sắc ký điều chế

I. SẮC KÝ LỚP MỎNG ĐIỀU CHẾNguyên tắc – yêu cầu:Sắc ký lớp mỏng điều chế (Preparative thin layer chromatography – PTLC) là một phương pháp sắc ký được sử dụng để tách một lượng nhỏ đơn chất (10 – 1000 mg) từ một hỗn hợp đơn giản (chỉ gồm vài cấu tử). Trong PTLC, một dung dịch mẫu thử được chấm trên một lớp chất hấp phụ (thường là silica gel, nhôm oxyd) có độ dày từ 0,5 – 2,0 mm tráng trên nền phẳng (kính, kim loại, chất dẻo) đóng vai trò là một pha tĩnh. Một dung môi khai triển (pha động) di chuyển dọc theo bản mỏng sẽ làm di chuyển các cấu tử của mẫu thử theo một vận tốc khác nhau tạo thành một sắc ký đồ gồm nhiều vết có Rf khác nhau. Sau khi khai triển, ta có thể thu được những cấu tử đặc trưng bằng cách cạo vùng chất hấp phụ chứa vết ra khỏi bản và phản hấp phụ chất ra khỏi giá hấp phụ bằng một dung môi thích hợp. Hợp chất thu được từ bản mỏng có thể được tinh khiết hóa tiếp tục bằng sắc ký lớp mỏng (Thin layer chromatography – TLC) hay các phương pháp sắc ký khác hoặc hợp chất này đã đạt độ tinh khiết để tiến hành định tính, xác định cấu trúc bằng các phương pháp phân tích cơ bản hay bằng phép đo quang phổ, nghiên cứu hoạt tính sinh học, nghiên cứu tổng hợp hóa học, sử dụng như chất chuẩn đối chiếu.

1. Ưu nhược điểm của PTLC:Ưu điểm: Phương pháp tiến hành của PTLC nhìn chung tương tự như TLC chỉ khác ở việc sử dụng những bản mỏng dày hơn so với TLC: PTLC 0,5 – 2 mm, có thể dày đến 10 mm tùy yêu cầu sử dụng; TLC 0,2 – 0,25 mm. So với sắc ký cột: Nhanh và thuận tiện hơn so với sắc ký cột cổ điển.Dễ tìm được dung môi thích hợp để tách các chất.Vùng chứa chất tụ thành lớp mỏng dễ phát hiện, dễ cô lậpTỉ lệ giữa silicagel và chất tách cao nên tách tốt hơnRẻ, đơn giản hơn so với HPLC. Thiết bị, thao tác đơn giản dễ nắm bắt và áp dụng. Sử dụng một lượng nhỏ dung môi → có thể triển khai nhiều lần để thu được kết quả phân tách tốt hơn, dễ dàng tách các vùng chứa chất hấp phụ ra khỏi bản mỏng, có thể triển khai đồng thời các chất chuẩn đối chiếu trong cùng một điều kiện xác định giúp tạo thuận lợi cho việc xác định hợp chất mong muốn.Nhược điểm:Các hợp chất kém bền chấm trên bề mặt bản mỏng có thể bị phân hủy khi tiếp xúc với không khí và ánh sáng.Sự hiện diện đồng thời của tạp chất khi phản hấp phụ chất mong muốn ra khỏi giá hấp phụ.

2. Ứng dụng:Dùng để tách các chất với hàm lượng nhỏ (10 – 1000 mg) trong trường hợp không thể tách bằng các phương pháp khác.Có thể phân lập được các đơn chất tinh khiết với khối lượng đủ từ các polymer tổng hợp, các sản phẩm tự nhiên từ nuôi cấy mô hay từ dược liệu, các sản phẩm chuyển hóa từ dịch sinh học, phân biệt cấu hình hoá học của các sản phẩm thiên nhiên hay tổng hợp.để khảo sát điểm chảy, phổ UV, IR, khảo sát cấu trúc và làm chất chuẩn.

3. Pha tĩnh:Pha tĩnh hay sử dụng trong PTLC là các chất hấp phụ, các chất hấp phụ này phần lớn có trộn thêm chất kết dính như CaSO4 5 – 15 %, tinh bột 2 – 5 %, dextran, nhưng cũng có trường hợp không dùng chất kết dính.

Sắc ký điều chế - Nhóm 2 – TT DL chiều T3 Trang 1

3.1. Silica gel:

Là một chất phân cực, hoạt động chủ yếu theo cơ chế hấp phụ, trung tâm hấp phụ là các nhóm – OH silanol → hấp phụ các chất có tính kiềm (alkaloid base...) hơn là các chất có tính acid (polyphenol...)Mật độ nhóm silanol càng cao (VD: hạt càng mịn), khả năng hấp phụ của silica gel sẽ càng lớn. Khả năng hấp phụ của silica gel phụ thuộc vào phụ thuộc vào tình trạng ngậm nước của hệ thống → khi dùng silica gel làm chất hấp phụ thì nên sấy silica gel ở 1050C trong 2h là đủ, đừng nung quá 4500C

3.2. Nhôm oxyd:

Có 3 dạng: oxyd nhôm kiềm, trung tính, acid.Là một chất hấp phụ phân cực mạnh, có tính trao đổi ion lưỡng tínhTrung tâm hấp phụ là các nhóm OH, khi các trung tâm hoạt động này bị hút ẩm, oxyd nhôm sẽ giảm hoạt tính. Muốn hoạt hóa nó, người ta sấy để loại bỏ lượng nước hấp phụ này đi. Nhiệt độ sấy càng cao, lượng nước hấp phụ càng giảm đi, oxyd nhôm càng hoạt động.Oxyd nhôm có nhiều cỡ hạt, hạt càng bé khả năng hấp phụ càng cao.

3.3. Cellulose:

Cellulose chủ yếu có cơ chế phân bố, thường được dùng để tách những chất phân cực mà khó tách hoặc không thể tách được bằng cơ chế hấp phụ.Là chất cao phân tử thiên nhiên được dùng dưới dạng bột mịn và thường không cần chất kết dính.

3.4. Silica gel ghép:

Là silica gel mà nhiều nhóm Si-OH silanol được biến đổi thành nhóm Si-R, Si-O-R hay Si-O-Si-RKhi –R là mạch hydrocarbon kém phân cực (2C, 6C, 8C, 18C) ta có silica gel ghép pha đảo, đây là các chất phân bố không phân cực.Khi –R là mạch phân cực ta có silica gel ghép pha thuận, đây là các chất hấp phụ yếu nếu so với các silica gel không ghép.

3.5. Các pha tĩnh khác:

Polyamid, nhựa trao đổi ion loại ionit vô cơ – hữu cơ, Kieselguhr.

4. Dung môi:Chọn dung môi:Có độ tinh khiết cao, tránh chứa các vết kim loạiDung môi không quá dễ bay hơiThay đổi dung môi:Khả năng tách riêng các hợp chất bằng PTLC tùy thuộc tỉ lệ phân phối của các hợp chất này giữa chất hấp phụ và dung môi ly giảiThường ly giải với hỗn hợp dung môi nhưng tránh sử dụng hỗn hợp dung môi có nhiều hơn 2 cấu tử (vì hỗn hợp phức tạp dễ dẫn đến việc thay đổi pha khi thay đổi nhiệt độ)Để thay đổi khả năng tách có thể thay đổi dung môi hoặc thành phần dung môi

5. Chuẩn bị mẫu sắc ký:Chuẩn bị lớp mỏng chế hóa:Các bản mỏng chế hóa có thể tự làm trong phòng thí nghiệm (bản mỏng tự tráng) hoặc sử dụng những bản mỏng tráng sẵn.Độ dày của bản mỏng PTLC thường sử dụng là 0,5 – 2,0 mm, kích thước bản mỏng thường là 5 × 20, 10 × 20, 20 × 20, 20 × 40 hay có thể đến 20 × 100 cm tùy yêu cầu sử dụng.


Dùng các chất hấp phụ tạo hỗn dịch bền trong nước (có thể thêm một lượng nhỏ chất trơ như thạch cao để kết dính nếu cần) rồi tráng lên tấm kính phẳng thành các bản có độ dày 0,5 – 2,0 mm (có thể dày đến 10 mm) tùy yêu cầu sử dụng.Để khô bản ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày, sau đó sấy sơ bộ 600C trong 2h rồi mới sấy hoạt hóa ở 1200C trong 2h.Chuẩn bị mẫu thử (dịch chấm):Mẫu thử (đã được sơ bộ loại tạp) được cô ở áp suất giảm đến khô, sau đó hòa vào trong một lượng vừa đủ dung môi (phải hòa tan tốt mẫu thử và dễ bay hơi) rồi chấm lên bản mỏng. Chấm mẫu thử:Đánh dấu đường xuất phát cách mép dưới 1 – 2 cm.Dùng ống mao quản hay micropipette chấm dung dịch mẫu thử lên bản mỏng thành băng liên tục, băng có thể dày từ 1 – 2 mm, cách mép bản 1,5 – 2 cm.Khi chấm không được làm thủng lớp mỏng, vết chấm phải gọn (nên chấm dưới một nguồn nhiệt), chứa lượng chất thử khoảng 1 – 10 µg.Khai triển sắc ký:Đặt bản mỏng đã chấm vào bình, đậy nắp bình. Sau khi dung môi chạy đến cách đầu trên của bản khoảng 1 – 2 cm thì lấy ra, đánh dấu mức dung môi trên kính, để khô.Lưu ý:Cấu tử nghiên cứu phải dễ phát hiện (tốt nhất là phát hiện được bằng đèn UV)Những điều kiện để phân tách thành công trên bản mỏng chế hóa: Bản mỏng phải đồng nhất.Lượng mẫu chấm trên bản mỏng phù hợp.Bình triển khai sắc ký được bão hòa tốt: quan trọng nhất vì một hợp chất di chuyển trên bản mỏng với sự thay đổi vận tốc phụ thuộc vào tỷ lệ bay hơi của dung môi, nó di chuyển nhanh hơn trên bề mặt của bản mỏng và chậm hơn ở phần bản mỏng gần với giá mang, hiện tượng này được giảm thiểu tối đa trong một bình sắc ký đã được bão hòa hoàn toàn.Lượng chất hấp phụ trên bản mỏng thay đổi tùy theo từng trường hợp, đối với silica gel cần 20 – 25 g/ bản mỏng kích thước 20 × 20 cm, dày 1mm, những bản mỏng dày có thể bị nứt trong quá trình sấy do đó phải giảm lượng nước trong hỗn dịch hay hỗn hợp bột nhão của chất hấp phụ, tăng lượng chất kết dính (thạch cao CaSO4), tăng thời gian sấy hoặc có thể sấy bằng tia hồng ngoại. Vết chấm phải thẳng, hẹp và phải cách 2 mép hai bên của bản mỏng ít nhất 1 – 3 cm để tránh hiệu ứng viền thường làm dung môi chuyển động nhanh hơn hoặc chậm hơn bình thường ở hai mép của bản mỏng hơn là ở trung tâm của bản mỏng.Mẫu thử được hòa tan trong một dung môi không phân cực, dễ bay hơi ở một nồng độ mà tất cả các cấu tử của mẫu thử được hấp phụ không chỉ trên bề mặt mà phải xuyên suốt chiều dày của bản mỏng. Có thể chấm bằng tay bằng cách sử dụng micropipette hay syringe và thước kẻ hoặc có thể sử dụng những dụng cụ được thương mại hóa phục vụ cho việc chấm mẫu.

6. Cách phát hiện trong sắc ký lớp mỏng điều chế:

6.1. Soi UV:

Ưu điểm:Nhanh, tiện lợiKhông bị hao hụt mẫu như phun xịt bảnNhược điểm:Mắt nhìn thấy vị trí biểu kiến khác vị trí thực của vết → đánh dấu trật vết và không thu được chất khi cạo rồi ly giải


Phun xịt bản với thuốc thử đặc trưng:Tiến hành:Dùng tấm kiếng hoặc tấm nilon che 1 phần bản

6.2. Phun thuốc thử lên phần không bị che

Dựa vào những vết hiện trên bản, dùng spatule cạo phần silicagel để thu hợp chấtƯu điểm:Biết chính xác vị trí vếtNhược điểm:Thuốc thử tạo phức với hợp chất không thể sử dụng để cạo bản, cô lập hợp chất

6.3. Sử dụng hơi iod:

Tiến hành:Đặt bản trong buồng hơi iodKhi thấy vết lấy bản ra khỏi buồngĐánh dấu vị trí vếtPhơi bản ngoài quạt gió để bay hơi iodCạo bản để thu chất

II. SẮC KÝ CỘT ĐIỀU CHẾPhương pháp sắc ký dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa hai pha động và tĩnh. Có nhiều nguyên nhân đưa đến sự phân bố khác nhau của các chất, nhưng chính sự lặp đi lặp lại hiện tượng hấp phụ - phản hấp phụ của các chất khi dòng pha động chuyển động qua pha tĩnh là nguyên nhân chủ yếu của việc tách sắc ký.

1. CÁC CÁCH TIẾN HÀNH PHÂN TÍCH SẮC KÝTuỳ thuộc chế độ đưa mẫu vào hệ thống sắc ký cũng như các thao tác tiến hành sắc ký, người ta chia cách tiến hành sắc ký thành ba loại:

1.1. Phương pháp tiền lưu

Đây là phương pháp sắc ký đơn giản nhất. người ta cho hỗn hợp, ví dụ, hai chất A và B liên tục chảy qua cột có nạp sẵn các các chất hấp phụ. Người ta xác định nồng độ các cấu tử trong dung dịch chảy ra khỏi cột và xây dựng đồ thị theo hệ toạ độ: nồng độ cấu tử- thể tích dung dịch chảy qua cột. đồ thị này thường gọi là sắc ký đồ hay đường cong thoát (có tác giả gọi là đường cong xuất). Do các cấu tử bị hấp phụ lên cột, nên trước hết từ cột chỉ chảy ra dung môi. Sau đó trong dung dịch thoát sẽ có cấu tử bị hấp phụ yến hơn trên cột, ví dụ cấu tử A, sau đó đến phần dung dịch chứa hỗn hợp A+B, đường cong thoát theo phương pháp tiền lưu cho trên hình dưới. Trong phương pháp tiền lưu, ta chỉ thu được dung dịch thoát có cấu tử A tinh khiết ở lúc đầu, sau đó là hỗn hợp A+B. Phương pháp tiền lưu không cho phép tách hoàn toàn các cấu tử ra khỏi nhau nên thực tế ít được dùng vào mục đích phân tích các chất.


1.2. Phương pháp rửa giải

Trong phương pháp rửa giải, đầu tiên người ta cho Vml dung dịch chứa hỗn hợp các cấu tử (ví dụ, hỗn hợp hai cấu tử A và B, trong đó A có ái lực với cột nhỏ hơn B) chạy qua cột. Các cấu tử A, B chứa trong Vml trước hết sẽ bị giữ lại ở phần trên của cột. Sau đó cho dung dịch rửa (thường là dung môi hoà tan các cấu tử) chảy qua cột. Lúc đó các cấu tử bị giữ ở phần trên của cột sẽ bị dung môi “rửa” và đưa dẫn xuống phía dưới. Cấu tử A có ái lực với cột nhỏ hơn B nên chuyển động xuống phía dưới nhanh hơn B. Nếu cột đủ dài và chế độ chảy của dung dịch rửa thích hợp thì sau một thời gian cho chảy dung dịch rửa, các cấu tử tách ra thành từng vùng. Các vùng này sẽ tuần tự thoát ra khỏi cột, mỗi vùng lại được cách nhau bằng một phần dung môi. Hình bên dưới biểu diễn đường cong thoát của quá trình rửa giải. Trong phương pháp rửa giải, người ta cũng hay dùng những dung dịch chứa một cấu tử có ái lực với cột nhưng phải nhỏ hơn ái lực của các cấu tử cần tách với cột.

1.3. Phương pháp rửa đẩy

Trong phương pháp rửa đẩy, sau khi đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột một dung dịch rửa chứa chất có ái lực với pha tĩnh lớn hơn các cấu tử cần tách. Các cấu tử cần tách sẽ bị chuyển dần xuống phía dưới khi ta tiến hành quá trình rửa cột và tuần tự thoát ra khỏi cột. Cấu tử thoát ra khỏi cột đầu tiên là cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất, sau đó dần dần đến các cấu tử có ái lực với cột mạnh dần. Khác với phương pháp rửa giải, nồng độ các cấu tử không giảm qua quá trình sắc ký. Một nhược điểm quan trọng của phương pháp rửa đẩy là rất khó phân biệt các phần riêng của các cấu tử trong dung dịch thoát vì ở đây giữa các phần dung dịch thoát chứa các cấu tử không tách nhau bằng các thể tích dung dịch rửa.

2. Cột sắc ký Cột sắc ký làm bằng thép không rỉ , thủy tinh đặc biệt hoặc chất dẻo

2.1. Cột phân tích

Dài: 10-30cmĐường kính trong: 4-10mmCỡ hạt pha tĩnh: 5-10µmN=40.000-60.000 đĩa /metCột nhỏ (microcolumn): 3-7.5cm, 1-2mm, 3-5µm, N=100.000 đĩa/mét

2.2. Chất nhồi cột:

Silica (silic dioxyd) kết tụ thành silicagelSilicagel bao lớp mỏng hữu cơ liên kết ( hóa học hoặc vật lý) với bề mặtNhôm oxyd, polymer, nhựa trao đổi ion

2.3. Cột chế hóa

Dài 25-100cmĐường kính trong 6-50mm, tránh được hiệu ứng thành của cột.Tốc độ dòng lớn hơn cột phân tích Sử dụng trong dược liệu để sơ bộ tách các nhóm hợp chất

3. Pha tĩnh

3.1. Silicagel(hay kieselgel của acid silicic) pha thuận

- Chất hấp phụ được sử dụng rộng rãi hiện nay. Là một chất phân cực, thường được dùng làm pha tĩnh để phân tách các chất. phù hợp với hầu hết các pha động. nó có thể chạy với những lượng mẫu rất nhỏ như trong sắc ký lớp mỏng.


- Ngày nay, Silicagel có kích thước các lỗ là 40,60 và 100Å(Si-40, Si-60, Si-100) được dùng tron sắc ký điều chế . Si-60 thường được sử dụng nhất. Trong một vài trường hợp, kích thước hạt quá nhỏ làm giảm hiệu quả của sự chiết tách.- Silicagel có diện tích bề mặt từ 0.4-0.6g/cm3, và nhiều nhất là 2.2g/cm3.Có nhiều kích cỡ silicagel khác nhau phụ thuộc vào nhà sản xuất. Đối với sắc ký chế hóa sử dụng cho những lượng mẫu trong phòng thí nghiệm thường sử dụng loại có kích thước 15-25µm,25-40µmhay 40-63µm. - Tính hấp phụ của silicagel do các nhóm OH trên bề mặt quyết định. Nhóm OH là các trung tâm hấp phụ - Để Silicagel hấp phụ được tốt thì cần hoạt hóa trước khi sử dụng: Sắt kim loại được loại bỏ bằng cách đun sôi với HCl đặc, dùng nước rửa sạch ion clorid và lắng gan loại các hạt nhỏ lơ lửng, sau đó sấy 120oC trong 48 giờ.( đối với các bảng tráng sẵn thì không cần hoạt hóa) . Không sấy quá lâu tránh làm mất nhóm silanol→bất hoạt.- Tùy chất cần phân tích mà hoạt hóa silicagel khác nhau. Ví dụ : khi chạy tịnh dầu thì sấy silicagel cần lâu càng tốt. còn đối với các chất phân cực mạnh thì sấy hoạt hóa ít đi, them một ít nước để giảm hoạt tăng Rf.- Tuỳ theo việc chọn các dung môi thích hợp cá thể dùng silicagel để tách các hợp chất base(alkaloid) hay các hợp chất ưa dầu. Phân tách các chất có độ phân cực gần với nó. Silicagel là sự lựa chọn tốt nhất làm pha tĩnh khi phân tách cá chất có khối lượng phân tử nhỏ(<2000Da)- Khả năng tách của silicagel tốt hơn khi tẩm nó bằng dung dịch bạc nitrat10-12%, dung dịch acid boric , ammoniac, dung dịch đệm phosphate..

3.2. Nhôm oxyd

- Ít được sử dụng hơn silicagel. Thường được dùng trong sắc ký hấp phụ- Là chất hấp phụ phân cực.- Trong sắc ký có 3 dạng nhôm oxyd: nhôm trung tính, acid, base.Tùy vào chất cần tách mà lựa chọn loại oxyd nhôm sử dụng cho phù hợp(chiết các acid amin có tính base cần dùng oxyd nhôm base, khi cần tách các chất trung tính thì dùng oxyd nhôm trung bình)- Để tách tốt hơn người ta xử lý nhôm với các dung dịch acid hoặc base.Hoạt tính của nhôm oxyd tùy thuộc lượng nước nó chứa, hoạt tính sẽ giảm đi khi lượng nước gia tăng. Trước khi dùng cần hoạt hóa ở 120oC trong 1 giờ.Bậc hoạt tính của nhôm được chia làm 5 bậc:Bậc hoạt tính

I II III IV V

% nước 0 3 6 10 15

- Diện tích bề mặt của oxyd nhôm khoảng 0.9g/cm3 đến khoảng 4.0g/cm3.- Oxyd nhôm phân tách tốt các chất phân cực yếu đến trung bình, thường dùng để phân tách các hợp chất thơm( có ái lực mạnh với OH phenol) và các hợp chất đồng phân của nó. Oxyd nhôm còn được dùng để tách các chất : hydrocacbon, alkaloid, chất màu thực phẩm, lipid.

3.3. Kieselguhr

- Ở dạng bột , chứa khoảng 70-95% SiO2 phần còn lại là các oxyd kim loại. - Là một chất phân cực yếu, dùng để tách các chất phân cực như đường, các triglyceric, các acid béo bậc cao, cetoacid, lacton. Nhưng thường được dùng chủ yếu làm giá mang cho pha tĩnh trong sắc ký phân bố.


3.4. Polyamide

- Ít được dùng làm chất hấp phụ , chủ yếu được dùng để tách các chất có chứa nhóm chức phenol( flavon) , đường.

3.5. Silicagel pha đảo

- Có nhiều loại mẫu kị nước như các peptid, thì sắc ký pha đảo thường là phương pháp được lựa chọn sử dụng cột silicagel C-18.- Trong sắc ký pha đảo thì pha tĩnh có bản chất khác với pha động(pha tĩnh không phân cực , phân động phân cực)- Đây là silicagel có gắn một chuỗi carbon dài thường là 18C(c-18) hay 8C(C-8) :Si-O-Si- nối Carbon.- Các hợp chất được rửa giải ra khỏi theo thứ tự: hợp chất chứa nhóm _COOH→ alcol/phenol →amin→ eter/aldehyd→ cetone→hợp chất halogen→alkan- Mặc dù sắc ký pha đảo có mắc tiền hơn sắc ký pha thuận nhưng nó có nhiều ưu điểm hơn như:Không cần phải hoạt hóa trước khi dùng.Hệ được thiết thiết lập cân bằng nhanh chóngDung dịch thân nước có thể đi qua Tách tốt đối với các chất phân cực- Thường được áp dụng trong HPLC

3.6. Pha tĩnh cho sắc ký rây phân tử

- Rây phân tử thường dùng các chất như :dextran, agarose hay polyacrylamide( Sephadex, Sepharose, Fraktogel, Bio-gel…)- Có các loại gel như gel cứng và gel bán cứng. Các gel cứng được cấu tạo từ các hợp chất vinyl và divinyl styren polymer. Còn các gel cúng thì được cấu tạo bởi các hạt thủy tinh xốp và silicagel xốp. Tùy vào tính chất của từng loại gel ma chia ra hai loại là gel thân nước (hydrophilic gel) và gel thân dầu (lipophilic gel)- Các Shephadex thông dụng: Sephadex G(20.50.75)Sephadex LH-20

3.7. Cellulose

- Là chất cao phân tử thiên nhiên có công thức [C6H7O2(OH)3]3, dạng bột mịn , dùng không cần chất kết dính.- Tách các hợp chất thân nước.- Tăng hoạt tính của cellulose xử lý với hỗn hợp methanol, acid formic và nước hoặc bằng isopropanol, acid acetic và nước.Nhược điểm của cellulose không thể phát hiện vết sắc ký bằng các thuốc thử mạnh như NaOH, H2SO4.

4. Kỹ thuật nhồi cột sắc kí

4.1. Dụng cụ:

- Cột sắc kí (giống giống như cái buret, gồm 1 ống thủy tinh và 1 cái khóa, nhưng không cần vạch chia độ)- Chất nhồi cột (pha tĩnh, stationary phase, thường dùng silicagel, có 2 loại là silicagel pha thuận và silicagel pha đảo, silicagel pha thuận thường dùng hơn, gồm Si có đính các nhóm OH, silicagel pha đảo gồm Si có đính các dây alkan R, ngoài ra còn dùng alumin) Chất nhồi cột quyết định quá trình sắc kí.


- Nếu dùng pha thuận, silicagel có gắn nhóm OH thì nó sẽ giữ chặt các chất phân cực, các chất không phân cực sẽ liên kết với silicagel yếu hơn nên sẽ ra trước, các chất phân cực hơn sẽ ra sau. Ngoài ra tùy thuộc vào lượng mẫu có mà sẽ dùng lượng silicagel bao nhiêu, từ đó sẽ chọn kích cỡ cột sắc kí. Dùng lượng silicagel gấp 20, 30 hay 50 lần lượng mẫu. Chú ý lượng silicagel phải đổ đến khoảng gấp 10 lần đường kính cột thì quá trình tách sẽ diễn ra tốt. Dung môi: thông thường chọn dung môi phụ thuộc vào chất nhồi cột. - Nếu dùng silicagel pha thường (phân cực) thì chọn dung môi đi từ không phân cực đến phân cực (ví dụ từ chloroform đếm methanol), thông thường dùng hỗn hợp dung môi. Chú ý dung môi chạy sắc kí cột phải phân cực hơn một chút so với dung môi chạy bản mỏng vì hạt silicagel dùng cho cột sắc kí sẽ to hơn hạt trên bản mỏng nên khả năng tách sẽ kém hơn một chút.(sắc kí cột là phương pháp để tách chất sau khi đã có tất cả thông tin trên bản mỏng, TLC, thin layer chromatography, là biện pháp đầu tiên dùng để "dò tìm" thông tin về hỗn hợp của mình cũng như biện pháp tách chất cần lấy).

4.2. Thực hiện

Bước 1: nhồi cột. Sau khi đã chọn cột, làm khô và cân silicagel cần dùng, pha dung môi chạy hệ rồi thì hòa tan silicagel vào dung môi đó trong một erlen. Lấy một miếng nhỏ bông gòn nhồi dưới đáy cột để chặn silicagel lại, nếu cột quá dài thì dùng 1 dây kẽm thọt bông gòn xuống, chú ý dùng ít bông gòn. Với những cột có sẵn miếng xốp hay lọc thủy tinh để chặn silicagel rồi thì không cần làm việc này, tuy nhiên miếng xốp có nhược điểm là sau khi chạy cột xong ta phải rửa lại nhiều lần cho sạch, rất mất thời gian so với việc nhồi bông gòn, khi chạy cột xong chỉ cần vứt bông gòn. Sau khi nhồi chặt bông gòn thì tiến hành khuấy silicagel trong dung môi (không phân cực) đã pha sẵn rồi rót nhẹ nhàng vào cột. Trong lúc rót thì nên mở khóa để silicagel lắng đều, nhớ để 1 erlen bên dưới để thu hồi dung môi, tiếp tục làm như vậy đến khi cho hết lượng silicagel vào, tiến hành rót thêm dung môi (từ erlen bên dưới) để ổn định hệ, chế đi chế lại nhiều lần đến khi hệ ổn định, cột không bị nứt hay gãy thì xem như việc nhồi cột đã hoàn thành. Khóa cột lại.Bước 2: Nạp mẫu chất vào. Có 2 loại nạp mẫu là nạp mẫu khô và nạp mẫu ướt. Nạp mẫu ướt là hỗn hợp chất phân tích cũng tan trong dung môi chạy cột nên chỉ cần cho mẫu vào. Còn nếu mẫu không tan trong dung môi chạy cột thì phải hòa tan mẫu vào dung môi gián tiếp trong 1 erlen. Sau đó dùng lượng ít silicagel cho vào erlen để hấp thu mẫu, sau đó cho hết vào bình cô quay để cô quay đuổi dung môi đi thu được silicagel khô có chứa mẫu. Lúc này nạp hết silicagel đó vào cột và cho dung môi chạy cột vào: gọi là nạp mẫu khô. Khi cô quay thì nhớ lót miếng bông gòn ở miệng bình cô quay để tránh silicagel bay lên. Cô quay là chưng cất trong áp suất kém (chân không). Bước 3: Sau khi hoàn tất việc nạp mẫu rồi thì lót 1 miếng bông gòn ở bên trên mẫu chất để ổn định hệ rồi tiếp tục châm dung môi vào, từ từ thay đổi độ phân cực của hệ, chú ý không được thay đổi đột ngột cũng như chuyển từ không phân cực sang phân cực rồi lại quay lại không phân cực, làm như vậy sẽ gãy cột và phải nhồi lại từ đầu.Bước 4: Mở khóa, lúc này cột bắt đầu tách chất, hứng lượng dung môi chảy ra có kém theo chất đã tách được bằng ống nghiệm nhỏ, mỗi lần hứng khoảng 1/3ống nghiệm. Sau đó đem chấm bản các ống nghiệm, những ống có vệt tương tự nhau sẽ được gom lại, đó là 1 chất. Tiếp tục như vậy thì cuối cùng ta sẽ tách được các chất mong muốn.Ghi chú- Mỗi lần tách cần khoảng 50-200ống nghiệm, thời gian tách từ 2 đến 7 ngày.Dùng khóa để điều chỉnh tốc độ dòng chảy dung môi, ra chậm hay nhanh, việc này quyết định


quá trình tách có tốt hay không. Nếu thận trọng quá cho chạy chậm thì phải chờ lâu, nếu nôn nóng quá cho chảy nhanh thì silicagel chưa kịp tách đã phải cho ra chất, như vậy cũng không tách được.Có những hệ phải tách rất lâu, cho dù đã mở khóa hết cỡ vẫn không chảy xuống nhanh thì dùng máy đẩy (máy sục oxi dùng để nuôi cá). Nó sẽ sục không khí vào để tăng tốc quá trình đẩy dung môi xuống (chỉ dùng khi tốc độ dòng dưới khoảng 3 giọt/phút). Chú ý chất không dễ bị oxi hóa thì mới dùng phương pháp này được. Nếu không oxi không khí sẽ oxi hóa hết chất phân tích.- Nếu dùng silicagel pha đảo thì cột không cần khóa vì pha đảo chạy rất chậm, nhưng nhược điểm là phải ngồi canh nó liên tục. Chú ý khi đã chạy pha đảo thì không được dùng máy đẩy, vì bản chất pha đảo là chậm. Nếu dùng máy đẩy thì như đã nói ở trên, silicagel không tách được.Khi chạy cột thì điều tối kị là khóa cột lại quá lâu. Dĩ nhiên chạy cột 2-3 ngày thì phải khóa cột lại ở cuối ngày, nhưng hôm sau phải lên làm ngay, nếu để quá lâu thì chất bị giữ lại trong cột lâu sẽ khó tách ra hơn.

5. Pha độngPha động là một thông số dễ điều chỉnh nhất khi tối ưu hóa hệ thống sắc ký. Trong khảo sát pha động, vấn đề đặt ra là làm sao để tìm dung môi hoặc hỗn hợp dung môi phù hợp nhất trong thời gian ngắn nhất có thể và sử dụng ít nhất vật liệu.

5.1. Lựa chọn dung môi:

Dung môi lựa chọn không được ảnh hưởng tới kết quả của phương pháp phát hiện.Thường dùng hỗn hợp dung môi nên cần phải chú ý đến khả năng trộn thành hỗn hợp của các dung môi:

Điểm sôi của các dung môi cũng là một yếu tốt rất quan trọng. Nhiệt độ sôi thấp sẽ dễ dàng và tiết kiệm cho việc thu hồi. Tuy nhiên dung môi sử dụng không nên có điểm sôi quá thấp (T s > 400C) nhằm tránh sự bay hơi trong quá trình phân lập.Dung môi với độ nhớt thấp cũng được ưu tiên vì giúp giảm áp lực phải đặt lên cột.Tính bền vững và tính trơ phải được quan tâm để tránh hư mẫu.Độc tính thấp, khả năng cháy nổ và giá cả cũng cần quan tâm.Độ mạnh của dung môiSnyder dựa trên giá trị thực nghiệm đưa ra bảng giá trị độ mạnh của dung môi:


Độ phân cực của dung môiĐộ phân cực của dung môi có thể lựa chọn dựa trên tam giác chọn lọc được xây dựng bởi Snyder:


Độ tinh khiết của pha động:Không có hoạt chất nào 100% tinh khiết. Độ tinh khiết càng cao, giá càng cao. Cần phù hợp yếu tố chi phí với độ tinh khiết nhằm đưa các ảnh hưởng của nó về giới hạn phù hợp.

5.2. Dung môi cho sắc ký pha thuận:

5.3. Dung môi cho sắc ký pha đảo:

5.4. Dung môi cho sắc ký gel:

(Theo cơ chế rây phân tử, trao đổi ion, ái lực)Ngược lại với các loại sắc ký khác, sắc ký gel không cho phép người dùng tác động lên tính tan do sự thay đổi pha động. Pha động chỉ được chọn theo 3 tiêu chí:Khả năng hòa tan tốt mẫuĐộ nhớt thấp (= áp lực tác động lê gel thấp)Không làm phá hủy pha tĩnh.Tài liệu cung cấp từ nhà sản xuất gel cần phải được nghiên cứu kĩ lưỡng nhằm tránh cho gel bị phá hủy do tương tác với dung môi không phù hợp.


6. Cách phát hiện trong sắc ký cột điều chế:Phương phát ghi nhận sắc ký bằng detector UV thường được sử dụng nhất. Trong khi việc phun thuốc thử giống để phát hiện là không khả thi thì sử dụng máy đo UV lại tỏ rõ hiệu quả, sự chọn lọc và tính khả dụng.

6.1. UV detector

Áp dụng được cho các hợp chất có nhân thơm, có nối đôi liên hợp, nhóm carbonyl, có chứa iod, brom, sulfur,…Nhìn chung UV detector có thể sử dụng được cho sắc ký gel mà không cần rửa giải.

6.2. Refractive detector (RI)

Bộ phận phát hiện nhờ chỉ số khúc xạ. Bộ phận phát hiện này tuy có độ nhạy thấp hơn so với bộ phát hiện UV nhưng nó có ứng dụng nhất định trong sắc ký điều chế. Với độ nhạy thấp, khi lựa chọn dung môi sẽ dựa vào RI để lựa chọn được loại dung môi nào chạy ra kết quả có nồng độ cao nhất.

7. Định tính một cột sắc kýVì nhiều lý do, cần thiết phải có sự đánh giá những đặc thù nhất định của cột tự làm.Thông tin nào quan trọng nhất cho việc đánh giá một cột sắc ký chế hóa?Thông tin về hiệu lực cột, thông tin này cho phép đưa ra kết luận về kết quả phân lập của sắc ký.

7.1. Sắc ký đồ

Nếu đầu ra của cột được ghi nhận bởi một bộ phận phát hiện thích hợp trong quá trình phân lập sắc ký, và tín hiệu từ bộ phận phát hiện được ghi nhận dạng nồng độ theo thời gian, sẽ ghi nhận được đường cong điển hình. Đường cong GausianToàn bộ các ghi nhận của các tín hiệu được gọi là sắc ký đồ. Dữ liệu sau đâu có thể thu trực tiếp từ một sắc ký đồ:


to = thời gian chết của cột, thời gian cần thiết cho dung môi chảy qua hết cột với tốc độ dòng xác địnhtR = Thời gian lưu, thời gian từ khi triển khai mẫu đến pic cực đạiW = Độ rộng cơ bản của picB0,5 = độ rộng pic tại ½ chiều cao.Sẽ không thực sự hợp lý nếu đánh giá một cột dựa vào thời gian lưu hoặc độ rộng của pic.Những thông số này phụ thuộc vào quá nhiều yếu tố như tốc độ dòng, thành phần dung môi, chiều dài cột… Tuy nhiên, việc đánh giá cột một cách thích hợp đối với sắc ký điều chế là dựa vào SI (symmetry index - chỉ số đối xứng) và số đĩa lý thuyết hay chiều cao đĩa lý thuyết.SI mô tả sơ lược hình dáng của pic và do đó là một thông số có ích cho việc đánh giá đặc tính chảy của cột. SI được định nghĩa:SI = b/aSự bất đối xứng trở nên rõ ràng, tuy nhiên, một điều kiện tiên quyết cho loại thử nghiệm này phải sử dụng đối với chất có khả năng tách rửa tốt nhất.

Ví dụ của một pic tốt (trái) và một pic xấu (phải)SI được đo không phải tại đường nền mà ở vị trí 5% hoặc 10% của chiều cao pic. (trong ví dụ này là 5%)

7.2. Số đĩa lý thuyết

Một thông số dùng để so sánh khác là số đĩa lý thuyết N của cộtCông thức tính N có được dựa trên giả định rằng pic có hình dạng đường cong Gaussian. Để đơn giản tính toán, các pic được thừa nhận có hình dạng Gaussian.


Số N lớn tương ứng với cột tốt.Khoảng cách lý thuyết cho một quá trình giải hấp phụ - hấp phụ là một đĩa lý thuyết do đó nó là thông số đại diện tốt nhất cho các thông số khác (kích thước pha hấp phụ, tốc độ dòng, chiều dài cột,…)

7.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến số đĩa lý thuyết:

Các yếu tố do pha động:Độ nhớtHóa chất tự nhiênTốc độ đưa vào cộtTốc độ khuếch tán vào pha tĩnhCác yếu tố hòa tanHóa chất tự nhiênMẫu nạp vào cộtDung môi nạp mẫuNồng độ của mẫu Tốc độ khuếch tán ở mỗi phaYếu tố dung tích k’Yếu tố do pha tĩnhĐường kính cộtKích thước hạt

Phân bố hạtHình dạng hạtBề mặtKích thước và hình dạng lỗ

Các yếu tố thuộc tính toánHình dạng picĐộ bất đối xứng của picPhương pháp tính toánĐộ chính xác và độ đúng của các phương pháp đo, ghi nhậnCác yếu tố thuộc về máy móc thiết bịTính đồng nhất của cấu trúc lớp nhồi cộtKhoảng trống và các kênh giữa các lớp nhồi cộtThể tích chết quá mức trong hệ thống LC

7.4. Chiều cao tương ứng với một đĩa lý thuyết

Để có thể so sánh các cột có chiều dài khác nhau, cần thiết phải tính chiều cao của đĩa lý thuyết H (H=L/N với L là chiều dài của cột)

7.5. Chiều cao đĩa lý thuyết đã làm giảm

Nhằm so sánh các cột có kích cỡ khác nhau, thông số thích hợp nhất là chiều cao đã làm giảm hh = H/d (d là đường kính của cột)Trong một vài trường hợp, số đĩa lý thuyết phụ thuộc chặt chẽ và hoạt chất sử dụng để kiểm tra. Thông tin chính xác về chất thử và điều kiện thử cần phải được cung cấp.

7.6. Độ phân giải

Độ phân giải mô tả mối liên hệ của 2 pic, đây là thông số đóng vai trò quan trọng trong việc phân lập một hỗn hợp các chất.R = 2(tR2 – tR1)/(w1 + w2) = 1,177(tR2 – tR1)/(b0,5(1) + b0,5(2))


7.7. Thể tích chết

Thể tích chết V0 được định nghĩa là khoảng trống trong cột sắc ký.V0 = tR . Fm (Fm là tốc độ phân phối hay lưu lượng dòng)G. Helmchen và B.Glatz đã đề nghị một phương pháp khác để tính V0 Cột được làm đầy với một dung môi thứ nhất (tỉ trọng d1), đóng kín và cân (G1). Cột sau khi triển khai được phục hồi lại bằng một dung môi thứ hai (d2), cũng đóng kín và cân (G2). V 0

được tính theo công thứcV0 = (G2 – G1)/(d2 – d1)Biết được V0 có thể tính toán được thời gian chết to to = V0 / Fm

8. Phân lập kết quả sắc ký:Khi yếu tố phân giải giảm và các pic trở nên gần nhau hơn, việc phân lập trở nên khó khăn

Mặc dù không lý tưởng nhưng sự phân lập của các chất tinh khiết vẫn có thể thực hiện được với độ phân giải R = 0.6 nhưng việc này đòi hỏi một điểm cắt trong các phân đoạn thu được. Chỉ các phân đoạn rìa tùy theo mỗi pic được thu thập và phần còn lại nằm giữa chúng có thể được thu hồi và tái phân lập.

Trường hợp tiến hành sắc ký quá tải có thể xảy ra hiện tượng kéo đuôi, cần có sự điều chỉnh vị trí thu thập để tránh lẫn phần kéo đuôi của pic trước.

8.1. Yếu tố phân giải alpha

α = (tR2 – t0) / (tR1 – t0) (tR2 >= tR1)Nếu hai thời gian lưu bằng nhau, α = 1 khi đó không thể phân lập được.

Giá trị α càng lớn, việc phân lập càng dễ dàng.

9. Sắc ký cột nhanh (FC – Flash Chromatography)

Giới thiệuVào giai đoạn đầu của kỹ thuật sắc ký, những cột đơn giản bằng thủy tinh được sử dụng, hoạt động nhờ vào áp lực thủy tĩnh của dung môi. Trong một ấn phẩm năm 1978 Clark W.Still khám phá ra khả năng tăng tốc quá trình phân lập trên cột thủy tinh, từ đó gia tăng


hiệu lực của phương pháp sắc ký. Kết quả hết sức thuyết phục và trở nên một phương pháp tinh chế không ngờ trong hóa học chế hóa.Ngày nay sắc ký cột nhanh càng được phát triển với nhiều thiết bị hỗ trợ và sự tiện dụng.Sắc ký cột nhanh trở nên phổ biến vì chúng đơn giản dễ sử dụng, tiện lợi và có thể trang bị ở mọi phòng thí nghiệm.

9.1. Nguyên tắc:

Sự phân lập sắc ký dựa trên một trạng thái cân bằng giữa các thành phần cần phân lập, một tác nhân hấp phụ trong cột (pha tĩnh) và một dung môi chảy xuyên qua nó (pha động).Khi một thành phần phân tán vào pha tĩnh được định nghĩa là sự hấp phụ, sự tách ra bởi pha động được định nghĩa là sự phản hấp phụ. Khả năng hấp phụ cao giữa các thành phần và pha tĩnh đồng nghĩa với sự lưu giữ của các chất này, được xem như chậm trong sự rửa giải cột. Sự phân lập của một hỗn hợp ra các thành phần riêng biệt chỉ có thể thực hiện khi mỗi thành phần này có đặc tính hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau.

9.2. Lựa chọn pha tĩnh phù hợp

Có thể tiến hành sắc ký trên cả pha tĩnh phân cực và không phân cực, độ hấp phụ tùy thuộc vào mỗi nhà sản xuất.

Sắc ký chuẩn yêu cầu sử dụng pha tĩnh phân cực như silica gel và dung môi không phân cực. Các thành phần riêng lẻ bị lưu giữ là do tương tác giữa nhóm chức phân cực của nó với chất hấp phụ. Các chất phân cực yếu được rửa giải ra trước, tiếp sau đó là các chất phân cực mạnh hơn.Trong sắc ký pha đảo, pha tĩnh là chất không phân cực và sự rửa giải được thực hiện bởi dung môi phân cực. Những pha tĩnh này được thiết kế bằng cách thay đổi silica gel với nhóm không phân cực nhưng C-18 hoặc những gốc tương đồng. Vật liệu pha đảo mắc hơn nhiều so với pha tĩnh chuẩn và đó là lý do chính khiến pha tĩnh chuẩn được sử dụng chủ yếu trong sắc ký nhanh.

9.3. Khảo sát hệ thống sắc ký trước bằng sắc ký lớp mỏng:

Như đã đề cập, đa phần sắc ký cột nhanh sử dụng pha tĩnh là silica gel bình thường hoặc phân cực cao do đó việc tiến hành khảo sát trước bằng TLC là hợp lý với một sự đầu tư nhỏ nhất về thời gian và vật liệu, hứa hẹn tìm ra điều kiện sắc ký có khả năng áp dụng cho cột sắc ký nhanh.Xác định pha tĩnh


Tìm pha động với sự chọn lọc nhấtXác định độ mạnh dung môiMột cách lý tưởng, chất hấp phụ trên 2 loại sắc ký nên giống nhau để khả năng áp dụng từ TLC cho FC là cao nhất.Khảo sát pha tĩnhThực nghiệm với TLC có thể giúp đưa ra chọn lựa đúng đắn. Nếu TLC với silica gel thường được sử dụng cho kết quả tốt thì cũng có thể sử dụng cho FC. Nếu kết quả không đạt, khi đó mới nghĩ đến khả năng sử dụng pha đảo.Khảo sát dung môiMột khi đã chọn được pha tĩnh với những đặc tính thích hợp, dung môi hoặc hỗn hợp dung môi phân lập các chất thành phần sẽ được khảo sát.Một cách tổng quát, mỗi dung môi đều có những đặc tính riêng, một số có xu hướng giống nhau trong khi một số thì khác nhau rất nhiều. L.R.Snyder và J.J.Kirkland đã nghiên cứu và so sánh các kết quả đặc tính của nhiều loại dung môi và các nhóm dung môi có chung tác dụng thành các nhóm chọn lọc.

Nhóm chọn lọc cho phép công việc tìm kiếm được tập trung, sẽ có ít điểm so sánh khi mà dung môi chung nhóm. Công việc sẽ được tiến hành theo hướng so sánh giữa các nhóm đặc tính.Những dung môi quan trọng cho sắc ký được trình bày theo bảng sau chỉ bao gồm các dung môi có thể dùng trong phân lập sử dụng bộ phận phát hiện UV (không gây tín hiệu)

Dựa trên độ phân cực của các thành phần

cần được phân lập, trong trường hợp độ dung môi có độ mạnh quá lớn khiến không thể phân tách được, độ mạnh của dung môi có thể được giảm xuống bằng cách hòa tan thêm hexane (độ mạnh 0.1), ngay lập tức có thể phân lập tốt.


Giảm độ mạnh của dung môi (trái: dichloromethane, phải: Hexane:dichloromethane 3:1)Việc thêm hexane giúp giảm độ mạnh của dung môi nhưng không tác động lên tính chọn lọc (khả năng phân giải)

Tùy theo thành phần được lựa chọn để chọn dung môi có sự chọn lọc thích hợp. Bản VI có sự phân tách tốt nhưng nếu chỉ quan tâm tới việc phân lập thành phần đầu tiên, dung môi chạy ở bản V sẽ được chọn.Lý tưởng = các thành phần khác càng tách xa chất cần tách càng tốt.

9.4. Từ TLC đến FC

Do hiệu năng tách của TLC cao hơn so với FC nên cần phải có sự điều chỉnh khi áp dụng từ TLC đến FCThể tích cột CV = 1/Rf

Rf nằm trong khoảng từ 0.15 – 0.4 sẽ tương ứng với thể tích cột 2.5 -6.6


9.5. Nạp mẫu lên cột

Việc nạp mẫu đối với sắc ký cột bình thường là một công việc đơn giản trong phân tích sắc ký, tuy nhiên trong sắc ký điều chế, cột thường được triển khai quá tải và việc nạp mẫu là rất quan trọng.Lúc trước, quy định chung cho sắc ký chế hóa là cột có thể nập mẫu ở nồng độ gần 1% tùy theo loại silica gel, ngày nay với việc sử dụng FC và tối ưu hóa pha động (R f 0.04 – 0.4, CV > 1), nồng độ mẫu nạp có thể tăng đến 10% và sự phân lập nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều. Khi đó thể tích mẫu sẽ nhỏ và được nạp thành băng có độ hẹp tối thiểu, hiệu năng tách sẽ cao.

9.6. Rửa giải theo gradient

Khảo sát pha động và ghi nhận sự phân tách các pic theo mỗi pha.

Chia phân đoạn để thay đổi dung môi nhằm tách tốt hơn.

Ví dụ các kết quả:


10. SẮC KÝ CỘT KHÔSắc ký cột khô ( DDC) là một kỹ thuật sắc ký hiện đại cho phép chuyển đổi nhanh chóng và dễ dàng các thông số hoạt động của cắc ký lớp mỏng phân tích ( TLC) sang sắc ký cột chế hóa ( CC). Sắc ký cột khô khắc phục được nhược điểm của 2 phương pháp sắc ký lớp mỏng phân tích và sắc ký cột chế hóa.Sắc ký lớp mỏng là một kỹ thuật quan trọng sử dụng trong phòng thí nghiệm,vì nó cho phép xác định nhanh thành phần của các hợp chất phức tạp. TLC có thể phân lập các chất ở một lượng rất nhỏ. Tuy nhiên, những chất từ vài mg đến vài g cũng có thể áp dụng sắc ký cột, vì khi đó dùng sắc ký lớp mỏng tốn nhiều thời gian và giá thành cao. Trong một số trường hợp, thậm chí những phương pháp gọi là lớp dày hay lớp chế hóa cũng là lựa chọn cuối cùng vì các yếu tố thời gian, giá thành, và thiếu hụt sự chuyển đổi các thông số của kỹ thuật phân tích. Bên cạnh đó, sự chuyển đổi từ sắc ký lớp mỏng sang sắc ký cột thì khó khăn hơn vì chất hấp phụ của sắc ký lớp mỏng không giống sắc ký cột.Trong sắc ký lớp mỏng lớp silic và nhôm thì khô trước khi sử dụng và chỉ tiếp xúc với dung môi sau khi được đặt vào bình khai triển. Đó là lý do tại sao trong sắc ký cột khô thì mẫu được nạp vào cột khô . Trái ngược với sắc ký cột thông thường, sắc ký cột khô là kỹ thuật không rửa giải được. Vì thế chỉ một lượng giới hạn chất rửa giải được dùng đơn thuần để lấp những kẽ của các phân tử hấp phụ.


Chất hấp phụ sắc ký cột khô có sẵn trên thị trường được điều chỉnh phù hợp với đặc tính lý hóa của sắc ký lớp mỏng, trong suốt chu trình sản xuất. Với những đặc tính lý hóa tương tự, các giá trị Rf của các chất phân tích bằng sắc ký lớp mỏng thì hầu như đúng với các giá trị thu được từ sắc ký cột khô. Việc sử dụng những chất hấp phụ được điều chỉnh một cách đặc biệt này, có thể sử dụng cùng một chất hấp thụ, cùng một dung môi cho việc tiến hành trên cột và có thể chuyển đổi những kết quả của sắc ký lớp mỏng sang sắc ký cột rửa giải một cách nhanh chóng, tiết kiệm thời gian và tiền bạc. Những chất liệu cho sắc ký cột hấp phụ tương ứng với những chất liệu của lớp mỏng thông dụng nhất, như chì DDC, nhôm DDC. Những chất hấp thụ sắc ký cột khô này được sử dụng rộng rãi khi cần phải tăng lên một cách tương xứng với sắc ký lớp mỏng, để chuẩn bị đủ số lượng các hợp chất cho các phản ứng hóa học và/ hoặc các quy trình phân tích tiếp theo. DDC thực tế được sử dụng cho các phân lập từ sắc ký lớp mỏng.

10.1. Quy trình đơn giản hóa:

Chuẩn bịSử dụng cùng 1 hệ dung môi trên sắc ký lớp mỏngCắt 1 ống nylon theo chiều dài yêu cầu. Để phân lập 1 g chất liệu, cần khoảng 300 g chất hấp thụ trong một ống 1-m*740 mm( hình 2)Đóng ống bằng cách kéo một đầu và giữ chặt một đầu bằng cái ấn, ghim hay đinh kẹpChèn một tấm giấy nhỏ hay lót bông thủy tinh ở đáy cột, dùng một cây kim đâm xuyên qua lỗ ở đáy cột.Đổ đầy cột đến ba phần tư chiều dài.Mẫu được dùng để phân lập nên kết hợp với một lượng chất hấp thụ tương tự bằng ít nhất 10 lần khối lượng của nó trong một ống kiểm tra hình nón.Thêm từng centimet chất hấp thụ vào phía trên mẫu, sau đó cho một miếng bông thủy tinh nhỏCột chặt ống bằng một kẹp trên giá.Mở khóa vòi của bình đựng dung môi, thêm dung môi cho đến khi dung môi chảy đến đáy cột. Ngưng lại, chờ khoảng 30 phút.( Hình 5) Tìm vị trí của dải phân lập bằng mắt thường, tia UV hay tắt quang. Phun thuốc thử thích hợp vào vùng tiếp xúc và so sánh với phần cột không được xử lý để đánh dấu dải đã được phân lập.Đánh giá vị trí của dải trên ống nilonLấy cột ra khỏi giáCắt cột thành những phần theo yêu cầu. ( Hình 6)Rửa giải những hợp chất tinh khiết từ những phần đã cắt bằng các dung môi phân cực

10.2. ỨNG DỤNG SẮC KÝ CỘT KHÔ

Tinh dầuMặc dù có thể dùng máy sắc ký khí mao dẫn để phân tích, các hợp chất phức tạp như tinh dầu có thể được phân tích bằng phương pháp khác. Bước phân tích rất cần thiết để tách các hydrocarbon từ các terpenoid bị oxy hóa và sắc ký cột có thể thực hiện chức năng này. Mặt hạn chế của phương pháp này là tiêu thụ nhiều dung môi, làm loãng các chất đặc biệt, khả năng tái chế kém, hình thành tạp chất và tốn nhiều thời gian.Sắc ký cột khô là phương pháp nhanh được sử dụng bởi Kubeczka để phân lập tinh dầu thành các giai đoạn thích hợp cho phân tích sắc ký khí.Các thành phần không phân cực sẽ được phân lập trên silica gel Woelm ( cần phải tái hoạt hóa với 7% nước để tránh sự tái sắp xếp lại của các hydrocarbon terpen) bằng cách rửa giải đầu tiên với n-pentan( cho phân đoạn 1), tiếp theo là benzen hay propyl chloride ( cho phân đoạn 2). Sau cùng benzen sẽ được chạy qua cột, cột sẽ được cắt thành 3 dãy chứa những thành phần phân cực hơn. Mỗi dãy sẽ được chiết xuất với diethylether-methanol 8:2, sau đó sẽ cho phân đoạn 3-5. Tất cả các phân đoạn 1-5 sẽ được tiêm


lần lượt vào cột sắc ký khí, sắc ký đồ dễ dàng được nhận diện. Hơn nữa, thông tin về độ phân cực liên quan của các giai đoạn do rửa giải trên silicagel thì rất hữu ích trong việc nhận dạng các pic.Sesquiterpene.Việc phân lập các sesquiterpene từ dược liệu thì thường được thực hiện bởi các bước sắc ký cột của phương pháp chiết xuất không phân cực ở áp suất thấp hay trung bình, hay phân lập bằng sắc ký lớp mỏng chế hóa và kết tinh lại với số lượng lớn.Thường sử dụng cột RP-8 hay RP-18 với dung môi rửa giải là hỗn hợp methanol-nước. Những giai đoạn này chắc chắn dẫn đến sự hấp thu không thuận nghịch của các hợp chất mong muốn.DiterpeneNghiên cứu hoạt tính kháng ung thư của paclitaxel từ loài T. yunnanensis của Trung Quốc. Phân tích đầu tiên với sắc ký cột khô ( silicagel 80-200 mesh; CH2Cl2- MeOH 40:1) và sau đó là trên các cột mở thông thường cho ra taxin B và 2-deacetyltaxin B.Hỗn hợp silicagel ( 63-200 µg) và AgNO3 ( 5:1) để phân lập labdane diterpene methyl esterCucurbitacinsSắc ký cột khô silicagel được sử dụng trong suốt quá trình phân lập chất độc 11-deoxycucurbitacin từ Desfontainia spinosa, triển khai với ethyl acetate- nước 9:1 và hexane-dichloromethane 7:3. Giai đoạn tinh chế cuối cùng được thực hiện với sắc ký lớp mỏng chế hóa và ly tâm.Lignans Cả lignans và neolignans đều thu được bằng cách kết hợp sắc ký cột khô và sắc ký lớp mỏng chế hóa.DepsideVí dụ như acid salvianolic B, sử dụng trong thuốc cổ truyền Trung Quốc. Được phân lập với sắc ký cột khô trên 2.3 kg silicagel ( CHCl3-MeOH-HCOOH 85:15:1). Cột được cắt thành 16 phần và rửa giải bằng ethanol ấm. Phần 13-14 được tinh khiết hóa bằng sephadex LH-20 ( MeOH) để thu được 20.6 g acid salvianolic B. ( Ai và Li 1988).

11. SẮC KÝ LỎNG CHÂN KHÔNGSắc ký lỏng chân không ( VLC) có nguồn gốc từ Úc. Vào năm 1977, một mô tả ngắn về phương pháp phân lập cembrenoid terpene từ san hô mềm của Úc đã được xuất bản.

11.1. Nguyên tắc:

Kỹ thuật này có thể được xem như sắc ký lỏng chế hóa, hoạt động như một cột, dùng chân không để tăng tốc độ chảy của chất rửa giải. Kỹ thuật này khác với sắc ký cột nhanh là cột được chạy khô sau khi thu mỗi phân đoạn. Điều này giống sắc ký lớp mỏng chế hóa vì các đĩa được làm khô sau khi chạy và sau đó được rửa giải lại.

11.2. Quy trình:

Một cột nhỏ hoặc một phễu lọc Buchner vừa với thủy tinh ( 10-20 µm, độ xốp D hay 2) được gắn khô với chất hấp thụ ( 10-40 µm của loại sắc ký lớp mỏng, ví dụ như silicagel Merck 60 H hay 60 G). Chất hấp thụ được cho vào bằng cách gõ nhẹ dưới trọng lực. Sau đó đưa chân không vào thông qua vòi 3 ngã, chất hấp thụ được nén xuống thành một lớp mỏng cứng bằng cách đè một nút chặn cao su và gõ nhẹ. Tắt chân không, rót dung môi kém phân cực nhanh lên trên bề mặt chất hấp phụ, sau đó mở chân không. Khi mà chất rửa giải đi qua, cột được hút khô và sẵn sàng để tải. Mẫu trong dung môi thích hợp được cho trực tiếp phía trên đầu cột và được kéo nhẹ nhàng vào vật hứng bằng chân không. Mẫu được tái hất thu trên silicagel, nhôm oxide.


Cột được triển khai với hỗn hợp dung môi thích hợp, bắt đầu với dung môi kém phân cực, tăng dần độ phân cực, rút cho cột khô giữa mỗi phân đoạn thu được ( điều này tránh tạo rãnh).Ngược với phương pháp sử dụng áp suất phía trên đầu cột, sự lôi kéo trên cột VLC thì dễ dàng vì phía trên đầu cột bằng với áp suất khí quyển.Nhìn chung, chiều cao cột hấp thụ không nên quá 5 cm. Với lớp nhỏ ( < 100 mg), thích hợp với cột .5-1 cm i.d. và cao 4 cm, đối với 0.5-1g, thích hợp kích thước 2.5*4 cm, từ 1-10 g, 5*5 cm, với lượng lớn hơn thì được phân lập tốt nhất với phễu lọc thủy tinh nung với chiều cao 5 cm. Hỗn hợp để phân lập được thêm vào cột silic ở bất cứ vị trí nào có thể với một ít dầu hỏa ( nếu không thể làm như trên thì thêm vào một chất rắn). Tăng lượng dung môi phân cực hơn cho mỗi phân đoạn dung môi liên tiếp. Tăng độ phân cực một lượng nhỏ (1%,2%, 3%), sau đó lượng tăng có thể tới 5%, 10%, 20%.

11.3. Các ứng dụng:

Sắc ký lỏng chân không được dùng để phân lập từng phần dịch chiết dược liệu trước khi dùng HPLC và các bước phân lập phức tạp khác. Trong những năm trước VLC được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực sản phẩm tự nhiên vì cơ chế hoạt động đơn giản. Những chất hỗ trợ sắc ký khác được sử dụng trong VLC: silicagel ( cả loại thường và loại pha đảo), Al2O3, CN, diol và polyamide. Chất rửa giải phổ biến nhất là ether dầu hỏa, tăng thành phần ethyl acetate.AlkaloidDiterpene alkaloids được phân lập nhanh chóng và dễ dàng bằng VLC.Việc tinh khiết hóa aconitine thương mại bằng VLC thì nhanh hơn, rẻ hơn và thuận tiện hơn bằng sắc ký lớp mỏng chế hóa, yếu tố quan trọng nhất, rõ nhất là việc rữa giải mẫu bởi VLC mà không cần phải cạo đĩa.Những phân lập về diterpene alkaloids dùng VLC trên Al2O3 đã được báo cáo ( Pelletier and Badawi 1987; Joshi et al. 1990: Liang et al. 1991). Trong những ví dụ này thì có sự kết hợp VLC và CTLC.Một alkaloid guanidine độc mới được phân lập từ bọt biển lục địa Anchinoe paupertas bởi một quy trình bao gồm VLC trên diol, với dichloromethane-methanol ( 10:05:5) ( Bouaicha et al. 1994) DiterpeneDầu hạt của Croton tiglium chứa phorbol-12,13-diester được biết như là chất dị ứng và gây ung thư. Những diesters này được tinh khiết hóa trên silicagel 60( 15-40 µm, Merck) với máy VLC được sữa đổi dùng dòng dung môi không đổi và chân không.IsobenzofuranonesDịch chiết từ rễ Polygonum multiflorum được sử dụng trong thuốc cổ truyền Trung Quốc trị bệnh tim mạch. Dịch chiết methanol của rễ được chia ra giữa nước và ethyl acetate. Phần ethyl acetate được sắc ký bởi VLC trên một giá sâu 2.5 cm theo loại silicagel 60H của sắc ký lớp mỏng pha đảo, Merck ( số 7716) ( trong một phễu Buchner đường kính 13.7 cm, thủy tinh xốp loại 3). Triterpen GlcosidesOleanolic acid saponin của cây Dialium guineense được phân lập từ quả bởi quy trình đầu tiên là sắc ký cột nhanh trên silicagel và sau đó là VLC trên lichoprep RP-18 với methanol 7:4. ( Odukova et al. 1996)LimonoidsAzadirone được phân lập từ nhân hạt chưa chín của Trichilia havanensis. Dịch chiết hexane của nhân được chia ra giữa hexane và methanol-nước 19:1. Dung dịch methanol nước được chiết với ethyl acetate và VLC của dịch chiết sau trên silicagel tái hoạt hóa với 5% nước ( rửa giải với dầu hỏa-ethyl acetate 19:1) thu được trực tiếp limonoid( Arenas and Rogriquez-Hahn 1990)


Xanthones5 xanthones được phân lập từ Garcinia cowa bởi quy trình gồm các bước phân lập chủ yếu của VLC. Dịch chiết methanol của vỏ được phân lập thành 8 phân đoạn bởi VLC trên silicagel ( 80g), rửa giải thường xuyên với hexane, hỗn hợp hexane-benzene và dichloromethane. Các xanthones có thể thu được bằng cách kết tinh trực tiếp từ các phân đoạn hay từ sắc ký lớp mỏng ly tâm liên tục. Cowanol cho thấy hoạt tính kháng khuẩn trung bình với Staphylococcus areus ( Na Pattalung et al. 1994)IridoidsViệc áp dụng VLC để phân lập các iridoid khác nhau đã được báo cáo bởi Handjieva et al.( 1991 a,b). Với mục đích này, cả nhôm trung tính 60G ( 5-40 µm, Merck 1090), Silicagel sắc ký lớp mỏng 60H ( 15 µm, Merck 11695), hoặc Florisil ( 10-63 µm, Merck 12519 ) và phễu lọc Buchner với đường kính khác nhau ( tùy theo kích thước mẫu) đã được sử dụng. Một số biến đổi nhỏ về phương pháp của Coll và Bowden ( 1986) đã được thực hiện, đun nóng chất hấp thụ và sử dụng một lớp nổi bằng nhựa bên trên phần hỗ trợ.Ví dụ: -Mẫu là dịch chiết dichloromethane từ rễ khô của Centrathus ruber. -So sánh giữa VLC và sắc ký lớp mỏng chế hóa cho việc phân lập valepotriates từ Valeriana oficinalis cho thấy những thuận lợi của VLC: thời gian phân tích ngắn hơn 6 lần, ít hơn 6 lần dung môi, chất hấp thụ có thể tái sử dụng 6-7 lần, hơn nữa VLC thu được valepotriate ít bị biến chất hơn so với sắc ký cột mở. -Secoiridoid glucosides gentiopicroside và swertiamarin thu được ở dạng tinh khiết từ rễ tươi của Gentiana punctata sau khi dùng VLC.Ngoài ra việc phân lập iridoid glycosides bằng VLC bao gồm các báo cáo bởi Boros at al.( 1990,1991), Akunyili et al. ( 1991) và Justice et al. ( 1992). Trong một ứng dụng được báo cáo bởi Boros et al.( 1990), “ mini-VLC” trên pipet Pasteur có sẵn được dùng để phân lập số lượng nhỏ nguyên liệuFlavonoid glycosidesTrong việc phân lập một flavonol glycoside mới ( kaempferol-3-(2,3-diacetoxy-4-p-coumaroyl) rhamnoside) từ lá của Myrica gale, bước tinh khiết hóa ban đầu là VLC trên polyamide-TLC 6 AC ( Macherey-Nagel), rửa giải với 50 ml, ước số của methanol-nước với độ phân cực tăng dần ( methanol-nước 1:1Methanol 100%) ( Carton et al. 1990)Acetylenic AlcoholsVLC trên pha khung cyano ( 40 µm) được sử dụng để phân lập acetylenic alcohols gây độc tế bào từ bọt biển Cribrochalina vasculum ( Hallock et al.1995). Chiết xuất bọt biển thô được rửa giải trong VLC với gradient của t-butyl methyl ether-hexanes: HPLC pha đảo thì cần thiết cho giai đoạn phân lập cuối của các alcohols chuỗi dài.PolyacetylenesMột polyacetyllene độc tế bào, (-)-17-hydroxy-9,11,13,15-octadecatetraynoic aicd được phân lập từ Minquartia guianensis, một cây từ Ecuador. Vỏ thân cây được chiết xuất với các dung môi có độ phân cực tăng dần và dịch chiết chloroform được cho là có hoạt tính chống lại tế báo ung thư máu lympho P-388 ở chuột. Dịch chiết này trước tiên được sắc ký với sắc ký cột mở và phân đoạn hoạt tính là mẫu cho VLC trên mộtt cột 8*40 cm của silicagel 70-230 mesh. Sau khi rửa giải với chloroform- ethylacetate- methanol ( 18:1:1) và cuối cùng kết tinh thu được polyacetylene có hoạt tính.KawalactonesDịch chiết của lá Cryptocarya kurzii ( Lauraceae) với ethanol thu được cặn, cặn này độc với tế bào KB. Hỗn hợp có hoạt tính này, một lacton loại kawa mới, kurzilactone, thu được bằng cách


kết hợp VLC, sắc ký lớp mỏng chế hóa, HPLC pha đảo. Silicagel 60H ( 70-230 mesh) được sử dụng cho VLC, với dichloromethane-methanol ( 100:0, 99:1, 99:2, 19:1, 9:1) như là chất rửa giải. ( Fu et al. 1993)

III. HPLC ĐIỀU CHẾ1. Nguyên tắc, yêu cầu:Sự tách các chất bằng phương pháp sắc ký dựa trên trạng thái cân bằng giữa các thành phần, một chất hấp phụ trong cột (=pha tĩnh) và một dung môi chảy qua nó (pha động).Khi một thành phần liên kết với pha tĩnh, hiện tượng này được định nghĩa là sự hấp phụ, khi thành phần này bị tách ra nhờ pha động, hiện tượng này được định nghĩa là phản hấp phụ. Khả năng hấp phụ cao giữa các thành phần nghiên cứu với pha tĩnh nghĩa là sự lưu giữ các thành phần này trên cột cao và do đó thành phần đó sẽ được rửa giải ra khỏi cột trễ hơn thành phần khác. Việc tách riêng các chất từ một hỗn hợp thành chỉ có thể tiến hành mỗi chất có khả năng hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau đối với pha tĩnh và pha động.

Sơ đồ mô hinh sắc ký lỏng chế hóa

HPLC điều chế là một phương pháp hiệu quả và đang được sử dụng rất phổ biến để tách các chất cần nghiên cứu ra khỏi 1 hỗn hợp hoặc để tinh chế các chất.Các yếu tố sau đây phải được chú ý đặc biệt:- Linh hoạt trong việc chọn cột. Số lượng chất và các yêu cầu tách ảnh hưởng khác nhau đến các vấn đề cần giải quyết. Đơn giản và phù hợp với kinh tế của một vấn đề phân tích cụ thể do đó có thể giải quyết được.- Hiệu suất bơm cao hơn. Dung tích cột lớn yêu cầu thể tích dòng lớn hơn, do đó tốc độ dòng cũng cần phải lớn hơn. - Áp suất lớn hơn. Khuynh hướng của sắc ký điều chế rõ ràng là hướng về chất hấp phụ dạng hạt mịn, điều này dẫn đến một kháng lực dòng đáng chú ý


Bình chứa dung môi Bơm dung môi

Bình chứa mẫu Bơm mẫu Valve bơm mâu

Cô t săc ky chê hoa

Detector

Bô xư ly dư liêu

Valve bơm phân đoan

Bình hưng cac phân đoan

2. Ưu- nhược điểm, khả năng và mức độ ứng dụng:Kích thước tiểu phân càng nhỏ hiệu quả quá trình tách chiết càng cao. Tuy nhiên kích thước tiểu phân càng nhỏ thì áp suất phản hồi trong cột nhồi càng cao, điều đó giới hạn kích thước thực tế tiểu phân, tùy thuộc vào khả năng chịu áp của thiết bị. Nói chung, đa số thiết bị chịu được áp suất phản hồi gây ra bởi tiểu phân kích thước 5µm ở tốc độ dòng tối ưu.Giá thành cao.Trong phân tách điều chế, pha tĩnh thường có thể hồi phục và tái sử dụng để tinh chế cùng hoạt chất. Dung môi chạy sắc kí mới là phần tốn kém và khả năng tái sử dụng dung môi đã dùng là quan trọng trong lựa chọn dung môi. Nếu trong quá trình chạy ta dùng nhiều dung môi, ví dụ 1 dung môi để tiêm mẫu và 1 dung môi khác để rửa giải, thì nên gom riêng các dung môi để tiện cho việc tái chế. 1 vài hỗn hợp dung môi hexane–methyl-tert-butyl ether, hexane–ether, và hỗn hợp 3 thành phần không thể phục hồi như dung môi tinh khiết.Trong kỹ thuật HPLC điều chế, cần sử dụng cột có kích thước lớn. Nếu bán kính cột tăng, trừ phi sử dụng kỹ thuật nhồi đặc biệt, sự nhồi hạt trong cột sẽ trở nên không hiệu quả và sự nhồi hạt tự nó cũng không ổn định. Ngoài ra, để duy trì tốc độ tối ưu cho pha động, lưu lượng pha động cần phải tăng lên và sự tiêu thụ pha động sẽ rất tốn kém. Ngược lại, nếu tăng chiều dài cột, thì kháng lực dòng chảy sẽ lớn hơn dẫn đến áp suất cao trong cột. Nếu sử dụng cột có bán kính lớn, sau đó nhờ sức mạnh cơ khí của hệ thống cột sẽ hạn chế áp suất tối đa trong cột. Do đó, khi kéo dài cột sắc ký thì bán kính hạt nhồi phải tăng lên để cung cấp đủ tính thấm. Tăng đường kính hạt sẽ làm giảm hiệu quả của cột, do đó sẽ làm giảm độ phân giải của các chất cần nghiên cứu. Thật vậy, việc tính toán cho một kỹ thuật sắc ký điều chế rất phức tạp, phải kiểm soát nhiều yếu tố tương tác, và vì vậy, các thông số tối ưu cần cho việc phân tách rất khó xác định. Để hiểu được các yếu tố cần thiết của sắc ký điều chế cần phải xác định công suất tải của cột.

3. Pha tĩnh, cách chuẩn bị cột: Lí thuyết của van Deemter cho rằng tính chất quan trọng nhất của pha tĩnh là sự dễ dàng của sự chuyển khối qua các lỗ của tiểu phân. Các tiểu phân silica thì dễ đạt độ đồng đều về kích thước lỗ và độ đồng nhất của các tiểu phân hơn các tiểu phân polymer. Điều này không có nghĩa là polymerics kém hơn, ngược lại những pha tĩnh này có kích cỡ tiểu phân đồng đều hơn. Bởi vì sự khác biệt giữa pha tĩnh silica và polymer ít rõ ràng khi so sánh chúng ở dạng cột nhồi sẵn (được nhồi ở áp suất cao hơn cột DAC dẫn tới sự biến dạng của các tiểu phân polymer- điều này làm giảm các khe hỡ tạo các tiểu phân nhỏ hơn)IUPAC định nghĩa pha thuận như là 1 tiến trình rửa giải trong đó pha tĩnh thì phân cực hơn pha động. trong thực tế, pha tĩnh thường dùng cho HPLC điều chế dựa trên silica và tính phân cực của silyl ether ở dưới và silanol cung cấp bề mặt thân nước. Liên kết amino và cyano với silica cũng phổ biến trong pha thuận mặc dù liên kết với cyano có vài tính chất của pha đảo. Cơ chế chiếm ưu thế là liên kết Hydro. Tuy nhiên nhóm silanol có tính acid nhẹ, vì thế bề mặt silica cũng có khả năng trao đổi cation.Pha thuận thường dùng để tinh chế những phân tử hữu cơ nhỏ, vì thế kĩ thuật này thường dùng trong dược phẩm và nông dược.Sự phát triển từ sắc kí cột nhanh tới HPLC điều chế dễ dàng hiểu được đối với những nhà hóa học hữu cơ truyền thống và nó dẫn tới sự chấp nhận kĩ thuật này với nhiều ng tiên phong và sự tách chiết chất từ thực vật. 1 sự chuyển tiếp đồng thời từ những tiểu phân vô định hình irregular tới những tiểu phân pha tĩnh có dạng hình cầu chắc chắn (điều chế bằng cách phun dung dịch silicate trung tính thành những giọt nhỏ trong 1 luồng khí nóng, hay phân tán dung dịch silica thành dạng nhũ tương trong 1 dung môi hữu cơ thích hợp, tại đó những giọt gel hình cầu hình thành. Tuy nhiên chi tiết việc sản xuất được giấu kín LC-A3) cũng được thúc đẩy bởi nhu cầu tăng dần. Như đã nói trước, tiểu phân silica vô định hình thường dễ bị đứt gãy và tạo thành bụi mịn.


Pha tĩnh bao phủ bởi các nhóm –OH thiết kế cho sắc kí loại cỡ như Zorbax GF 250 và PL-aquagel cũng tương tự pha thuận, thuận lợi của chúng ở chỗ tăng độ ổn định ở pH cao.lựa chọn pha tĩnh trong qua trình nâng cấp qui mô (từ sắc kí phân tích)1 tiêu chuẩn quan trọng khi phát triển phương pháp ban đầu là pha tĩnh sắc kí dùng trong qui trình nâng cấp phải có bán sẵn ở cả dạng cột phân tích (250mm x 4mm) và dạng thô ở lượng lớn. Nói chung, vật liệu nhồi thường dùng cho cột điều chế có kích cỡ từ 10-20 mcm.

3.1. Normal-phase silica gels:

• Kromasil, 10 µm dp with 60 or 100 Å pore diameter • Kromasil, 16 µm dp with 100 Å pore diameter• Chiralcel AS, 20 µm dp • Chiralcel OD, 20 µm dp

3.2. Reversed-phase silica gels:

• Kromasil C8• YMC C18• Hyperprep C8 Mặc dù hầu như 84% pha tĩnh dung trong HPLC điều chế là silica pha đảo. Tuy vậy, pha thuận có những lợi điểm riêng:+ có thể chuyển đổi trực tiếp từ TLC pha thuận hoặc HPLC sang LC chế hóa.+ giá thành của vật liệu nhồi pha đảo cao và vài vật liệu nhồi không có dạng thô (để nhồi thủ công)+ làm sạch silica pha thuận thì dễ hơn vì pha thuận bền vững hơn nhiều.+ loại bỏ dung môi thường dùng trong sắc kí pha thuận khỏi dịch sản phẩm cuồi dễ dàng hơn loại bỏ nước khỏi 1 phân đoạn của sắc kí pha đảo, có thể thực hiện ở nhiệt độ thấp và cho chất lượng sản phẩm cao hơn và ít tốn năng lượng hơn.

4. Cách nhồi cột:+ DAC (dynamic axial compression system- nén theo trục thẳng) phát minh bởi Couillard:+ radial compression system- phát triển bởi Waters, và thương mại hóa bởi Biotage:Dùng cartridge bằng polymer dẻo nhồi với pha tĩnh. Cartridge được đặt trong 1 xy-lanh (cyclinder) và được áp cho 1 áp suất ngoài. + annular expansion:Dùng 1 que có đầu hình nêm nén pha tĩnh trong cột (tạo ra cả sự nén trục và nén kiểu tỏa tròn-radial)Cách nhồi cột phụ thuộc vào thiết kế của cột. Kiểu cột ngắn với phần cột mở rộng có thể tháo rời và đủ để chứa hỗn hợp chất nhồi(hình 4.3); cột dài, đủ lớn để chứa hỗn hợp chât nhồi pha tĩnh (hình 4.4)


4.1. Cột kiểu 4.3:

Tính tổng thể tích của cột cộng với ống chứa(reservoir) để xác định thể tích hỗn hợp nhồi A. Mật độ nhồi của pha tĩnh polymer thường là 0.3g/cm3, của pha tĩnh silica thường là 0.6g/cm3. Thêm lượng thích hợp pha tĩnh vào 1 bình đựng và pha loãng với dung môi đã chọn để được thể tích A. Khuấy trộn bằng tay hay máy, khi đạt được hỗn hợp đồng nhất, ngừng khuấy và để hỗn hợp qua đêm để loại khí trong pha tĩnh.Lắp cột, phần ống chứa; gắn bơm hút chân không và đồ hứng dung môi vào đáy cột. Không hút chân không ở giai đoạn này. Phân tán lại hỗn hợp, sau đó đổ liên tục hỗn hợp vào cột. Cần đổ nhanh để tránh hỗn hợp lắng trở lại; sự ngừng 1 vài giây cũng có thể dẫn đến nứt cột làm giảm hiệu lực tách. Hút chân không, rút dung môi cho tới khi còn 1 lớp dung môi khoảng vài mm trên


mặt cột. Tháo ống hút chân không và bít đáy cột (end fitting) lại. Tháo ống chứa và gắn nắp trên (column top end-fitting). Gắn 1 đường dẫn dung môi thải vào dưới cột (đáy cột vẫn được bịt kín). Nén cột cho tới khi áp suất nén tới áp suất cho bởi nhà sản xuất (60-100 bar). Cột lúc này đã sẵn sàng cho nạp dung môi.

4.2. Cột kiểu hình 4.4:

Chuẩn bị hỗn hợp nhồi cột như trên. Bịt đáy cột và nạp cột nhu trên. Sau đó gắn piston lên trên cột, bình chứa dung môi, nén, mở đáy cột cho dung môi đi ra.

4.3. Chuẩn bị mẫu- Đưa mẫu lên cột:

Đưa mẫu vào : bước này khá phức tạp vì áp suất đầu vào rất cao.Thời gian lưu của mẫu (retention time): Là khoảng thời gian từ lúc đưa mẫu vào đến khi đỉnh (peak) của hiển thị rõ nét. Khoảng thời gian này bị chi phối bởi các yếu tố :+ Áp suất đầu vào+ Tính chất của pha tĩnh (hợp chất, kích thước hạt)+ Thành phần dung môi+ Nhiệt độ cột.overload trong sắc kí: khi lượng mẫu nạp quá lớn và điều đó làm giảm hiệu năng của cột, có 2 loại: nạp vượt quá thể tích (volume overload) và nạp vượt quá khối/ nồng độ (mass overload); có thể do mặc định hoặc có chủ ý trong sắc kí điều chế. + volume overload dẫn tới mở rộng peak, nhưng sự mở rộng này đối xứng vì thế hình dạng peak ở trước và sau không bị méo/ biến dạng. Trong sắc kí chế hóa thể tích mẫu có thể tăng cho tới khi 2 peak của 2 chất được rửa giải gần nhau nhất chạm nhau, và thể tích mẫu lúc này là tối ưu. Trong sắc kí phân tích thì không chấp nhận chuyện này, không dùng bất cứ cách nạp mẫu overload nào, ngoại trừ trong những trường hợp khả dĩ có thể làm tăng khả năng phân tích chất dạng vết.+ mass overload thì chắc chắn làm cho peak bị biến dạng; mức nồng độ chất cần tách trong pha tĩnh sẽ ở trong vùng không tuyến tính của đường đẳng nhiệt hấp phụ. Nếu đường đẳng nhiệt hấp phụ lõm về phía trục biểu thị nồng độ trong pha động thì ở nồng độ cao của chất tan hệ số phân bố hiệu dụng sẽ thấp hơn. Vì vậy phần có nồng độ chất tan cao hơn sẽ di chuyển trong cột nhanh hơn phần có nồng độ thấp, và peak sẽ bị méo với phía trước nhọn và đuôi bị nghiêng/ thoải. Thời gian lưu nói chung sẽ giảm. Tuy nhiên nếu đường đẳng nhiệt lõm về phía trục biểu diễn nồng độ trong pha tĩnh thì ở nồng độ cao của chất tan, hệ số phân bố hiệu dụng sẽ lớn hơn. Và vì thế phần có nồng độ cao hơn sẽ di chuyển chậm hơn phần có nồng độ thấp trong cột, peak sẽ bị méo với phía trước nghiêng và đuôi nhọn; trong trường hợp này thời gian lưu nói chung sẽ giảm khi khối mẫu tăng.

4.4. Với pha đảo (Reverse Phase HPLC Basics for LC/MS)

Mẫu không nên hòa tan trong 1 dung môi hữu cơ nếu không nó có thể không gắn lên pha tĩnh được. Mẫu cũng không nên tan trong dung dịch chứa chất tẩy, một vài chất tẩy có thể gắn lên cột pha đảo và làm thay đổi tính chất cột không thuận nghịch. Hơn nữa chất tẩy được ion hóa ưu tiên khi bị tác động của dòng electron trong đầu dò khối phổ, làm giảm khả năng phát hiện hay ức chế sự ion hóa chất phân tích. Kiểm soát nhiệt độ:Không 1 nghiên cứu nào về sắc kí gọi là hoàn chỉnh nếu thiếu phần nghiên cứu về nhiệt độ. Nhiệt độ xung quanh ảnh hưởng thời gian lưu. Nhiệt độ chạy thường là 40°C. Để ổn định nhiệt độ cho cột, ta có thể dùng jacket (áo giữ nhiệt), buồng ổn nhiệt,..


Có thể dùng nhiệt độ để tác động tới quá trình chiết tách. Nói chung nhiệt độ cao hơn thì tốt hơn, peak sẽ nhọn hơn và rửa giải sớm hơn. Tuy vậy nhiệt độ cao làm giảm tuổi thọ cột và nhiều cột không chịu được nhiệt độ quá 60°C.

5. Lựa chọn dung môi- Thay đổi dung môi:Pha thuận thường được chạy với dung môi hữu cơ, thường là hexane, heptane, cyclohexane hay halocarbon như DCM, Cloroform. Pha động rửa giải thường là 1 dung môi thân nước, như nước, ester. Acid hữu cơ thường thêm vào để giảm thiểu hiệu ứng trao đổi ion do những nhóm silanol.Rửa giải đẳng dòng với hỗn hợp butanol, acid acetiic và nước là giao thức chuẩn cho sự tách giải các acid amin và 1 hỗn hợp methanol, cloroform, nước hữu dụng cho hợp chất hữu cơ nói chung. Peptide dễ dàng được tinh chế bằng rửa giải kiểu gradient trên silica pha thuận, tăng dần từ acetonitrile tới pha động có nước. Kĩ thuật này đặc biệt hiệu quả với những peptide rất phân cực khó phân lập trên sắc kí pha đảo.Pha đảo hoạt động trong môi trường đệm thân nước, nơi hấp phụ kị nước giữa chất phân tích và pha tĩnh bị xáo trộn bới sự tăng dần nồng độ 1 dung môi hữu cơ có thể hỏa lẫn. Ứng dụng phổ biến của HPLC pha đảo là trong tinh chế peptides và protein, trong đó chất phân tích thường được giả hấp bởi sự rửa giải gradient. Đệm chạy thân nước phổ biến nhất thường là nước chứa hàm lượng thấp của axit trifluoroacetic (thường là 0,1% v / v) và các pha động rửa giải thường là acetonitrile- chất điều chỉnh độ phân cực- chứa axít trifluoroacetic.Các trifluoroacetic axit phục vụ hai mục đích: trước hết, nó tạo một cặp ion mạnh với chất phân tích, như vậy chống lại việc trao đổi cation với bất kỳ nhóm silanol tự do nào trên giá mang silica; và thứ nhì, với vai trò các cặp ion, nó làm giảm sự thay đôi cấu trúc protein và peptide và do đó cải thiện hình dạng peak. Lợi điểm của axit trifluoroacetic ở chỗ nó không hấp thu UV- kĩ thuật chính trong phát hiện peptide và nhiều phân tử khác. Các đệm acid khác như phosphate, acetate and hydrochloride cũng thường được dùng. Ethanol, methanol, tetrahydrofuran, pro-pionitrile và propan-2-ol cũng thường được dùng với vai trò chất điều chỉnh độ phân cực, nhưng chúng không tốt bằng acetonitrile.Silica pha đảo không ổn định trong môi trường kiềm do sự mất các gốc ankyl và sự hòa tan của silica khi hoạt động lâu ở pH cao. Với pha tĩnh polymer lỗ lớn ổn định ở pH cao (macroporous polymeric stationary phases) có thể mở rộng khoảng pH hoạt động của pha đảo trong khoảng 1-14. Pha đảo polymer thường dùng nhất là loại polymer trùng hợp từ styrene và divinyl benzene. Tính kị nước của pha tĩnh này là do mạch polymer dài và vòng benzene, vì thế quá trình rửa giải dự đoán sẽ khác với pha tĩnh silica C18 chẳng hạn. Thực tế, trên dữ liệu rửa giải nhiều chất, trình tự rửa giải và thời gian rửa giải quan sát được trên pha tĩnh polymer chất lượng cao thường tương tự kết quả thu được từ pha tĩnh silica chất lượng cao.

6. Phương pháp phát hiện và thu nhận kết quả sắc ký:


Một số bộ phận phát hiện:-LC Detectors Based on Refractive Index Measurement The Refractive Index Detector The Angle of Deviation Method The Fresnel Method The Christiansen Effect Detector The Interferometer Detector The Thermal Lens Detector The Dielectric Constant Detector -The UV Detectors The UV Absorption Detectors The Fixed Wavelength UV Detector The Multi–Wavelength UV Detector The Multi–Wavelength Dispersive UV Detector The Diode Array Detector The Fluorescence Detector The Single Wavelength Excitation Fluorescence Detector The Multi Wavelength Fluorescence Detector -Transport Detectors The Moving Wire Detector The Chain Detector The Modified Moving Wire Detector The Disc Detector -The Evaporative Light Scattering Detector -Liquid Light Scattering Detectors The Low Angle Laser Light Scattering Detector The Multiple Angle Laser Light Scattering (MALLS) Detector-The Electrical Conductivity Detector -The Electrochemical Detector Electrode Configurations Electrode Construction Basic Electrochemical Detector Electronics The Multi–Electrode Array Detector


7. Các ứng dụng cụ thể:Tinh chế taxol bằng sắc ký lỏng điều chế sử dụng trong công nghiệp: một phương pháp đã được nghiên cứu phát triển để tinh chế taxol từ dịch chiết cloroform thô của cây Taxus yunnanensis sử dụng sắc ký lỏng điều chế công nghiệp (IPLC) dựa trên pha tĩnh polymer (D956 resin). Sử dung hệ thống thiết bị đơn (single-system apparatus), khoảng 5 kg dịch chiết thô có thể được tải qua cột đầu tiên, và cuối cùng, qua 3 lần chạy sắc ký, khoảng 50g taxol (99% tinh khiết) có thể thu được sau 155h, ko tốn bất kỳ dung môi hữu cơ nào. Sự thu hồi taxol đạt trên 80%. Nhựa D956 đã cho thấy tính chon lọc và khả năng tách taxol cao hơn so với silicagel và C materials. Với hệ thống này, việc áp dung chiết taxol trong công nghiệp có thể thực hiện được. (Journal of Chromatography A, 813 (1998) 201–204 Purification of taxol by industrial preparative liquid chromatography, Xuefeng Yang*, Kailu Liu, Man Xie, Beijing Research Institute of Chemical Engineering and Metallurgy, P.O. Box 234, Beijing 101149, China, 1998)Ứng dụng sắc ký lỏng điều chế xác định polyphenol từ lá chè xanh thứ phẩm. TS. Phùng Lan Hương

IV. SẮC KÝ PHÂN BỐ NGƯỢC DÒNG1. Nguyên tắc của phương pháp:[7]Là 1 phương pháp sử dụng chất lỏng hoàn toàn, không có sự tham gia của giá mang phase rắn dựa vào sự phân bố của mẫu giữa 2 chất lỏng không hỗn hòa để có thể tiến hành tách. Hệ số phân bố giúp xác định tỉ lệ của mẫu giữa 2 phase. Cột CCC gồm một ống hình xoắn ốc bằng Teflon được độn vào pha tĩnh lỏng, Pha động sẽ được cho chảy qua từ từ qua, và thay thế dần pha tĩnh. Để tránh hiện tượng pha động chảy qua và chỉ đơn thuần đẩy toàn bộ pha tĩnh ra ngoài, người ta thêm tác động trọng trường bằng cách dùng lực ly tâm, lực này có thể thay đổi được bởi chuyển động quay tròn của hai trục.[6]

2. Ưu nhược điểm của phương pháp:[9]

Ưu điểm:So với phương pháp phân tích rắn lỏng truyền thống thì CCC có nhiều ưu điểm nổi trội:có sự hấp phụ đảo ngượchồi phục hoàn toàn được mẫu bơmít kéo vệt nhất trong sắc ký đồít rủi ro nhất về khả năng mẫu bị phá hủytiết kiệm dung môi và rất kinh tế ( không cần cột đắt tiền, dung môi thông thường…)Trong HPLC pha tĩnh chiếm 29% thể tích, trong khi đó trong CCC con số này là 80%Có thể nội chuyển đổi giữa phase động và phase tĩnh1 sự thay thế tuyệt vời cho những quy trình gặp phải sự hấp phụ phase rắnNhược điểm:Số đĩa lý thuyết CCC ít hơn HPLC.Thời gian sắc ký kéo dài và phải giữ nhiệt độ cố định trong suốt quá trình.


3. Pha tĩnh:Cellulose: tách những chất phân cực mà không tách được bằng cơ chế hấp phụ. Cấu tạo là một polysacccharid ở dạng polymer (C6H10O5)n.Đối với sắc ký cột, dùng dạng cellulose vi tinh thể được làm ẩm với một lượng pha tĩnh vừa đủ, hoà vào pha động tạo thành hỗn dịch.Polyamid: là chất phân bố hơn là chất hấp phụ, cơ chế phân bố là nhớ các xoang rỗng của polyamid. Polyamid thông dụng là loại polyamid 6 (polycaprolactam) và polyamid 11 (polyundecanamid).Silica gel ghép: là silica gel (Si-OH) ghép với mạch hydrocarbon kém phân cực (Silica gel pha đảo), hoặc ghép với mạch phân cực (Silica gel pha thuận)

4. Dung môi:Do sự sắc ký tuỳ thuộc vào khả năng hoà tan của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh nên dung môi là yếu tố quan trọng quyết định để cho một bảng sắc ký tốt.Mẫu phân tích thường là các chất phân cực nên dùng môi cũng mang tính phân cực. Việc chọn dung môi nên tham khảo các tài liệu nghiên cứu trước đó. Bảng các hệ dung môi tương ứng với từng loại hợp chất tự nhiên có thể tham khảo tại tài liệu [8]Hệ dung môi 2 pha tốt cần đảm bảo yêu cầu: Đảm bào pha tĩnh có ái lực thích hợp nhất, thời gian ổn định của hệ dung môi nên dưới 30s.Hệ số phân bố của chất phân tích nên trong khoảng 0,5<K<2,0, và hệ số phân bố giữa 2 thành phần nên lớn hơn 1,5. Để tăng khả năng tách, ta có thể thay đổi pH.

5. Cách phát hiện:Cũng như kỹ thuật sắc ký cột thông thường, ta sẽ thu những phân đoạn chất chảy ra, những chất có độ tan càng nhiều trong pha động thì sẽ ra trước. Từ những phân đoạn thu được, ta tiến hành những phương pháp chuyên biệt để định tính cũng như định lượng chất phân tích.


V. MPLC ĐIỀU CHẾ1. Tổng quan:MPLC là buớc chuẩn bị cho HPLC. MPLC với áp suất và tỉ suất dòng chảy cao hơn, cho phép sử dụng cột C18 với kích thuớc hạt giảm để cho kết quả gần với hệ thống chuẩn bị HPLC.

2. So sánh ưu nhược điểm giữa MPLC và HPLC

2.1. Chuyển đổi dung môi:

HPLC: chỉ dùng đuợc cấu hình để chạy sắc ký pha đảo và pha thuờngMPLC: có tính linh hoạt và dễ chuyển đổi hệ thống dung môi giữa pha đảo và pha thường

2.2. Cột nạp mẫu rắn

MPLC: cho phép sử dụng nhiều kỷ thuật nạp mẫu. Thuận lợi chính của MPLC về cơ chế tiêm mẫu là sự phục hồi mẫu cao. Hợp chất đuợc dễ dàng chuyển lên cột trong suốt thời gian nạp mẫu.Có nhiều thuận lợi về tiêm mẫu lỏng. Nó giúp sử dụng tốt nhất khả năng tự động của hệ thống. Người sử dụng chỉ cần ấn nút Start và đi làm việc khác.Hệ thống cân bằng cột, nạp cột, tái cân bằng cột mà không cần can thiệp khác.Ngoài ra MPLC cho phép hợp chẩt tan giới hạn trong trong pha động, có thể nạp dễ dàng mà không cần tiêm một luợng dung môi mạnh, có thể gây giảm hiệu suất cột.Hệ thống HPLC yêu cầu hợp chất tan hoàn toàn, do đó cần một luợng dung môi mạnh gây giảm khả năng gắn ban đầu vào cộtCó nhiều chọn lựa chất hấp phụ:hợp chất nạp lên cột C18 có thể hấp phụ lên Celite,.. Ngoài ra còn có thể nạp thẳng lên cột làm sẵn. Vật liệu đuợc hoà tan trong dung môi mạnh và khí sẽ đuợc thổi qua cột để làm đuổi dung môi bằng hệ thống chân không.Nạp mẫu lỏng: mẫu đuợc tiêm thẳng lên cột hoặc qua val bằng một ống tiêm.Hợp chất đuợc tách tinh khiết cao Lọc dung môi không cần lọc hay khử khí dung môi, giúp tiết kiệm thời gian cho việc tinh khiết. Đặc biệt bóng khí không làm mất nguyên tố của hệ thống.

3. Ứng dụngTinh khiết hợp chất chứa 5-5-benzyl-N-α-N-im-di-t-Boc-L-His1 (hợp chất A), sử dụng cột C18, hệ dung môi 5-95% ACN:H2O, ở bước sóng 214nm


VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO:

1. Laboratory Chromatography Guide, Angelo Talamona, Büchi Labortechnik AG.

2. Liquid Chromatography Column Theory, Raymond P. W. Scott, John Wiley & Sons.

3. Preparative Chromatography, Book 12 Chrom-Ed Book Series, Raymond P. W. Scott

4. Encyclopedia of chromatography Third Edition, Jack Cazes.

5. Preparative chromatography techniques Second edition “Applications in natural

product isolation”, K.Hostettmann, A. Marston, M.Hostettmann, Springer.

6. Journal of Chromatography library volume 3 – Liquid column chromatography a survey

of modern thechniques and applications, Z.Deyl, K.Macek and J.Janak, p.163

7. Methods in Chemical Ecology volume 1, Jocelyn G.Millar & Kenneth F.Haynes, p.80

8. A. Marston, K. Hostettmann, Journal of Chromatography A, 1112 (2006) 181–194,

Review Developments in the application of counter-current chromatography to plant

analysis

9. A.P. Foucault, L. Chevolot, Journal of Chromatography A, 808 (1998) 3–22, Review

Counter-current chromatography: instrumentation, solvent selection and some recent

applications to natural product purification

10. A Practical Handbook of Preparative HPLC, Donald A. Wellings.

11. The Role of the Column in Preparative HPLC, Ronald E. Majors, Agilent Technologies,

Wilmington, Delaware, USA.


VII.MỤC LỤCI. SẮC KÝ LỚP MỎNG ĐIỀU CHẾ.........................................................................................1

1. Ưu nhược điểm của PTLC:..................................................................................................12. Ứng dụng:............................................................................................................................13. Pha tĩnh:...............................................................................................................................14. Dung môi:............................................................................................................................25. Chuẩn bị mẫu sắc ký:...........................................................................................................26. Cách phát hiện trong sắc ký lớp mỏng điều chế:.................................................................3

II. SẮC KÝ CỘT ĐIỀU CHẾ...................................................................................................41. CÁC CÁCH TIẾN HÀNH PHÂN TÍCH SẮC KÝ.............................................................42. Cột sắc ký.............................................................................................................................53. Pha tĩnh................................................................................................................................54. Kỹ thuật nhồi cột sắc kí........................................................................................................75. Pha động...............................................................................................................................96. Cách phát hiện trong sắc ký cột điều chế:..........................................................................127. Định tính một cột sắc ký....................................................................................................128. Phân lập kết quả sắc ký:.....................................................................................................159. Sắc ký cột nhanh (FC – Flash Chromatography)...............................................................1610. SẮC KÝ CỘT KHÔ.......................................................................................................2011. SẮC KÝ LỎNG CHÂN KHÔNG.................................................................................22

III. HPLC ĐIỀU CHẾ..............................................................................................................251. Nguyên tắc, yêu cầu:..........................................................................................................252. Ưu- nhược điểm, khả năng và mức độ ứng dụng:.............................................................263. Pha tĩnh, cách chuẩn bị cột:...............................................................................................264. Cách nhồi cột:....................................................................................................................275. Lựa chọn dung môi- Thay đổi dung môi:..........................................................................296. Phương pháp phát hiện và thu nhận kết quả sắc ký:..........................................................307. Các ứng dụng cụ thể:.........................................................................................................31

IV. SẮC KÝ PHÂN BỐ NGƯỢC DÒNG...............................................................................311. Nguyên tắc của phương pháp:[7].......................................................................................312. Ưu nhược điểm của phương pháp:[9]................................................................................323. Pha tĩnh:.............................................................................................................................324. Dung môi:..........................................................................................................................325. Cách phát hiện:...................................................................................................................32

V. MPLC ĐIỀU CHẾ.............................................................................................................331. Tổng quan:.........................................................................................................................332. So sánh ưu nhược điểm giữa MPLC và HPLC.................................................................333. Ứng dụng............................................................................................................................33

VI. TÀI LIỆU THAM KHẢO:................................................................................................34VII. MỤC LỤC..........................................................................................................................35


Documents

sắc ký điều chế