửa giải. Cũng trong năm 1941 sắc ký

phân bố ra đời khi Martin và Synge đề xuất phương pháp tách không phải theo

ái lực của các cấu tử đối với chất hấp thụ, mà do sự phân bố khác nhau của các

cấu tử giữa hai chất lỏng không trộn lẫn. Các tác giả trên đã phát triển một dạng

mới của sắc ký phân bố: sắc ký giấy. Do có công đóng góp các tác giả đã nhận

giải Nobel năm 1952. Vào năm 1941 – 1942, Martin đã làm một bước ngoặt lớn

trong sắc ký do dùng sắc ký giấy tách thành công các ancaloit chiết được từ các

cây thuốc. Năm 1952, Martin công bố công trình đầu tiên về sắc ký khí dựa trên

sự phân bố của chất giữa pha tĩnh là chất lỏng và pha động là chất khí. Vào

những năm 1970, sắc ký khí phát triển, cùng với nó, sắc ký lỏng cũng nâng cao

hiệu quả của phương pháp, các vật liệu làm pha tĩnh không ngừng được cải tiến,

từ đó hiệu lực của các phương pháp sắc ký đạt được những thành tựu đáng kể

như tách được các hỗn hợp các chất cực kỳ giống nhau (thí dụ các nguyên tố đất

hiếm), các ancaloit, các hiđrocacbon trong các mẫu dầu…Ngày nay trong sắc ký

lỏng chất nhồi được cải tiến, kích thước hạt giảm xuống tới 1,5 – 1,7 m, có khả

năng chịu áp suất và nhiệt độ tốt, hình thành các phương pháp cực kỳ hiệu quả

(Ultra Performance Liquid Chromatography – UPLC) có thể tách nhanh các hợp

chất khó trong thời gian vài chục giây. Ngoài ra phương pháp siêu tới hạn

7

(Supercritical fluid chromatography – SFC) cũng được phát triển để phù hợp với

các chất có khối lượng phân tử lớn. Vào cuối thể kỷ trước, một phương pháp

tách mới được đời là các phương pháp điện di, đặc biệt là điện di mao quản.

Phương pháp có hiệu lực tách rất cao, nhanh, có thể tách được nhiều các đối

tượng vô cơ và hữu cơ. Năm 1994, những máy điện di mao quản đầu tiên được

bán trên thị trường, được sử dụng rất có hiệu quả để phân tích các dược phẩm,

các mẫu sinh học, đặc biệt là các mẫu cực kỳ khó như protein, enzim…

Sự phát triển phong phú của sắc ký đã làm cho danh từ “sắc ký” không

còn đúng theo ý nghĩa ban đầu của nó. Tuy nhiên tất cả các phương pháp sắc ký

đều có những nét chung nhất: quá trình tách dựa trên sự chuyển dịch của hỗn

hợp chất phân tích qua lớp chất bất động (pha tĩnh) là chất rắn hoặc chất lỏng

mang trên chất rắn hoặc giấy và sự chuyển dịch đó được thực hiện bằng một

chất khí hoặc chất lỏng (pha động).

1.2. Định nghĩa, nguyên tắc và phân loại các phƣơng pháp sắc ký [10, 15]

1.2.1. Định nghĩa

Tính đa dạng muôn màu của phương pháp sắc ký đã làm nảy sinh nhiều định

nghĩa, nhiều tên gọi trong lĩnh vực sắc ký. Nhưng định nghĩa được nhiều nhà

hoá học thừa nhận là hoàn chỉnh nhất, tổng quan nhất như sau:

Sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố

không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động đi xuyên qua pha tĩnh.

- Một hệ sắc ký bao gồm: chất phân tích, pha tĩnh và pha động.

1.2.2. Nguyên tắc của sắc ký

Nguyên tắc chung của mọi phương pháp sắc ký là dựa trên sự phân bố các

chất giữa hai pha: một pha thường cố định gọi là pha tĩnh(stationary phase) và

một pha chuyển động gọi là pha động (mobile phase). Khi cho mẫu chứa hỗn

hợp chất cần phân tích đã được hoà tan trong dung môi thích hợp (pha động) di

chuyển qua pha tĩnh do sự phân bố các chất cần phân tích giữa hai pha là khác

nhau nên tốc độ di chuyển của chúng khác nhau và sẽ được tách khỏi nhau sau

một thời gian nhất định.

1.2.3. Phân loại các phƣơng pháp sắc ký

1.2.3.1. Phân loại theo trạng thái liên hợp của pha động và pha

tĩnh

- Theo cách phân loại này tất cả các phương pháp sắc ký được phân thành hai

nhóm lớn theo pha động: sắc ký lỏng và sắc ký khí. Đây là cách phân loại lôgic

nhất và được sử dụng rộng rãi.

- Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc chất lỏng (được mang trên chất rắn).

1.2.3.2. Phân loại theo cơ chế của quá trình tách

8

Phương pháp phân loại này dựa trên cơ chế của quá trình hấp thụ - giải hấp thụ,

nghĩa là theo tương tác của chất được sắc ký với pha động. Có bốn cơ chế sắc ký

chính sau đây.

A. Sắc ký hấp phụ.

Sự tách do ái lực khác nhau của các chất đối với chất hấp phụ rắn (pha tĩnh). Đối

với các chất hấp phụ phân cực, ái lực đó chủ yếu do tương tác của các cực. Do

đó các nhóm phân cực trong phân tử ảnh hưởng tới kết quả tách mạnh hơn các

mạch hiđrocacbon không phân cực.

B. Sắc ký phân bố.

Trong phương pháp này người ta lợi dụng sự phân bố khác nhau của các chất

giữa pha tĩnh lỏng (được giữ bởi chất mang rắn) và pha động. Trong sắc ký lỏng

pha tĩnh thường phân cực hơn pha động, tuy nhiên cũng có trường hợp ngược

lại. Về nguyên tắc có thể có rất nhiều tổ hợp hai pha lỏng. Tuy nhiên trong thực

tế số đó bị hạn chế rất lớn. Như chúng ta đã biết qui tắc về độ tan “các chất

giống nhau hoà tan vào nhau”, do đó độ phân cực của các chất được sắc ký cũng

như của các pha tĩnh và pha động có ảnh hưởng tới quá trình tách.

C. Sắc ký trao đổi ion.

Sự tách xảy ra do ái lực khác nhau của các ion trong dung dịch đối với các trung

tâm trao đổi ion (nhóm chứa ion) trên chất rắn là pha tĩnh. Chất rắn quan trọng

nhất trong trường hợp này là các nhựa trao đổi ion. Sắc ký trao đổi ion chủ yếu

dùng trong dung môi là nước hoặc hỗn hợp nước - dung môi hữu cơ trong môi

trường có độ điện môi tương đối lớn để các ion có thể tồn tại tự do và bền.

D. Sắc ký rây phân tử.

Trong phương pháp này người ta sử dụng các vật liệu rắn có độ xốp lớn. Có các

lỗ với kích thước nhất định để rây chọn lọc các cấu tử tuỳ theo kích thước và

hình dạng phân tử. Các zeolit tổng hợp có giá trị rất lớn trong sắc ký rây các chất

khí. Có thể dùng các hợp chất vô cơ, hữu cơ, polime tổng hợp để tách các chất

vô cơ và hữu cơ; đặc biệt nhóm polime ưa nước (loại dextran mạng) được dùng

để tách các chất có hoạt tính sinh học.

Ngoài ra còn có các loại sắc ký kết tủa, sắc ký tạo phức, sắc ký oxi hoá-

khử, nhưng chúng ít có giá trị thực tế.

Cuối cùng cần nhấn mạnh rằng, đối với một quá trình sắc ký có một cơ chế chủ

đạo, nhưng có thể xảy ra các cơ chế phụ khác. Ví dụ trong sắc ký hấp phụ có thể

có một phần trao đổi ion (hấp phụ hoá học, tạo phức) hoặc cơ chế phân bố.

1.2.3.3. Phân loại theo cách hình thành sắc đồ.

Cơ sở của phương pháp phân loại này dựa trên cách chuyển dịch tương đối của

pha động so với pha tĩnh. Có thể khai triển sắc đồ theo ba phương pháp: tiền lưu,

9

đẩy và rửa giải. Phương pháp rửa giải quan trọng và phổ biến nhất, sau đó là

phương pháp đẩy, còn phương pháp tiền lưu ít được sử dụng.

A. Phương pháp tiền lưu.

Theo phương pháp này, người ta cho hỗn hợp chất phân tích, ví dụ, dung môi

chứa các cấu tử A, B liên tục đi vào lớp đầu tiên của pha tĩnh (đầu cột) và di

chuyển tới lớp cuối cùng của pha tĩnh (cuối cột). Nếu chất B bị hấp thụ mạnh

hơn chất A thì tuyến dung môi phía trước sẽ nghèo cấu tử B hơn và kết quả là

dung môi đi ra khỏi cột chứa cấu tử A nguyên chất. Cấu tử B sẽ không bị hấp

thụ ở những lớp chất hấp thụ đã bão hoà cấu tử B và chuyển động dọc cột cùng

với cấu tử A. Cuối cùng dung môi chứa hỗn hợp A, B đi ra khỏi cột. Như vậy

phương pháp này cho phép thu được một lượng nào đó A nguyên chất.

B. Phương pháp đẩy.

Nguyên tắc của phương pháp này là đưa một mẫu tương đối nhỏ hỗn hợp chất

phân tích chứa các cấu tử A, B lên lớp đầu của pha tĩnh (lúc này xảy ra quá trình

tiền lưu nhưng rất ít). Sau đó cho dung môi chứa chất E (pha động) đi qua. Điều

kiện quan trọng là chất E bị hấp thụ mạnh hơn A, B. Do đó E đẩy các cấu tử A,

B chuyển động xuống phía dưới. Vì B bị giữ mạnh hơn A cho nên B lại đẩy A

về phía trước. Kết quả ta được các vùng A nguyên chất, B nguyên chất và pha

động chứa E nguyên chất

Hình 1.1. Phương pháp đẩy

Như vậy, khác với phương pháp tiền lưu, nhờ phương pháp đẩy ta có thể

thu được các phân đoạn chứa từng cấu tử nguyên chất.

C. Phương pháp rửa giải.

Trước hết đưa các mẫu nhỏ gồm hỗn hợp các cấu tử A, B vào lớp đầu tiên của

pha tĩnh. Giả sử B bị hấp thụ mạnh hơn A. Sau đó cho pha động chứa cấu tử E

đi qua cột. Điều kiện quan trọng là cấu tử E bị hấp thụ yếu hơn cả. Lúc đó pha

động sẽ rửa A, B với tốc độ khác nhau tuỳ theo mức độ các cấu tử đó bị pha tĩnh

giữ. Vì A bị hấp thụ yếu hơn nên nó dịch chuyển nhanh hơn cùng với pha động.

10

Đó là kết quả của sự chuyển dịch cân bằng hấp thụ-giải hấp thụ giữa các cấu tử

A, B, E. Nếu tốc độ chuyển dịch của A, B đủ khác nhau, thì các vùng A, B

chồng chập nhau lúc đầu dần dần được tách ra và cuối cùng tạo thành hai vùng

riêng biệt và được ngăn cách bởi dung môi nguyên chất (chứa E). Vùng A

chuyển dịch trước vùng B

Hình 1.2. Phương pháp rửa giải

Nếu đường đẳng nhiệt hấp thụ là tuyến tính, thì đường cong biểu diễn sự

biến thiên nồng độ các cấu tử có dạng hình chuông (phân bố Gauss). Nhược

điểm của phương pháp này là dùng lượng lớn dung môi do đó nồng độ chất đi ra

khỏi đầu cột rất loãng.

1.2.3.4. Phân loại theo thiết bị hình thành sắc đồ.

Theo phương pháp phân loại này, tất cả các phương pháp sắc ký được chia thành

hai nhóm: Sắc ký cột và sắc ký phẳng. Trong sắc ký cột (kể cả sắc ký cột mao

quản) quá trình tách hỗn hợp được thực hiện trên các cột hình tròn nạp các chất

hấp thụ thích hợp. Còn trong sắc ký phẳng sự hình thành sắc đồ được tiến hành

trên các lớp phẳng chất hấp thụ (giấy hoặc lớp mỏng).

Cuối cùng cần nói rằng tuyệt đại đa số phương pháp sắc ký đều tiến hành theo

lối động, nghĩa là một pha đứng im và một pha chuyển động; tuy nhiên có một

số trường hợp tách theo lối tĩnh nghĩa là cả hai pha đều đứng im tương đối và

phải khuấy trộn mạnh để cân bằng hấp thụ - giải hấp thụ xảy ra nhanh. Lý thuyết

sắc ký không áp dụng cho lối tĩnh.

1.3. Cơ sở lí thuyết về sắc ký [10, 15]

1.3.1. Các khái niệm cơ bản

. Hệ số phân bố

Một cấu tử A cho tiếp xúc với pha động và pha tĩnh sẽ phân bố giữa

hai pha theo tỷ số nồng độ nhất định, như vậy, nó có hệ số phân bố riêng, nói

một cách khác cân bằng phân bố được thiết lập, có phương trình:

11

As Am (3.1)

Hệ số phân bố là tỷ số nồng độ chất phân tích giữa hai pha

KD = s

m

[A ]

[A ] (3.2)

Trong đó [As] là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh

[Am] là nồng độ chất phân tích trong pha động

. Mối liên hệ giữa hệ số phân bố và tốc độ di chuyển của các chất

trong hệ sắc ký.

Chất phân tích A muốn di chuyển được phải ở pha động.

Gọi fa là phần thời gian của chất A ở pha động

fa = Số milimol A trong pha động/số milimol A trong toàn cột

fa =m m

m m s s

[A] .V

[A] .V +[A] .V (3.3)

Biến đổi phương trình 3.3 (chia phân sôa cho [A]m.Vm ta có:

as

DA

m

1f

V1 K

V

(3.4)

Đặt ' sA DA

m

Vk K .

V , ta có A ,

A

1f

1 k

(3.5)

Trong đó ,

Ak được gọi là hệ số lưu.

Tốc độ tuyến tính của cấu tử A trong pha động, UA là:

A Au u.f hay A ,

A

uu

(1 k )

u là tốc độ tuyến tính của pha động (cm/s). Qua đó ta thấy hệ số KD và hệ

số lưu ,

Ak đều tỉ lệ nghịch với tốc độ di chuyển của chất tan.

. Thời gian lƣu tR và thời gian lƣu hiệu chỉnh tR’

Thời gian lưu tR là thời gian tính từ lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột tới

khi pic đạt giá trị cực đại.

,

ARA

A

L(1 k )Lt

u u

L/u = tm là thời gian cấu tử không lưu giữ trên cột, còn gọi là thời gian chết.

,sRA m DA m A

m

Vt t (1 K . ) t (1 k )

V (3.6)

Thời gian lưu hiệu chỉnh t’R là thời gian lưu không tính thời gian chết

t’RA = tRA – tm = tm.k’A

, ,, R RA

m m

t Vk

t V (3.7)

. Thể tích lƣu VR và thể tích lƣu hiệu chỉnh VR’

Thể tích lưu VR là thể tích của dung dịch rửa giải tính từ khi bắt đầu bơmmẫu

12

vào cột đến khi pic đạt giá trị cực đại. Gọi F là tốc độ chảy của pha động

(ml/phút). Thể tích lưu VR được tính theo công thức:

VRA = tRA.F; Vm = tm.F; thay vào 3.6 ta có

VRA = Vm(1+ K’A) (3.8)

Thể tích lưu hiệu chỉnh V’R là thể tích lưu để loại đi thể tích trống của cột.

V’RA = VR – Vm = Vm.k’A = KDA.Vs (3.9)

Thể tích lưu riêng Vg là thể tích đặc trưng riêng cho cấu tử, là thể tích dung dịch

rửa giải để rửa giải chất phân tích trong một đơn vị trọng lượng hay thể tích của

pha tĩnh.

V’RA/Vs = KDA = Vg

. Hệ số tách

Hệ số tách là đại lượng đánh giá khả năng tách 2 chất bằng phương

pháp sắc ký. Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố của chúng và là tỉ số của hệ số

phân bố của 2 chất, một chất phân tích A và một chất khác B hoặc một chất

chuẩn.

Điều kiện cần thiết để hai chất A và B tách khỏi nhau là 1 (3.10)

Nói một cách khác hệ số phân bố của hai chất A và B giữa pha tĩnh và pha động

phải khác nhau. Mặt khác từ số thể tích lưu riêng của hai chất, t’RA/t’RB cũng

chính là tỉ số của hệ số phân bố

Vậy có thể tóm tắt là: , , ,

DA A RA RA

, , ,

DB B RB RB

K k t V

K k t V

. Đĩa lý thuyết

+ Khái niệm đĩa lý thuyết

Đĩa lí thuyết là phần nào đó của cột mà ở đó cân bằng được thiết lập.

Theo quan niệm của Martin và synge, cân bằng phân bố được thiết lập nhanh

chóng, tức thời. Tuy nhiên điều này gặp khó khăn khi giải thích sự giãn rộng

vùng mẫu, hiện tượng pic sắc ký không cân đối. Amoudson và Lapidus và sau

đó là Van Deemter cho rằng đĩa được hình thành khi đạt cân bằng chuyển khối

lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại,

+ Sắc đồ và tính số đĩa lí thuyết

Sắc đồ là đường biểu diễn sự phụ thuộc diện tích S hoặc chiều cao h tín

hiệu đo được có thể là độ hấp thụ quang, cũng có thể là độ dẫn điện, hoặc tần số

xung điện…liên quan chặt chẽ tới nồng độ chất phân tích có trong mẫu và thời

gian. Các tín hiệu này được gọi là “pic” sắc ký. Định lượng các chất phân tích

dựa vào diện tích pic sắc ký là chính xác nhất. Ngày nay, hầu hết các máy sắc ký

hiện đại đều được trang bị phần mềm để tính diện tích của pic một cách tự động.

Có thể hiểu rằng phần nào đó của cột được gọi là đĩa lí thuyết khi cân

13

bằng phân bố chất phân tích tại đó được đáp ứng.

Gọi N là số đĩa lí thuyết, là độ lệch chuẩn; tỉ lệ thuận với N . Đối với

cột sắc ký N càng lớn pic càng hẹp, thời gian lưu tR tỉ lệ thuận với số đĩa lí

thuyết N, nên ta có thể viết:

Rt N

N

hay 2RtN ( )

(3.11)

Mặt khác w = 4 hay w

4

Số đĩa lí thuyết N có thể viết lại là:

2 2R R

1/2

t tN 16( ) 5,54( )

w w (3.12)

Trong sắc ký cột nhồi, số đĩa lí thuyết được tính tương đối dựa vào chiều

dài cột và chiều cao đĩa lí thuyết, H 2-3dp

. Độ phân giải

Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử ra khỏi nhau trong một phép

tách sắc ký. Hay cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để, độ phân giải

càng cao. Độ phân giải được đánh giá qua các đại lượng đặc trưng là: thời gian

lưu tRA, tRB, độ rộng pic wA, wB.

Độ phân giải R được định nghĩa: RB RA RB RA

A BA B

2(t t ) t tR

W WW W

2 2

(3.13)

Trong đó: tRB – tRA = Rt là sự chênh lệch thời gian lưu (cũng có thể dùng thể

tích lưu VRA – VRB) của hai cấu tử A và B. Đại lượng này được so sánh với tổng

bán chiều rộng pic, đo bằng giây hoặc ml nói lên khả năng tách của cột.

Khi R = 1, hai cấu tử A và B mới tách khỏi nhau đạt 95%, nghĩa là còn

2,5% của A ở trong B, 2,5% ở trong A. Khi R = 1,5 thì hai cấu tử A và B đã tách

khỏi nhau đạt 99,8% có nghĩa là còn 0,1% A ở trong B và ngược lại.

Khi tăng chiều dài cột, số đĩa lý thuyết tăng:

Rt N , chiều rộng pic tỉ lệ với N

N

RN

hay R L

Thí dụ tăng gấp đôi chiều dài cột, độ phân giải mới R’ sẽ là R’= 2R

Cách làm tăng độ phân giải

a) Dựa trên sự thay đổi cấu trúc cột:

- Tăng chiều dài cột

- Sử dụng chất nhồi có kích thước hạt nhỏ hơn, đồng đều hơn.

- Thay đổi pha tĩnh.

- Giảm đường kính cột.

14

b) Dựa trên thay đổi vận hành cột

- Tối ưu hoá tốc độ pha động.

- Giảm lượng mẫu.

- Giảm nhiệt độ (GC).

- Thay đổi thành phần pha động (LC)

1.3.2. Thuyết đĩa

* Thiết lập phƣơng trình rửa giải

Đĩa lý thuyết là một khái niệm vừa trừu tượng vừa hiện thực. Nó hiện thực ở chỗ

là một phần của cột sắc ký, tuy nhiên nó cũng trừu tượng ở chỗ không thể phân

biệt được ranh giới cụ thể của nó. Có thể định nghĩa: “đĩa lý thuyết là phần nào

đó của cột mà trên đó cân bằng phân bố được thiết lập trong quá trình tách”. Số

đĩa lý thuyết của một sắc ký thường không cố định cho một cột sắc ký nào, thậm

chí cho các phép sắc ký khác nhau trên cùng một cột.

Gọi là thuyết đĩa vì các tác giả đã xây dựng phương trình tính thể tích lưu

cho phép tách sắc ký dựa trên việc tính toán lượng chất tan có trong từng đĩa lý

thuyết. Đặt KD là hệ số phân bố, V là thể tích trống của một đĩa và Vm là thể tích

trống của toàn cột.

Gọi Sx,n là phần chất phân tích đi vào pha tĩnh, Lx,n là phần chất phân tích còn lại

ở pha động. Theo định nghĩa về hệ số phân bố ta có:

x,n

D

x,n

SK

L (3.14)

Trong đó x là số lần đưa V ml dung dịch rửa giải vào, n là số thứ tự của đĩa

Khi nạp chất phân tích

Mẫu được nạp vào đĩa số 0, tại đây, cân bằng phân bố được thiết lập:

S0,0 = KD.L0,0 (3.15)

Mặt khác do nạp chất phân tích vào cột là 1 đơn vị khối lượng, ta có:

S0,0 + L0,0 = 1 (3.16)

Thay (3.15) vào (3.16) ta có: KD.L0,0 + L0,0 = 1

Từ đó dễ dàng suy ra: 0,0

D

1L

1 K

(3.17)

Và D0,0

D

KS

1 K

(3.18)

Khi đƣa 1V ml dung dịch rửa giải vào:

Pha động của đĩa số 0 di chuyển xuống đĩa số 1.

Tại đĩa số 0:

Chất phân tích từ đĩa số 0 phân bố lại:

D1,0 1,0 0,0

D

KS L S

(1 K )

từ (3.14) ta có 1,0 D 1,0S K .L thay vào biểu thức vừa rồi

15

ta có: DD 1,0 1,0

D

KK .L L

(1 K )

suy ra:

D1,0 2

D

KL

(1 K )

;

2

D1,0 2

D

KS

(1 K )

(3.19)

Tại đĩa số 1:

Khi x = 1, toàn bộ chất phân tích ở pha động ở đĩa số 0 chuyển xuống đĩa số 1,

phân bố vào pha tĩnh và pha động, ta có

1,1 1,1 0,0

D

1S L L

(1 K )

từ (3.14) ta có 1,1 D 1,1S K .L thay vào biểu thức vừa rồi ta

có: D 1,1 1,1

D

1K .L L

(1 K )

và suy ra:

1,1 2

D

1L

(1 K )

; D

1,1 2

D

KS

(1 K )

(3.20)

Khi đƣa 2V ml dung dịch rửa giải vào:

Tại đĩa số 0:

Pha động của đĩa số 0 lại di chuyển xuống đĩa số 1 lần nữa, sau đó cân bằng tại

đĩa này lại được phân bố lại, ta có: 2

D2,0 2,0 1,0 2

D

KS L S

(1 K )

từ (3.14) ta có 2,0 D 2,0S K .L thay vào biểu thức vừa rồi ta

có: 2

DD 2,0 2,0 2

D

KK .L L

(1 K )

và suy ra:

2

D2,0 3

D

KL

(1 K )

;

3

D2,0 3

D

KS

(1 K )

(3.21)

Tại đĩa số 1:

Khi x = 2, lượng chất phân tích trong đĩa 1 gồm 2 nguồn, một là do từ đĩa số 0

chuyển xuống, và hai là do từ pha tĩnh của đĩa số 1 cân bằng lại:

D D D2,1 2,1 1,1 1,0 2 2 2

D D D

K K 2KS L S L

(1 K ) (1 K ) (1 K )

từ (3.14) ta có 2,1 D 2,1S K .L thay vào biểu thức vừa rồi ta có:

DD 2,1 2,1 2

D

2KK .L L

(1 K )

và suy ra:

D2,1 3

D

2KL

(1 K )

;

2

D2,1 3

D

2KS

(1 K )

(3.22)

Tại đĩa số 2:

Khi x = 2, toàn bộ chất phân tích ở pha động của đĩa số 1 chuyển xuống đĩa số 2,

phân bố vào pha tĩnh và pha động, ta có:

2,2 2,2 1,1 2

D

1S L L

(1 K )

16

từ (3.14) ta có 2,2 D 2,2S K .L thay vào biểu thức vừa rồi ta có:

D 2,2 2,2 2

D

1K .L L

(1 K )

và suy ra:

2,2 3

D

1L

(1 K )

; D

2,2 3

D

KS

(1 K )

(3.23)

Tính toán tương tự cho các đĩa tiếp theo lượng chất trong pha động có kết quả

như ở bảng sau:

Bảng 1.1. Giá trị của Lx,n

n = 0 n = 1 n = 2 n = 3 n = 4 n = 5

x = 0

D

1

1 K

x = 1 D

2

D

K

(1 K ) 2

D

1

(1 K )

x = 2 2

D

3

D

K

(1 K )

D

3

D

2K

(1 K )

3

D

1

(1 K )

x = 3 3

D

4

D

K

(1 K )

2

D

4

D

3K

(1 K ) D

4

D

3K

(1 K ) 4

D

1

(1 K )

x = 4 4

D

5

D

K

(1 K )

3

D

5

D

4K

(1 K )

2

D

5

D

6K

(1 K ) D

5

D

4K

(1 K ) 5

D

1

(1 K )

x = 5 5

D

6

D

K

(1 K )

4

D

6

D

5K

(1 K )

3

D

6

D

10K

(1 K )

2

D

6

D

10K

(1 K ) D

6

D

5K

(1 K ) 6

D

1

(1 K )

x = 6 6

D

7

D

K

(1 K )

5

D

7

D

6K

(1 K )

4

D

7

D

15K

(1 K )

3

D

7

D

20K

(1 K )

2

D

7

D

15K

(1 K ) D

7

D

6K

(1 K )

x = 7 7

D

8

D

K

(1 K )

6

D

8

D

7K

(1 K )

5

D

8

D

21K

(1 K )

4

D

8

D

35K

(1 K )

3

D

8

D

35K

(1 K )

2

D

8

D

21K

(1 K )

Phương trình tổng quát tính lượng chất phân tích cho một đĩa bất kỳ như sau:

Sx,n + Lx,n = Sx-1,n + Lx-1,n-1 (3.24)

x n 1

Dx,n x 1

D

Kx!S .

(x n)!n! (1 K )

(3.25)

x n

Dx,n x 1

D

Kx!L .

(x n)!n! (1 K )

(3.26)

Điều kiện x n , nếu x < n thì Lx,n = 0; Sx,n = 0

Khi x tăng, Lx,n sẽ qua giá trị cực đại sau đó giảm dần tới 0. Trong sắc ký, số

đĩa lý thuyết thường rất lớn. Giá trị Lx,n tại cực đại được ký hiệu là Lx*,n sẽ

không khác nhau nhiều so với Lx-1,n. Ta có thể viết:

Lx*,n = Lx*-1,n. Giá trị của n rất lớn, như vậy, giá trị của Lx*,n được viết lại là:

17

* *

* ** *

x n x 1 n* *

D D

* *x ,n x 1,nx 1 x

D D

K Kx ! (x 1)!L . L .

(x n)!n! (x 1 n)!n!(1 K ) (1 K )

Nhân cả hai vế của phương trình trên với phân số: *

*

x*

D

* x 1 n

D

(1 K )(x 1 n)!n!.

(x 1)! K

ta có:

* *

* *

x n x* * *

D D D

* * *x n x 1 nDD D

K (1 K ) Kx ! (x 1 n)!n! x. . . . 1

(x n)!n! (x 1)! x n 1 K(1 K ) K

* *

D Dx .K (x n).(1 K ) ; rút ra được: x* = n(1+KD) (3.27)

x*.V = VR là lượng dung dịch tại cực đại của đường cong rửa

n.V = Vm là thể tích trống của cột. Nhân phương trình (3.27) với V ta có phương

trình quan trọng để giải thích quá trình sắc ký:

VR = Vm(1+KD) (3.28)

1.3.3. Thuyết tốc độ, phƣơng trình Van Deemter

Sự giãn rộng vùng mẫu

Theo thuyết này, yếu tố tốc độ của pha động có vai trò cực kỳ quan trọng đối với

hiệu quả tách sắc ký. Sự giãn rộng vùng mẫu mà nguyên nhân sâu xa là hệ số

khuếch tán của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh bị ảnh hưởng nhiều

bởi tốc độ pha động. Ngoài ra, đường kính hạt nhồi, kỹ thuật nạp cột..., cũng ảnh

hưởng rất nhiều tới sự giãn rộng vùng chất phân tích, ảnh hưởng tới độ rộng của

pic thu được trong sắc đồ. Các tác giả đưa ra đại lượng đặc trưng cho độ giãn

rộng của vùng chất phân tích là chiều cao đĩa lý thuyết, H. Chiều cao đĩa lý

thuyết được cấu thành do 3 yếu tố H1, H2, H3 là 3 đại lượng độ giãn rộng thành

phần.

H = H1 + H2 + H3 (3.29)

H1 là đại lượng khuếch tán xoáy, đặc trưng cho độ đồng đều của hạt nhồi,

đường kính hạt nhồi, khả năng nạp cột, được viết:

1 pH 2 d (1.30)

trong đó là hệ số nạp cột, nếu nạp cột tốt, = 1,5; pd là đường kính hạt nhồi

H2 là đại lượng khuếch tán theo chiều dọc. Nó được hình thành do sự

khuếch tán của chất phân tích về hai đầu của cột, phụ thuộc vào tốc độ của pha

động, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động, đường đi của chất

phân tích, được biểu diễn bằng phương trình:

H2 = B/u

Trong đó mB 2 D là đại lượng đặc trưng cho hệ số khuếch tán của chất

phân tích trong pha động và hệ số đường đi của nó. Trong điều kiện nạp cột tốt,

18

đường đi của chất phân tích không quá khúc khuỷu, 1 ; Dm là hệ số khuếch

tán của chất phân tích trong pha động, như vậy, H2 có thể viết là:

2 mH 2 D / u (1.31)

H3 là đại lượng đặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng, là yếu tố phụ thuộc

nhiều vào tốc độ hấp thụ và giải hấp. Quá trình này phụ thuộc vào cả pha tĩnh và

pha động vì vậy H3 có thể viết:

3 s mH (C C )u (1.32)

trong đó Cs là hệ số đặc trưng cho sự chuyển khối của chất phân tích trong pha

tĩnh phụ thuộc vào pha tĩnh, nó có giá trị nhỏ, khi tốc độ dòng,

sF 1ml / phút, C 0 .

2

s f sC K.d / D (1.33)

K – là hệ số.

Ds – là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha tĩnh.

2

fd - là chiều dày pha tĩnh.

Cm là hằng số đặc trưng cho sự chuyển khối của chất phân tích trong

pha động, phụ thuộc vào pha động,

2

m p mC d / D (1.34)

là hệ số thực nghiệm, có giá trị 0,5-1

mD là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động.

Tổng hợp lại, H có biểu thức tổng quát là:

2 2

p m f s p mH 2 d 2 D / u (K.d / D d / D )u (1.35)

Phương trình (1.35) thường được viết tắt là

H = A + B/u + Cu

Trong thực tế có thể tính gần đúng pH 3 4d

Để xét cực tiểu chiều cao đĩa lý thuyết, lấy đạo hàm phương trình Van Deemter,

ta có: ' 2H B/ u C. Tại cực tiểu, 'H 0 hay 2B/ u C 0 u2

t.ư=B/C

u2

t.ư= (B/C)1/2

(1.36)

Hmin = A + 2.(B/C)1/2

(1.37)

19

Hình 1.3. Đường cong Van Deemter

Ngoài ra còn có các yếu tố làm giãn rộng vùng mẫu do nguyên nhân ở

ngoài cột như thể tích pha động giữa đầu ra cột sắc ký và detector lớn, thể tích

mẫu bơm vào cột lớn, lượng mẫu lớn…

Vì mục đích và phạm vi nghiên cứu của luận văn đã được trình bày ở trên

nên chúng tôi sẽ giới thiệu chi tiết hơn về sắc ký lớp mỏng (thin layer

chromatography), sắc ký giấy (paper chromatography) và sắc ký hấp phụ lỏng

trên cột (Adsorption liquid chromatography on columns)

1.4. Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography) [15, 18]

Sắc ký lớp mỏng hay còn gọi là sắc ký phẳng là kỹ thuật phân bố rắn –

lỏng. Trong đó pha động là chất lỏng được đi xuyên qua một lớp chất hấp thụ trơ

như silicagel hoặc nhôm oxit, chất hấp thụ này được tráng thành một lớp mỏng,

đều phủ lên một nền phẳng như tấm kính, tấm nhôm, hoặc tấm plastic. Do chất

hấp thụ được tráng thành lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp

mỏng (hay sắc ký lớp mỏng). Trước đây Sắc ký lớp mỏng chủ yếu dùng trong

phân tích định tính, nhưng đến nay đã áp dụng sang cả phân tích định lượng do

những tiến bộ của kỹ thuật làm tăng tính lặp lại và độ chính xác. Hệ số di

chuyển Rf là đại lượng đặc trưng quan trọng về mức độ tách. Hệ số di chuyển Rf

được tính theo công thức:

0

fl

lR hoặc

0

fv

vR

20

Hình 1.4. Cách xác định giá trị Rf.

Trong đó l là khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tâm vệt sắc ký, lo là

khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tuyến dung môi, v là tốc độ di chuyển của

chất tan và vo là tốc độ của dung môi. Như vậy Rf chỉ có giá trị từ 0 đến 1. Khi

Rf = 0 thì chất tan hoàn toàn không di chuyển, còn khi Rf = 1 thì chất tan di

chuyển bằng tốc độ của dung môi.

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến Rf nhưng quan trọng là:

+ Chất lượng và hoạt tính chất hấp thụ

+ Bề dày của lớp mỏng

+ Chất lượng và độ tinh khiết của pha động

+ Độ bão hoà của dung môi trong bình sắc ký

+ Lượng mẫu đưa lên bản mỏng

1.4.1. Các chất hấp thụ dùng trong sắc ký lớp mỏng

Trong sắc ký lớp mỏng thông thường người ta dùng các chất hấp thụ sau:

, nhôm oxit, xenlulozơ, tinh bột, nhựa trao đổi ion… ngoài ra còn dùng các chất

hấp thụ biến tính khác

Bảng 1.2. Các chất hấp thụ thƣờng dùng trong sắc ký lớp mỏng

Chất hấp thụ Hoạt năng Cơ chế Công dụng

Silicagel Có hấp thụ và phân bố Cho tất cả các hợp chất

Nhôm oxit Có Phân bố steroit

Magie photphat yếu hấp thụ Carotenoit, tocopherol

Canxi hiđroxit yếu hấp thụ tocopherol

Canxi sunfat yếu hấp thụ tocopherol

sắt(III)hiđroxit Có hấp thụ Chất phân cực

Than hoạt tính Có hấp thụ chất không phân cực

21

1.4.2. Dung môi khai triển và thuốc thử hiện màu

Ứng với mỗi loại hợp chất phân tích khác nhau sẽ có một số hệ dung môi

và thuốc thử khác nhau, sau đây là một số hệ dung môi và thuốc thử trong

SKLM các hợp chất tự nhiên

Bảng 1.3. Một số hệ dung môi và thuốc thử trong SKLM các hợp chất tự

nhiên

hợp

chất

chất hấp

thụ

hệ dung môi thuốc thử hiện

màu

Ankaloit SiO2G CHCl3-MeOH (9:1)

CHCl3-axetol-MeOH-NH3

(20:20:3:1)

CHCl3-EtOAC-MeOH (20:201)

Benzen-ETOAC-dietylamin

(7:2:1)

hơi I2

Saponin SiO2G n-butan-ACOH-H2O (4:1:5)

n-butan-EtOH-NH4OH (7:2:5)

CHCl3-MeOH-H2O (61:32 : 7)

EtOAC-MeOH-H2O (100 :17

:13)

CHCl3-MeOH (9 :1) Genin

Vanillin | H3PO4

SbCl3 | CHCl3

H2SO4

Caroten SiO2G Ete dầu hoả – toluen – axeton

(45: 1: 5)

Hơi I2

Tinh dầu SiO2G Benzen EtOAC (95 :5)

Benzen MeOH (95: 5)

I2, H2SO4, H3PO4

Tanin SiO2G EtOAC-MeOH-H2O (100 :17

:13)

Toluen-MeOH-H2O (4 :3:1)

FeCl3

Flavonit SiO2G Toluen – Etyl fomiat – axit

formic (5:4:1)

MeOH

10%(H2O)

sắc tố lá

cây

CaCO3 Ete petrol

1.5. Sắc ký giấy (paper chromatography) [15, 19]

Là một phương pháp sắc ký dùng giấy hấp thụ để phân tích một lượng nhỏ chất

lỏng mang (chất hoà tan) và lấy ra khi vạch chất hoà tan tiến gần đến đầu kia của

một băng giấy. Trong quá trình sắc ký các cấu tử được tách dọc theo lớp mỏng

22

của tờ giấy. Đặc trưng cho sự chuyển động của các chất trên giấy là hệ số di

chuyể Rf như sau:

0

fl

lR ; hoặc Rf = tốc độ chuyển động của một cấu tử/ tốc độ chuyển

động của tuyến pha động

Trong đó l là đoạn đường đi của cấu tử, lo là đoạn đường đi của dung môi. Nếu

Rf lớn quá thì không tách được các chất, Rf bé quá thì tách chậm.

1.5.1. Kỹ thuật tiến hành sắc ký giấy

Có các phương pháp sắc ký giấy như sau: một chiều, hai chiều, vòng và

điện di. Tuy nhiên do mục đích nghiên cứu đã trình bày nên ở đề tài này tôi xin

phép chỉ trình bày sắc ký một chiều đi lên.

A. Sắc đồ một chiều đi lên

Sắc ký một chiều đi lên là phương pháp đơn giản nhất. Dùng mao quản

hoặc micropipet chấm một giọt dung dịch mẫu lên phần đuôi giấy cách mép một

khoảng nhất định. Nếu pha tĩnh là nước thì giấy không phải xử lý đặc biệt, vì

giấy trong không khí đã chứa một lượng nước khá đủ (20 – 22%). Rót pha động

đã được bão hoà trước bằng pha tĩnh vào bình sắc ký (xi lanh hoặc ống nghiệm).

Nhúng mép dưới giấy vào pha động, trên mép treo để giấy buông tự do xuống

dưới. Đậy bình và để vào nơi điều hoà nhiệt, dao động của nhiệt độ trong suốt

quá trình sắc ký không nên quá 2oC. Nhờ lực hút mao quản, chất lỏng được

thấm lên theo giấy và các cấu tử được tách thành vùng riêng do các chất chuyển

động với tốc độ khác nhau. Khi tuyến dung môi đạt tới chiều cao nhất định,

thường cách mép trên của băng giấy 1 cm, thì lấy giấy ra, sấy khô giấy và hiện

sắc đồ. Vì kết quả tách Rf phụ thuộc vào lượng chất đưa lên giấy, thường lấy

không quá 0,001 – 0,005 ml. Chiều rộng băng giấy cho một giọt là 2 – 5 cm.

Chiều dài băng phụ thuộc vào điều kiện tách.

1.5.2. Giấy sắc ký

Các yêu cầu đối với giây sắc ký như sau: tinh khiết hoá học, trung tính về

phương diện hoá học hấp phụ, đồng nhất về tỉ trọng, bảo đảm cho dung môi

chuyển động với tốc độ nhất định.

Để có giấy tinh khiết hoá học, xử lý giấy lọc thường bằng các tác nhân

khác nhau, ví dụ axit amino axetic, 8-oxiquinonlin v.v để tạo phức tan với các

ion vô cơ có trong giấy. Sau đó rửa bằng dung môi để loại hết tạp chất vô cơ ra

khỏi giấy. Có thể dùng giấy lọc lọai mịn, giấy vatmam…

Để đặc trưng cho giấy dùng khối lượng 1m2 (tính theo gam). Chiều dày

(mm), chiều cao nước thấm lên một đơn vị thời gian (cm/h) và chiều cao thấm

của hỗn hợp ancol n-butylic, axit axetic, nước theo tỉ lệ 4:1:5 trong một đơn vị

23

thời gian. Để tách tốt cần chú ý hướng sợi giấy trùng với hướng chuyển động

của dung môi. Giấy sắc ký phải chứa một lượng pha tĩnh cần để tách các chất.

Các loại giấy thường là hyđrophyl ưa nước. Do đó nếu dùng nước làm

pha tĩnh không cần phải làm ẩm.

Để tách hỗn hợp các chất hữu cơ không tan trong nước cần chuyển giấy từ

ưa nước thành kị nước theo cách tẩm bằng các chất kị nước khác nhau và axetyl

hoá.

Tẩm giấy bằng dung dịch parafin 1% trong ete dầu hoả dung dịch cao su

0,5% trong bezen, dung dịch dầu thực vật sạch 1- 2% trong ete etylic. Kiểm tra

độ kị nước của muối sau khi tẩm dung môi nói trên: cho bay hơi bằng một giọt

nước. Nếu giọt nước trượt theo tờ giấy, không bị thấm là tốt. Giữ giấy trong

bình kín bão hoà hơi dung môi sẽ làm pha tĩnh.

Axetyl hoá giấy bằng cách xử lí giấy bằng hỗn hợp 90ml axit axetic, 10ml

ete dầu hoả và 8 – 10 giọt H2SO4 đặc. Nhúng giấy vào hỗn hợp axetyl hoá này

trong 45 phút, sau đó lấy ra, rửa cẩn thận bằng dòng nước trong 15 phút, ngâm

trong nước cất 10 – 15 phút, rửa và sấy. Kiểm tra độ kị nước của giấy như trên.

Phương pháp thu sắc đồ trên giấy kị nước dùng để tách các hỗn hợp các

chất không tan trong nước gọi là phương pháp pha biến tính. Trong trường hợp

này pha tĩnh là dung môi không phân cực, còn pha động là dung môi phân cực.

1.5.3. Dung môi trong sắc ký giấy

Chọn đúng pha tĩnh và pha động là yếu tố quan trọng nhất để tách các

chất trong sắc ký giấy. Khả năng tách phụ thuộc vào sự khác nhau của hệ số

phân bố (Kp)các cấu tử giữa hai pha lỏng. Pha lỏng phải đạt được những yêu cầu

sau:

+ Hai chất không được trộn lẫn vào nhau

+ Các cấu tử phải có độ tan trong dung môi làm pha động nhỏ hơn trong

dung môi làm pha tĩnh. Độ tan của chất trong dung môi làm pha động phải vừa

đủ. Nếu lớn quá chất sẽ chuyển động theo tuyến của dung môi động, nếu bé quá

chất sẽ gần như ở tuyến xuất phát;

+ Độ tan, hệ số phân bố của các cấu tử phải khác nhau đối với cặp dung

môi đã chọn;

+ Thành phần dung môi trong quá trình sắc ký giấy, phải không biến đổi;

+ Dung môi phải dễ loại khỏi giấy và không độc với người.

+ Đối với các chất tan trong nước, dùng dung môi hữu cơ bão hoà nước

làm pha động, dùng nước làm pha tĩnh. Đối với các chất không tan trong nước

phải sắc ký bằng dung dịch nước của các chất hữu cơ, dùng các chất hữu cơ

không phân cực làm pha tĩnh.

24

1.5.4. Ứng dụng của sắc ký giấy

Sắc ký giấy được ứng dụng khá rộng rãi điển hình là:

- Phân tích để xác định hệ số phân bố của các chất trước khi chọn phương pháp

tách sắc ký một hỗn hợp nào đó.

- Phân tích định tính hỗn hợp các cation.

- Phân tích định lượng một số axit hữu cơ.

- Phân tích định lượng glucozơ trong dung dịch.

- Phân tích định lượng hàm lượng nhựa trong các sản phẩm dầu mỏ.

- Phân tích định tính và định lượng các axit amino.

1.6. Sắc ký hấp phụ lỏng trên cột (Adsorption liquid chromatography on

columns) [15, 19]

1.6.1. Nguyên tắc của sắc ký hấp phụ lỏng

Phương pháp sắc ký hấp phụ lỏng dựa trên tính chất hấp phụ khác nhau của các

cấu tử trong hỗn hợp cần tách. Giữa nồng độ chất trong dung dịch và nồng độ

chất bị hấp phụ trên bề mặt chất hấp phụ có một cân bằng động, cân bằng đó

phụ thuộc vào nhiệt độ. Sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp thụ vào nồng độ của

nó trong dung dịch ở một nhiệt độ không đổi được đặc trưng bởi đường đẳng

nhiệt hấp phụ. Căn cứ vào đường đẳng nhiệt hấp phụ ta có thể chọn được điều

kiện sắc ký thích hợp.

Theo thuyết Langmuir có hai giả thiết: 1) trên bề mặt chất hấp phụ có

những trung tâm hoạt động, trường lực tự do của chúng có thể hút các phân tử

khí hoặc chất tan trong dung dịch; 2)chỉ một lớp đơn phân tử tạo thành trên bề

mặt chất rắn do các phân tử đó làm mất trường lực của chất hấp phụ. Mặt khác

các phân tử bị hấp phụ lại có thể được giải phóng trở lại môi trường xung quanh

(bay hơi hoặc giải hấp). Kết quả là cân bằng được thiết lập giữa chất hấp phụ và

môi trường xung quanh, nghĩa là tốc độ hấp phụ (dính) và tốc độ giải hấp (nhả)

bằng nhau.

Trước khi bị hấp phụ, phân tử chuyển động tự do và phải va chạm vào bề

mặt chất hấp phụ và dính vào chỗ trống (chỗ bề mặt chưa bị hấp phụ). Vì số lần

va chạm tỷ lệ với nồng độ chất trong dung dịch C, còn xác suất rơi vào chỗ

trống tỉ lệ với diện tích trống nên tốc độ quá trình hấp phụ Uh được biểu diễn bởi

phương trình:

Uh = k1C(1-fs) (1)

Trong đó: k1 là hằng số

fs là phần chỗ đã bị chiếm trên bề mặt chất hấp phụ

1-fs là phần chỗ trống.

25

Tốc độ quá trình giải hấp Ug tỉ lệ với số phân tử bị hấp phụ, nghĩa là tỉ lệ

với diện tích bề mặt bị chiếm:

Ug = k2fs (2)

Trong đó k2 là hằng số.

Khi hệ đạt tới trạng thái cân bằng, ta có Uh = Ug:

k1C(1-fs) = k2fs (3)

Giải phương trình (3) theo fs và đặt k = k1/k2 ta có

fs = kC1

kC

(4)

Nếu gọi q là lượng chất cực đại có thể bị hấp phụ (tỉ lệ với bề mặt chất

hấp phụ) và q là lượng chất bị hấp phụ ở một nồng độ nào đó (tỉ lệ với diện tích

bị chiếm), ta có kC1

kCqq

(5).

Đây là phương trình đẳng nhiệt hấp phụ Langmuir, có dạng như hình vẽ

dưới đây

Hình 1.5. Đường đẳng nhiệt hấp phụ Langmuir

Qua phương trình và hình vẽ ta thấy sự hấp phụ có giới hạn, nghĩa là khi

tăng nồng độ quá giới hạn nào đó, lượng chất bị hấp phụ không tăng lên nữa

(đoạn nằm ngang trên hình).

phương trình Langmuir giải thích được đa số các trường hợp hấp phụ khí,

lỏng cũng như chất tan trong dung dịch. Tuy nhiên, sự hấp phụ trong dung dịch

xảy ra phức tạp hơn nhiều do lượng dung môi thường rất lớn so với chất tan. Do

đó sự hấp phụ xảy ra ít nhất với hai loại phân tử: dung môi và chất tan. Khi bị

hấp phụ dung môi làm giảm khả năng hấp phụ chất tan. Do đó trong sắc ký cần

chọn dung môi nào bị hấp phụ kém nhất đối với chất hấp phụ dùng. Khi xác

định đường đẳng nhiệt hấp phụ của các chất phải tiến hành trong cùng một loại

dung môi. Dạng đường đẳng nhiệt hấp phụ trong dung dịch bị sai lệch, khác với

đường hấp phụ đẳng nhiệt thông thường, bó có hình chữ S, nghĩa là lượng chất

26

bị hấp phụ tăng theo nồng độ chất trong dung dịch, vì các phân tử bị hấp phụ

trên bề mặt lại có thể làm phân cực các phân tử trong dung dịch hấp phụ chúng.

Kết quả tạo thành hấp phụ nhiều lớp. Như vậy, muốn chọn đúng điều kiện tách

sắc ký phải biết đường đẳng nhiệt hấp phụ của mỗi cấu tử trong hỗn hợp. Có thể

dùng phương pháp sắc ký để xác định các đường đẳng nhiệt hấp phụ đó. Trong

sắc ký hấp phụ lỏng trên cột thì phương pháp rửa giải có ứng dụng rộng rãi nhất.

Giả sử tiến hành phân tích rửa giải một cấu tử. Sau khi đưa mẫu vào cột ta

thu được sắc đồ sơ cấp

Hình 1.6. Sơ đồ phân bố chất trên cột chất hấp phụ (sắc đồ) với trường

hợp đường đẳng nhiệt hấp phụ phi tuyến tính (a, b) và tuyến tính (c)

Trong vùng đó nồng độ chất không đổi và nồng độ cân bằng trong dung

dịch là Co. Lượng chất bị hấp phụ trên một đơn vị chiều dài cột là mf(Co), trong

đó m là khối lượng chất hấp phụ trên một đơn vị chiều dài, còn f(Co) là hấp phụ

năng riêng (lượng chất bị hấp phụ bởi một đơn vị khối lượng chất hấp phụ) ứng

với nồng độ dung dịch Co. Ở tuyến trước, nồng độ tụt xuống không (dốc thẳng

đứng).

Nếu Vo

1là thể tích pha lỏng trên một đơn vị chiều dài cột thì tổng lượng chất có

trong một đơn vị chiều dài cột là )C(mfC o

o

1V . Sau khi cho qua cột một thể tích

dung môi rửa giải Vr , vùng dịch chuyển một đoạn :

o

oo

1

r

oo

o

1

or

C

)C(mf

V

)C(mfC

CV

VV

(19)

27

Như vậy khi cho thể tích dung môi V, tuyến trước của chất chuyển dịch một

đoạn là L:

o

oo

1 C

)C(fm

VL

V

(20)

nếu hệ lý tưởng tuyến tính, toàn bộ vùng một được dịch chuyển y nguyên. Trong

trường hợp đường hấp phụ đẳng nhiệt “lồi”, nghĩa là f(Co) bị biến đổi theo Co,

lúc đó mức độ chuyển dịch L sẽ tính theo công thức:

)C('mf

VL

Vo

1

*

(21)

Vì f’(C)>o

o

C

)C(f (do đường cong lồi) nên XL* , nghĩa là vùng nồng độ nhỏ sẽ

chuyển động chậm hơn. Kết quả là sắc đồ bị kéo dài đuôi (hình 4, vùng II). Khi

cho dung môi qua càng nhiều (V càng lớn), nồng độ chất bị giảm xuống và đuôi

kéo dài hơn (hình 4, vùng III).

Đối với trường hợp đường đẳng nhiệt hấp phụ “lõm” (thực tế rất ít gặp) sắc đồ

có dạng ngược lại, phía trước là mũi nhọn và đuôi bằng. Còn khi đường đẳng

nhiệt hấp phụ tuyến tính, sự phân bố chất gần như đối xứng (hình 4, c).

Theo các công thức ở trên, chất cùng bị hấp phụ, nghĩa là đường đẳng nhiệt hấp

phụ càng dốc, chất chuyển động càng chậm. Chính vì thế khi rửa giải cột chứa

một số chất bị hấp phụ chúng sẽ được giải hấp với những tốc độ khác nhau và

nếu cột đủ dài ta có thể thu được từng chất riêng.

Vấn đề tốc độ hấp phụ và giải hấp cần được đặc biệt chú ý như đã nói trong

phương trình Van Deemter. Phải chọn tốc độ tối ưu đối với dung môi rửa giải để

đảm bảo thiết lập cân bằng hấp phụ, đồng thời giảm độ khuếch tán dọc.

1.6.2. Ứng dụng của sắc ký hấp phụ lỏng

Sắc ký hấp phụ lỏng có nhiều ứng dụng điển hình là:

- Xác định hấp phụ năng của silicagel.

- Xác định hiđrocacbon thơm trong keroxin.

- Tách hỗn hợp parafin – naphten lấy được từ keroxin.

- Tinh chế clobenzen và xác định hàm lượng FeCl3.

- Xác định các ancaloit trong beladon.

- Tách các picmen lá xanh.

1.7. Khái quát về chất diệp lục (chlorophyl) và carotenoit (xanthophyl và

caroten) [5, 9, 16]

1.7.1. Chất diệp lục (diệp lục tố, chlorophyl)

Là sắc tố quang tổng hợp màu xanh lá cây có ở thực vật, tảo, vi khuẩn

lam. Từ này có nguồn gốc Hán-Việt: "diệp" là lá, "lục" là xanh. Đây là nhóm sắc

tố có vai trò quan trọng nhất đối với quang hợp, vì nó có khả năng hấp thụ trực

tiếp ánh sáng và biến năng lượng hấp thụ được (năng lượng vật lí) thành năng

lượng dự trữ trong các hợp chất hữu cơ (năng lượng hoá học). Các nhóm sắc tố

khác không làm được chức năng đầy đủ và trực tiếp như vậy.

Có 5 loại chlorophyl là chlorophyl a, b, c1, c2 và d (có tài liệu chia thành

chlorophyl a,b,c,d và e) nhưng sự khác nhau giữa chúng chỉ ở một số chi tiết về

28

cấu tạo và sau đó là về điểm cực đại trong quang phổ hấp thụ ánh sáng.

Chlorophyl c1và c2 chỉ có ở các loại tảo khác nhau, chlorophyl d chỉ có ở vi

khuẩn lam, còn chlorophyl a và b có ở các thực vật bậc cao nên rất phổ biến, ở

luận văn này ta chỉ xem xét kỹ chlorophyl a và b.

Về cấu tạo chung của chlorophyl, ta chú ý đến các đặc điểm sau:

phân tử chlorophyl có 4 nhân pyron liên kết với nhau bằng các cầu nối (-

CH = ) để tạo nên vòng porphyrin có nguyên tử Mg ở giữa liên kết với 4 nguyên

tử N của các nhân pyron, có hai nguyên tử H ở nhân pyron thứ tư, nhân này nối

với gốc rượu phyton và có vòng cyclopentan ở nhân pyron thứ ba với một

nguyên tử oxi.

Sau đây là công thức của chlorophyl a và chlorophyl b:

- Công thức của chlorophyl a (C55H72O5N4Mg)

- Công thức của chlorophyl b: (C55H70O6N4Mg)

Diệp lục b chỉ khác diệp lục a là nhóm CH3 ở nhân pyron thứ hai được

thay bằng nhóm CH=O.

a. Chlorophyl không tan trong nước, chỉ tan trong các dung môi hữu cơ.

Vì vậy khi muốn tách chlorophyl ra khỏi lá, bắt buộc phải dùng một dung môi

hữu cơ như: ete, cồn, benzen hay axeton, …

b. Chlorophyl là este của axit dicacboxilic:

C32H30ON4Mg(COOH)2 với hai loại rượu là phyton: C20H39OH và metanol:

CH3OH, nên công thức của chlorophyl có thể viết như sau:

COOCH3

C32H30ON4Mg

COOC20H39

và khi tác dụng với bazơ sẽ xảy ra phản ứng xà phòng hoá tạo thành muối

chlorophylat vẫn có màu xanh. Ngược lại khi tác dụng với axit thì Mg bị H thay

29

thế và hình thành một hợp chất kết tủa có màu nâu pheophytin. Nếu cho

pheophytin tiếp tục tác dụng với một kim loại khác thì kim loại này lại thay thế

vị trí của Mg và tạo thành một hợp chất cơ-kim (hữu cơ - kim loại) có màu xanh

rất bền.

c. Sự mất màu của chlorophyl:

Chlorophyl a có màu xanh lam, còn chlorophyl b có màu xanh vàng.

Chlorophyl trong tế bào không bao giờ bị mất màu, trừ trường hợp bị phân huỷ

trong quá trình hoá già của cơ quan, cơ thể. Bởi vì chlorophyl nằm trong phức

hệ cấu trúc chặt chẽ với protein và lipoit. Nhưng dung dịch chlorophyl ngoài ánh

sáng và trong môi trường có O2 thì sự mất màu xảy ra do chlorophyl bị oxi hoá

dưới tác dụng của ánh sáng:

Chlorophyl + h => Chlorophyl* (trạng thái kích thích)

Chlorophyl* + O2 > ChlorophylO2 (trạng thái oxi hoá, mất màu).

e. Quang phổ hấp thụ của chlorophyl

Trong bước sóng ánh sáng nhìn thấy (400 nm - 700 nm), có hai vùng hấp

thụ của chlorophyl: vùng xanh tím (430 nm) và vùng đỏ (680nm). Màu xanh đặc

trưng của chlorophyl và cũng là màu xanh của lá cây chính là kết quả của sự hấp

thụ hai vùng quang phổ xanh tím và đỏ này. Vì phổ ánh sáng nhìn thấy (ánh

sáng trắng) gồm các vùng ánh sáng: đỏ, da cam, vàng, lục, lam, chàm, tím. Các

sắc tố của lá cây hấp thụ các vùng ánh sáng ở đầu và cuối của phổ ánh sáng nhìn

thấy để lại ánh sáng vùng lục không hấp thụ (phản xạ hoặc xuyên qua). Ánh

sáng màu lục đập vào mắt ta khi ta nhìn vào lá cây và thấy lá cây có màu xanh

lục.

f. Chlorophyl tham gia trực tiếp vào quá trình quang hợp

Năng lượng tích luỹ được bởi chlorophyl khi hấp thụ ánh sáng được

chuyển trực tiếp cho các phản ứng quang hoá để quang phân li H2O giải phóng

O2, H+ và electron và sau đó hình thành 2 sản phẩm vô cùng quan trọng của pha

sáng là ATP và NADPH.

1.7.2. Carotenoit

Đây là nhóm sắc tố có các màu từ vàng đến tím đỏ. Chúng được cấu tạo

theo mạch nối đôi không nhánh, gồm 40 nguyên tử C và 56 nguyên tử hidro

(C40H56).

Nhóm carotenoit được chia thành 2 nhóm nhỏ theo cấu trúc hoá học: Caroten và

xanthophyl

* Caroten - C40H56 là một hiđrocacbon chưa bão hoà, không tan trong nước mà

chỉ tan trong các dung môi hữu cơ. Công thức cấu tạo gồm một mạch cacbon dài

gồm 8 gốc izopren và hai đầu là một hoặc hai vòng ionon. Trong thực vật

30

thường có 3 loại caroten: anpha, beta, gama caroten. Caroten có màu vàng da

cam. Cắt đôi phân tử beta caroten ta được hai phân tử vitamin. Bước sóng hấp

thụ cực đại của caroten ở 446 - 467 nm.

- Công thức cấu tạo của alpha caroten(C40H56):

- Công thức cấu tạo của beta caroten(C40H56):

- Công thức cấu tạo của gama caroten(C40H56):

* Xanthophyl - C40H56On (n = 1- 6) là dẫn xuất (dạng oxi hoá) của caroten.

Các nguyên tử oxi liên kết trong các nhóm: hidroxy, cacboxy, axetoxy, metoxy,

epoxy,…Vì oxi từ 1 đến 6 nên có nhiều loại xanthophyl ví dụ:

+ Cripthoxanthin (C40H56O)

+ Lutein (C40H56O2)

+ Violaxanthin (C40H56O4)

31

+ Neoxanthin (C40H56O4)

Bước sóng hấp thụ của cực đại của xanthophyl ở 451 - 481 nm.

Người ta còn phân chia nhóm carotenoit thành hai nhóm nhỏ theo tính chất sinh

học:

Sự phân cực của diệp lục a, diệp lục b, caroten và xanthophyl

Màu sắc và mức độ phân cực của phân tử các chất đó tăng dần theo thứ tự

từ trên xuống như sau:

Bảng 1.4. Màu sắc và thứ tự phân cực của các loại diệp lục, caroten và

xanthophyl

chất màu sắc

caroten vàng

pheophytin màu xanh lá cây ô liu

chất diệp lục a màu xanh xanh

chất diệp lục b màu vàng xanh

lutein màu vàng

violaxanthin màu vàng

neoxanthin màu vàng

1.7.3. Các phƣơng pháp sắc ký đã dùng để tách các diệp lục và carotenoit

- Theo [15, 18] Năm 1903 nhà thực vật học người Nga Mikhail Tswett

(Mikhail Semyonovich Tsvet) đã tách các chất màu thực vật bằng sắc ký cột với

pha tĩnh là bột CaCO3, pha động là dung dịch các sắc tố thực vật trong ete dầu

hỏa.

- Theo [15] có thể tách các chất màu thực vật trong lá xanh bằng sắc ký

cột với pha tĩnh là bột CaCO3 hoặc bột đường, chiết mẫu bằng hỗn hợp xăng ben

32

- zen (tỉ lệ thể tích 9:1), rửa cột bằng hỗn hợp xăng-benzen (tỉ lệ thể tích 10:1).

Picmen sẽ thành 3 vùng màu vàng là carotenoit, màu xanh chlorophyl a và màu

xanh vàng là chlorophyl b.

- Theo [16] dùng sắc ký giấy với dung môi là ete dầu hoả tách được:

clorophin b, clorophin a, xanthophyl, caroten (theo thứ tự từ dưới lên). Trong

thời gian 20-30 phút.

- Theo [12] cho mẫu chiết từ lá, hoa hoặc quả các thực vật bằng n – hexan

chạy HPLC với hệ dung môi (gồm axeton nitrin : metanol :

clorofoc = 70 : 27 : 3) tách và xác định được hàm lượng các carotenoit: beta-

caroten, lutein, lycopen.

- Theo [24] có thể tách các chất màu ở lá xanh bằng SKLM với pha động

là hỗn hợp 100 ml ete dầu hoả, 11ml isopropanol và 5 giọt nước.

- Theo [25] sử dụng SKLM silicagel với pha động là hỗn hợp của ete dầu

hoả, oxeton, xyclohexan, etyl axetat và metanol tách được các chất màu trong lá

cây rau bina (rau chân vịt) trong 10 phút.

- Theo [21] sử dụng SKLM silicagel với pha động là hỗn hợp của ete dầu

hoả và axeton tỉ lệ 4:1tách được các chất màu trong lá xanh từ trên xuống là

Caroten (vàng), Pheophytin (xanh ô-liu), diệp lục a (màu xanh lá cây), diệp lục b

(xanh-vàng), Lutein (vàng), violaxanthin (vàng), neoxanthin (vàng).

- Theo [26] sử dụng SKG với pha động là hỗn hợp của ete dầu hoả và

axeton tỉ lệ 7:3 hoặc 8:2 hoặc 9:1tách được các chất màu trong lá xanh.

- Theo [26] sử dụng SKG với pha động là hỗn hợp của ete dầu hoả và

axeton tỉ lệ 9:1tách được các chất màu trong lá xanh thành 3 nhóm từ trên xuống

là màu vàng, màu xanh lá cây, màu xanh vàng.

1.8. Khái quát về ion Co2+

, Cu2+

, Fe3+

, Ni2+

và muối của chúng [3, 7]

1.8.1. Sơ lƣợc về muối sắt(III) và ion Fe3+

Sắt(III) tạo nên muối với đa số các anion, trừ những anion có tính khử. Đa

số muối sắt(III) dễ tan trong nước cho dung dịch chứa ion bát diện [Fe(H2O)6]3+

màu tím nhạt. Khi kết tinh từ dung dịch, muối sắt(III) thường ở dạng tinh thể

hiđrat ví dụ như FeF3.3H2O màu đỏ, FeF3.4,5H2O màu hồng FeCl3.6H2O màu

nâu vàng, Fe(NO3)3.9H2O màu tím, Fe(ClO4)3.10H2O màu hồng,

Fe2(SO4)3.10H2O màu vàng và phèn sắt MFe(SO4)2.12H2O (trong đó M là Na+,

K+, Cs

+, NH4

+) màu tím nhạt. Màu của muối khan tuỳ thuộc vào bản chất của

anion ví dụ FeF3 màu lục, FeCl3 màu nâu đỏ, FeBr3 màu đỏ thẫm, Fe2(SO4)3

màu trắng và Fe(SCN)3 màu đỏ máu.

Muối sắt(III) thuỷ phân mạnh hơn muối sắt(II) nên dung dịch có màu

vàng nâu và có phản ứng axit mạnh; tuỳ theo nồng độ, pH của dung dịch có

33

thể vào khoảng 2-3:

[Fe(H2O)6]3+

+ H2O [FeOH(H2O)5]2+

+ H3O+

[FeOH(H2O)5]2+

+ H2O [Fe(OH)2(H2O)4]+ + H3O

+

Chỉ trong dung dịch có phản ứng axit mạnh (pH < 1) sự thuỷ phân mới bị

đẩy lùi. Ngược lại khi thêm kiềm hoặc đun nóng dung dịch, phản ứng thuỷ phân

xảy ra đến cùng tạo thành kết tủa (gel) hoặc dung dịch keo (sol) của sắt(III)

hiđroxit bao gồm những phức chất hiđroxo nhiều nhân do hiện tượng ngưng tụ

tạo nên.

Ví dụ:

OH2 3+

H2O OH2 4+

H2O OH2 H2O OH OH2

Fe Fe Fe

H2O OH2 H2O OH OH2

OH2 H2O OH2

H2O OH2 4+

H2O OH2

Fe O Fe

H2O OH2

H2O OH2

Hay viết gọn là: [Fe(H2O)6]3+

[(H2O)4Fe-(OH)2-Fe(H2O)4]4+

[(H2O)4Fe-O-Fe(H2O)4]

4+

Muối sắt(III) trong dung dịch tương đối dễ bị khử bởi các ion I-, S

2-, Sn

2+,

2

32OS . Ví dụ:

2Fe3+

+ 2I- 2Fe

2+ + I2

2Fe3+

+ S2-

2Fe2+

+ S

2Fe3+

+ Sn2+

2Fe2+

+ Sn4+

2Fe3+

+ 2 2

32OS 2Fe2+

+ 2

64OS

Vì thế từ dung dịch không thể tách ra những hợp chất FeI3, Fe2S3.

Sắt(III) florua khó nóng chảy, thăng hoa ở > 1000oC. Sắt(III) clorua nóng

chảy ở 308 oC và sôi ở 315

oC. Sắt(III) bromua kém bền hơn trên 100

oC đã phân

huỷ thành FeBr2 và Br2. Ở trạng thái khí và ở 700oC, sắt(III) clorua ở dạng đime

hoá Fe2Cl6:

Cl Cl Cl

Fe Fe

Cl Cl Cl

34

Và ở trên 700oC Fe2Cl6 bị phân huỷ thành monome FeCl3.

Ion sắt(III) tạo nên nhiều phức chất. Đa số các phức chất có cấu hình bát

diện, ví dụ như M3[FeF6], M3[Fe(SCN)6], M3[Fe(CN)6], một số rất ít có cấu hình

tứ diện, ví dụ như M[FeCl4] (trong đó M là kim loại kiềm). Những phức chất bát

diện thường có spin cao, trừ những phức chất tạo nên với phối tử trường mạnh

có spin thấp, ví dụ như [Fe(CN)6]3-

, [Fe(phen)3] (ở đây phen là o-phenantrolin).

1.8.2. Sơ lƣợc về muối đồng(II) và ion Cu2+

Đa số muối đồng(II) dễ tan trong nước, bị thuỷ phân và khi kết tinh từ

dung dịch thường ở dạng hiđrat. Dung dịch loãng của các muối tan có màu lam,

màu của ion [Cu(H2O)6]2+

, trong khi ở trạng thái rắn các muối có màu khác.

Ion [Cu(H2O)6]2+

có hình bát diện lệch với ion Cu2+

ở trung tâm, trong đó

hai phân tử H2O ở cách Cu2+

xa hơn so với bốn phân tử H2O còn lại.

Ion Cu2+

là chất tạo phức mạnh. Những ion phức quen thuộc của Cu2+

là

[CuX3]-, [CuX4]

2- (trong đó X là F, Cl, Br), [Cu(NH3)4]

2+, [Cu(C2O4)2]

2-,

[Cu(en)2]2+

, (trong đó en là etylenđiamin H2N-CH2-CH2-NH2).

Nói chung khi gặp chất khử, muối đồng(II) có thể chuyển thành muối

đồng(I) hoặc đồng kim loại.

Trong nước khi có NH3 ion Cu2+

tạo phức chất với NH3 bằng cách thay

thế lần lượt các phân tử H2O trong ion [Cu(H2O)6]2+

(màu xanh lam) bằng các

phân tử NH3 nhưng việc thay thế phân tử NH3 thứ năm và thứ sáu là rất khó hơn

nữa hai phân tử H2O còn lại liên kết rất yếu với ion Cu2+

nên ion phức của Cu2+

với NH3 thường được biểu diễn là [Cu(NH3)4]2+

(xanh chàm), với lý do tương tự

phức chất của ion Cu2+

với etylenđiamin là [Cu(en)2]2+

(xanh chàm đậm) với cấu

hình hình vuông.

Đồng(II) clorua là chất ở dạng tinh thể màu nâu, nóng chảy ở 596oC và

sôi ở 993oC có phân huỷ thành CuCl và Cl2. Đồng(II) clorua là polime vô cơ, ở

trạng thái hơi có cấu tạo mạch dài:

Cl Cl Cl

Cu Cu Cu

Cl Cl Cl

Ở trạng thái tinh thể những mạch dài đó chồng lên nhau làm cho mỗi

nguyên tử Cu được sáu nguyên tử clo bao quanh tạo thành bát diện lệch:

Cl

Cl Cl

Cu

Cl Cl

Cl

35

Đồng(II) clorua dễ tan trong nước, rượu, ete và axeton. Khi kết tinh từ

dung dịch nước, nó tách ra dưới dạng đihiđrat CuCl2.2H2O.

Đihiđrat đồng(II) clorua là những tinh thể màu lục cũng có kiến trúc lập

phương lệch như đồng(II) clorua khan nhưng trong đó mỗi nguyên tử đồng được

phối trí bởi bốn nguyên tử Cl và hai phân tử nước:

Dung dịch đậm đặc của CuCl2.2H2O ở trong nước vẫn có màu lục nhưng

dung dịch loãng có màu lam, màu đặc trưng của ion [Cu(H2O)6]2+

. Khi đun nóng

150oC thì CuCl2.2H2O mất nước thành muối khan.

Đồng(II) sunfat (CuSO4) là bột màu trắng, hút mạnh hơi ẩm của không

khí tạo thành hiđrat CuSO4.5H2O màu lam. Lợi dụng tính chất này, người ta

dùng CuSO4 khan để phát hiện nước lẫn trong chất hữu cơ. Khi đun nóng,

pentahiđrat mất dần nước và đến 250oC biến thành muối khan:

CuSO4.5H2O C100o

CuSO4.3H2O C150o

CuSO4.H2O C250o

CuSO4

Đồng(II) axetat là chất dạng tinh thể màu lục, dễ tan trong nước. Nó có

cấu tạo dạng đime [Cu(CH3COO)2.H2O]2 trong đó nguyên tử Cu ở trạng thái lai

hoá d2sp

3, những nhóm CH3COO

- là cầu nối giữa hai nguyên tử Cu.

1.8.3. Sơ lƣợc về muối coban(II) và ion Co2+

Ion Co2+

tạo muối với hầu hêt các anion bền. Muối khan có màu khác với

muối ở dạng tinh thể hiđrat, ví dụ như CoBr2 màu lục còn CoBr2.6H2O màu đỏ,

CoCl2 màu xanh lam còn CoCl2.6H2O màu đỏ-hồng. Khi tan trong nước ion

Co2+

tạo ion bát diện [Co(H2O)6]2+

có màu đặc trưng là đỏ - hồng, ion

[Co(H2O)6]2+

tồn tại trong một số tinh thể hiđrat như CoCl2.6H2O màu đỏ -

hồng, Co(NO3)2.6H2O màu đỏ - hồng. Trong nước ion [Co(H2O)6]2+

thuỷ phân

một phần làm cho dung dịch có phản ứng axit yếu. CoX2 khi được kết tinh từ

dung dịch nước thường ở dạng tinh thể hiđrat CoX2.6H2O(trừ florua). Các

hexahiđrat dễ tan trong nước, trong rượu. Ở dạng khan màu của muối tuỳ thuộc

vào màu của các anion cụ thể:

CoF2 màu đỏ nhạt, CoCl2 màu xanh lam, CoBr2 màu lục, CoI2 màu đen.

CoCl2 nóng chảy ở 727oC và sôi ở 1049

oC.

Khi nhiệt phân tinh thể hiđrat CoX2.6H2O cũng như muối hiđrat khác của

Co(II) xảy ra hiện tượng mất nước dần kèm theo sự đổi màu từ đỏ - hồng đến

xanh lam.

Ví dụ:

CoCl2.6H2O C49o

CoCl2.4H2O C58o

CoCl2.2H2O C90o

CoCl2.H2O

(đỏ-hồng) (hồng) (tím xanh) (xanh lam)

C140o

CoCl2

(xanh lam)

36

Quá trình mất nước của CoCl2.6H2O không kèm theo sự thuỷ phân làm cho sự

tương tác giữa CoCl2 và nước có tính thuận nghịch. Dựa vào tính chất này người

ta cho CoCl2 vào silicagel để làm chất chỉ thị độ ẩm.

CoSO4 màu hồng, phân huỷ ở trên 600oC, hút ẩm và dễ tan trong nước.

Khi kết tinh từ dung dịch nước ở nhiệt độ thường thu được tinh thể hiđrat

CoSO4.7H2O có màu đỏ, nóng chảy ở 96-98oC. CoSO4.7H2O bền trong không

khí, tan trong nước nhưng không tan trong rượu, khi đung nóng CoSO4.7H2O

mất dần nước biến thành muối khan.

Ion Co2+

tạo nên nhiều phức chất bát diện với số phối trí là 6 ví dụ

amoniacat coban(II) [Co(NH3)6]2+

có màu nâu vàng, [Co(CN)6]4-

màu đỏ,

[Co(H2O)6]2+

có màu đặc trưng là đỏ - hồng, [CoF6]4-

. Ion Co2+

cũng tạo nên

nhiều phức tứ diện ví dụ như: [CoCl4]2-

, [CoBr4]2-

, [CoI4]2-

, [Co(OH)4]2-

,

[Co(SCN)4]2-

. Phức chất bát diện của Co(II) có màu đỏ-hồng còn phức chất tứ

diện của Co(II) có màu xanh lam. Trong dung dịch nước, amoniacat coban(II)

dễ dàng tác dụng với oxi không khí tạo thành amoniacat coban(III):

4[Co(NH3)6]2+

+ O2 + 2H2O 4[Co(NH3)6]3+

+ 4OH-

1.8.4. Sơ lƣợc về muối Niken(II) và ion Ni2+

Niken(II) tạo được muối với hầu hết các anion bền, muối khan có màu

khác với muối ở dạng tinh thể hiđrat, ví dụ NiSO4 màu vàng nhưng NiSO4.7H2O

màu lục, NiSO4.6H2O màu lục. Trong nước ion Ni2+

hiđrat hóa tạo ion bát diện

[Ni(H2O)6]2+

có màu lục và ion này thủy phân một phần làm dung dịch có phản

ứng axit yếu. Trong tinh thể hiđrat có trường hợp không có ion [Ni(H2O)6]2+

ví

dụ trong NiCl2.6H2O. Màu của các muối halogen khan tùy thuộc vòa anion NiF2

màu lục, NiCl2 màu vàng, NiBr2 màu nâu sẫm, NiI2 màu đen. Muối

ddihalogenua có thể kết hợp với halogen kim loại kiềm (M) tạo nên muối kép

M[NiX3] hay M2[NiX4]. NiSO4.7H2O bền trong không khí, khi đun nóng mất

dần nước cuối cùng biến thành muối khan. Ion Ni2+

tạo nhiều phức chất đa số có

cấu hình bát diện ví dụ [Ni(H2O)6]2+

, [Ni(NH3)6]2+

đều thuận từ. Trong những

phức chất với số phối trí là 4 của niken một số ít được tạo nên với phối tử trường

yếu có cấu hình tứ diện như [NiCl4]2-

và số nhiều hơn với phối tử trường mạnh,

và có cấu hình hình vuông như [Ni(CN)4]2-

, tất cả các phức chất hình vuông của

Ni(II) đều có tính nghịch từ và có các màu đỏ vàng hay nâu ví dụ Na2[Ni(CN)4]

màu vàng, K2[Ni(CN)4] màu da cam, niken ddimetylglioxximat màu đỏ.

[Ni(CN)4]2-

là phức bền nhất của niken, Kb = 1.1031

. Muối Ni(II) khan kết hợp

với khí NH3 tạo nên muối phức amoniacat chứa ion bát diện [Ni(NH3)6]2+

có

màu tím với Kb là 1,02.108 , [Ni(NH3)6]

2+ được tạo nên cả trong dung dịch, sự

thay thế nước trong [Ni(H2O)6]2+

bằng NH3 đã làm màu biến đổi từ lục sang tím.

37

Muối [Ni(NH3)6](ClO4)2 có độ tan rất bé nên có thể dung để định lượng niken.

Muối Ni(II) khi tác dụng với xianua kim loại kiềm mới đầu tạo nên kết tủa

Ni(CN)2 màu lục, sau đó kết tủa tan trong xianua dư tạo nên ion phức hình

vuông [Ni(CN)4]2-

.

1.8.5. Các phƣơng pháp sắc ký đã đƣợc dùng để tách ion Co2+

, Cu2+

,

Fe3+

, Ni2+

- Theo [15] có thể dùng cột anoinit để tách hỗn hợp 2 loại ion Fe3+

-Zn2+

, Cu2+

-

Zn2+

, Co2+

-Zn2+

hoặc Ni2+

-Zn2+

ra khỏi nhau trong dung dịch nước dựa vào khả

năng tạo phức [ZnCl4]2-

của ion Zn2+

trong dung dịch HCl 0,5 – 1,0M và bị cột

giữ lại. Rửa cột bằng dung dịch HCl 1,0M các ion Fe3+

, Cu2+

, Co2+

hoặc Ni2+

sẽ

ra khỏi cột.

- Theo [15]

+ SKLM kết tủa trên lớp silicagel chứa 14% oxim tách và bán định

lượng được Co2+

,Cu2+

, Fe3+

, Ni2+

.

+ SKLM với pha ngược là silicagel hoặc xenlulozơ tẩm tributyl

photphat và pha động là các dung dịch axit tách được ion của các kim loại Ni-

Cu-Ag-Zn-Fe hoặc Co-Cu-Ag-Zn-Fe.

+ SKLM trên lớp silicagel với pha động là axeton có thể tách ion của các

kim loại Fe, Cu, Ni, Co, Ca, Hg, Zn ra khỏi các nguyên tố đất hiếm.

+ SKG dung môi axeton chứa 5% nước và 8% HCl đặc tách được các ion

theo thứ tự từ dưới lên: Ni2+

, Co2+

, Cu2+

, Fe3+

trong khoảng thời gian từ 2-4 giờ.

- Theo [26] SKG với pha động là hỗn hợp HCl đặc, etanol và butanol trong

khoảng 75 – 90 phút tách được các ion Co2+

, Fe3+

, Cu2+

, Hg2+

, Ag+.

- Theo [27] SKG với pha động là hỗn hợp HCl đặc, etanol và butanol trong

khoảng 75 phút tách được các ion Co2+

, Fe3+

, Cu2+

, Ag+.

- Theo [28] SKG với pha động là hỗn hợp 6ml HCl 8M và 19ml axeton tách

được các ion Co2+

, Fe3+

, Cu2+

, Ni2+

ra khỏi dung dịch muối nitrat trong nước.

- Theo [29] SKG với pha động là hỗn hợp 10ml HCl 7,2M và 30ml butan-2-ol

tách được các ion Co2+

, Fe3+

, Cu2+

, Ni2+

ra khỏi dung dịch muối tan trong nước

của chúng.

38

CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 Các hoá chất và thiết bị cần thiết

2.1.1. Hoá chất

- Axeton. Ete dầu hoả 60 – 90oC. Benzen. Toluen. Cồn etylic tuyệt đối. Dung

dịch HCl đặc (37%). Bột CaCO3.

- Tinh bột sắn dây

- Đường glucozơ

- Keo dán nước

- Thạch cao nung (2CaSO4.H2O)

- Dung dịch FeCl3 0,2M

- Dung dịch CuCl2 0,2M

- Dung dịch CoCl2 0,2M

- Dung dịch NiCl2 0,2M và 0,5M

- Dung dịch NH3 4M

- Dung dịch NH4NO3 4M

- Dung dịch CH3COOH 2M và 1,5M

2.1.2. Thiết bị

- Giấy sắc ký loại 3S của Trung Quốc kích thước 60 cm x 60 cm.

- Giấy lọc loại đường kính 12 cm (dùng thay thế giấy sắc ký).

- Bản mỏng sắc ký loại TLC Silica gel 60 F254 của hãng MERCK kích thước

20 cm x 20 cm và bản mỏng tự chế tạo từ tinh bột sắn dây kích thước

4 cm x 12 cm.

- Kẹp giữ giấy sắc ký.

- Ống thuỷ tinh mao quản hoặc micro pipet để chấm mẫu.

- Bình triển khai sắc ký bằng thuỷ tinh hoặc nhựa trong suốt có nắp đậy kín để

bão hoà dung môi và có kích thước phù hợp với kích thước bản mỏng và giấy

sắc ký.

- Cột sắc ký (buret chuẩn độ loại 25 ml).

- Bông thuỷ tinh hoặc bông y tế.

- Máy ảnh kỹ thuật số để chụp và lưu giữ sắc đồ.

- Tấm kính thuỷ tinh kích thước dài, rộng, dày tương ứng 12 cm, 4 cm, 0,2 cm

để chế tạo bản mỏng.

- Tủ hút hơi độc.

- Máy sấy.

- Phễu chiết.

- Bình nón nút nhám.

39

- Giá để các bản mỏng.

- Thìa nhựa 1- 2 ml để trải chất hấp phụ lên tấm kính thành một lớp mỏng đồng

đều, có chiều dày thích hợp.

2.2. Chế tạo bản mỏng từ tinh bột sắn dây

Qua thử nghiệm nhiều lần chúng tôi thấy bản mỏng chế tạo từ tinh bột sắn

dây có ưu điểm là rẻ tiền, dễ tìm kiếm ở nước ta, độ bền cao (những bản mỏng

đã để trong phòng thí nghiệm ở điều kiện bình thường đã được 4-5 tháng vẫn sử

dụng được bình thường, không thấy bị biến màu hay bị mốc) trong khi những

những sản phẩm từ các loại tinh bột khác thường nhanh bị mốc hoặc ôi thiu.

Điều này rất phù hợp với mục đích của đề tài.

2.2.1. Chuẩn bị bản mỏng

Các tấm kính phải được lau rửa sạch bằng nước máy sau đó tráng lại bằng

nước cất (nếu có thể thì ngâm các phiến kính trong dung dịch sulfocromic trước

khi cọ rửa bằng nước máy để tẩy hết chất béo), để khô trên giá ở nhiệt độ thường

hay sấy trong tủ sấy.

2.2.2. Ðiều chế vữa của chất hấp phụ

Có thể dùng trực tiếp keo dán dạng nước có bán sẵn ở các cửa hàng văn

phòng phẩm làm chất kết dính tinh bột vào tấm kính hoặc tự điều chế keo bằng

cách trộn tinh bột sắn dây và nước cất theo tỉ lệ thể tích tương ứng 1:10 cho vào

cốc thuỷ tinh khuấy đều và đun sôi trên đèn cồn khoảng 5 phút.

Lấy tinh bột sắn dây, thạch cao nung, keo dán dạng nước và nước cất theo

tỉ lệ thể tích tương ứng 4 : 1 : 0,5 : 3,5 trộn đều trong cốc thuỷ tinh dung tích 100

ml. Qua thực nghiệm nhiều lần chúng tôi thấy cần sử dụng keo dán (dạng nước)

để làm tăng độ bám của tinh bột lên kính, còn thạch cao nung có tác dụng làm

cho lớp mỏng khó bị nứt khi nước bay hơi.

2.2.3. Trải vữa lên bản mỏng

Lấy thìa nhựa đưa vữa lên tấm kính (khoảng 3,0 - 3,5 ml vữa cho 10 cm2

kính), dùng thìa gạt và nhẹ nhàng nghiêng tấm kính về các phía cho vữa phủ đều

lên tấm kính rồi để lên giá phẳng cho khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong

khoảng 10 giờ. Khi khô tấm kính được phủ đều một lớp mỏng khoảng 0,25 mm

màu trắng là được.

2.3. Chiết dịch từ lá xanh

Lấy 10 gam lá rau muống còn tươi (khoảng 30 lá) hoặc lá xanh khác cắt

nhỏ cho vào cối sứ (bỏ gân lá), trộn thêm 2 gam bột CaCO3 để trung hoà dịch

axit của tế bào, có thể cho một ít bột thuỷ tinh cho dễ nghiền. Nghiền các mẩu lá

đến khi thành một thể đồng nhất, cho 15 - 20 ml axeton 80% hoặc cồn etylic 90o

vào cối sứ khuấy đều và để 5 phút rồi lọc bằng bông trên phễu thuỷ tinh, dung

40

dịch thu được trộn với 2,0 ml toluen rồi chiết bằng phễu chiết lấy phần trên (màu

xanh đậm) được dịch mẫu. Nên chứa dịch mẫu trong bình thuỷ tinh có nút

nhám.

2.4. Tiến hành sắc ký cột

2.4.1. cột sắc ký

Cột sắc ký là ống thuỷ tinh hình trụ có thể bằng kim loại kích thước rất

khác nhau tuỳ trường hợp. Trong luận văn này chúng tôi sử dụng buret chuẩn độ

loại 25 ml làm cột sắc ký.

2.4.2. Chất nhồi cột

Pha tĩnh (stationary phase), có khá nhiều chất được dùng làm pha tĩnh như

nhôm oxit, silicagel, than hoạt tính, magie oxit, magie cacbonat, canxi cacbonat,

tinh bột … trong đề tài này chúng tôi sử dụng pha tĩnh là silicagel kích thước hạt

40 – 60 mesh, bột CaCO3, bột đường glucozơ, tinh bột sắn dây.

Về nguyên tắc thì tùy thuộc vào mẫu mà sẽ dùng lượng silicagel hoặc

canxi cacbonat gấp 20, 30 hay 50 lần lượng mẫu. Chú ý lượng silicagel hoặc

canxi cacbonat phải đổ đến khoảng gấp 10 lần đường kính cột thì quá trình tách

sẽ diễn ra tốt. Nếu các chất cần tách có độ phân cực gần nhau thì lượng silicagel

hoặc canxi cacbonat dùng phải gấp 50 lần lượng mẫu, còn xa nhau thì chỉ cần

gấp 20 lần là đủ. Trong luận văn này chúng tôi thấy nạp silicagel vào buret đạt

chiều cao cột khoảng 10 – 12 cm còn bột canxi cacbonat nạp 15 – 20 cm là

được.

2.4.3. Dung môi

Thông thường chọn dung môi phụ thuộc vào chất nhồi cột. Nếu dùng

silicagel (phân cực) thì chọn dung môi đi từ không phân cực đến phân cực (ví dụ

từ chloroform đếm methanol), thông thường dùng hỗn hợp dung môi, cách chọn

dung môi như thế nào dựa vào sắc đồ trên bản mỏng.

Chú ý dung môi chạy sắc ký cột phải phân cực hơn một chút so với dung

môi chạy bản mỏng vì hạt silicagel dùng cho cột sắc ký sẽ to hơn hạt trên bản

mỏng nên khả năng tách sẽ kém hơn một chút.

2.4.4. Nhồi cột

Nhồi ƣớt:

Lấy một cục nhỏ bông để dưới đáy cột để giữ silicagel (hoặc canxi

cacbonat) lại. Sau khi nhồi chặt bông thì tiến hành khuấy silicagel hoặc canxi

cacbonat trong dung môi (không phân cực) đã pha sẵn rồi rót nhẹ nhàng vào cột.

Trong lúc rót thì nên mở khóa để silicagel (hoặc canxi cacbonat) lắng đều, nhớ

để 1 bình tam giác bên dưới để thu hồi dung môi, tiếp tục làm như vậy đến khi

cho hết lượng silicagel (hoặc canxi cacbonat) vào, tiến hành rót thêm dung môi

41

(từ bình tam giác bên dưới) để ổn định hệ, chế đi chế lại nhiều lần đến khi hệ ổn

định, cột không bị nứt hay gãy thì xem như việc nhồi cột đã hoàn thành. Khóa

cột khi bề mặt trên của dung môi vừa bằng mặt trên lớp silicagel (hoặc canxi

cacbonat).

Nhồi khô:

Lấy một cục nhỏ bông để dưới đáy cột để giữ silicagel (hoặc canxi

cacbonat) lại. Sau khi nhồi chặt bông thì tiến hành đổ từ từ bột silicagel (hoặc

canxi cacbonat) vào buret vừa đổ vừa gõ nhẹ vào buret để silicagel (hoặc canxi

cacbonat) phân bố kín và đều trong buret khi chay sắc ký không bị nứt, gãy hay

có bọt khí. Cho dung môi chạy qua cột để ổn định, cột nhồi đạt tiêu chuẩn phải

không bị nứt gãy hay có bọt khí, sau đó khoá cột khi bề mặt trên của dung môi

vừa bằng mặt trên lớp silicagel (hoặc canxi cacbonat).

2.4.5. Đƣa mẫu vào cột

Có hai cách cho mẫu vào cột là ướt hoặc khô, nhưng các mẫu ở luận văn

này tan được trong dung môi chạy sắc ký nên ta nạp mẫu ướt. Cho mẫu trực tiếp

vào cột khoảng 3 - 5 giọt chú ý không để xáo trộn bề mặt lớp silicagel (hoặc

canxi cacbonat) hoặc mẫu dính lên thành thuỷ tinh phía trên của buret.

Sau khi hoàn tất việc nạp mẫu rồi thì lót 1 miếng bông hoặc phủ 0,3 cm

cát sạch ở bên trên mẫu để khi nạp dung môi vào lớp silicagel (hoặc canxi

cacbonat) và mẫu không bị xáo trộn.

2.4.6. Chạy sắc ký

Trong luận văn này chúng tôi sử dụng phương pháp rửa giải. Cho dung

môi vào cột rồi mở khoá điều chỉnh để tốc độ chảy của dung môi khoảng 12 –

15 giọt/phút, chờ khi sắc đồ xuất hiện thì chụp ảnh để lưu sắc đồ.

2.5. Tiến hành sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography)

2.5.1. Chuẩn bị bình khai triển

Các bình khai triển thường là bình thủy tinh, hình hộp hay hình trụ, có nắp đậy

kín, kích thước thay đổi tùy theo yêu cầu của các bản mỏng sử dụng. Bão hòa

hơi dung môi trong bình bằng cách lót giấy lọc xung quanh thành trong của

bình, rồi rót một lượng vừa đủ dung môi vào bình, lắc rồi để giấy lọc thấm đều

dung môi. Lượng dung môi sử dụng sao cho sau khi thấm đều giấy lọc còn lại

một lớp dày khoảng 5 mm đến 10 mm ở đáy bình. Ðậy kín nắp bình và để yên

10 phút ở nhiệt độ phòng (không cần để lâu hơn vì các dung môi sử dụng trong

luận văn này đều dễ bay hơi).

2.5.2. Đƣa chất phân tích lên bản mỏng

Sử dụng bản mỏng TLC silicagel 60 F254 của hãng Merck được cắt bằng

kéo thành bản hình chữ nhật có kích thước 3,5 cm x 12 cm và bản tự chế tạo từ

42

tinh bột sắn dây kích thước 4 cm x 12 cm.

Sử dụng ống thuỷ tinh mao quản hoặc micropipet để đưa mẫu lên bản

mỏng. Lượng chất hoặc hỗn hợp chất đưa lên bản mỏng có ý nghĩa quan trọng

đối với hiệu quả tách sắc ký, đặc bịệt ảnh hưởng rất lớn đến trị số Rf. Lượng

chất quá lớn làm cho vết sắc ký lớn và kéo dài, khi đó, vết của các chất có trị số

Rf gần nhau sẽ bị chồng lấp. Lượng chất nhỏ quá có thể không phát hiện được.

Thể tích dung dịch từ 0,001ml đến 0,005ml đối với trường hợp đưa mẫu lên bản

mỏng dưới dạng điểm và từ 0,l - 0,2ml khi đưa mẫu lên bản mỏng dưới dạng

vạch. Nếu dung dịch loãng thì có thể làm giàu trực tiếp trên bản mỏng bằng cách

chấm nhiều lần ở cùng một vị trí và sấy khô sau mỗi lần chấm.

Ðường xuất phát phải cách mép dưới của bản mỏng 1,5cm - 2cm và cách bề mặt

dung môi từ 0,8 - 1 cm. Các vết chấm phải nhỏ, có đường kính 2 - 6mm và cách

nhau 15mm. Các vết ở bìa phải cách bờ bên của bản mỏng ít nhất 1cm để tránh

hiệu ứng bờ.

2.5.3. Triển khai SKLM

Ðặt bản mỏng gần như thẳng đứng với bình triển khai, các vết chấm phải

ở trên bề mặt của lớp dung môi khai triển. Ðậy kín bình và để yên ở nhiệt độ

không đổi. Khi dung môi đã triển khai trên bản mỏng được một đoạn, lấy bản

mỏng ra khỏi bình, đánh dấu mức dung môi, làm bay hơi dung môi còn đọng lại

trên bản mỏng rồi chụp ảnh, đo khoảng di chuyển của dung môi và các chất cần

tách. Tính hệ số Rf.

Với tách chất màu thực vật trong lá xanh làm với các hệ dung môi khác

nhau, trong mỗi hệ dung môi khảo sát ở nhiều tỉ lệ để tìm ra tỉ lệ tối ưu. Đối với

tách các ion kim loại cần khảo sát bằng chấm các mẫu riêng trước khi sử dụng

mẫu hỗn hợp.

2.6. Tiến hành sắc ký giấy (paper chromatography)

2.6.1. Chuẩn bị bình khai triển

Làm như bình khai triển của SKLM.

2.6.2. Đƣa chất phân tích lên giấy sắc ký

Sử dụng giấy sắc ký loại 3S và giấy lọc đường kính 12cm được cắt thành hình

chữ nhật kích thước 3,5 x 10cm.

Cách đưa chất phân tích lên giấy sắc ký giống như đưa chất phân tích lên bản

mỏng.

2.6.3. Triển khai SKG

Cần dùng kẹp nhỏ để giữ mép trên của giấy sắc ký tránh bị gập giấy trong quá

trình chạy sắc ký. Các bước tiến hành cụ thể tương tự triển khai SKLM.

43

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Sắc ký cột

3.1.1. Tách chất màu trong lá xanh

a) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi: ete dầu hoả -

axeton.

Khi cho dung môi là 100% ete dầu hoả chúng tôi thấy chỉ có vùng chất

màu vàng di chuyển khá nhanh xuống dưới còn vùng chất màu xanh di chuyển

rất chậm, chúng tôi cho rằng vùng chất màu vàng là caroten do chất này không

phân cực nên ít bị hấp phụ bởi pha tĩnh là silicagel (phân cực) đồng thời caroten

tan tốt trong ete dầu hoả là dung môi không phân cực nên di chuyển nhanh.

Vùng chất màu xanh là các chlorophyl và các xanthophyl chưa tách khỏi nhau

do chúng phân cực hơn nên bị silicagel hấp phụ mạnh nên di chuyển chậm, trên

cơ sở đó chúng tôi suy luận rằng để tách tốt hơn cần phải tăng độ phân cực của

dung môi, không tăng chiều dài cột vì silicagel có kích thước nhỏ tăng chiều dài

cột sẽ kéo dài thời gian tách không phù hợp với mục đích của đề tài là thực hiện

trong giờ thực hành ở trường THPT. Chúng tôi đã tăng dần sự phân cực của

dung môi, cụ thể là sau mỗi thí nghiệm tăng 10% thể tích axeton vào dung môi

và theo dõi, kết quả đúng như dự đoán khi tỷ lệ axeton càng cao vùng chất màu

xanh di chuyển càng nhanh như vậy quá trình tách ở đây chủ yếu theo cơ chế

hấp phụ. Kết quả với tỷ lệ thể tích ete dầu hoả - axeton (9:1) thì quá trình tách

tối ưu với thời gian 15 phút tách được 4 vùng màu theo thứ tự từ dưới lên là:

màu vàng, màu xanh tươi, màu xanh vàng và màu vàng. Theo các tài liệu [5, 9]

các vùng màu đó lần lượt là caroten (vàng), chlorophyl a (xanh tươi), chlorophyl

b (xanh vàng) và các xanthophyl (vàng).

Trường hợp này có thể áp dụng thực hành trong giờ học ở trường THPT.

Các trường hợp tỷ lệ axeton cao hơn tách không hiệu quả do khi dung môi có độ

phân cực cao quá chlorophyl và các xanthophyl di chuyển nhanh gần với tốc độ

của caroten nên không tách được.

44

Hình 3.1. Tách chất màu trong lá xanh với pha tĩnh là silicagel pha

động là ete dầu hoả - axeton (9:1)

b) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi: toluen –

axeton.

Vì ở phòng thực hành các trường THPT hiện nay ete dầu hoả ít phổ biến,

với mục đích tăng tính khả thi của thí nghiệm sắc ký trong trường THPT chúng

tôi thử nghiệm thay thế ete dầu hoả bằng toluen là một dung môi không phân

cực khá phổ biến trong các phòng thí nghiệm ở trường phổ thông hiện nay. Cách

tiến hành tương tự như hệ dung môi ete dầu hoả - axeton. Kết quả khi cho dung

môi là 100% toluen thì tương tự như trường hợp 100% ete dầu hoả chỉ có vùng

chất màu vàng (caroten) di chuyển khá nhanh xuống dưới còn vùng chất màu

xanh (chlorophyl và xanthophyl) di chuyển rất chậm, với suy luận tương tự hệ

dung môi ete dầu hoả - axeton, chúng tôi thử nghiệm tăng dần sự phân cực của

dung môi. Kết quả đúng như dự đoán khi tỷ lệ axeton càng cao vùng chất màu

xanh di chuyển càng nhanh và với tỷ lệ thể tích toluen - axeton (9:1) thì quá

trình tách tối ưu trong thời gian 18 phút tách được 4 vùng màu theo thứ tự từ

dưới lên là: màu vàng, màu xanh tươi, màu xanh vàng và màu vàng tương tự

như hệ dung môi ete dầu hoả - axeton tuy nhiên vùng chất kéo dài hơn chứng tỏ

hệ dung môi ete dầu hoả - axeton tách hiệu nghiệm hơn.

Tương tự trường hợp hệ dung môi ete dầu hoả - axeton chúng tôi cho rằng

các vùng màu đó lần lượt là caroten (vàng), chlorophyl a (xanh tươi), chlorophyl

b (xanh vàng) và các xanthophyl (vàng).

45

Hình 3.2. Tách chất màu trong lá xanh với pha tĩnh là silicagel pha

động là toluen - axeton (9:1)

Các trường hợp tỷ lệ axeton cao hơn không tách được do khi dung môi có

độ phân cực cao quá chlorophyl và các xanthophyl di chuyển nhanh gần với tốc

độ của caroten.

Vậy trường hợp này có thể áp dụng thực hành trong giờ học ở trường

THPT nhất là khi không có ete dầu hoả

c) Pha tĩnh là bột canxi cacbonat, pha động là hệ dung môi: ete dầu

hoả - axeton

Chúng tôi lại thay silicagel bằng canxi cacbonat là hóa chất phổ biến và rẻ

hơn silicagel. Cách tiến hành và suy luận vẫn tương tự như trường hợp pha tĩnh

là silicagel, dung môi ete dầu hoả nhưng do canxi cacbonat ít phân cực hơn

silicagel nên chúng tôi chỉ tăng 5% tỉ lệ axeton trong dung môi sau mỗi thí

nghiệm. Khi cho dung môi là 100% ete dầu hoả chúng tôi thấy chỉ có vùng chất

màu vàng di chuyển khá nhanh xuống dưới còn vùng chất màu xanh di chuyển

rất chậm, khi tỉ lệ ete dầu hoả - axeton (9,5:0,5) thì quá trình tách tối ưu với thời

gian 20 phút tách được 4 vùng màu theo thứ tự từ dưới lên là: vàng, xanh tươi,

xanh vàng và vàng. Theo các tài liệu [5, 9] chúng tôi cho rằng các vùng màu đó

46

lần lượt từ dưới lên là caroten (vàng), chlorophyl a (xanh tươi), chlorophyl b

(xanh vàng) các xanthophyl (vàng).

Hình 3.3. Tách chất màu trong lá xanh với pha tĩnh là bột

canxicacbonat pha động là ete dầu hoả - axeton (9,5:0,5)

Nhưng các vùng màu không rõ ràng như tách bằng silicagel chứng tỏ

silicagel tách hiệu quả hơn canxi cacbonat. Chúng tôi cũng đã thử nghiệm tăng

độ dài cột để tăng hiệu quả tách song không thành công do bột canxi cacbonat

khá mịn nên dễ bị tắc cột và thời gian tách bị kéo dài không phù hợp với mục

đích nghiên cứu của luận văn này.

Tóm lại trường hợp này có thể áp dụng thực hành trong giờ học ở trường

THPT và chiều dài cột vẫn chỉ để ở mức bình thường (12 – 15 cm).

d) Pha tĩnh là bột canxi cacbonat, pha động là hệ dung môi:

toluen - axeton.

Cách tiến hành tương tự phần trên. Khi cho dung môi là 100% toluen

chúng tôi thấy chỉ có vùng chất màu vàng di chuyển khá nhanh xuống dưới còn

vùng chất màu xanh di chuyển rất chậm, chúng tôi cho rằng vùng chất màu vàng

là caroten do chất này không phân cực nên hấp phụ yếu với canxi cacbonat phân

cực đồng thời tan tốt trong toluen là dung môi không phân cực nên di chuyển

nhanh. Vùng chất màu xanh chúng tôi cho rằng đó là các chlorophyl và các

47

xanthophyl chưa tách khỏi nhau do chúng phân cực hơn nên bị canxi cacbonat

hấp phụ mạnh hơn và di chuyển chậm. Sau đó chúng tôi cũng tăng dần sự phân

cực của dung môi bằng cách mỗi thí nghiệm tăng 5% thể tích axeton, kết quả khi

tỷ lệ axeton càng cao vùng chất màu xanh di chuyển càng nhanh như vậy quá

trình tách ở đây chủ yếu theo cơ chế hấp phụ. Kết quả với tỷ lệ thể tích toluen -

axeton (9,5:0,5) thì quá trình tách tối ưu với thời gian 20 phút tách được 3 vùng

màu theo thứ tự từ dưới lên là: màu vàng, màu xanh tươi và màu xanh vàng.

Theo các tài liệu [5, 9] chúng tôi cho rằng các vùng màu đó lần lượt là

caroten (vàng), chlorophyl a (xanh tươi), chlorophyl b (xanh vàng), các

xanthophyl có thể vẫn trong vùng chất chứa chlorophyll b.

Hình 3.4. Tách chất màu trong lá xanh với pha tĩnh là bột canxi

cacbonat pha động là toluen – axeton (9,5:0,5)

Như vậy ta dễ dàng nhận thấy ete dầu hoả tách tốt hơn toluen. Các trường

hợp tỷ lệ axeton cao hơn tách không hiệu quả do khi dung môi có độ phân cực

cao quá chlorophyl và các xanthophyl di chuyển nhanh gần với tốc độ của

caroten nên không tách được.

Trường hợp này có thể áp dụng thực hành trong giờ học ở trường THPT.

48

e) Pha tĩnh là glucozơ, pha động là hệ dung môi: ete dầu hoả -

axeton.

Chúng tôi thấy glucozơ có ưu điểm rẻ tiền, dễ kiếm, không độc điều này

rất phù hợp với mục đích nghiên cứu của đề tài, nên chúng tôi đã quyết định thử

nghiệm sử dụng glucozơ làm pha tĩnh.

Qua khảo sát với dung môi 100% ete dầu hỏa chúng tôi thấy khi độ dài

cột tách là 12 cm mẫu di chuyển khá nhanh qua cột và không tách được. Chúng

tôi dự đoán do kích thước hạt glucozơ khá lớn, độ phân cực của glucozơ kém

silicagel nên độ hiệu nghiệm của cột tách không cao trên cơ sở đó chúng tôi thử

nghiệm tăng dần độ dài cột tách và thực tế khi chiều dài cột tách lên tới 30 cm

với thời gian 20 phút tách được hai vùng chất từ dưới lên là màu vàng và màu

xanh.

Chúng tôi cho rằng vùng chất màu vàng là caroten, vùng chất màu xanh là

các chlorophyl và các xanthophyl chưa tách khỏi nhau nhưng màu xanh của các

chlorophyl đã lấn át màu của các xanthophyl nên chỉ quan sát thấy màu xanh.

Chúng tôi suy luận rằng để các chất trong nhóm chlorophyl và xanthophyl có thể

tách khỏi nhau không nên tăng thêm chiều dài cột tách nữa vì sẽ kéo dài thời

gian tách và có thể tắc cột mà cần phải tăng sự phân cực của dung môi. Sau đó

chúng tôi tăng dần 5% thể tích axeton trong dung môi sau mỗi thí nghiệm và

thấy với dung môi ete dầu hoả - axeton (9,5:0,5) tách được 4 vùng màu trong

thời gian khoảng 20 phút, từ dưới lên là màu vàng (caroten), màu xanh tươi

(chlorophyl a), màu xanh vàng (chlorophyl b), màu vàng (xanthophyl).

Vậy trường hợp này hoàn toàn phù hợp và thỏa mãn mục tiêu của đề tài

nên có thể áp dụng để dạy trong trường THPT ở nước ta.

49

Hình 3.5. Tách chất màu trong lá xanh với pha tĩnh là glucozơ pha

động là ete dầu hoả - axeton (9,5:0,5)

f. Pha tĩnh là glucozơ, pha động là hệ dung môi: toluen - cồn

etylic tuyệt đối.

Chúng tôi cũng đã thử nghiệm pha tĩnh vẫn là glucozơ nhưng dung môi là

hai hóa chất thông dụng hơn trong phòng thí nghiệm đó là toluen - cồn etylic

tuyệt đối với các tỉ lệ thể tích tương ứng từ 10:0; 9:1;…; 1:9; 0:10 nhưng đều

không tách được.

3.1.2. Tách các ion Fe3+

, Cu2+

, Co2+

a) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi: NH4NO3 4M –

NH3 4M

Trên cơ sở hệ dung môi này tách được các ion kim loại trên SKLM với

pha tĩnh là silicagel chúng tôi thử nghiệm tách các ion kim loại này trên sắc ký

cột với pha tĩnh là silicagel. Chúng tôi đã thử nghiệm các tỉ lệ NH4NO3 - NH3

tương ứng lần lượt là 9:1; 8:2; …;1:9 kết quả thấy ion Fe3+

không di chuyển và

có màu nâu đỏ, ion Co2+

có màu xanh đậm và di chuyển rất chậm, ion Cu2+

có

màu xanh lam di chuyển khá nhanh, khả năng di chuyển của 2 ion Cu2+

và Co2+

50

tăng khi tỉ lệ NH4NO3 tăng trong dung môi. Với tỉ lệ dung NH4NO3 - NH3 (9:1)

quá trình tách là tốt nhất và thời gian tách chỉ khoảng 15 phút. Chúng tôi sơ bộ

giải thích như sau ion Fe3+

không tạo được phức chất với NH3 mà tạo thành kết

tủa Fe(OH)3 màu nâu đỏ (do dung môi có môi trường bazơ) không xảy ra quá

trình hấp thụ và giải hấp với silicagel nên không di chuyển được. Các ion Cu2+

và Co2+

đều có cấu hình electron với phân lớp 3d chưa bão hòa nên tạo với NH3

thành các phức chất [Co(NH3)4]2+

, [Cu(NH3)4]2+

nhưng ion [Co(NH3)4]2+

di

chuyển chậm hơn có thể do phức của coban bền (Kb = 1,99x1035

), cân bằng trao

đổi ion thiết lập chậm hơn:

2RSiO3H + [Co(NH3)4]2+

(RSiO3)2[Co(NH3)4] + 2H+

Khi tỉ lệ NH4NO3 trong dung môi tăng khả năng di chuyển của ion Cu2+

và Co2+

đều tăng là do khi đó pH giảm tức nồng độ ion H+ tăng làm cân bằng:

2RSiO3H + [M(NH3)4]2+

(RSiO3)2[M(NH3)4] + 2H+

chuyển dịch sang trái giảm khả năng hấp phụ với pha tĩnh nên chúng di chuyển

nhanh hơn.

Hình 3.6. Sắc đồ tách hỗn hợp các ion kom loại với pha tĩnh là silicagel, pha

động là hệ dung môi NH4NO3 - NH3 (9:1)

Vậy trường hợp này có thể áp dụng vào dạy thực hành ở trường THPT để

tách hỗn hợp 3 ion Fe3+

, Cu2+

, Co2+

hoặc hỗn hợp 2 trong 3 ion đó trong dung

dịch nước ở dang muối clorua hoặc nitrat.

51

b) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi: CH3COONH4

1,5M - CH3COOH 1,5M

Khi thử nghiệm với nồng độ các ion kim loại đều là 0,2M chúng tôi thấy

ion Fe3+

có màu vàng nâu khá rõ, ion Cu2+

có màu xanh nhạt khó quan sát, ion

Co2+

có màu hồng nhạt khó quan sát nên chúng tôi đã giữ nguyên nồng độ của

ion Fe3+

tăng nồng độ của 2 ion Cu2+

và Co2+

kết quả thấy màu của các pic tăng

theo sự tăng nồng độ ion nhưng khi nồng độ quá cao pic dễ bị kéo đuôi, qua

thực nghiệm chúng tôi thấy ở nồng độ 0,5M các pic của 2 ion Cu2+

và Co2+

có

màu đậm đủ để quan sát và pic không bị kéo dài nên chúng tôi chọn nồng độ đó

để nghiên cứu tiếp. Sau khi thử với các tỉ lệ dung môi CH3COONH4 1,5M -

CH3COOH 1,5M tương ứng từ 9:1; 8:2;…; 1:9 nhận thấy 2 ion Cu2+

và Co2+

di

chuyển nhanh gần như nhau nên không tách khỏi nhau, ion Fe3+

không di

chuyển ở tỉ lệ CH3COOH dưới 20%, khi tăng tỉ lệ CH3COOH khả năng di

chuyển của ion Fe3+

tăng dần nhưng vẫn di chuyển chậm hơn 2 ion Cu2+

, Co2+

.

Từ đó ta thấy dùng hệ dung môi này tách hỗn hợp 3 loại ion Fe3+

, Cu2+

, Co2+

là

không phù hợp, nhưng nếu chỉ tách hỗn hợp 2 loại ion Fe3+

, Cu2+

hoặc Fe3+

, Co2+

thì quá trình tách chỉ diễn ra trong khoảng 15 - 20 phút với tỉ lệ tối ưu là

CH3COOH : CH3COONH4 4 : 6.

Hình 3.7. Sắc đồ tách hỗn hợp ion kim loại với pha tĩnh là silicagel, pha động

là CH3COOH - CH3COONH4 (4:6),

Chúng tôi sơ bộ giải thích các hiện tượng đó như sau:

52

Trong nước ion Fe3+

bị thuỷ phân theo 3 nấc nhưng có thể viết gộp thành

Fe3+

+ 3H2O Fe(OH)3 + 3H+

Khi tỉ lệ CH3COOH thấp nồng độ H+ thấp cân bằng trên chuyển dịch về

bên phải tạo thành Fe(OH)3 kết tủa nên khó di chuyển, trái lại khi nồng độ

CH3COOH cao thì nồng độ H+ cao cân bằng trên chuyển dịch về bên trái tạo ra

ion Fe3+

xảy ra quá trình hấp phụ và giải hấp với pha tĩnh nên tăng khả năng di

chuyển. Các ion Cu2+

và Co2+

thuỷ phân yếu mà chủ yếu tồn tại ở dạng hiđrat

hoá nên di chuyển nhanh hơn, đồng thời có màu đặc trưng của ion hiđrat hoá.

Trường hợp này có thể áp dụng vào dạy ở trường THPT.

c) Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi: Axeton – HCl

đặc

Với các tỉ lệ của hệ dung môi axeton – HCl đặc, kết quả các ion di chuyển

khá nhanh nhưng đều không tách được ra khỏi nhau.

d) Pha tĩnh là bột canxi cacbonat, pha động là hệ dung môi:

NH4NO3 4M - NH3 4M

Với các tỉ lệ khác nhau của hệ dung môi NH4NO3 4M - NH3 4M mẫu có

di chuyển nhưng đều không tách được.

e) Pha tĩnh là silicagel, pha động dung dịch CH3COOH

Chúng tôi đã thử nghiệm với dung môi là dung dịch CH3COOH từ 0,1M

đến 2M nhưng đều không tách được.

f) Pha tĩnh là tinh bột sắn dây

Do tinh bột sắn dây có kích thước hạt quá nhỏ cột bị tắc, chúng tôi đã trộn

cát sạch vào tinh bột sắn dây để tránh tắc cột rồi thử với các hệ dung môi ở trên

song đều không tách được hoặc tách rất kém hiệu quả. Không thể áp dụng vào

dạy ở trường THPT.

3.1.3. Kết luận

Với sắc ký cột chúng tôi đã lựa chọn được một số thí nghiệm đơn giản có

thể áp dụng vào dạy ở trường trung học phổ thông gồm:

- 5 thí nghiệm tách chất màu trong lá xanh:

+ Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi: ete dầu hoả - axeton

(9:1)

+ Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi: toluen – axeton (9:1)

+ Pha tĩnh là bột canxi cacbonat, pha động là hệ dung môi: ete dầu hoả -

axeton ( 9,5:0,5)

+ Pha tĩnh là bột canxi cacbonat, pha động là hệ dung môi: toluen –

axeton (9,5:0,5)

53

+ Pha tĩnh là glucozơ, pha động là dung môi ete dầu hoả-axeton (9,5:0,5)

- 2 thí nghiệm tách hỗn hợp các ion Fe3+

, Cu2+

và Co2+

trong dung dịch nước ở

dạng muối nitrat hoặc muối clorrua:

+ Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi: NH4NO3 4M - NH3 4M

(9:1), tách Fe3+

-Cu2+

-Co2+

, Fe

3+-Cu

2+,Fe

3+-Co

2+, Cu

2+-Co

2+

+ Pha tĩnh là silicagel, pha động là hệ dung môi: CH3COONH4 1,5M -

CH3COOH 1,5M (6:4), tách Fe3+

-Cu2+

hoặc Fe3+

-Co2+

3.2. Sắc ký lớp mỏng

3.2.1. Tách chất màu trong lá xanh

a) Bản mỏng silicagel của hãng Merck, hệ dung môi: ete dầu

hoả - axeton

Bảng 3.1. Giá trị Rf của các chất màu trong lá xanh với bản mỏng silicagel

của hãng Merck, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton

V ete dầu hoả : V

axeton

T.gian

(phút)

Các vệt màu Rf Ghi chú

10 : 0 10 Vàng

Xanh

1,0

0,0

9 : 1 10 Vàng

Xanh

0,99

0,063

8 : 2 14 Vàng

Xanh tươi

Xanh vàng

0,99

0,340

0,302

7 ; 3 10 Vàng

Xanh tươi

Xanh vàng

Vàng

Vàng

Vàng

0,99

0,486

0,471

0,457

0,429

0,286

6 : 4 10 Vàng

Xanh tươi

Xanh vàng

Vàng

Vàng

Vàng

0,98

0,600

0,557

0,514

0,414

0,44

54

5 : 5 10 Vàng

Xanh tƣơi

Xanh vàng

Vàng

Vàng

Vàng

0,98

0,82

0,78

0,75

0,68

0,58

Tách tốt nhất

4 : 6 10 Vàng

Xanh

0,96

0,83

3 : 7 10 Vàng

Xanh

0,95

0,83

2 : 8 10 Vàng

Xanh

0,93

0,85

1 : 9 10 Vàng

Xanh

0,92

0,86

0 : 10 10 Vàng

Xanh

0,90

0,87

Qua bảng trên ta thấy khi tỉ lệ axeton tăng đồng thời tỉ lệ ete dầu hoả giảm

thì khả năng di chuyển của các chất phân cực (chlorophyl, xanthophyl) tăng rõ

rệt, đồng thời khả năng di chuyển của chất không phân cực (caroten) giảm

nhưng không nhiều. Chúng tôi giải thích là khi tăng tỉ lệ axeton tức là dung môi

tăng phân cực các chất phân cực sẽ tăng khả năng giải hấp phụ với lớp mỏng

silicagel (phân cực) nên di chuyển nhanh hơn, đồng thời với quá trình đó là sự

giảm tỉ lệ ete dầu hoả (không phân cực) tuy nhiên do lớp mỏng khá phân cực,

khả năng hấp thụ của caroten tăng không đáng kể, nên caroten chuyển động

chậm lại nhưng không nhiều.

55

Hình 3.8. Sắc đồ tách chất màu trong lá xanh bằng lớp mỏng silicagel của

hãng Merck, dung môi ete dầu hoả - axeton (5:5)

Với tỉ lệ ete dầu hoả - axeton (5:5) quá trình tách tốt nhất và trong 10 phút

được kết quả từ trên xuống lần lượt là các chất caroten lẫn xanthophyl (vàng),

chlorophyl a (xanh tươi), chlorophyl b (xanh vàng), lutein (vàng), vidaxanthin

(vàng), neoxanthin (vàng).

Có thể áp dụng trường hợp này vào dạy thực hành ở trường THPT.

b) Bản mỏng tự chế tạo từ tinh bột sắn dây, hệ dung môi ete

dầu hoả - axeton

Bảng 3.2. Giá trị Rf của các chất màu trong lá xanh với bản mỏng tự

chế tạo từ tinh bột sắn dây, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton

V ete dầu hoả : V

axeton

T.gian

(phút)

Các vệt màu Rf Ghi chú

10 : 0 10 Vàng

Xanh

0,98

0,19

9 : 1 10 Vàng

Xanh tươi

Xanh vàng

0,94

0,38

0,20

8 : 2 10 Vàng

Xanh tƣơi

Xanh vàng

Vàng

0,90

0,51

0,41

0,30

kết quả tốt

7 : 3

10 Vàng

Xanh tươi

0,85

0,72

56

Xanh vàng

Vàng

0,65

0,58

6 : 4

10 Vàng

Xanh

Vàng

0,82

0,70

0,65

Chưa tách

5 : 5 10 Xanh 0,80 Chưa tách

4 : 6 10 Xanh 0,81 Chưa tách

3 : 7 10 Xanh 0,82 Chưa tách

2 : 8 10 Xanh 0,83 Chưa tách

1 : 9 10 Xanh

Vàng

0,86

0,75

Chưa tách

Qua bảng trên ta thấy khi tỉ lệ axeton tăng thì khả năng di chuyển của các

chất phân cực (chlorophyl, xanthophyl) tăng rõ rệt, tỉ lệ ete dầu hoả giảm thì khả

năng di chuyển của chất không phân cực (caroten) giảm. Chúng tôi giải thích là

khi tăng tỉ lệ axeton tức là dung môi tăng phân cực các chất phân cực sẽ tăng

khả năng giải hấp phụ với lớp mỏng bằng tinh bột (phân cực) nên di chuyển

nhanh hơn, đồng thời với quá trình đó là sự giảm tỉ lệ ete dầu hoả (không phân

cực) nên khả năng hấp thụ của caroten tăng và phân bố vào pha động ít hơn nên

caroten chuyển động chậm lại. Theo chiều từ tỉ lệ ete dầu hoả cao đến thấp các

chất không phân cực có hệ số di chuyển Rf giảm dần đồng thời các chất phân

cực có Rf tăng dần. Với tỉ lệ ete dầu hoả - axeton (8:2) quá trình tách tốt nhất và

trong 10 phút được kết quả như sau:

Hình 3.9. Sắc đồ tách chất màu trong lá xanh bằng lớp mỏng tự chế tạo từ

tinh bột sắn dây, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton (8:2)

57

Sau đó ở tỉ lệ 6:4 hai loại chlorophyl bị chồng chập, các tỉ lệ tiếp theo

gồm 5:5; 4:6; 3:7 và 2:8 chỉ thấy một vệt màu xanh chúng tôi cho rằng khi đó hệ

số di chuyển Rf của tất cả các chất không khác nhau nhiều dẫn tới chúng bị

chồng chập không tách khỏi nhau và màu xanh của hai loại chlorophyl lấn át các

màu khác nên chỉ thấy màu xanh. Ở hai tỉ lệ tiếp theo là 1:9 và 10:0 quan sát chỉ

thấy hai vệt, vệt trên màu xanh và vệt dưới màu vàng theo chúng tôi vệt trên là

các chlorophyl và các xanthophyl không tách khỏi nhau nhưng chỉ thấy màu

xanh do màu của chlorophyl lấn át màu của xanthophyl, còn vệt dưới màu vàng

là caroten có hệ số Rf giảm đến mức thấp nhất.

Như vậy ta thấy trường hợp tỉ lệ ete dầu hoả - axeton là 8:2 quá trình tách

tốt nhất, trường hợp này có thể áp dụng dạy thực hành ở trường THPT.

3.2.2. Tách các ion kim loại Fe3+

, Cu2+

, Co2+

, Ni2+

.

a) Bản mỏng silicagel của hãng Merck, hệ dung môi: NH3 4M –

NH4NO3 4M Trước tiên chúng tôi thử nghiệm đưa các mẫu riêng biệt lên bản mỏng

trước để khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ dung môi với các nồng độ 1,0 M;

2,0 và 4,0 M của 2 dung dịch NH3 và NH4NO3 và thấy nồng độ 4,0 M các chất

tách tốt hơn. Tiếp theo chúng tôi khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ ion kim

loại và thấy với nồng độ cao mẫu bị kéo dài dễ bị chồng vệt và sự khuếch tán

ngang mạnh dẫn tới mép trên của vệt dễ bị thành vạch ngang. Với nồng độ 0,1M

là tốt nhất cho quá trình tách.

Bảng 3.3. Giá trị Rf của các ion Fe3+

, Cu2+

, Co2+

, Ni2+

với bản mỏng

silicagel của hãng Merck, hệ dung môi NH3 4M – NH4NO3 4M

NH3 : NH4NO3 Rf

Fe3+

Cu2+

Co2+

Ni2+

1:9 0,0 0,26 0,12 0,42

2:8 0,0 0,18 0,07 0,35

3:7 0,0 0,17 0,05 0,31

4:6 0,0 0,15 0,04 0,28

5:5 0,0 0,13 0,02 0,24

6:4 0,0 0,11 0,01 0,20

7:3 0,0 0,10 0,0 0,18

8:2 0,0 0,07 0,0 0,15

9:1 0,0 0,05 0,0 0,10

58

Qua bảng ta thấy quá trình tách tốt nhất là tỉ lệ NH3:NH4NO3 (1:9) các vệt

từ trên xuống là Ni2+

màu xanh da trời, Cu2+

xanh lam, Co2+

xanh thẫm, Fe3+

vàng nâu. Sau đó chúng tôi cũng đã đưa mẫu hỗn hợp các ion Fe3+

-Cu2+

-Co2+

-

Ni2+

hoặc Fe3+

-Cu2+

-Co2+

lên bản mỏng ở tỉ lệ dung môi NH3:NH4NO3 (1:9), và

kết quả đã tách thành công.

Hình 2.10. Sắc đồ của các ion Fe3+

-Cu2+

-Co2+

-Ni2+

trên lớp mỏng silicagel của

hãng Merck, hệ dung môi NH3 4M – NH4NO3 4M (1:9)

a) b)

Hình 3.11. Sắc đồ tách hỗn hợp các ion kim loại bằng lớp mỏng silicagel của

hãng Merck, hệ dung môi NH3 4M – NH4NO3 4M (1:9),

a) hỗn hợp ion Fe3+

-Cu2+

-Co2+

-Ni2+

b) hỗn hợp ion Fe3+

-Cu2+

-Co2+

59

Chúng tôi sơ bộ giải thích hệ số di chuyển Rf của một số ion như sau: ion

Fe3+

không tạo được phức chất với NH3 mà tạo thành kết tủa Fe(OH)3 màu nâu

đỏ (do dung môi có môi trường bazơ) không xảy ra quá trình hấp thụ và giải hấp

với silicagel nên không di chuyển được. Các ion Cu2+

, Ni2+

và Co2+

đều có cấu

hình 3 lớp electron và tạo với NH3 thành các phức chất có kích thước ion

[Co(NH3)4]2+

> [Ni(NH3)4]2+

> [Cu(NH3)4]2+

nhưng ion [Co(NH3)4]2+

di chuyển

chậm hơn có thể do phức của coban rất bền (Kb = 1,99x1035

), cân bằng trao đổi

ion thiết lập chậm hơn:

2RSiO3H + [Co(NH3)4]2+

(RSiO3)2[Co(NH3)4] + 2H+

Khi tỉ lệ NH4NO3 trong dung môi tăng khả năng di chuyển của ion Cu2+

,

Ni2+

và Co2+

đều tăng là do khi đó pH giảm tức nồng độ ion H+ tăng làm cân

bằng:

2RSiO3H + [M(NH3)4]2+

(RSiO3)2[M(NH3)4] + 2H+

chuyển dịch sang trái giảm khả năng hấp phụ với pha tĩnh nên chúng di chuyển

nhanh hơn. Riêng trường hợp ion Ni2+

di chuyển nhanh nhất chúng tôi thấy chưa

đủ căn cứ để đưa ra lời giải thích.

Vậy với tỉ lệ NH3:NH4NO3 (1:9) có thể áp dụng tách hỗn hợp các ion

Fe3+

-Cu2+

-Co2+

-Ni2+

trong dung dịch nước ở dạng muối clorua hoặc nitrat cho

học sinh THPT trong giờ học. Dĩ nhiên là khi không có đủ các ion kim loại cũng

có thể thực hiện tách hỗn hợp 2 hoặc 3 ion trong số 4 ion đó .

b) Bản mỏng chế tạo từ tinh bột sắn dây, hệ dung môi: axeton –

HCl đặc

Trước tiên chúng tôi thử nghiệm đưa các mẫu riêng biệt lên bản mỏng

trước để khảo sát và có kết quả được ghi ở bảng sau:

Bảng 3.4. Giá trị Rf của các ion Fe3+

, Cu2+

, Co2+

với bản mỏng chế tạo từ

tinh bột sắn dây, hệ dung môi: axeton - HCl đặc

axeton : HCl đặc Rf Ghi chú

Fe3+

Cu2+

Co2+

10:0 0,68 0,45 0,41

9:1 0,83 0,55 0,46 Tách tốt nhất

8:2 0,60 0,40 0,38

7:3 0,34 0,22 0,22

Qua thực nghiệm chúng tôi thấy do không sử dụng thuốc thử hiện màu

nên ở nồng độ 0,1 M đến 0,5 M của các ion kim loại, sắc đồ rất mờ khó quan

60

sát, vì thế chúng tôi đã thử nghiệm với các nồng độ tăng dần và thấy sắc đồ đậm

dần và nồng độ các ion kim loại khoảng 1,0 M là hợp lý. Tuy nhiên ở nồng độ

cao mẫu bị giãn rộng dẫn tới vệt có thể thành vạch ngang, để tránh hiện tượng

mẫu khuếch tán ngang chúng tôi đã đưa mẫu lên bản mỏng ở dạng vạch ngang.

Chúng tôi nhận thấy khi chỉ có axeton các ion di chuyển chậm và khó

tách, ở tỉ lệ 9 axeton : 1HCl đặc các ion đều di chuyển nhanh rõ rệt và quá trình

tách là tốt nhất, sau đó khi tỉ lệ HCl đặc tăng thêm thì dung môi và mẫu đều chỉ

di chuyển một đoạn rồi dừng hẳn, tỉ lệ HCl đặc càng cao khoảng di chyển của

mẫu và dung môi càng giảm có lẽ do khi đó HCl bay hơi quá nhiều (có lẫn

nước) làm lớp mỏng bị ẩm mất lực mao quản nên cả mẫu và dung môi không di

chuyển lên theo lớp mỏng được. Đến tỉ lệ 30% HCl chúng tôi thấy mẫu di

chuyển không đáng kể đồng thời bình sắc ký bị mờ nhanh do sự bay hơi mạnh

của HCl, vì thế chúng tôi quyết định không thử nghiệm ở các tỉ lệ HCl cao hơn

nữa. Sau khi thử nghiệm đưa riêng các mẫu lên bản mỏng chúng tôi đã đưa mẫu

hỗn hợp của 3 ion Fe3+

-Cu2+

-Co2+

, mẫu hỗn hợp 2 ion Fe3+

-Cu2+

, mẫu hỗn hợp 2

ion Fe3+

-Co2+

ở tỉ lệ axeton - HCl đặc (9:1) và thấy trong thời gian 10 – 13 phút

tách được hỗn hợp 2 ion Fe3+

-Cu2+

hai vệt từ trên xuống là ion Fe3+

(màu vàng)

và ion Cu2+

(màu xanh) hoặc hỗn hợp 2 ion Fe3+

-Co2+

hai vệt từ trên xuống là

ion Fe3+

(màu vàng) và ion Co2+

(màu xanh). Nếu tách hỗn hợp 3 loại ion Fe3+

-

Cu2+

-Co2+

cần 16 phút các vệt màu từ trên xuống là ion Fe3+

(màu vàng), ion

Cu2+

(màu xanh) và ion Co2+

(màu xanh), Cu2+

và Co2+

không tách hoàn toàn.

a) b)

Hình 3.12. Sắc đồ tách hỗn hợp các ion kim loại bằng lớp mỏng tự chế

tạo từ tinh bột sắn dây, dung môi axeton – HCl đặc (9:1)

a) hỗn hợp ion Fe3+

, Cu2+

, Co2+

b) hỗn hợp ion Fe3+

, Cu2+

61

Với mức độ chỉ tách định tính cho học sinh THPT thì các trường hợp vừa nêu

đều có thể dụng vào dạy thực hành ở trường THPT.

3.2.3. Kết luận

Với sắc ký lớp mỏng chúng tôi đã lựa chọn được 2 thí nghiệm tách chất

màu trong lá xanh là:

+ Sử dụng bản mỏng silicagel của hãng Merck, hệ dung môi: ete dầu hoả -

axeton (5:5)

+ Sử dụng bản mỏng tự chế tạo từ tinh bột sắn dây, hệ dung môi ete dầu

hoả - axeton (8:2)

- Và lựa chọn được 2 thí nghiệm tách các ion kim loại là:

+ Sử dụng bản mỏng silicagel của hãng Merck, hệ dung môi: NH3 4M –

NH4NO3 4M (1:9) tách hỗn hợp các ion Fe3+

-Cu2+

-Co2+

-Ni2+

+ Sử dụng bản mỏng tự chế tạo từ tinh bột sắn dây, hệ dung môi: axeton –

HCl đặc (9:1) tách hỗn hợp các ion Fe3+

-Cu2+

-Co2+

; Fe3+

-Cu2+

; Fe3+

-Co2+

Các thí nghiệm này có thể áp dụng vào dạy ở trường THPT.

62

3.3. Sắc ký giấy

3.3.1. Tách chất màu trong lá xanh

a) Giấy sắc ký 3S, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton

Bảng 3.5. Giá trị Rf của các chất màu trong lá xanh với giấy sắc ký 3S, hệ

dung môi ete dầu hoả - axeton

V ete dầu hoả:V axeton T.gian

(phút)

Các vệt

màu

Rf Ghi chú

10:0 8 Vàng

Xanh

0,98

0,06

chỉ tách caroten

9:1 10 Vàng

Vàng

Xanh

Xanh vàng

0,86

0,64

0,54

0,45

Tách tốt nhất

8:2 10 Vàng

Vàng

Xanh tươi

Xanh vàng

0,84

0,793

0,724

0,621

7:3 10 Vàng

Vàng

Xanh tươi

Xanh vàng

0,81

0,79

0,74

0,67

6:4 10 Vàng

Xanh

0,78

0,73

Không tách

5:5 10 Vàng

Xanh

0.78

0,74

Không tách

4:6

10 Vàng

Xanh

0,76

0,75

Không tách

3:7 10 Xanh 0,77 Không tách

2:8 10 Xanh 0,78 Không tách

1:9 10 Xanh 0,80 Không tách

0:10 10 Xanh 0,81 Không tách

Chúng tôi xin giải thích định tính như sau:

Khi tỉ lệ ete dầu hoả (dung môi không phân cực) cao thì chất có màu vàng di

chuyển nhanh (Rf lớn) và ở trên nhất chúng tôi cho rằng đó là caroten điều này

63

phù hợp với lý thuyết vì caroten không phân cực sẽ di chuyển tốt trong dung

môi không phân cực, đồng thời khi đó các chất phân cực (chlorophyl, các

xanthophyl có từ 2 nguyên tử oxi trở lên) di chuyển khó khăn (Rf nhỏ), Khi tỉ lệ

axeton (dung môi phân cực) cao thì các chất phân cực di chuyển nhanh (Rf lớn).

Tóm lại dung môi càng phân cực hệ số di chuyển Rf của những chất phân cực

càng lớn, dung môi càng ít phân cực hệ số di chuyển Rf của những chất không

hoặc ít phân cực càng lớn, điều này hoàn toàn phù hợp với qui luật những chất

cùng phân cực hoặc cùng không phân cực dễ phân bố trong nhau. Nhìn vào bảng

trên ta thấy khi dung môi là 100% ete dầu hoả chỉ tách được caroten các chất

còn lại do phân cực nên di chuyển rất ít, sau khi tăng tỉ lệ axeton 10% thì Rf của

caroten giảm đồng thời Rf của xanthophyl và chlorophyl tăng và đã tách được 4

chất từ trên xuống là caroten, xanthophyl, chlorophyl a, chlorophyl b. Sau đó

theo quy luật thay đổi Rf đến tỉ lệ 40% và 50% axeton thì xanthophyl,

chlorophyl a, chlorophyl b không tách khỏi nhau nên chỉ quan sát thấy hai vệt

màu, màu vàng của caroten (vệt trên) và màu xanh của xanthophyl, chlorophyl

a, chlorophyl b không tách khỏi nhau (vệt dưới). Từ tỉ lệ axeton 60% trở lên các

chất có Rf khác nhau không nhiều nên không tách được chất nào ta chỉ thấy một

vệt màu xanh do màu xanh của chlorophyl lấn át các màu khác. Vậy với hệ dung

môi ete dầu hoả - axeton với tỉ lệ thể tích tương ứng 9:1 tách được tốt nhất và

kết quả tách được 4 chất theo thứ tự từ trên xuống là: caroten (vàng), xanthophyl

(vàng), chlorophyl a (xanh tươi), chlorophyl b (xanh vàng), trong thời gian 10

phút. Trường hợp này có thể áp dụng vào dạy ở trường THPT.

Hình 3.13. Sắc đồ tách các chất màu trong lá xanh bằng giấy sắc

ký 3S, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton (9:1)

64

b) Giấy sắc ký là giấy lọc, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton

Chúng tôi thử thay thế giấy sắc ký bằng giấy lọc loại đường kính 12cm

thường sử dụng trong các phòng thí nghiệm hoá học vì thành phần chính của

giấy sắc ký cũng như giấy lọc đều là xenlulozơ, giấy sắc ký có ưu điểm nổi bật

là rất rẻ tiền và rất phổ biến trong các phòng thí nghiệm hóa điều này rất phù

hợp với mục tiêu của đề tài. Kết quả như sau:

Bảng 3.6. Giá trị Rf của các chất màu trong lá xanh với giấy sắc ký là giấy

lọc, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton

V ete dầu hoả:V axeton T.gian

(phút)

Các vệt màu Rf Ghi chú

10:0 10 Vàng

Xanh

1,00

0,14

9:1 10 Vàng

Xanh tươi

Xanh vàng

0,98

0,66

0,31

Chưa tách hoàn toàn

caroten và xanthophyl

8:2 10 Vàng

Vàng

Xanh tƣơi

Xanh vàng

0,95

0,76

0,67

0,54

Tách tốt nhất

7:3 10 Vàng

Xanh tươi

Xanh vàng

0,94

0,89

0,84

Không tách

6:4 10 Vàng

Xanh

0,92

0,85

Không tách

5:5 10 Vàng

Xanh

0,92

0,86

Không tách

4:6 10 Vàng

Xanh

0,91

0,87

Không tách

3:7 10 Vàng

Xanh

0,91

0,87

Không tách

2:8 10 Vàng

Xanh

0,90

0,87

Không tách

1:9 10 Vàng

Xanh

0,91

0,88

Không tách

10:0 10 Vàng

Xanh

0,90

0,89

Không tách

65

Xét thấy cách giải thích trường hợp này vẫn như trường hợp giấy sắc ký ở

trên, nên chúng tôi xin phép không trình bày nữa. Qua bảng số liệu giá trị hệ số

Rf của hai trường hợp sử dụng sử dụng giấy sắc ký và sử dụng giấy lọc chúng

tôi thấy khả năng tách của giấy lọc và giấy sắc ký gần như nhau, mẫu di chuyển

trên giấy lọc nhanh hơn chút ít so với giấy sắc ký có lẽ do giấy lọc hơi kém phân

cực hơn. Tuy nhiên với mục đích của đề tài và qua bảng số liệu trên ta thấy sử

dụng giấy lọc thay cho giấy sắc ký có ưu điểm dễ kiếm, giá rẻ thời gian tách

nhanh nên hoàn toàn có thể áp dụng trường hợp tỉ lệ dung môi ete dầu hoả -

axeton (8:2) vào giờ dạy ở trường THPT. Với thời gian 10 phút tách được 4 vệt

màu từ trên xuống là caroten (vàng), xanthophyl (vàng), chlorophyl a (xanh

tươi), chlorophyl b (xanh vàng).

a) b)

Hình 3.14. Sắc đồ tách chất màu trong lá xanh bằng giấy lọc, hệ dung

môi ete dầu hoả - axeton (8:2), a) mẫu tròn, b) mẫu vạch ngang.

Chúng tôi cũng đã thử nghiệm trường hợp tách này trong thời gian 3 – 4

phút và thấy vẫn tách được 4 vệt màu như trên, nhưng các vệt ở sát nhau hơn,

tuy nhiên trong một giờ dạy ở trường phổ thông thì thời gian thí nghiệm ngắn

cũng là một ưu điểm.

66

Hình 3.15. Sắc đồ tách chất màu trong lá xanh bằng giấy lọc, hệ dung

môi ete dầu hoả - axeton (8:2), thời gian 3 phút.

c) Giấy sắc ký 3S, hệ dung môi: toluen - cồn etylic tuyệt đối

Bảng 3.7. Giá trị Rf của các chất màu trong lá xanh với giấy sắc ký 3S, hệ

dung môi toluen - cồn etylic tuyệt đối

V toluen:V cồn etylic T.gian

(phút)

Các vệt

màu

Rf Ghi chú

10:0 8 Vàng

Vàng

Xanh tƣơi

Xanh vàng

0,97

0,92

0,46

0,35

Tách tốt nhất

9:1 8 Vàng

Xanh

0,96

0,87

Không tách

8:2 8 Xanh 0,98 Không tách

7:3 10 Xanh 0,98 Không tách

6:4 10 Xanh 0,965 Không tách

5:5 10 Xanh 0,96 Không tách

4:6 10 Xanh 0,97 Không tách

3:7 10 Xanh 0,98 Không tách

2:8 10 Xanh 0,97 Không tách

1:9 10 Xanh 0,96 Không tách

10:0 10’ Xanh 0,97 Không tách

67

Qua bảng ta thấy khi dung môi là hỗn hợp toluen và cồn etylic các chất

không tách mà di chuyển rất nhanh gần bằng tốc độ của dung môi có thể do

dung môi phân cực nhiều đồng thời giấy sắc ký ít phân cực, chỉ có trường hợp

dung môi 100% là toluen tách được 4 vệt màu đó là: caroten (vàng),

xanthophyl(vàng), chlorophyl a (xanh tươi) và chlorophyl b (xanh vàng) trong 8

phút nhưng pic không đẹp tuy nhiên vẫn có thể áp dụng trường hợp này vào bài

thực hành ở trường THPT trong trường hợp không có dung môi ete dầu hoả và

axeton.

Hình 3.16. Sắc đồ tách chất màu trong lá xanh bằng giấy sắc ký, dung môi

toluen.

68

d) Giấy sắc ký là giấy lọc, hệ dung môi toluen - cồn etylic tuyệt

đối

Bảng 3.8. Giá trị Rf của các chất màu trong lá xanh với giấy lọc, hệ dung

môi toluen - cồn etylic tuyệt đối

V toluen:V cồn etylic T.gian

(phút)

Các vệt màu Rf Ghi chú

10:0 8 Vàng

Vàng

Xanh tƣơi

Xanh vàng

0,98

0,93

0,46

0,36

Tách tốt nhất

9:1 8 Vàng

Xanh

0,97

0,88

Không tách

8:2 8 Xanh 0,98 Không tách

7:3 10 Xanh 0,98 Không tách

6:4 10 Xanh 0,97 Không tách

5:5 10 Xanh 0,96 Không tách

4:6 10 Xanh 0,97 Không tách

3:7 10 Xanh 0,96 Không tách

2:8 10 Xanh 0,97 Không tách

1:9 10 Xanh 0,96 Không tách

10:0 10’ Xanh 0,98 Không tách

Qua bảng số liệu ta thấy kết quả tương tự như trường hợp sử dụng giấy sắc ký

chỉ có dung môi là 100% toluen tách được 4 vệt màu đó là: caroten (vàng),

xanthophyl (vàng), chlorophyl a (xanh tươi) và chlorophyl b (xanh vàng) trong 8

phút và có thể áp dụng vào dạy ở trường THPT.

69

Hình 3.17. Sắc đồ tách chất màu trong lá xanh bằng giấy lọc, dung môi

toluen.

3.3.2. Tách các ion Fe3+

, Cu2+

và Co2+

a) Giấy sắc ký 3S, hệ dung môi: axeton - HCl đặc

Trước tiên chúng tôi thử nghiệm đưa các mẫu riêng biệt lên giấy sắc ký để

khảo sát và qua thực nghiệm chúng tôi thấy do không sử dụng thuốc thử hiện

màu nên ở nồng độ 0,1M đến 0,5M của các ion kim loại sắc đồ rất mờ khó quan

sát, vì thế chúng tôi đã thử nghiệm với các nồng độ tăng dần thì sắc đồ đậm dần

và nồng độ các ion kim loại khoảng 1,0 M– 1,5 M thì sắc đồ hiện khá rõ. Tuy

nhiên ở nồng độ cao mẫu dễ bị giãn rộng do khuếch tán ngang dẫn tới vệt màu

thành vạch ngang, chúng tôi đã chọn phương pháp đưa mẫu lên ở dạng vạch

ngang để khắc phục nhược điểm này. Chúng tôi cũng thấy ở tỉ lệ 9 axeton :

1HCl đặc các ion đều di chuyển nhanh rõ rệt và quá trình tách là tốt nhất, sau đó

khi tỉ lệ HCl đặc tăng thêm thì dung môi và mẫu đều chỉ di chuyển một đoạn rồi

dừng hẳn, tỉ lệ HCl đặc càng cao khoảng di chyển của mẫu và dung môi càng

giảm có lẽ do khi đó HCl và nước bay hơi quá nhiều làm giấy sắc ký bị ẩm mất

lực mao quản nên cả mẫu và dung môi không di chuyển lên được. Đến tỉ lệ 30%

HCl chúng tôi thấy mẫu di chuyển không đáng kể đồng thời bình sắc ký bị mờ

nhanh do hơi HCl lẫn nước quá nhiều, vì thế chúng tôi không thử nghiệm ở các

tỉ lệ HCl cao hơn nữa.

70

Bảng 3.9. Giá trị Rf của các ion Fe3+

, Cu2+

và Co2+

với giấy sắc ký 3S, hệ

dung môi axeton - HCl đặc

axeton : HCl

đặc

Rf Ghi chú

Fe3+

Cu2+

Co2+

10:0 0,94 0,72 0,67

9:1 0,92 0,72 0,66 Tách tốt nhất

8:2 0,91 0,68 0,64

7:3 0,68 0,62 0,59

Sau khi thử nghiệm đưa riêng các mẫu lên giấy sắc ký chúng tôi đã đưa

mẫu hỗn hợp của 3 ion Fe3+

-Cu2+

-Co2+

, mẫu hỗn hợp 2 ion Fe3+

-Cu2+

, mẫu hỗn

hợp 2 ion Fe3+

-Co2+

ở tỉ lệ axeton - HCl đặc (9:1) và thấy trong thời gian 10 – 13

phút tách được hỗn hợp 2 ion Fe3+

-Cu2+

hai vệt màu từ trên xuống là ion Fe3+

(màu vàng) và ion Cu2+

(màu xanh) hoặc hỗn hợp 2 ion Fe3+

-Co2+

hai vệt màu từ

trên xuống là ion Fe3+

(màu vàng) và ion Co2+

(màu xanh để trong không khí

chuyển dần thành tím hồng).

a) b) c)

Hình 3.18. Sắc đồ tách hỗn hợp các ion kim loại bằng giấy sắc ký, hệ dung

môi axeton – HCl đặc (9:1) a) hỗn hợp ion Fe3+

-Cu2+

-Co2+

, b) hỗn hợp ion

Fe3+

-Co2+

, c) hỗn hợp ion Fe3+

-Cu2+

.

71

Nếu tách hỗn hợp 3 loại ion Fe3+

-Cu2+

-Co2+

cần 16 – 20 phút các vệt màu

từ trên xuống là ion Fe3+

(màu vàng) và ion Cu2+

(màu xanh) và ion Co2+

(màu

xanh để trong không khí chuyển dần thành tím hồng). Tuy Cu2+

và Co2+

không

tách hoàn toàn nhưng với mức độ chỉ tách định tính cho học sinh THPT thì các

trường hợp này đều có thể dụng vào dạy thực hành ở trường THPT.

b) Giấy sắc ký là giấy lọc, hệ dung môi: axeton - HCl đặc

Do cách tiến hành và quá trình sắc ký hoàn toàn tương tự với giấy sắc ký

nên chúng tôi xin phép không trình bày cách làm mà nêu luôn kết quả:

Khi thay đổi tỉ lệ dung môi thì khả năng di chuyển của dung môi thay đổi

không đáng kể, có lẽ do sự phân cực của dung môi không thay đổi nhiều. Với hệ

dung môi 9V axeton : 1V HCl đặc, thời gian 10 phút tách được hỗn hợp ion Fe3+

và ion Cu2+

hoặc hỗn hợp ion Fe3+

và Co2+

, 15 phút tách được hỗn hợp Fe3+

,

Cu2+

, Co2+

. Có thể áp dụng vào thực hành ở trường THPT.

a) b)

Hình 3.19. Sắc đồ tách hỗn hợp các ion kim loại bằng giấy lọc, hệ dung môi

axeton – HCl đặc (9:1, a) hỗn hợp Fe3+

-Cu2+

-Co2+

b) hỗn hợp Fe3+

-Cu2+

.

3.3.3. Kết luận

Với sắc ký giấy chúng tôi đã lựa chọn được 4 thí nghiệm tách chất màu

trong lá xanh có thể áp dụng vào dạy ở trường THPT đó là:

+ Giấy sắc ký 3S, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton (9:1)

+ Giấy sắc ký là giấy lọc, hệ dung môi ete dầu hoả - axeton (8:2)

72

+ Giấy sắc ký 3S, dung môi toluen

+ Giấy sắc ký là giấy lọc, dung môi toluen

- Và lựa chọn được 2 thí nghiệm tách các ion kim loại là:

+ Giấy sắc ký 3S, hệ dung môi: axeton - HCl đặc (9:1),

tách Fe3+

-Cu2+

-Co2+

, Fe3+

-Co2+

, Fe3+

-Cu2+

.

+ Giấy sắc ký là giấy lọc, hệ dung môi: axeton - HCl đặc (9:1),

tách Fe3+

-Cu2+

-Co2+

, Fe3+

-Cu2+

.

73

KẾT LUẬN CHUNG

Qua quá trình nghiên cứu chúng tôi đã lựa chọn ra được 17 thí nghiệm sắc

ký gồm sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và sắc ký giấy, có thể tách các chất màu

trong lá xanh hoặc các ion kim loại Fe3+

, Cu2+

, Co2+

, Ni2+

. Các thí nghiệm này

đều dễ thực hiện, thời gian ngắn, không cần sử dụng thuốc thử hiện màu, chỉ sử

dụng các hóa chất dễ tìm kiếm hầu hết ít hoặc không độc hại.

Trong số 17 thí nghiệm trên chúng tôi cũng đã chọn ra được 4 thí nghiệm

tốt nhất có thể sử dụng dạy ở trường THPT ở nước ta đó là:

1) Tách chất màu trong lá xanh bằng sắc ký cột, với pha tĩnh là glucozơ,

pha động là hệ dung môi: ete dầu hoả-axeton (9,5:0,5).

2) Tách hỗn hợp các ion Fe3+

-Cu2+

-Co2+

bằng sắc ký cột, với pha tĩnh là

silicagel, pha động là hệ dung môi: NH4NO3 4M - NH3 4M (9:1).

3) Tách hỗn hợp các ion Fe3+

-Cu2+

-Co2+

-Ni2+

bằng sắc ký lớp mỏng, với

bản mỏng silicagel của hãng Merck, hệ dung môi: NH4NO3 4M - NH3 4M (9:1).

4) Tách chất màu trong lá xanh bằng sắc ký giấy, với giấy sắc ký là giấy

lọc, hệ dung môi: ete dầu hoả - axeton (8:2).

Chúng tôi cũng đã cải tiến thay thế bản mỏng silicagel trong sắc ký lớp

mỏng bằng bản mỏng tự chế tạo từ tinh bột sắn dây, thay thế silicagel nhồi cột

trong sắc ký cột bằng glucozơ hoặc bột canxi cacbonat, thay thế giấy sắc ký

trong sắc ký giấy bằng giấy lọc. Các sự cải tiến đó có ưu điểm là thay thế các

hóa chất, thiết bị đắt tiền, bằng những hóa chất, thiết bị rẻ tiền, sẵn có ở Việt

Nam hoàn toàn không độc hại, mà vẫn đảm bảo hiệu quả tách sắc ký và chuyển

tải được cho học sinh những kiến thức cơ bản nhất về bản chất, nguyên lý và

ứng dụng của sắc ký.

74

KIẾN NGHỊ

Trên cơ sở kết quả nghiên cứu của đề tài và mong muốn chương trình hoá

học phổ thông ở nước ta dần theo kịp chương trình của các nước phát triển trên

thế giới, chúng tôi đề nghị trong lần thay sách giáo khoa tới bộ Giáo dục và Đào

tạo xem xét việc đưa nội dung sắc ký vào dạy ở trường trung học phổ thông.

75

TÀI LIỆU THAM KHẢO

I. Tiếng việt

1. Nguyễn Bá Hoài Anh (2003), đại cương về sắc ký lỏng, NXB Đại học

quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

2. Nguyễn Bá Hoài Anh (2003), các quá trình tách trong sắc ký lỏng,

NXB Đại học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh..

3. Nguyễn Tinh Dung (2003), Hoá Học phân tích, phần III: các phương

pháp phân tích hoá học, NXBGD, Hà Nội.

4. Lê văn Đăng (2005), chuyên đề một số hợp chất thiên nhiên, NXB Đại

học quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh.

5. Trần Đăng Kế, Nguyễn Như Khanh (1995), Sinh lý thực vật, NXB Giáo

dục.

6. Nguyễn Thanh Khuyến (2000), Các phương pháp sắc ký, Trung tâm

sắc ký thành phố Hồ Chí Minh.

7. Hoàng Nhâm (2004), Hoá học vô cơ tập ba, NXB Giáo dục.

8. Nguyễn Thị Thu Nga (2005), giáo trình thực hành hoá học phân tích,

NXBGD, Hà Nội.

9. Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn, Vũ văn Vụ (1993), Sinh lý học thực

vật, NXB Giáo dục.

10. Nguyễn Văn Ri (2009), Các phương pháp tách, khoa Hoá, Trường

ĐHKHTN ĐHQG Hà Nội.

11. Nguyễn Văn Ri (2006), hướng dẫn thực hành bộ môn hoá phân tích,

khoa hoá trường ĐHKHTN ĐHQG Hà Nội.

12. “Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 23

(2007) 130-134”

13. Phạm Hùng Việt (2001), sắc ký khí cơ sở lý thuyết và khả năng ứng

dụng, NXB ĐHQG Hà Nội.

14. Phạm Hùng Việt (2003), Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký,

NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội.

15. Đào Hữu Vinh (chủ biên), Nguyễn Xuân Dũng, Trần Thị Mĩ Linh,

Phạm Hùng Việt (1985), Các phương pháp sắc ký , NXB khoa học và kỹ thuật

Hà Nội.

16. Nguyễn Duy Minh, Nguyễn Như Khanh (1982), Thực hành sinh lý

thực vật, NXB Giáo dục.

76

II. Tiếng Anh

17. Bowen, W. R. and Baxter, W. D (1980), Experimental Cell Biology,

An Integrated Laboratory, Macmillan Publishing Co, Inc, New York.

18. D. Kealey, P. J. Haines (2002), Analytical Chemistry, printed in the

united States of America.

19. Daniel C. Harris (2007), Quantitative Chemical Analysis, printed in

the united States of America.

20. I.M. Hais, K. Macek (1963), Paper chromatography. Czechoslovak

Academy of Sciences. Prague.

21. Verlag chemie Academic pess (1966), N.Y. Thin Layer

Chromatography.

22. E. Hoftman (1967), Chromatography, Reynold. N.Y. 1967.

23. Jeff Altig (2009), “Paper Chromatography of a Metal Cation

Mixture”, CHEM 121L ,volume 50, issue 5, pp. 134 – 139.

24. Peter Keusch (2003), “Separation of Plant Pigments by Thin Layer

Chromatography (TLC)”, Organic Chemistry Demonstration Experiments on

VideoChemistry Visualized, University of Regensburg, vol. 40, issue 1, p. 36 -

40.

25. Anwar, M. H (1963), “Separation of plant pigments by thin layer

chromatography”, Journal of Chemical Education, vol. 40, issue 1, p. 29.

26. Rollins, Charles (1963), “Thin layer chromatographic separation of

leaf pigments: A rapid demonstration” Journal of Chemical Education, vol. 40,

issue 1, p. 32

27. A. S. Ritchie (1961), “A paper chromatographic scheme for

the identification of metallic ions”J. Chem. Educ, 38 (8), p 400.

28. S. Lincoln, R. A. Pohl and D. T. Haworth (1970), “A thin-layer

chromatography experiment for general chemistry”, J. Chem. Educ, 47 (5), p

401.

29. David J. Rakestraw , Rebecca J. Whelan , Theresa E. Hannon and

Richard N. Zare (2004), “Application of Ion Chromatography to the

Investigation of Real-World Samples”, J. Chem. Educ, 81 (9), p 1299