Ứng dụng sắc ký lớp mỏng và sắc ký khí trong kiểm nghiệm một số loại tinh dầu

8/20/2019 Ứng dụng sắc ký lớp mỏng và sắc ký khí trong kiểm nghiệm một số loại tinh dầu

http://slidepdf.com/reader/full/ung-dung-sac-ky-lop-mong-va-sac-ky-khi-trong-kiem-nghiem 1/62

BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢ C HÀ NỘI

LÊ THỊ MAI

Ứ NG DỤNG SẮC KÍ LỚ P MỎNG VÀ

SẮC KÍ KHÍ TRONG KIỂM NGHIỆMMỘT SỐ LOẠI TINH DẦU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

\

HÀ NỘI - 2014

WWW.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON



BỘ Y TẾ

TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢ C HÀ NỘI

LÊ THỊ MAI

Ứ NG DỤNG SẮC KÍ LỚ P MỎNG VÀSẮC KÍ KHÍ TRONG KIỂM NGHIỆM

MỘT SỐ LOẠI TINH DẦU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Ngƣời hƣớ ng dẫn:

ThS. Lê Thanh Bình

Nơi thự c hiện :

Bộ môn Dƣợ c liệu

HÀ NỘI - 2014





LỜ I CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng kính tr ọng và biết ơn sâu sắc tớ i ThS. Lê Thanh Bình và

TS. Nguyễn Quỳnh Chi, Bộ môn Dượ c Liệu – Trường Đại Học Dượ c Hà Nội, là

người đã truyền cho em niềm đam mê nghiên cứu cũng như giúp em có thêm nhiều

kiến thức về cuộc sống. Bằng những kiến thức và kinh nghiệm quý báu học đượ c,

em đã có thể hoàn thành khoá luận đồng thờ i có thêm hành trang chuẩn bị bướ c vào

nghề.

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị kĩ thuật viên Bộ môn

Dượ c Liệu đã tận tình giúp đỡ , tạo điều kiện để em có thể hoàn thành khoá luận mộtcách tốt nhất. Cảm ơn các thầy cô giáo đã cung cấ p cho em những kiến thức quý

báu trong suốt 5 năm qua.

Và em cũng xin gửi lờ i cảm ơn tới gia đình, bạn bè luôn ở bên cạnh tin tưở ng,

động viên em giúp em có đượ c k ết quả như ngày hôm nay.

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Lê Thị Mai





MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………. 1

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN…………………………………………….. 2

1.1. Tổng quan về sắc kí lớ p mỏng ………………………………........... 2

1.1.1. Giớ i thiệu chung về phương pháp ………………………….. 2

1.1.2. Ứ ng dụng của SKLM trong kiểm nghiệm dượ c liệu ………. 4

1.1.3. Ứ ng dụng của SKLM trong kiểm nghiệm tinh dầu ………… 5

1.2. Tổng quan về sắc kí khí - khối phổ ……………….……………….. 5

1.2.1. Sắc kí khí ………..…………………………………………. 5

1.2.2. Detector khối phổ trong sắc kí khí …………………………. 7

1.2.3. Ứ ng dụng của sắc kí khí trong kiểm nghiệm …………….… 7

1.2.4. Ứ ng dụng của sắc kí khí - khối phổ trong kiểm nghiệm

tinh dầu …………………………………………………….. 8

1.3. Tổng quan về các dƣợ c liệu nghiên cứu …………………………... 9

1.3.1. Hoắc hương ( Pogostemon cablin (Blanco) Benth.,

Lamiaceae)…………………………………………………. 9

1.3.2. Húng chanh ( Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng,

Lamiaceae)…………………………………………………. 10

1.3.3. Hương nhu trắng (Ocimum gratissimum L., Lamiaceae) …... 11

1.3.4. Hương nhu tía (Ocimum sanctum L., Lamiaceae) ...……….. 12

1.3.5. Tràm Úc ( Melaleuca alternifolia (Maiden Betche) Cheel,

Myrtaceae)………………………………………………….. 12





1.3.6. Tràm lá dài ( Melaleuca cajuputi Pwell, Myrtaceae) ………. 13

CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU….. 14

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị …….……………………………………… 14

2.1.1. Nguyên vật liệu ………….…………………………………. 14

2.1.2. Hóa chất ………….…………………………………………. 15

2.1.3. Thiết bị ………….………………………………………….. 15

2.2. Nội dung nghiên cứu………………………………………………... 15

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………… 15

2.3.1. Chiết xuất và xác định hàm lượ ng tinh dầu bằng phương

pháp cất kéo hơi nướ c……………………………………… 16

2.3.2. Phân lậ p chất đối chiếu bằng phương pháp sắc kí cột ……… 16

2.3.3. Định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp SKLM .……. 17

2.3.4. Định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí

k ết hợ p khối phổ …………………………………………… 17

CHƢƠNG 3. THỰ C NGHIỆM, K ẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN………… 18

3.1. Chiết xuất, xác định hàm lƣợ ng tinh dầu trong các mẫu dƣợ c

liệu nghiên cứ u ……………………………………………………… 18

3.2. Định tính các mẫu tinh dầu bằng phƣơng pháp SKLM ………… 18

3.2.1. Tinh dầu Hoắc hương ...…………………………………...... 18

3.2.2. Tinh dầu Húng chanh ............................................................. 213.2.3. Tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía ............................ 24

3.2.4. Tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài …………………………….. 28

3.3. Định tính các mẫu tinh dầu bằng phƣơng pháp sắc kí khí k ết

hợ p khối phổ ..……………………………………………………….. 31

3.3.1. Tinh dầu Hoắc hương …………………….………………… 31





3.3.2. Tinh dầu Húng chanh ………………………………………. 34

3.3.3. Tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía ………………… 36

3.3.4. Tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài …………………………….. 38

3.4. Bàn luận …………………………………………………………….. 41

3.4.1. Về chiết xuất và xác định hàm lượ ng tinh dầu trong các

mẫu dượ c liệu nghiên cứu ..……………………………….. 41

3.4.2. Về định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp SKLM 44

3.4.3. Về định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp sắc kí khí

k ết hợ p khối phổ …………………………………………… 45

K ẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………... 48

K ết luận …………………………………………………….. 48

Đề xuất ……………………………………………………… 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC





DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẲT

DĐVN: Dược điển Việt Nam

GC-MS: Sắc kí khí k ết hợ p khối phổ

NXB: Nhà xuất bản

SKK: Sắc kí khí

SKLM: Sắc kí lớ p mỏng





DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên bảng Trang

1 Bảng 1.1. Một số chất thường dùng làm pha tĩnh cho SKLM 3

2 Bảng 2.1. Các mẫu dượ c liệu sử dụng trong nghiên cứu 14

3Bảng 3.1. Hàm lượ ng tinh dầu trong các mẫu dượ c liệu nghiên

cứu18

4

Bảng 3.2. K ết quả phân tích mẫu tinh dầu Hoắc hương tươi bằng

GC-MS 32

5Bảng 3.3. Kết quả phân tích tinh dầu Hoắc hương khô bằng GC-

MS33

6Bảng 3.4. K ết quả phân tích tinh dầu Hoắc hương ủ bằng GC-

MS 34

7 Bảng 3.5. K ết quả phân tích tinh dầu Húng chanh bằng GC-MS 35

8Bảng 3.6. K ết quả phân tích tinh dầu Hương nhu trắng bằng GC-

MS37

9Bảng 3.7. K ết quả phân tích tinh dầu Hương nhu tía bằng GC-

MS38

10 Bảng 3.8. K ết quả phân tích tinh dầu Tràm Úc bằng GC-MS 39

11 Bảng 3.9. K ết quả phân tích tinh dầu Tràm lá dài bằng GC-MS 40





DANH MỤC CÁC HÌNH

STT Tên bảng Trang

1 Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo máy sắc kí khí 6

2 Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo máy khối phổ 7

3 Hình 2.1. Bộ dụng cụ định lượng tinh dầu cải tiến 16

4Hình 3.1. Hình ảnh sắc kí đồ các mẫu tinh dầu Hoắc hương quan

sát ở ánh sáng thườ ng sau khi phun thuốc thử hiện màu20

5

Hình 3.2. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Húng chanh quan sát dướ i

ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm và ánh sáng thườ ng sau khi

phun thuốc thử hiện màu

23

6Hình 3.3. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hương nhu trắng, Hương

nhu tía quan sát dướ i ánh sáng tử ngoại bướ c sóng 254 nm26

7

Hình 3.4. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hương nhu trắng, Hương

nhu tía quan sát dưới ánh sáng thườ ng sau khi phun thuốc thử hiện

màu

27

8Hình 3.5. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài quan

sát dưới ánh sáng thườ ng sau khi phun thuốc thử hiện màu30





1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cùng vớ i sự phát triển của các sản phẩm có nguồn gốc từ dượ c liệu nói chung,

số lượ ng và chủng loại tinh dầu trên thị trườ ng Việt Nam cũng ngày càng tăng cao.

Tuy nhiên hiện nay các biện pháp kiểm soát chất lượ ng tinh dầu còn chưa thực sự

được quan tâm, do đó làm thế nào để đánh giá chất lượ ng tinh dầu vẫn còn là một

câu hỏi lớ n.

Trong khi hiện nay sắc ký lớ p mỏng (SKLM) và sắc ký khí (SKK) là hai

phương pháp bắt buộc phải tiến hành khi đánh giá chất lượ ng tinh dầu theo quy

định trong tất cả các chuyên luận tinh dầu của Dược điển Châu Âu thì theo thống

kê, ở Dược điển Việt Nam IV chỉ có 7 chuyên luận về tinh dầu trên tổng số 283

chuyên luận về dượ c liệu. Đặc biệt chưa có chuyên luận nào quy định sử dụng

phương pháp sắc ký khí, và chỉ có 4 chuyên luận quy định sử dụng phương pháp sắc

ký lớ p mỏng để đánh giá chất lượ ng tinh dầu.

Điều đó cho thấy các quy định về kiểm nghiệm tinh dầu ở nướ c ta hiện nay

chưa đượ c chú tr ọng; các phương pháp kiểm nghiệm tiên tiến và hiện đại chưa đượ c

áp dụng phổ biến trong kiểm nghiệm tinh dầu. Do đó cần có thêm nhiều nghiên cứuvề tinh dầu đồng thờ i áp dụng các k ỹ thuật tiên tiến sẵn có vào công tác kiểm tra và

đánh giá chất lượ ng các loại tinh dầu đang lưu hành .

Vì vậy đề tài: ―Ứ ng dụng sắc kí lớ p mỏng và sắc kí khí trong kiểm nghiệm

một số loại tinh dầu‖ đượ c thực hiện vớ i mục tiêu ứng dụng phương pháp SKLM

và sắc ký khí k ết hợ p khối phổ (GC-MS) để phân tích nhằm đưa ra điều kiện sắc ký

tối ưu nhất trong kiểm tra, đánh giá chất lượ ng tinh dầu, tạo cơ sở bước đầu cho

việc xây dựng tiêu chuẩn SKLM và SKK đối vớ i một số tinh dầu thườ ng dùng.

Nội dung nghiên cứu của khoá luận:

1. Chiết xuất, xác định hàm lượ ng tinh dầu trong các dượ c liệu nghiên cứu

2. Định tính các thành phần trong tinh dầu bằng phương pháp SKLM

3. Định tính các thành phần trong tinh dầu bằng phương pháp GC-MS





2

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về sắc kí lớ p mỏng

1.1.1.

Giớ i thiệu chung về phƣơng pháp

Khái niệm

Sắc kí lớ p mỏng (SKLM) là một kĩ thuật tách các chất đượ c tiến hành khi cho

pha động di chuyển qua pha tĩnh trên đó đã chấm hỗn hợ p các chất cần tách [1],

[25].

Nguyên t ắ c

Quá trình tách xảy ra khi cho pha động chuyển động qua pha tĩnh. Pha tĩnh là

chất hấ p phụ đượ c chọn phù hợ p theo từng yêu cầu phân tích, đượ c tr ải thành lớ p

mỏng trên một giá đỡ phẳng. Pha động là một hệ dung môi đơn hoặc đa thành phần

đượ c tr ộn vớ i nhau theo tỉ lệ thích hợp. Pha động thấm theo lớ p mỏng chủ yếu dướ i

tác dụng của lực mao quản. Trong quá trình di chuyển của pha động, nhờ các quá

trình hấ p phụ và giải hấ p phụ đượ c lặp đi lặ p lại và do hệ số phân bố khác nhau, mà

những chất khác nhau di chuyển theo hướ ng chuyển động vớ i các tốc độ khác nhau.

K ết quả, mỗi chất trong hỗn hợ p phân tích sẽ ở các vị trí khác nhau trên bản mỏngnên đượ c tách riêng [5], [17].

Cơ chế

Cơ chế của sự tách có thể là cơ chế hấ p phụ, phân bố, trao đổi ion, sàng lọc

phân tử hay sự phối hợp đồng thờ i của nhiều cơ chế tuỳ thuộc vào tính chất pha tĩnh

và pha động [5].

Đại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di

chuyển R f = a/b. Trong đó:

a – khoảng cách di chuyển của chất phân tích

b – khoảng cách di chuyển của dung môi tính từ thời điểm chấm mẫu.

R f có giá tr ị từ 0 đến 1

Các yếu tố ảnh hưởng đến R f trong SKLM bao gồm chất lượ ng và hoạt tính

của chất hấ p phụ; bề dày của lớ p mỏng; tính chất, thành phần và độ tinh khiết của

pha động; độ bão hoà dung môi trong bình sắc kí; phương pháp khai triển sắc kí; tốc





3

độ di chuyển của pha động; đoạn đường pha động đi đượ c; vị trí đưa chất tan lên

bản mỏng; lượ ng mẫu đưa lên bản mỏng; ảnh hưở ng của các chất tan khác, chất tạo

phức, pH, nhiệt độ; độ chính xác của phép đo khoảng cách…[1].

Pha tĩnh

Pha tĩnh là các hạt có kích thướ c 10-30μm đượ c r ải đều và k ết dính thành lớ p

mỏng đồng nhất dày khoảng 250 μm trên giá đỡ hình vuông. Bản mỏng có sẵn trên

thị trường có kích thướ c khác nhau, thườ ng 5x20 cm hoặc 20x20cm, nhiều khi có

thêm các chất phát huỳnh quang không tan vào pha tĩnh để dễ phát hiện chất phân

tích.

Bảng 1.1: M ột số chất thường dùng làm pha tĩnh cho SKLM

STT Pha tĩnh Cơ chế sắc kí Ứ ng dụng phân tích

1 Silica Hấ p phụ Acid amin, hydrocarbon, alcaloid,

vitamin

2 Dẫn chất siloxan Phân bố Các chất ít phân cực

3 Cellulose Phân bố Acid amin, carbohydrat, nucleotid

4 Alumina Hấ p phụ Hydrocarbon, alcaloid, chất màuthực phẩm, lipid

5 Cát biển Phân bố Đườ ng, acid béo

6Cellulose trao đổi

ionTrao đổi ion

Acid nucleic, nucleotid, ion kim

loại, halogenid

7 Gel Sephadex Loại cỡ Polymer, protein, phức kim loại

Trong đó Silicagel thườ ng dùng nhất theo cơ chế sắc kí hấ p phụ. Các loại bản

mỏng silica gel: Silicagel G: có tr ộn thạch cao 5%; Silicagel H: không tr ộn thạch

cao; Silicagel GF254: có tr ộn thạch cao và chất huỳnh quang (fluorescent)[1][25].

Pha động

Để tăng cườ ng r ửa giải, thườ ng k ết hợ p 2 hay nhiều dung môi.

Nguyên lí lựa chọn: Tuỳ thuộc tính chất phân cực và ái lực với pha tĩnh để

chọn lựa dung môi sao cho phù hợ p. Khảo sát lựa chọn theo nguyên tắc tam giác





4

Stahl, nghĩa là muốn tách những chất không hoặc ít phân cực, phải dùng chất hấ p

phụ có hoạt năng cao và dung môi khai triển yếu (ít phân cực) hoặc ngượ c lại[1].

Phát hiện sắc kí đồ

Phát hiện các vết tách dưới ánh sáng thườ ng bằng mắt, quan sát đượ c các vết

có màu. Ngoài ra, có thể sử dụng hệ thống đèn tử ngoại với 2 bước sóng thườ ng sử

dụng là 254 nm và 366nm. Cũng có thể quét bản mỏng qua bộ phận Scanner

Densitometer trong khoảng bướ c sóng 200-800 nm để lựa chọn bướ c sóng phát hiện

phù hợ p. Trong một số trườ ng hợ p cần dùng thuốc thử để hiện vết trên sắc kí đồ thì

sử dụng bình phun thuốc thử[1].

Ưu điể m của phương pháp [1], [22], [23], [24], [25]

- Yêu cầu trang thiết bị cần thiết r ất đơn giản

- Cho k ết quả nhanh, r ất thuận tiện cho theo dõi phản ứng, dự đoán nhanh các

chất…

- Thờ i gian thực hiện ngắn

- Khá kinh tế nên r ất hiệu quả trong thăm dò kết quả của nhiều quá trình khác

nhau Nhược điể m [1]

- Khả năng phân tách còn hạn chế.

- Không thể tự động hoá hoàn toàn.

- Độ lặ p lại R f thấp do pha động thay đổi trong quá trình triển khai.

- Tăng giãn rộng của pic sắc ký do khuếch tán vì tốc độ dòng pha động thấ p.

1.1.2. Ứ ng dụng của SKLM trong kiểm nghiệm dƣợ c liệu [3], [24]

SKLM là một phương pháp đượ c áp dụng r ộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác

nhau như: dượ c phẩm, hoá sinh, lâm sàng… để phân tích, kiểm nghiệm, xây dựng

tiêu chuẩn. Đối vớ i kiểm nghiệm nói chung và kiểm nghiệm dượ c liệu nói riêng,

SKLM có thể đượ c ứng dụng để phân tích định tính, thử tinh khiết và định lượ ng

các hoạt chất trong mẫu phân tích.

Thử tinh khiế t





5

Là một ứng dụng r ất phổ biến của SKLM nhằm kiểm tra sự tinh khiết của các

hợ p chất: khai triển dung dịch mẫu vớ i các hệ dung môi khác nhau để phát hiện các

vết lạ ngoài vết chính của hợ p chất.

Một ứng dụng thử tinh khiết r ất hay gặ p khác của SKLM là sử dụng để nhận

biết sơ bộ thành phần của hỗn hợ p phản ứng, các phân đoạn chiết xuất, các phân

đoạn của sắc kí cột…

Định tính

Mỗi chất trong một hệ sắc kí có một giá tr ị R f đặc trưng. Do vậy để định tính

một chất cụ thể ta cần so sánh R f của mẫu thử vớ i mẫu chuẩn tiến hành sắc kí trong

cùng điều kiện. Để việc định tính được chính xác, không được thay đổi điều kiện thực

nghiệm khi so sánh và phải thực hiện một loạt phép đo để xác định giá tr ị trung bình.

Định lượng và bán định lượ ng

Bằng các biện pháp chính xác hoá lượ ng mẫu đưa lên bản mỏng có thể áp

dụng SKLM để định lượ ng. Tuỳ theo phương tiện sử dụng mà độ chính xác của

phép định lượ ng ở cấp độ khác nhau.

1.1.3.

Ứ ng dụng của SKLM trong kiểm nghiệm tinh dầuSKLM là một trong những kĩ thuật sắc kí đầu tiên đã và đang đượ c sử dụng

trong nhiều năm để phân tích tinh dầu. Phương pháp này cung cấ p các thông tin r ất

có giá tr ị so với các phương pháp đơn giản khác vì vậy mà nó đượ c thực hiện như là

một tiêu chuẩn để mô tả đặc tính của tinh dầu trong Dược điển.

Mặc dù r ất đơn giản và thực hiện nhanh chóng, kĩ thuật này đang dần tr ở nên

lỗi thời đối vớ i phân tích các hỗn hợ p phức tạp như tinh dầu. Tuy nhiên, trong các

cuộc khảo sát nhanh về các thành phần hoá học của tinh dầu hoặc sự khác nhau về

thành phần tinh dầu của các loài, phương pháp này vẫn còn r ất hữu ích [18].

1.2. Tổng quan về sắc kí khí - khối phổ

1.2.1. Sắc kí khí

Khái niệm

Sắc kí khí là một phương pháp tách dựa trên sự phân bố khác nhau giữa các

chất của hai pha không tr ộn lẫn vào nhau, trong đó pha động là chất khí đi qua pha





6

tĩnh chứa trong cột. Sắc kí khí đượ c áp dụng để tách những chất hoặc dẫn xuất của

chúng mà có thể hoá hơi ở nhiệt độ phân tích.

Sắc kí khí dựa trên cơ chế hấ p phụ, phân bố hoặc loại theo kích thướ c (dùng

rây phân tử) [3], [12].

Nguyên t ắ c [12]

Mẫu được bơm đưa vào tr ong và theo dòng khí mang (thườ ng là N2) đưa lên

cột sắc kí ( pha tĩnh). Mẫu khi qua cột này sẽ đượ c hấ p phụ lên trên pha tĩnh đó. Sau

đó, các chất lần lượ t tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài đượ c ghi nhận bởi đầu dò.

Từ các tín hiệu nhận đượ c, máy tính sẽ xử lí và biểu hiện k ết quả bằng sắc kí đồ.

Các chất được xác định nhờ giá tr ị thời gian lưu (là thờ i gian từ khi bơm mẫu đến

khi r ửa giải) trên sắc kí đồ.

Hình 1.1. Sơ đồ cấu tạo máy sắc kí khí

Ưu điể m của phương pháp[12]

- Có thể phân tích đồng thờ i nhiều hợ p chất

- Không cần làm bay hơi mẫu

- Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột

- Độ nhạy cao nhờ đầu dò

- Thể tích mẫu phân tích nhỏ (1-100μl)

- Dễ dàng k ết hợ p vớ i khối phổ

Nhược điể m[12]





7

- Máy móc hiện đại

- Yêu cầu phải có trình độ kĩ thuật, chuyên môn cao.

1.2.2.

Detector khối phổ trong sắc kí khí [18]

* Khái niệm

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượ ng phân tử của

các hợ p chất hoá học bằng việc phân tách các ion phân tử hay các ion mảnh của

phân tử theo tỷ số giữa khối lượng và điện tích của chúng (m/z).

Về bản chất, có thể coi khối phổ là một loại detector, nhưng là một detector

đặc biệt vì ngoài vai trò phát hiện, khối phổ còn có khả năng tách các chất đồng r ửa

giải dựa trên sự khác nhau về khối lượ ng của chúng.

* Nguyên t ắ c hoạt động

Mẫu từ máy sắc kí khí đưa vào máy khối phổ sẽ đượ c ion hoá trong buồng ion

để tạo các phần tử mang điện, sau đó đượ c chuyển đến bộ phận lọc và phân tích

khối để tách các ion khác nhau theo tỉ số m/z. Các ion đượ c bộ phận phát hiện thu

nhận, tín hiệu thu đượ c chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ.

C ấ u t ạoMáy khối phổ gồm có 3 bộ phận chính là: nguồn ion hoá, bộ phân tích khối và

bộ phát hiện [9].

Hình 1.2. Sơ đồ cấu tạo máy khối phổ

1.2.3. Ứ ng dụng của sắc kí khí trong kiểm nghiệm [1]

Phân tích định tính





8

- So sánh thời gian lưu tR của chất phân tích vớ i tR của chất chuẩn đối chiếu

trong cùng điều kiện sắc kí.

-

So sánh sắc kí đồ của mẫu phân tích vớ i sắc kí đồ của mẫu phân tích đã thêm

chất chuẩn đối chiếu.

- So sánh khối phổ của chất phân tích vớ i chất chuẩn đối chiếu trong cùng điều

kiện sắc kí và so sánh phổ khối của chất phân tích vớ i phổ khối các chất có trong

thư viện phổ. Phương pháp này cho kết quả tin cậy nhất.

Phân tích định lượ ng

Sắc kí khí có thể ứng dụng để định lượ ng bằng một số phương pháp như:

- Phương pháp chuẩn hoá diện tích: Hàm lượ ng phần trăm của một thành phần

trong mẫu phân tích được xác định bằng tỉ số (tính theo phần trăm) giữa diện tích

pic của các thành phần đó và tổng diện tích các pic của tất cả các thành phần có mặt

trong mẫu (tr ừ pic của dung môi, thuốc thử và của các thành phần có hàm lượ ng

nhỏ hơn giớ i hạn phát hiện của chúng).

- Phương pháp ngoại chuẩn: Đườ ng chuẩn đượ c lậ p dựa trên mối tương quan

giữa các lượ ng chất chuẩn đối chiếu khác nhau và diện tích pic tương ứng củachúng. Nồng độ các chất phân tích trong mẫu thử được định lượ ng dựa trên đườ ng

chuẩn này.

- Phương pháp thêm chuẩn: Phân tích các mẫu thêm chuẩn vào mẫu cùng điều

kiện như phân tích mẫu bình thườ ng. Dựa trên lượ ng chuẩn thêm và tín hiệu các

mẫu không thêm chuẩn và mẫu thêm chuẩn từ đó tính đượ c nồng độ chất có trong

mẫu.

-

Phương pháp nội chuẩn: Trong phương pháp này, ngườ i ta chọn một chất

chuẩn nội đưa vào trong mẫu phân tích và trong dung dịch chuẩn đối chiếu. Tỷ số

diện tích của các chất phân tích và chất chuẩn nội là thông số phân tích đượ c dùng

để xây dựng đườ ng chuẩn.

1.2.4. Ứ ng dụng của sắc kí khí - khối phổ trong kiểm nghiệm tinh dầu

Sắc kí khí - khối phổ là một kĩ thuật phân tích hiện đại và ngày càng đượ c ứng

dụng r ộng rãi, đặc biệt là trong lĩnh vực kiểm nghiệm tinh dầu. Mặc dù thiết bị đắt





9

tiền và tốn nhiều thời gian hơn nhưng khả năng phân tách của GC-MS là vượ t tr ội

hơn hẳn so với các kĩ thuật phân tách khác [18].

Sự phù hợ p của sắc kí khí đối vớ i kiểm nghiệm tinh dầu: phạm vi khối lượ ng

hoạt động của sắc kí khí là từ 2 (phân tử H2) đến khoảng 1500 đơn vị khối lượ ng;

đồng thờ i các chất phải có khả năng hoá hơi tại nhiệt độ quy định. Trong khi đó

thành phần của tinh dầu chủ yếu là các terpenoid, có khối lượ ng phân tử khoảng

dướ i 400, và r ất dễ bay hơi nên đặc biệt phù hợp để sử dụng sắc kí khí phân tích

[20].

Sau khi qua cột sắc kí khí, các tinh dầu phức tạ p có thể cho các pic chồng chất,

che khuất nhau, nên sẽ luôn tồn tại một tỉ lệ không chắc chắn về mức độ tinh khiết

của pic ghi chép đượ c. K hi đó khối phổ tr ở nên hiệu quả vì có thể nhận ra các pic

chồng chất và xác định số lượ ng các thành phần tại vị trí xảy ra sự chồng chất pic

[20].

Sắc kí khí tách các cấu tử riêng biệt của tinh dầu và định lượ ng tổng số cấu tử

hiện diện. Xác định đặc tính thực vật của tinh dầu bằng cách so sánh sự hiện diện và

số lượ ng của mỗi thành phần. Sắc kí khí có thể sàng lọc các thành phần không tự nhiên, thành phần bị khuyết, hoặc các thành phần có tỷ lệ không tự nhiên cao, có

biểu hiện pha tr ộn hay giả mạo. Cùng vớ i việc k ết hợ p vớ i khối phổ, GC-MS có khả

năng xác định các thành phần trong tinh dầu theo tên và phát hiện sự giả mạo[20].

Tóm lại, các loại tinh dầu thườ ng là một hỗn hợ p phức tạ p của r ất nhiều chất

khác nhau, trong đó có một số chất có cấu trúc hoá học tương tự nhau, đồng thờ i

khả năng phân tách của SKLM lại r ất hạn chế, nên việc sử dụng SKLM trong kiểm

nghiệm tinh dầu gặ p r ất nhiều khó khăn. Do khả năng phân tách tốt các hỗn hợ p

phức tạ p chứa các thành phần dễ bay hơi như tinh dầu nên GC-MS có thể sử dụng

trong cả định tính, thử tinh khiết, định lượ ng từng thành phần cấu thành trong tinh

dầu.

1.3. Tổng quan về các dƣợ c liệu nghiên cứ u

1.3.1. Hoắc hƣơng (Pogostemon cabl in (Blanco) Benth., Lamiaceae)





10

Từ lâu cây Hoắc hương đã được đưa trồng r ộng rãi để lấy tinh dầu ở nhiều

nước Đông Nam Á, đặc biệt là ở Inđônêsia và ở Trung Quốc. Hiện nay, chúng đượ c

tr ồng ở các vùng nhiệt đới như châu Á và châu Phi vớ i qui mô lớn để lấy tinh dầu.

Những nướ c sản xuất Hoắc hương nhiều nhất hiện nay là Ấn Độ, Malaysia,

Philipin, Mangat, Inđônesia [11]. Ở Việt Nam, cây Hoắc hương đượ c biết từ r ất lâu

đời và đượ c coi là một vị thuốc trong y học dân gian. Cây hiện đượ c tr ồng ở khắ p

các làng bản trên hầu hết các khu vực từ Bắc vào Nam. Lá Hoắc hương có chứa tinh

dầu, hàm lượ ng 2,2-2,6% (tính trên tr ọng lượ ng khô tuyệt đối). Nếu ủ men trướ c khi

cất, có thể đạt hàm lượng cao hơn [4]. Tinh dầu Hoắc hương là một hỗn hợ p phức

tạ p của những chất hoá học khác nhau, trong đó thành phần chính là patchouli alcol

(32-38%) - là thành phần quyết định phẩm chất tinh dầu; ngoài ra còn có chứa các

hợ p chất hydrocarbon sesquiterpenic như elemen, caryophyllen, patchoulen,

guaien… Hoắc hương là vị thuốc dùng trong y học cổ truyền, tính ấm, vị cay đắng,

tác dụng vào kinh vị và đại tràng, có tác dụng giải cảm nắng, thanh nhiệt ở tỳ vị

trong trườ ng hợp đầy bụng, ăn không tiêu, đi tả, nôn. Hoắc hương cũng là một trong

số r ất ít loài cho tinh dầu có tác dụng định hương. Đây là nguồn nguyên liệu khôngthể thiếu trong các kĩnh vực hương phẩm và mỹ phẩm. Tinh dầu Hoắc hương còn có

tính kháng khuẩn nên đượ c sử dụng trong nhiều chế phẩm diệt côn trùng, nhậy.

Tinh dầu Hoắc hương là loại tinh dầu có giá tr ị cao trên thị trườ ng thế giớ i [2], [7],

16].

1.3.2. Húng chanh (Plectranthus amboinicus (Lour.) Spreng, Lamiaceae)

Tên gọi khác: rau tần; tần dầy lá; cần dầy lá; r au thơm lùn.

Húng chanh có nguồn gốc ở Inđônêsia, một số tài liệu lại ghi là ở Châu Phi.

Hiện chỉ gặ p Húng chanh phân bố ở các khu vực thuộc vùng nhiệt đới. Đến nay,

Húng chanh đã được đưa trồng ở nhiều nước Đông Nam Á và Nam Á. Ở nướ c ta,

loài Húng chanh đã được đưa trồng r ải rác ở nhiều địa phương từ Bắc vào Nam. Chi

Húng chanh gồm khoảng 200 loài và phân bố chủ yếu ở các khu vực nhiệt đớ i, cận

nhiệt đớ i. Châu Phi được coi là trung tâm đa dạng và phong phú nhất của chi Húng

chanh. Trong hệ thực vật Việt Nam, chi Húng chanh hiện đã biết 7 loài.





11

Lá Húng chanh có chứa tinh dầu, hàm lượ ng từ 0,05-0,12% (tính trên nguyên

liệu tươi). Thành phần hoá học chủ yếu trong tinh dầu Húng chanh ở nướ c ta gồm:

carvacrol (39,5-82,8%); γ-terpinen (2,3-19,0%); α-terpinen (vết-16,8%); β-

caryophyllen (2,6-5,9%); α-bergamoten (1,9-3,0%); myrcen (vết-1,9%)… Húng

chanh là cây lấy tinh dầu và đượ c dùng làm gia vị trong chế biến thực phẩm, có tác

dụng lợ i phế, tr ừ đờ m, chữa ho, chữa cảm sốt, tiêu chảy, sát trùng hoặc đắ p lên các

vết do r ết và bọ cạ p cắn.Tinh dầu Húng chanh có tác dụng chữa cảm, cúm, sốt cao,

sốt không ra mồ hôi đượ c, viêm phế quản, ho, hen, ho ra máu, viêm họng, khản

tiếng, nôn ra máu, chảy máu cam. Theo những nghiên cứu gần đây, tinh dầu Húng

chanh còn có tác dụng ức chế nhiều loại vi khuẩn như Staphylococcus, Shigella

flexneri, Shiga, Streptococcus, D.pneumoniae… Hoạt tính kháng sinh mạnh này của

Húng chanh là do nhóm các chất phenolic, đặc biệt là hàm lượ ng cao của các hợ p

chất carvacrol trong tinh dầu quyết định. Trên thị trườ ng ngày nay, tinh dầu Húng

chanh là loại tinh dầu có giá tr ị r ất cao, do đó cần có các phương pháp kiểm tra

thích hợp để đảm bảo chất lượ ng tinh dầu lưu hành trên thị trườ ng, hạn chế sự giả

mạo [6], [8].1.3.3. Hƣơng nhu trắng (Ocimum gratissimum L., Lamiaceae)

Tên khác: É lớn lá; hương nhu.

Hương nhu trắng đượ c gieo tr ồng và mọc tự nhiên ở nhiều nướ c nhiệt đớ i và

cận nhiệt đớ i. Nguồn gốc của Hương nhu trắng là vùng nhiệt đớ i ở Châu Phi. Cây

Hương nhu trắng đượ c tr ồng ở nhiều nơi trên thế giớ i: Liên Bang Nga, Ấn Độ, Sri

Lanka. Ở Việt Nam, cây mọc hoang và đượ c tr ồng ở nhiều nơi. Hương nhu trắng có

chứa 0,78-1,38% tinh dầu (hoa 2,77%; lá 1,38%; toàn cây 1,14%, tính trên tr ọng

lượ ng khô tuyệt đối). DĐVN IV quy định, dượ c liệu phải chứa ít nhất 1% tinh dầu.

Thành phần hoá học tinh dầu Hương nhu trắng r ất đa dạng, trong đó eugenol là chất

chính (60-70%), DĐVN IV quy định hàm lượng eugenol không dướ i 60%; ngoài ra

trong tinh dầu còn có D-germacren (8,8%), β-ocimen (7%)… Hương nhu trắng là

nguồn nguyên liệu cất tinh dầu để tách eugenol dùng trong nha khoa và tổng hợ p

vanillin. Tinh dầu Hương nhu còn là nguyên liệu để làm dầu cao xoa xuất khẩu.





12

Hương nhu trắng còn đượ c dùng làm thuốc chữa cảm mạo nhức đầu, xông cho ra

mồ hôi, chữa lở miệng, đau bụng. Hương nhu trắng cũng có tác dụng chống viêm,

giảm đau và hạ nhiệt… Tinh dầu Hương nhu trắng có thể đượ c dùng thay thế cho

một số loại tinh dầu khác có chất lượng cao hơn và giá trị hơn (tinh dầu đinh hương

và xạ hương) [3], [7].

1.3.4. Hƣơng nhu tía (Ocimum sanctum L., Lamiaceae)

Tên khác: É đỏ, é tía, é r ừng.

Hương nhu tía vốn là cây cổ nhiệt đới, châu Á, đượ c tr ồng r ải rác ở Trung

Quốc, Lào, Thái Lan để làm thuốc và làm gia vị. Ở Việt Nam, Hương nhu tía mớ i

đượ c tr ồng hạn chế trong vườn các gia đình hoặc các cơ sở chữa bệnh theo y học cổ

truyền. Phần trên mặt đất có chứa tinh dầu - đây là phần đáng chú ý và có giá trị cao

trong cây. Theo DĐVN IV, dượ c liệu phải chứa ít nhất 0,5% tinh dầu (tính theo

dượ c liệu khô tuyệt đối) [3]. Về thành phần hoá học, tinh dầu Hương nhu tía Việt

Nam chứa các thành phần chính là eugenol (trên 70%), methyl eugenol (trên 12%)

và β-caryophyllen. Hương nhu tía mớ i chỉ đượ c dùng theo kinh nghiệm dân gian để

chữa cảm sốt, đau bụng đi ngoài, nôn mửa, cướ c khí, thuỷ thũng. Tinh dầu Hươngnhu tía thể hiện tác dụng tốt trong điều tr ị nấm Candida [19]. Ở nướ c ta, tinh dầu

Hương nhu tía chưa đượ c khai thác, sử dụng nhiều.

1.3.5. Tràm Úc (Melaleuca alternif olia (Maiden Betche) Cheel, Myrtaceae)

Tên khác: Tràm lá hẹ p, dầu trà.

Có nguồn gốc từ Australia, đượ c Viện Dượ c liệu di thực vào nướ c ta từ năm

1986. Lá Tràm Úc có chứa tinh dầu, thành phần hoá học chính của tinh dầu Tràm

Úc tr ồng ở Việt Nam gồm: terpinen-4-ol; terpinolen; 1,8-cineol… Tinh dầu Tràm

Úc đượ c sử dụng nhiều trong Y tế, làm thuốc chữa các bệnh về đườ ng hô hấ p, thần

kinh suy nhượ c, phong thấp, phù thũng… Ngoài ra, tinh dầu Tràm Úc còn có tác

dụng sinh học kháng khuẩn và nấm nên đượ c sử dụng để chữa các bệnh nhiễm

trùng, bỏng, lở miệng, vết nứt, vết tr ầy teo lợ i, hoại thư, bệnh lậu, nấm da chân…

Tinh dầu Tràm Úc không gây kích ứng da ngay ở liều lượ ng cao. Tinh dầu Tràm Úc

là loại tinh dầu r ất quý [13], [14].





13

1.3.6. Tràm lá dài (Melaleuca cajuputi Pwell, Myrtaceae)

Tên khác: Khuynh diệp, chè đồng, chè cay.

Tràm mọc nhiều ở vùng đồi núi, và đầm lầy của nhiều nước Đông Nam Á:

Inđônêsia, Việt Nam, Philipin, Myanmar, Malaysia, Campuchia. Ở Việt Nam, Tràm

mọc ở cả hai miền Bắc và Nam nhưng tậ p trung nhiều ở các tỉnh phía Nam: Quảng

Bình, Long An, Đồng Tháp, Hậu Giang, Kiên Giang… Lá Tràm có chứa tinh dầu.

Hàm lượ ng tinh dầu thay đổi theo từng vùng và theo mùa ở các tỉnh miền Trung.

DĐVN IV quy định hàm lượ ng tinh dầu Tràm không dướ i 1% (tính trên nguyên liệu

khô tuyệt đối). Thành phần hoá học chủ yếu trong tinh dầu Tràm là 1,8-cineol (20-

60%); và các hợ p chất khác có hàm lượng đáng kể như: sesquiterpen, alcol globulol,

spathuleol, ngoài ra còn có một số thành phần khác với hàm lượ ng nhỏ như:

limonen; β-caryophyllen… Lá Tràm có tác dụng kháng khuẩn, giải cảm và giảm

đau nên đượ c dùng để điều tr ị các vết thương, vết bỏng, cảm lạnh, cúm và ăn khó

tiêu. Lá Tràm đôi khi còn đượ c sử dụng làm chè uống thay nướ c giúp tiêu hoá, chữa

ho hoặc xông giải cảm. Tinh dầu Tràm và cineol có tác dụng sát khuẩn đườ ng hô

hấ p, kích thích trung tâm hô hấ p, chữa viêm nhiễm đườ ng hô hấ p. Tinh dầu Tràmcòn có tác dụng kháng khuẩn, làm lành vết thương, chữa bỏng, làm chóng lành da

[3], [7], [21].





14

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1. Nguyên vật liệu

Các mẫu dượ c liệu sử dụng trong nghiên cứu đượ c trình bày trong bảng 2.1.

Bảng 2.1. Các mẫu dượ c liệu sử d ụng trong nghiên cứ u

STT

Tên

Vi ệtNam

Tên khoa h ọcB ộ ph ậndùng

Nơi thu mẫ uTh ờ i gian thu

m ẫ u

1 Hoắchương

Pogostemoncablin

(Blanco)Benth.,

Lamiaceae

Lá tươi

Lá khôLá ủ

Nghĩa Trai - VănLâm - Hưng Yên 18/02/2014

2Húngchanh

Plectranthusamboinicus

(Lour.)Spreng,

Lamiaceae

Lá tươi Hà Nội 24/02/2014

3

Hương

nhutr ắng

Ocimum

gratissimumL., Lamiaceae

Lá tươi

Trung tâm tr ồng và

chế biến cây thuốcHà Nội, Viện Dượ cliệu

20/08/2013

4Hươngnhu tía

Ocimumtenuiflorum

L., LamiaceaeLá tươi

Trung tâm tr ồng vàchế biến cây thuốcHà Nội, Viện Dượ c

liệu

20/08/2013

5

Tràm

Úc

Melaleucaalternifolia

(Maiden

Betche)Cheel,

Myrtaceae

Lá tươi

Trung tâm tr ồng vàchế biến cây thuốc

Hà Nội, Viện Dượ cliệu

26/08/2013

6Tràm lá

dài

MelaleucacajuputiPowell,

Myrtaceae

Lá tươi

Trung tâm tr ồng vàchế biến cây thuốcHà Nội, Viện Dượ c

liệu

26/08/2013





15

Các mẫu dượ c liệu sau khi thu hái được giám định tên khoa học tại Bộ môn

Thực vật, Trường Đại Học Dượ c Hà Nội, tiêu bản được lưu tại Phòng tiêu bản cây

thuốc (HNIP) - Trường Đại học Dượ c Hà Nội (phụ lục I và phụ lục II).

2.1.2. Hoá chất:

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích.

- Các dung môi: ether dầu hoả, n-hexan, toluen, ethyl acetat, chloroform.

- Thuốc thử: Vanillin-acid sulfuric gồm 2 dung dịch

+ Dung dịch 1: Vanillin 1% pha trong ethanol

+ Dung dịch 2: Acid sulfuric 10% pha trong ethanol

Tr ộn dung dịch 1 vớ i dung dịch 2 theo tỉ lệ 1:1 (tt/tt) ngay trướ c khi sử dụng.

Sau khi phun, bản mỏng đượ c sấy ở 110°C trong 5 phút để hiện màu.

2.1.3. Thiết bị

- Máy xác định độ ẩm SATORIUS.

- Cân kĩ thuật Precisa (Switzerland).

- Tủ sấy SHELLAB (Đức).

- Bộ dụng cụ định lượ ng tinh dầu cải tiến.- Sắc ký lớ p mỏng: sử dụng bản mỏng tráng sẵn silicagel 60 F254 (Merck).

- Sắc kí cột: chất nhồi cột là silicagel pha thườ ng, cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm

(Merck).

- Hệ thống SKLM Camag Linomat 5.

- Hệ thống SKK Agilent 7890A k ết hợ p khối phổ Agilent 5975C.

- Pipet, ống đong, ống nghiệm thuỷ tinh…

2.2. Nội dung nghiên cứ u

- Chiết xuất, xác định hàm lượ ng tinh dầu trong các mẫu dượ c liệu nghiên cứu.

- Phân lậ p các thành phần chính trong các mẫu tinh dầu để làm chất đối chiếu,

định tính các mẫu tinh dầu bằng phương pháp SKLM.

- Định tính các mẫu tinh dầu nghiên cứu bằng phương pháp sắc kí khí k ết hợ p

khối phổ.

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứ u





16

2.3.1. Chiết xuất và xác định hàm lƣợ ng tinh dầu bằng phƣơng pháp cất kéo

hơi nƣớ c [2]

Tinh dầu từ các mẫu dượ c liệu nghiên

cứu đượ c chiết xuất và định lượ ng bằng

phương pháp cất kéo hơi nướ c sử dụng bộ

dụng cụ định lượ ng tinh dầu cải tiến (Hình

2.1)

Cách ti ế n hành : Cân chính xác tớ i

0,01g một lượng dượ c liệu (đã đượ c chia

nhỏ qua rây số 2000) cho vào bình cất.

Thêm 300 đến 500ml nướ c cất. Lắ p dụng

cụ. Đun bình cho đến sôi, sau đó nếu

không có chỉ dẫn gì khác thì điều chỉnh tốc

độ cất sao cho cất đượ c 2 – 3ml dịch cất

trong 1 phút. Cất cho đến khi thể tích tinh

dầu thu đượ c không tăng thêm nữa. Ngừngcất, sau ít nhất 10 phút đọc thể tinh dầu cất

đượ c trong ống hứng.

Hàm lượ ng tinh dầu trong dượ c liệu

đượ c tính theo công thức:

Trong đó: X: Hàm lượ ng phần trăm tinh dầu (ml/g)a: Thể tích tinh dầu đọc đượ c sau khi cất (ml)

b: Khối lượng dượ c liệu đã trừ độ ẩm (g)

Sau khi thu đượ c tinh dầu, loại nướ c bằng natri sulfat khan, sau đó bảo quản

tinh dầu trong lọ thuỷ tinh sẫm màu.

2.3.2. Phân lập chất đối chiếu bằng phƣơng pháp sắc kí cột

Bộ phận hứng tinh dầu

nhẹ hơn nướ c

Bộ phận hứng tinh dầu

nặng hơn nướ c

Hình 2.1. Bộ dụng cụ

định lượ ng tinh dầu cải tiến





17

Các thành phần chính trong các mẫu tinh dầu nghiên cứu đượ c phân lậ p bằng

sắc kí cột vớ i chất hấ p phụ silicagel pha thườ ng, cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm. Theo dõi

các phân đoạn bằng SKLM. Nhận dạng chất phân lập đượ c bằng hệ thống sắc kí khí

k ết hợ p khối phổ, so sánh với thư viện chuẩn Wiley, Nist và Flavor.

2.3.3. Định tính các mẫu tinh dầu bằng phƣơng pháp SKLM

Các mẫu tinh dầu nghiên cứu đượ c pha loãng bằng dung môi hữu cơ thích hợ p

r ồi đưa lên bản mỏng silicagel 60 F254 (Merck) bằng máy CAMAG Linomat 5 vớ i

thể tích chính xác đến 0,1μl. Bản mỏng đượ c khai triển bằng hệ dung môi thích hợ p.

Sắc ký đồ thu đượ c sau khi khai triển sẽ quan sát dướ i ánh sáng tử ngoại có bướ c

sóng 254 nm, 366 nm và hiện màu bằng thuốc thử vanillin- acid sulfuric, sau đó

chụ p ảnh bằng hệ thống CAMAG Reprostar 3.

2.3.4. Định tính các mẫu tinh dầu bằng phƣơng pháp sắc kí khí k ết hợ p khối

phổ

Chuẩn bị mẫu phân tích: Mẫu tinh dầu sau khi đã loại nướ c bằng natri sulfat

khan đượ c pha loãng trong dung môi chlorofom đến nồng độ 10-2 (tt/tt).

Mẫu tinh dầu sau đó đượ c phân tích trên trên hệ thống sắc kí khí (GC)Agilent 7890A k ết nối vớ i detector khối phổ (MS) 5975C, sử dụng cột HP-5MS

hoặc DB-WAX (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm).

Các chất đượ c nhận dạng dựa trên k ết quả phổ khối, thời gian lưu, đối chiếu

với thư viện phổ Wiley, Nist và Flavor.





18

CHƢƠNG 3: THỰ C NGHIỆM, K ẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1. Chiết xuất, xác định hàm lƣợ ng tinh dầu trong các mẫu dƣợ c liệu nghiên cứ u

Tinh dầu đượ c tách ra khỏi dượ c liệu bằng phương pháp cất kéo hơi nướ c.

Định lượ ng tinh dầu trong dượ c liệu bằng bộ dụng cụ định lượ ng tinh dầu cải tiến.

Mỗi mẫu được định lượ ng 3 lần, lấy giá tr ị trung bình. K ết quả hàm lượ ng tinh dầu

trong các mẫu dượ c liệu nghiên cứu đượ c trình bày trong bảng 3.1.

Bảng 3.1. Hàm lượ ng tinh d ầu trong các mẫu dượ c liệu nghiên cứ u

Dƣợ c liệu Khối

lƣợ ng

trung

bình (g)

Độ ẩm

trung

bình

(%)

Thờ i gian

cất (tính từ

thời điểm

sôi) (giờ )

Thể tích

tinh dầu

trung bình

(ml)

Hàm lƣợ ng

phần trăm

tinh dầu

(%)

Hoắc hương

- Tươi

- Khô

- Ủ

100

75

70

84,15

32,90

53,50

4

4

4

0,30

0,60

0,95

1,89

1,19

2,92

Húng chanh 300 82,67 3 0,04 0,08

Hương nhu

tr ắng

100 69,70 2 0,80 2,64

Hương nhu

Tía

100 84,20 2 0,40 2,53

Tràm Úc 120 45,90 2 2,50 3,85

Tràm lá dài 150 74,95 2 0,50 1,33

Nh ận xét: Hàm lượ ng tinh dầu ở các mẫu dượ c liệu nghiên cứu đều cao trên

1%, riêng dượ c liệu Húng chanh có hàm lượ ng tinh dầu thấ p (0,08%). Với dượ c liệu

Hoắc hương, mẫu dượ c liệu ủ có hàm lượ ng cao nhất (2,92%), tiếp đến là mẫu dượ c

liệu tươi (1,89%), thấ p nhất là mẫu dượ c liệu khô với hàm lượ ng tinh dầu là 1,19%.

3.2. Định tính các mẫu tinh dầu bằng phƣơng pháp SKLM

3.2.1. Tinh dầu Hoắc hƣơng





19

3.2.1.1. Phân l ập patchouli alcol t ừ tinh d ầu Ho ắc hương

Tiến hành phân lậ p patchouli alcol từ tinh dầu Hoắc hương mẫu dượ c liệu ủ

bằng sắc ký cột vớ i chất nhồi cột là silicagel, cỡ hạt 0,040 - 0,063mm (Merck).

Silicagel đượ c hoạt hóa ở 1100C trong 1 giờ r ồi đem nhồi cột theo phương

pháp nhồi cột ướ t. Cột thủy tinh có khóa, có lót bông thủy tinh, đườ ng kính 1cm,

r ửa sạch, sấy khô. Tr ộn silicagel đã hoạt hóa bằng dung môi khai triển là n-hexan,

đổ lên cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ. Ổn định cột trong 2 giờ .

Tinh dầu Hoắc hương đượ c pha loãng bằng dung môi n-hexan vớ i tỉ lệ 1 : 3

(tt/tt), sau đó đưa lên cột.

R ửa giải bằng dung môi n-hexan, tốc độ r ửa giải khoảng 20 giọt/phút. Hứng

dịch r ửa giải vào ống nghiệm sạch, khô, mỗi ống khoảng 1ml.

Kiểm tra dịch r ửa giải bằng SKLM vớ i hệ dung môi Toluen: ethyl acetat (10 :

1). K ết quả thu đượ c một phân đoạn cho 1 vết trên sắc ký đồ.

Kiểm tra phân đoạn này bằng sắc ký khí k ết hợ p khối phổ, vớ i cột sắc ký DB-

WAX, thể tích tiêm mẫu 1 µl, tỷ lệ chia dòng 50:1, sử dụng khí mang Heli vớ i tốc

độ khí mang 0,9 ml/phút. Chương trình nhiệt độ như sau:Thờ i gian (phút) Nhiệt độ (oC)

Cột 0-5 110

5-17 110-170

17-32 170

Nhiệt độ hóa hơi 250

K ết quả thu đượ c một pic chính trên hình ảnh sắc ký đồ (phụ lục 3), so sánh

k ết quả khối phổ của pic này với các thư viện chuẩn Wiley, Nist và Flavor cho thấy

chất phân lập đượ c là patchouli alcol.

Patchouli alcol mớ i phân lậ p sẽ đượ c sử dụng làm chất đối chiếu khi định tính

tinh dầu Hoắc hương bằng SKLM.

3.2.1.2. Đị nh tính các m ẫ u tinh d ầu Ho ắc hương bằng SKLM

- Chuẩ n bị d ịch chấ m sắ c ký:





20

Ba mẫu tinh dầu Hoắc hương tươi, Hoắc hương khô và Hoắc hương ủ đượ c

pha loãng trong dung môi ether dầu hỏa.

Chất đối chiếu patchouli alcol trong dung môi n-hexan.

- Tiế n hành:

+ Chất hấ p phụ: Bản mỏng tráng sẵn Silicagel 60 GF254 (Merck), hoạt hoá ở

1100C trong 1 giờ .

+ Chấm dịch chiết: Sử dụng máy CAMAG - Linomat 5.

+ Hệ dung môi khai triển: Sau khi lựa chọn và khảo sát vớ i một số hệ dung

môi khai triển khác nhau, nhận thấy hệ dung môi Toluen: ethyl acetat (10 : 1) cho

k ết quả tách tốt nhất trên sắc ký đồ.

+ Hiện màu: Bản mỏng sau khi khai triển, để khô dung môi r ồi hiện màu bằng

thuốc thử vanillin-acid sulfuric.

+ Chụ p ảnh: sử dụng hệ thống CAMAG reprostar3 k ết hợ p vớ i phần mềm

winCATS.

K ết quả sắc ký lớ p mỏng các mẫu tinh dầu Hoắc hương vớ i chất đối chiếu

patchouli alcol, hệ dung môi khai triển Toluen: ethyl acetat (10 : 1) quan sát ở ánhsáng thườ ng sau khi hiện màu vớ i thuốc thử đượ c thể hiện ở hình 3.1.

Hình 3.1. Hình ảnh sắc ký đồ các mẫu

tinh dầu Hoắc hương quan sát ở ánh

sáng thườ ng sau khi phun thuốc thử

hiện màu

1.

Tinh dầu Hoắc hương tươi

2. Tinh dầu Hoắc hương khô

3. Tinh dầu Hoắc hương ủ

4. Patchouli alcol





21

Nh ận xét: Hình ảnh sắc kí đồ thu đượ c của tinh dầu Hoắc hương chiết xuất từ

lá tươi, lá khô và lá ủ xuất hiện các vết tương tự nhau về màu sắc và vị trí, trong đó

đều xuất hiện vết màu hồng tím vớ i giá tr ị R f tương đương vết patchouli alcol.

K ết quả hình ảnh sắc ký đồ các mẫu tinh dầu Hoắc hương có thể tóm tắt như

trong hình sau:

Vùng tím (R f = 0,78)

Vùng hồng tím (R f = 0,47)

3 vùng tím (R f = 0,34,

R f = 0,30, R f = 0,27)

Vùng hồng tím (R f = 0,47)

Dung dịch thử Patchouli alcol

3.2.2. Tinh dầu Húng chanh

3.2.2.1. Phân l ập carvacrol t ừ tinh d ầu Húng chanh

Tiến hành phân lậ p carvacrol từ tinh dầu Húng chanh bằng sắc ký lớ p mỏng

chế hóa vớ i bản mỏng tráng sẵn silicagel F254.

Bản mỏng silicagel F254 kích thước 10 x 20 cm đượ c hoạt hóa ở 1100C trong

1 giờ .

Tinh dầu Húng chanh đượ c pha loãng bằng dung môi chloroform vớ i tỉ lệ 1 :

10 (tt/tt), sau đó đưa lên bản mỏng bằng máy CAMAG Linomat 5.

Khai triển bản mỏng bằng hệ dung môi: n-hexan: ethyl acetat (9 : 1).

Bản mỏng sau khi khai triển, quan sát dướ i ánh sáng tử ngoại, bướ c sóng 254

nm, đánh dấu các vết quan sát đượ c.





22

Cắt hai bên bản mỏng, mỗi bên có chiều r ộng 1,5 cm, r ồi phun thuốc thử hiện

màu vanillin-acid sulfuric. Ghép vào bản mỏng và đánh dấu những vết cho màu

đậm và tách rõ ràng trên bản mỏng.

Dùng kim mũi mác cạo lấy lớ p silicagel ở các vùng đã đánh dấu. Gộ p riêng

từng vùng r ồi r ửa giải bằng dung môi chloroform.

Kiểm tra dịch r ửa giải bằng SKLM vớ i hệ dung môi: n-hexan: ethyl acetat (9 :


Kiểm tra phân đoạn này bằng sắc ký khí k ết hợ p khối phổ, vớ i cột sắc ký HP-

5MS, thể tích tiêm mẫu 1 µl, tỷ lệ chia dòng 5:1, sử dụng khí mang Heli vớ i tốc độ

khí mang 1 ml/phút. Chương trình nhiệt độ như sau:

Thờ i gian (phút) Nhiệt độ (oC)

Cột 0-5 60

5-33 60-200

33-38 200




chất phân lập đượ c là carvacrol.

Carvacrol mớ i phân lậ p sẽ đượ c sử dụng làm chất đối chiếu khi định tính tinh

dầu Húng chanh bằng SKLM.

3.2.2.2. Đị nh tính tinh d ầu Húng chanh b ằng SKLM


Tinh dầu Húng chanh đượ c pha loãng bằng dung môi chloroform.

Chất đối chiếu carvacrol trong dung môi chloroform.

- Tiế n hành:



+ Chấm dịch chiết: Sử dụng máy CAMAG - Linomat 5, phần mềm winCATS.





23


môi khai triển khác nhau, nhận thấy hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat (9 : 1) cho


+ Hiện màu: Bản mỏng sau khi khai triển, để khô dung môi r ồi quan sát ở ánh

sáng tử ngoại bước sóng 254 nm, sau đó hiện màu bằng thuốc thử vanillin-acid

sulfuric.


winCATS.

K ết quả sắc ký lớ p mỏng các mẫu tinh dầu Hoắc hương vớ i chất đối chiếu

patchouli alcol, hệ dung môi khai triển n-hexan: ethyl acetat (9 : 1), quan sát dướ i

ánh sáng tử ngoại bướ c sóng 254nm và ánh sáng thườ ng sau khi hiện màu vớ i thuốc

thử đượ c thể hiện ở hình 3.2.

UV 254 nm Sau khi phun thuốc thử hiện màu

Hình 3.2. Hình ảnh sắc ký đồ tinh dầu Húng chanh

quan sát dướ i ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm và ánh sáng thườ ng

sau khi phun thuốc thử hiện màu

1. Tinh dầu Húng chanh 2. Carvacrol





24

Nh ận xét : Quan sát dướ i ánh sáng tử ngoại bướ c sóng 254 nm, sắc kí đồ của

tinh dầu Húng chanh xuất hiện 2 vết gần nhau, trong đó có 1 vết nhạt hơn và có R f

tương đương vớ i carvacrol (R f = 0,28).

Sau khi phun thuốc thử hiện màu, trên sắc ký đồ tinh dầu Húng chanh quan sát

đượ c 6 vết vớ i các màu sắc khác nhau, trong đó xuất hiện một vết màu vàng và có

giá tr ị R f tương đương vớ i carvacrol. K ết quả hình ảnh sắc ký đồ tinh dầu Húng

chanh quan sát dưới ánh sáng thườ ng sau khi phun thuốc thử hiện màu có thể tóm

tắt như trong hình sau:


Vùng tím (R f = 0,43)Vùng xanh tím (R f = 0,36)

Vùng vàng (R f = 0,28)


Vùng xanh tím (R f = 0,13)

Vùng vàng (R f = 0,28)

Dung dịch thử Carvacrol

3.2.3. Tinh dầu Hƣơng nhu trắng, Hƣơng nhu tía

3.2.3.1. Phân l ập eugenol t ừ tinh d ầu Hương nhu trắng

Tiến hành phân lậ p eugenol từ tinh dầu Hương nhu trắng bằng sắc ký cột vớ i

chất nhồi cột là silicagel, cỡ hạt 0,040 - 0,063mm (Merck).







25

r ửa sạch, sấy khô. Tr ộn silicagel đã hoạt hóa bằng n-hexan, đổ lên cột, vừa đổ vừa

gõ nhẹ. Ổn định cột trong 2 giờ .

Tinh dầu Hương nhu trắng đượ c pha loãng bằng dung môi n-hexan vớ i tỉ lệ 1 :

3 (tt/tt), sau đó đưa lên cột.

R ửa giải bằng hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat (99,5 : 0,5), tốc độ r ửa giải

khoảng 20 giọt/phút. Hứng dịch r ửa giải vào ống nghiệm sạch, khô, mỗi ống

khoảng 1ml.

Kiểm tra dịch r ửa giải bằng SKLM vớ i hệ dung môi Toluen : ethyl acetat (96 :


Kiểm tra phân đoạn này bằng sắc ký khí k ết hợ p khối phổ, vớ i cột sắc ký HP-

5MS, thể tích tiêm mẫu 1 µl, tỷ lệ chia dòng 100:1, sử dụng khí mang Heli vớ i tốc

độ khí mang 1 ml/phút. Chương trình nhiệt độ như sau:


Cột 0-5 60

5-25 60-200

25-30 200




chất phân lập đượ c là eugenol.

Eugenol mớ i phân lậ p sẽ đượ c sử dụng làm chất đối chiếu khi định tính tinh

dầu Hương nhu trắng và Hương nhu tía bằng SKLM.

3.2.3 .2. Đị nh tính tinh d ầu H ương nhu trắng và Hương nhu tía b ằng SKLM


Tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía đượ c pha loãng trong dung môi

chloroform.

Chất đối chiếu eugenol trong hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (99,5 : 0,5).

- Tiế n hành:





26





môi khai triển khác nhau, nhận thấy hệ dung môi Toluen: ethyl acetat (96 : 4) cho


+ Hiện màu: Bản mỏng sau khi khai triển, để khô dung môi r ồi quan sát dướ i

ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm và ánh sáng thườ ng sau khi hiện màu bằng



winCATS.

K ết quả sắc ký lớ p mỏng tinh dầu Hương nhu tr ắng, Hương nhu tía vớ i chất

đối chiếu eugenol, hệ dung môi khai triển Toluen: ethyl acetat (96 : 4) quan sát dướ i

ánh sáng tử ngoại bướ c sóng 254 nm đượ c thể hiện ở hình 3.3.

Hình 3.3. Hình ảnh sắc ký đồ tinh dầuHương nhu tr ắng, Hương nhu tía quan

sát dướ i ánh sáng tử ngoại bướ c sóng

254 nm

1. Tinh dầu Hương nhu trắng

2. Tinh dầu Hương nhu tía

3. Eugenol

Nh ận xét: Khi quan sát sắc kí đồ dướ i ánh sáng tử ngoại bướ c sóng 254 nm,

cả tinh dầu Hương nhu trắng và tinh dầu Hương nhu tía đều xuất hiện vết r ất đậm có

giá tr ị R f tương đương vớ i eugenol. Ngoài ra, trong tinh dầu Hương nhu trắng, số

lượ ng vết quan sát đượ c nhiều hơn số lượ ng vết ở tinh dầu Hương nhu tía.





27

K ết quả hình ảnh sắc ký đồ tinh dầu Hương nhu tr ắng, Hương nhu tía quan sát

dướ i ánh sáng tử ngoại bướ c sóng 254 nm có thể tóm tắt như trong hình sau:

Vùng đen (R f = 0,74)


3 vùng đen (R f = 0,18,

R f = 0,06

R f = 0,03





Hương nhu trắng Hương nhu tía Chất đối chiếu

K ết quả sắc ký lớ p mỏng tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía vớ i chất

đối chiếu eugenol, hệ dung môi khai triển Toluen: ethyl acetat (96 : 4) quan sát dướ i

ánh sáng tử ngoại bướ c sóng 254 nm đượ c thể hiện ở hình 3.4.

Hình 3.4. Hình ảnh sắc ký đồ tinh dầu

Hương nhu trắng, Hương nhu tía quan

sát dưới ánh sáng thườ ng sau khi phun

thuốc thử hiện màu.1. Hương nhu trắng

2. Hương nhu tía

3. Eugenol





28

Nh ận xét: Sau khi hiện màu bằng thuốc thử vanillin-acid sulfuric, trên sắc kí

đồ, tinh dầu Hương nhu trắng xuất hiện 8 vết, tinh dầu Hương nhu tía xuất hiện 4

vết, trong đó cả hai tinh dầu này đều xuất hiện một vết đậm có màu sắc và giá tr ị R f

tương đương vết eugenol.

K ết quả hình ảnh sắc ký đồ tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía quan sát

dưới ánh sáng thườ ng sau khi phun thuốc thử hiện màu có thể tóm tắt như trong

hình sau:


Vùng vàng nâu (R f =0,39)

6 vùng xanh tím(R f = 0,27, R f = 0,22,

R f = 0,17, R f = 0,1,

R f = 0,07, R f = 0,04



Vùng xanh tím (R f = 0,19)


Hương nhu trắng Hương nhu tía Chất đối chiếu

3.2.4. Tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài

3.2.4.1. Phân l ập 4-terpineol và1,8-cineol t ừ tinh d ầu Tràm Úc

Tiến hành phân lậ p 4-terpineol và 1,8-cineol từ tinh dầu Tràm Úc bằng sắc ký

cột vớ i chất nhồi cột là silicagel, cỡ hạt 0,040 - 0,063mm (Merck).



r ửa sạch, sấy khô. Tr ộn silicagel đã hoạt hóa bằng dung môi khai triển là n-hexan,

đổ lên cột, vừa đổ vừa gõ nhẹ. Ổn định cột trong 2 giờ .





29

Tinh dầu Tràm Úc đượ c pha loãng bằng dung môi n-hexan vớ i tỉ lệ 1 : 3 (tt/tt),

sau đó đưa lên cột.

R ửa giải bằng hệ dung môi n-hexan: ethyl acetat (99,5 : 0,5), tốc độ r ửa giải

khoảng 20 giọt/phút. Hứng dịch r ửa giải vào ống nghiệm sạch, khô, mỗi ống

khoảng 1ml.

Kiểm tra dịch r ửa giải bằng SKLM vớ i hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (9 :

1). K ết quả thu đượ c hai phân đoạn, mỗi phân đoạn cho 1 vết trên sắc ký đồ.

Kiểm tra hai phân đoạn này bằng sắc ký khí k ết hợ p khối phổ, vớ i cột sắc ký

DB-WAX, thể tích tiêm mẫu 1 µl, tỷ lệ chia dòng 50:1, sử dụng khí mang Heli vớ i

tốc độ khí mang 1 ml/phút. Chương trình nhiệt độ như sau:


Cột 0-5 50

5-31 50-180

31-36 180


K ết quả thu đượ c ở mỗi phân đoạn xuất hiện một pic chính trên hình ảnh sắc ký

đồ (phụ lục 6 và 7), so sánh k ết quả khối phổ của hai pic này với các thư viện chuẩn

Wiley, Nist và Flavor cho thấy hai chất phân lập đượ c là 1,8-cineol và 4-terpineol.

Hai chất mớ i phân lậ p sẽ đượ c sử dụng làm chất đối chiếu khi định tính tinh

dầu Tràm Úc và Tràm lá dài bằng SKLM.

3.2.4 .2. Đị nh tính tinh d ầu Tràm Úc vàTràm lá dài b ằng SKLM


Tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài đượ c pha loãng trong dung môi chloroform.

Hai chất đối chiếu 1,8-cineol và 4-terpineol trong hệ dung môi n-hexan : ethyl

acetat (99,5 : 0,5).

- Tiế n hành:


1100

C trong 1 giờ .





30



môi khai triển khác nhau, nhận thấy hệ dung môi n-hexan : ethyl acetat (9 : 1) cho


+ Hiện màu: Bản mỏng sau khi khai triển, để khô dung môi r ồi hiện màu bằng



winCATS.

K ết quả sắc ký lớ p mỏng tinh dầu Tràm Úc và Tràm lá dài vớ i hai chất đối

chiếu 1,8-cineol và 4-terpineol, hệ dung môi khai triển n-hexan : ethyl acetat (9 : 1)

quan sát dướ i ánh sáng tử ngoại bướ c sóng 254 nm đượ c thể hiện ở hình 3.5.

Hình 3.5. Hình ảnh sắc ký đồ tinh

dầu Tràm Úc, Tràm lá dài quan sát

dướ i ánh sáng thườ ng sau khi phun

thuốc thử hiện màu1. Tinh dầu Tràm lá dài

2. Tinh dầu Tràm Úc

3. 1,8-cineol

4. 4-terpineol

Nh ận xét: Sau khi hiện màu và quan sát ở ánh sáng thườ ng, sắc kí đồ của tinh

dầu Tràm Úc và Tràm lá dài có một số vết đặc trưng giống nhau, trong đó cả hai

mẫu tinh dầu đều xuất hiện vết có màu sắc và giá tr ị R f tương đương chất đối chiếu

1,8-cineol. Ngoài ra, trên sắc kí đồ của tinh dầu Tràm Úc xuất hiện vết có màu sắc

và giá tr ị R f tương đương chất đối chiếu 4-terpineol, trong khi đó vết này hầu như

không quan sát đượ c trên sắc kí đồ của tinh dầu Tràm lá dài.





31

K ết quả hình ảnh sắc ký đồ tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài quan sát ở ánh sáng

thườ ng sau khi phun thuốc thử hiện màu có thể tóm tắt như trong hình sau:


Vùng xanh (R f =0,47)

Vùng tím (R f =0,39)

Vùng xanh (R f = 0,31)

2 vùng tím (R f = 0,23,

R f = 0,18)





Vùng tím (R f = 0,23,


Vùng xanh (R f =0,47)


Tràm lá dài Tràm Úc 1,8-cineol 4-terpineol

3.3. Định tính các mẫu tinh dầu bằng phƣơng pháp sắc kí khí k ết hợ p khối phổ

3.3.1. Tinh dầu Hoắc hƣơng

Các mẫu tinh dầu Hoắc hương tươi, Hoắc hương khô, Hoắc hương ủ sau khi

pha loãng bằng dung môi chloroform đến nồng độ 10-2, sẽ đượ c tiêm mẫu tự động

vào cột DB-WAX vớ i thể tích 1 µl, tỷ lệ chia dòng 50 : 1, sử dụng khí mang Heli

vớ i tốc độ dòng khí mang là 0,9 ml/phút. Chương trình nhiệt độ cột sắc ký như sau:


Cột 0-5 110

5-17 110-170

17-32 170






32

K ết quả phân tích sắc ký đồ các mẫu tinh dầu Hoắc hương tươi, Hoắc hương

khô và Hoắc hương ủ sau khi so sánh với các thư viện phổ chuẩn đượ c trình bày ở

Bảng 3.2, Bảng 3.3 và Bảng 3.4.

Bảng 3.2. K ế t quả phân tích mẫ u tinh d ầu Hoắc hương tươi bằ ng GC-MS

STTThời gian lƣu

(phút)Tên chất

Hàm lƣợng

(%)

1 5,697 γ-Elemen 0,06

2 6,164 β-Patchoulen 0,52

3 8,263 α-Guaien 4,294 8,462 β-Caryophyllen 1,10

5 9,373 α-Patchoulen 1,62

6 9,485 Seychellen 3,47

7 9,840 α-Gurjunen 0,39

8 10,049 α-Caryophyllen 0,41

9 10,205 Alloaromadendren 0,20

10 10,541 γ-Selinen 0,07

11 10,755 α-Selinen 0,93

12 10,911 Germacren D 0,31

13 11,057 α-Bulnesen 6,42

14 12,099 γ-Gurjunen 0,26

15 16,802 Caryophyllen oxid 0,10

16 21,700 Patchouli alcol 68,7817 29,943 Farnesol 0,35

K ết quả phân tích tinh dầu Hoắc hương tươi bằng GC-MS đã xác định đượ c 29

thành phần, trong đó có 17 thành phần xác định đượ c tên, chiếm 89,28% trong mẫu

phân tích. Thành phần có hàm lượ ng cao nhất là patchouli alcol (chiếm 68,78%).

Tiếp đến là một số thành phần có hàm lượng cao như α-Bulnesen (6,42%), α-

Guaien (4,29%), seychellen (3,47%).





33

Bảng 3.3. K ế t quả phân tích mẫ u tinh d ầu Hoắc hương khô bằ ng GC-MS

Tương tự mẫu tinh dầu Hoắc hương tươi, vớ i tinh dầu Hoắc hương khô, khi

phân tích bằng GC-MS xuất hiện 28 thành phần, trong đó có 19 thành phần xác định

đượ c tên, chiếm 91,85% trong mẫu phân tích. Thành phần có hàm lượ ng cao nhất là

patchouli alcol với hàm lượ ng 60,28%, tiế p theo là α-Bulnesen (9,60%), α-Guaien

(6,92%), seychellen (5,21%).

STT

Thời gian lƣu

(phút) Tên chất Hàm lƣợng (%)

1 5,697 γ-Elemen 0,10


3 8,268 α-Guaien 6,92

4 8,462 β-Caryophyllen 1,70


6 9,485 Seychellen 5,217 9,840 α-Gurjunen 0,59


9 10,200 trans-Caryophyllen 0,30

10 10,541 γ-Selinen 0,10

11 10,755 α-Selinen 1,41

12 10,911 Germacren D 0,38

13 11,057 α-Bulnesen 9,60

14 11,719 α-Farnesen 0,06

15 20,790 Aromadendren 0,31

16 20,902 Veridiflorol 0,79

17 21,481 Paradisiol 0,15

18 21,685 Patchouli alcol 60,28

19 29,943 Farnesol 0,20





34

Bảng 3.4. K ế t quả phân tích mẫ u tinh d ầu Hoắc hương ủ bằ ng GC-MS

STTThời gian lƣu

(phút)Tên chất Hàm lƣợng (%)

1 5,692 γ-Elemen 0,07


3 8,263 α-Guaien 5,45



6 9,485 Seychellen 4,33

7 9,835 α-Gurjunen 0,51


9 10,200 trans-Caryophyllen 0,26

10 10,541 Cadinen 0,09

11 10,755 α-Selinen 1,33

12 10,906 Germacren D 0,35

13 11,057 α-Bulnesen 9,05

14 12,104 Germacren A 0,30

15 20,907 Veridiflorol 0,8716 21,690 Patchouli alcol 63,80

17 22,766 Pogostol 3,99

18 29,952 Farnesol 0,24

Bằng phương pháp GC-MS đã xác định trong mẫu tinh dầu Hoắc hương ủ có

27 thành phần, trong đó có 18 thành phần xác định đượ c tên, chiếm 95,04% mẫu

tinh dầu nghiên cứu. Thành phần có hàm lượ ng cao nhất là patchouli alcol

(63,80%), các thành phần đáng chú ý khác là α-Bulnesen (9,05%), α-Guaien

(5,45%), seychellen (4,33%).

3.3.2. Tinh dầu Húng chanh

Mẫu tinh dầu Húng chanh sau khi pha loãng bằng dung môi chloroform đến

nồng độ 10-2, sẽ đượ c tiêm mẫu tự động vào cột HP-5MS vớ i thể tích 1 µl, tỷ lệ chia

dòng 50 : 1, sử dụng khí mang Heli vớ i tốc độ dòng khí mang là 1 ml/phút. Chương

trình nhiệt độ cột sắc ký như sau:





35


Cột 0-5 60

5-33 60-20033-38 200


K ết quả phân tích sắc ký đồ tinh dầu Húng chanh sau khi so sánh với các thư

viện phổ chuẩn đượ c trình bày ở Bảng 3.5.

Bảng 3.5. K ế t quả phân tích mẫ u tinh d ầu Húng chanh bằ ng GC-MS

STTThời gian lƣu

(phút)

Tên chất Hàm lƣợng

(%)1 9,806 α-Terpinen 0,26

2 10,079 Cymen 0,87

3 11,252 γ-Terpinen 2,03

4 12,620 Linalol 0,38

5 15,088 4-Terpineol 0,84

6 16,617 cis-Geraniol 0,15

7 17,002 Citral b 6,64

8 17,377 trans-Geraniol 1,61

9 17,859 Citral a 7,94

10 18,453 Thymol 0,30

11 18,759 Carvacrol 52,22

12 20,264 Eugenol 0,21

13 20,532 Piperiton oxid 1,28

14 20,940 Geranyl acetat 0,34

15 21,968 β-Caryophyllen 11,3016 22,839 α-Humulen 3,26

17 23,526 Germacren D 0,19

18 23,584 β-Farnesen 0,17

19 24,149 β-Bisabolen 0,53

20 24,324 α-Amorphen 0,72

21 24,529 β-Cadinen 0,26

22 26,004 Caryophyllen oxid 1,15





36

K ết quả phân tích mẫu tinh dầu Húng chanh bằng phương pháp GC-MS đã xác

định đượ c 25 thành phần, trong đó có 22 thành phần đã xác định đượ c tên, chiếm

92,65% trong mẫu tinh dầu nghiên cứu. Thành phần có hàm lượ ng cao nhất là

carvacrol (52,22%). Các thành phần khác có hàm lượng đáng chú ý là β-

caryophyllen (11,30%), citral a (7,94%), citral b (6,64%), α-Humulen (3,26%).

3.3.3. Tinh dầu Hƣơng nhu trắng, Hƣơng nhu tía

Các mẫu tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía sau khi pha loãng bằng

dung môi chloroform đến nồng độ 10-2, sẽ đượ c tiêm mẫu tự động vào cột HP-5MS

vớ i thể tích 1 µl, tỷ lệ chia dòng 10 : 1, sử dụng khí mang Heli vớ i tốc độ dòng khí

mang là 1 ml/phút. Chương trình nhiệt độ cột sắc ký như sau:


Cột 0-5 60

5-25 60-200

25-30 200


K ết quả phân tích sắc ký đồ tinh dầu Hương nhu trắng và Hương nhu tía saukhi so sánh với các thư viện phổ chuẩn đượ c trình bày ở Bảng 3.6 và Bảng 3.7.

Vớ i tinh dầu Hương nhu trắng, k ết quả phân tích bằng phương pháp GC-MS

xác định đượ c sự có mặt của 28 thành phần, trong đó 21 thành phần xác định đượ c

tên, chiếm 98,87% mẫu tinh dầu nghiên cứu. Thành phần có hàm lượ ng cao nhất là

eugenol với hàm lượ ng 84,98%. Các thành phần khác có hàm lượ ng cao gồm

Germacren D (4,39%), cis-Ocimen (3,54%), β-caryophyllen (2,08%).

Tương tự mẫu tinh dầu Hương nhu trắng, bằng phương pháp GC-MS đã xác

định đượ c sự có mặt của 25 thành phần trong tinh dầu Hương nhu tía, chiếm

98,51% mẫu tinh dầu nghiên cứu. Thành phần có hàm lượ ng cao nhất là eugenol

với hàm lượ ng 62,39%, các thành phần đáng chú ý khác là β-caryophyllen

(20,75%), β-elemen (5,47%).





37

Bảng 3.6. K ế t quả phân tích mẫ u tinh d ầu Hương nhu trắ ng bằ ng GC-MS

STTThời gian lƣu

(phút)Tên chất

Hàm lƣợng

(%)

1 9,300 α-Terpinen 0,07

2 9,524 Cymen 0,14

3 9,889 cis-Ocimen 3,54

4 10,171 β-Ocimen 0,15

5 10,458 γ-Terpinen 0,09

6 10,692 cis-Sabinen hydrat 0,09

7 11,520 Linalol 0,16

8 13,423 4-Terpineol 0,67

9 17,274 Eugenol 84,98

10 17,654 α-Copaen 0,42

11 17,844 β-Bourbonen 0,24

12 17,937 β-Elemen 0,23



15 19,519 α-Amorphen 0,08

16 19,636 Germacren D 4,39

17 19,855 α-Cubeben 0,16

18 20,342 γ-Cadinen 0,41

19 21,442 Caryophyllen oxid 0,3020 21,875 γ-Cadinen 0,14

21 22,576 α-Cadinol 0,35





38

Bảng 3.7. K ế t quả phân tích mẫ u tinh d ầu Hương nhu tía bằ ng GC-MS

STTThời gian lƣu

(phút)Tên chất

Hàm lƣợng

(%)1 9,890 cis-Ocimen 0,19

2 13,154 Borneol 0,53

3 17,280 Eugenol 62,39

4 17,944 β-Elemen 5,47

5 18,098 Methyleugenol 0,10



8 19,306 β-Gurjunen 0,03

9 19,633 Germacren D 0,77

10 19,735 β-Selinen 0,68

11 19,888 α-Selinen 1,06

12 20,078 trans-γ-Bisabolen 2,38

13 20,339 γ-Cadinen 0,15

14 20,787 Elemol 0,53

15 21,397 Junipen 0,1316 21,442 Caryophyllen oxid 1,27

17 22,541 β-Eudesmol 0,07

18 22,606 5-epi-Neointermedeol 0,58

3.3.4. Tinh dầu Tràm Úc, Tràm lá dài

Các mẫu tinh dầu Tràm Úc và Tràm lá dài sau khi pha loãng b ằng dung môi

chloroform đến nồng độ 10-2, sẽ đượ c tiêm mẫu tự động vào cột HP-5MS và cột

DB-WAX vớ i thể tích 1 µl, tỷ lệ chia dòng 50 : 1, sử dụng khí mang Heli vớ i tốc độ

dòng khí mang là 1 ml/phút. Chương trình nhiệt độ cột sắc ký như sau:


Cột 0-10 60

10-50 60-180

50-55 180






39

K ết quả phân tích sắc ký đồ tinh dầu Tràm Úc và Tràm lá dài sau khi so sánh

với các thư viện phổ chuẩn đượ c trình bày ở Bảng 3.8 và Bảng 3.9.

Bảng 3.8. K ế t quả phân tích mẫ u tinh d ầu Tràm Úc bằ ng GC-MS

STT

DB-WAX HP-5MS

Thời

gian

lƣu

(phút)

Tên chất

Hàm

lƣợng

(%)

Thời

gian

lƣu

(phút)

Tên chất

Hàm

lƣợng

(%)

1 4,783 β-Pinen 0,23 7,360 α-pinen 0,90

2 6,330 β-Myrcen 0,56 9,716 β-pinen 0,283 6,868 α-Terpinen 1,58 10,817 β-myrcen 0,61

4 7,608 dl-Limonen 2,04 12,423 α-terpinen 1,93

5 8,094 1,8-Cineol 23,30 12,956 Cymen 1,93

6 9,938 γ-terpinen 5,81 13,207 dl-limonen 2,75

7 11,293 Cymen 2,10 13,335 1,8-cineol 28,85

8 12,038 α-terpinolen 1,29 15,194 γ-terpinen 6,43

9 24,237 α-gurjunen 0,21 17,010 α-terpinolen 1,29

10 27,019trans-

caryophyllen0,19 22,095 4-terpi neol 30,52

11 27,442 Aromadendren 0,55 22,837 α-terpineol 14,47

12 27,727 4-terpineol 35,63 33,286 α-Gurjunen 0,24

13 29,002Alloaromadend

— ren0,28 34,521 aromadendren 0,53

14 31,075leden/

viridifloren

0,82 35,449Alloaromadend-

ren

0,26

15 31,602 α-terpineol 16,50 36,903 Viridifloren 0,81

16 33,525 γ-cadinen 1,07 38,081 γ-cadinen 0,98

17 42,476 Epiglobulol 0,27 39,758 Cadinen 0,28

18 44,702 Viridiflorol 0,80 40,173 Spathulenol 0,17

19 45,966 Spathulenol 0,29 42,501 isospathulenol 0,24

20 48,328 γ-cadinol 0,17 42,662 α-cubeben 0,35

21 49,115 Isospathulenol 0,27 42,815 α-copaen 0,19





40

Bảng 3.9. K ế t quả phân tích tinh d ầu Tràm lá dài bằ ng GC-MS

DB-WAX HP-5MS

STTThờigianlƣu

(phút)

Tên chất Hàmlƣợng(%)

Thờigianlƣu

(phút)

Tên chất Hàmlƣợng(%)

1 4,794 β-pinen 0,46 7,381 α-pinen 0,322 6,349 β-myrcen 0,23 9,738 β-pinen 0,333 7,626 dl-limonen 2,49 10,833 β-myrcen 0,234 8,112 1,8-cineol 41,03 12,980 Cymen 0,465 11,318 Cymen 0,58 13,229 dl-Limonen 1,80

6 27,018 β-caryophyllen 1,64 13,355 1,8-cineol 34,177 27,717 4-terpineol 0,92 22,099 4-terpineol 0,598 29,825 γ-muurolen 0,21 22,849 α-terpineol 15,19

9 29,932 α-humulen 1,37 31,608 α-ylangen 0,1810 30,870 α-muurolen 0,34 33,687 β-caryophyllen 2,5711 31,065 β-cadinen 0,26 35,137 α-Humulen 2,1312 31,610 α-terpineol 24,24 36,121 α-Gurjunen 0,6913 31,849 β-selinen 1,15 36,301 α-Muurolen 0,5714 32,078 α-selinen 0,92 36,510 β-Selinen 1,45

15 39,020 α-calacoren 0,09 36,593 β-eudesmen 0,2816 39,540 α-ylangen 0,24 36,759 Cadinen 0,4017 41,129 caryophyllen oxid 2,20 36,890 α-selinen 1,6718 42,857 Ledol 1,23 38,823 α-calacoren 0,2219 44,706 Viridiflorol 7,24 39,777 Palustrol 0,10

20 45,017 aromadendren 0,22 40,376caryophyllen

oxid3,96

21 46,325 Neointermedeol 0,55 40,722 Viridiflorol 12,1222 46,642 α-cubeben 2,97 41,009 cis-α-bisabolen 0,3823 47,202 α-Gurjunen 0,12 41,155 Ledol 1,9524 49,776 β-eudesmen 2,15 41,252 Germacren D 0,2225 51,127 β-panasinen 0,47 41,545 Neointermedeol 0,9126 53,630 Farnesol 0,29 42,270 α-cubeben 4,4327 43,001 β-Guaien 1,1528 44,607 junipercamphor 0,3629 45,610 Farnesol 0,19

Nh ận xét:

-

Tinh dầu Tràm Úc:





41

+ Vớ i cột DB-WAX: đã xác định đượ c sự có mặt của 31 chất, trong đó 21 chất

xác định đượ c tên, chiếm 93,96% mẫu tinh dầu nghiên cứu.

+ Vớ i cột HP-5MS: đã xác định đượ c sự có mặt của 30 chất, trong đó 21 chất


K ết quả phân tích bằng cột DB-WAX và HP-5MS đều cho thấy thành phần

chính trong mẫu tinh dầu Tràm Úc là 4-terpineol, tiếp đến là 1,8-cineol.

- Tinh dầu Tràm lá dài:

+ Vớ i cột DB-WAX: đã xác định đượ c sự có mặt của 37 chất, trong đó 26 chất


+ Vớ i cột HP-5MS: đã xác định đượ c sự có mặt của 39 chất, trong đó 29 chất


K ết quả phân tích bằng cột DB-WAX và HP-5MS đều cho thấy thành phần

chính trong mẫu tinh dầu Tràm lá dài là 1,8-cineol, tiếp đến là α-terpineol.

3.4. Bàn luận

3.4.1. Về chiết xuất và xác định hàm lƣợ ng tinh dầu trong các mẫu dƣợ c liệu

nghiên cứ u* Về phương pháp: Trong quá trình thực nghiệm, hàm lượ ng tinh dầu trong các

mẫu dượ c liệu nghiên cứu được xác định bằng phương pháp cất kéo hơi nướ c sử dụng

bộ dụng cụ định lượ ng tinh dầu cải tiến. Việc sử dụng phương pháp này đã tạo r ất

nhiều thuận lợ i cho công việc thực nghiệm: Vừa đơn giản, thuận tiện, nhanh chóng lại

chiết xuất tương đối triệt để, khai thác đượ c hết tinh dầu có trong nguyên liệu mà chi

phí lại thấ p. Các thành phần trong tinh dầu của các mẫu dượ c liệu nghiên cứu tương

đối bền vớ i nhiệt nên tinh dầu cất đượ c vẫn giữ đượ c mùi như trong nguyên liệu ban

đầu.

Đặc biệt là đối vớ i các dượ c liệu Hương nhu trắng, Hương nhu tía, Tràm Úc,

Tràm lá dài: Thờ i gian định lượ ng r ất nhanh (2 giờ tính từ thời điểm nướ c bắt đầu sôi).

Đối vớ i dượ c liệu Húng chanh, do hàm lượ ng tinh dầu trong Húng chanh r ất thấ p

(0,08%), do đó yêu cầu lượ ng mẫu dượ c liệu nghiên cứu nhiều thì mớ i giảm đượ c sai

số trong phép định lượ ng này.





42

Trong các mẫu dượ c liệu nghiên cứu, chỉ riêng mẫu Hoắc hương là thờ i gian cất

tinh dầu tương đối dài, thườ ng gấp đôi so vớ i các mẫu dượ c liệu khác (4 giờ ).

* Về hàm lượ ng tinh dầu: Hàm lượ ng tinh dầu trong các mẫu dượ c liệu nghiên

cứu đều đượ c tính theo khối lượ ng dượ c liệu khô tuyệt đối. So sánh với hàm lượ ng

tinh dầu của các dượ c liệu này được quy định trong DĐVN IV và một số tài liệu tham

khảo như Dượ c liệu học (Bộ Y tế), Tài nguyên thực vật có tinh dầu ở Việt Nam thì tất

cả các dượ c liệu nghiên cứu đều đạt tiêu chuẩn về hàm lượ ng tinh dầu, cụ thể:

- Tinh dầu Hoắc hương: DĐVN IV quy định khi định lượ ng tinh dầu Hoắc

hương bằng phương pháp cất kéo hơi nước thì hàm lượ ng tinh dầu không được ít hơn

3% tính theo dượ c liệu khô tuyệt đối [5]. Tuy nhiên khi tham khảo một số tài liệu khác

thì công bố hàm lượ ng tinh dầu của cây Hoắc hương phụ thuộc vào việc xử lý nguyên

liệu trước khi chưng cất. Nếu là lá tươi, hàm lượng đạt 0,38%, lá phơi khô hàm lượ ng

đạt 2,6% và lá ủ men đạt 2,7% [7]. Để đánh giá hàm lượ ng tinh dầu trong mẫu dượ c

liệu Hoắc hương sử dụng trong nghiên cứu này, dượ c liệu cũng đượ c cất tinh dầu vớ i

ba mẫu: Lá tươi, lá phơi khô trực tiếp dướ i ánh nắng mặt tr ờ i và lá ủ (ngày phơi trong

bóng râm, tối ủ vào bao vớ i nhiệt độ trong bao có thể lên tớ i 45 - 500

C), lặ p lại trongmột tuần cho đến khi nguyên liệu khô. K ết quả cho thấy mẫu dượ c liệu ủ đạt hàm

lượ ng tương đối cao (2,92%), tiếp đến là mẫu dượ c liệu tươi (1,89%). Mẫu dượ c liệu

khô có hàm lượ ng thấ p nhất (1,19%). Để so sánh về hàm lượ ng, các mẫu dượ c liệu

đều đượ c cất trong cùng điều kiện về nhiệt độ và thờ i gian, tuy nhiên trong quá trình

cất tinh dầu, r ất dễ nhận thấy r ằng việc cất tinh dầu từ lá tươi mất nhiều thờ i gian nhất

do tạo bọt và keo, khoảng thờ i gian tính từ thời điểm nướ c bắt đầu sôi cho đến khi xuất

hiện tinh dầu quan sát đượ c ở bộ phận hứng tinh dầu r ất dài. Trong khi đó vớ i hai mẫu

tinh dầu Hoắc hương khô và Hoắc hương ủ thì ngay sau khi nước sôi đã bắt đầu quan

sát đượ c tinh dầu ở bộ phận hứng tinh dầu. Như vậy nếu sản xuất tinh dầu vớ i khối

lượ ng lớ n thì cần cân nhắc đến phương pháp xử lý nguyên liệu để có thể thu đượ c tinh

dầu với hàm lượ ng lớ n trong khoảng thờ i gian cất đượ c rút ngắn.

- Tinh dầu Húng chanh: DĐVN IV không quy định hàm lượ ng tinh dầu Húng

chanh. Theo một số tài liệu tham khảo, tinh dầu Húng chanh đạt 0,05-0,12% tính theo





43

dượ c liệu tươi [3], 0,02-0,09% trong lá tươi hoặc 0,5-1,2% trong lá khô tuyệt đối [8].

Trong nghiên cứu này, hàm lượ ng tinh dầu Húng chanh chỉ đạt 0,08% tính theo dượ c

liệu khô tuyệt đối. Như vậy mẫu dượ c liệu nghiên cứu co hàm lượ ng tinh dầu thấ p.

- Tinh dầu Hương nhu trắng và tinh dầu Hương nhu tía: DĐVN IV quy định

dượ c liệu Hương nhu trắng và Hương nhu tía phải chứa ít nhất 0,5% tinh dầu tính theo

dượ c liệu khô tuyệt đối [5]. Trong khi đó một số tài liệu tham khảo công bố hàm lượ ng

tinh dầu trong lá, hoa cao nhất là 2,25% tính theo khối lượ ng khô tuyệt đối [7]. Trong

nghiên cứu này, cả hai mẫu dượ c liệu nghiên cứu là Hương nhu trắng và Hương nhu

tía đều đạt hàm lượ ng tinh dầu r ất cao (lần lượ t là 2,64% và 2,53%).

- Tinh dầu Tràm Úc: Tràm Úc chưa được đưa vào tiêu chuẩn trong DĐVN IV,

tham khảo một số tài liệu thấy r ằng hàm lượ ng tinh dầu trong Tràm Úc đạt 1,8% [3].

Trong nghiên cứu này, mẫu dượ c liệu Tràm Úc chứa tớ i 3,85% tinh dầu.

- Tinh dầu Tràm lá dài: DĐVN IV quy định hàm lượ ng tinh dầu Tràm thu đượ c

bằng phương pháp cất kéo hơi nước không đượ c nhỏ hơn 1% [5]. Nguyên liệu sử dụng

trong nghiên cứu này đạt tiêu chuẩn về mặt hàm lượ ng tinh dầu (1,33%).

3.4.2. Về định tính các mẫu tinh dầu bằng phƣơng pháp SKLM Khả năng phân tích của SKLM là r ất đa dạng, từ những chất có độ phân cực kém

tớ i các chất phân cực trung bình tớ i mạnh. R ất nhiều nhóm chất tự nhiên có trong tinh

dầu có thể phân tích bằng sắc kí lớ p mỏng. Mặc dù khả năng tách không cao và không

nhạy bằng GC-MS nhưng sắc kí lớ p mỏng hiện vẫn là phương pháp rất phổ biến và

hữu ích trong phân tích dượ c liệu nói chung và tinh dầu nói riêng. Dược điển nhiều

nước như Việt Nam, Trung Quốc, Anh… vẫn sử dụng phương pháp sắc kí lớ p mỏng

như một tiêu chuẩn bắt buộc trong kiểm nghiệm tinh dầu.

Tuy nhiên, tham khảo các chuyên luận quy định về tiêu chuẩn tinh dầu trong

DĐVN IV nhận thấy r ằng với dượ c liệu Hoắc hương và Húng chanh, khi định tính

tinh dầu chỉ yêu cầu đối chiếu vớ i mẫu tinh dầu cất từ dượ c liệu chuẩn. Trong khi vấn

đề tìm mẫu dượ c liệu chuẩn không phải là dễ dàng. Hơn nữa, tài liệu này cũng không

mô tả một cách tỉ mỉ về cách đánh giá kết quả, chỉ yêu cầu mẫu tinh dầu thử phải có





44

các vết cùng màu sắc và tương đương về giá tr ị R f vớ i các vết trong mẫu tinh dầu đối

chiếu. Việc mô tả này gây khó khăn cho công tác kiểm nghiệm tinh dầu trên thực tế.

Xuất phát từ thực tế đó, trong nghiên cứu này, để cụ thể hóa việc định tính các

mẫu tinh dầu bằng phương pháp SKLM, các mẫu tinh dầu nghiên cứu đã đượ c thử

định tính vớ i nhiều điều kiện khác nhau và lựa chọn ra điều kiện tối ưu nhất về dung

môi pha loãng tinh dầu, bản mỏng sắc ký, hệ dung môi khai triển sắc ký, thuốc thử

hiện màu. Các k ết quả đều đượ c thể hiện dướ i dạng hình ảnh rõ ràng, sau đó có khái

quát thành dạng sơ đồ về màu sắc và vị trí tương đối của các vết trên bản mỏng sắc ký,

điều này sẽ tạo cơ sở để xây dựng các tiêu chuẩn kiểm nghiệm tinh dầu cụ thể hơn và

thuận lợi hơn cho việc áp dụng các tiêu chuẩn này trong công tác kiểm nghiệm tinh

dầu.

Đặc biệt, trong nghiên cứu này, từ các mẫu tinh dầu nghiên cứu, các thành phần

chính đã đượ c phân lậ p vớ i mục đích sử dụng làm chất đối chiếu khi định tính bằng

SKLM. Các chất phân lập đều đượ c kiểm tra bằng GC-MS để đảm bảo tính chính xác.

Việc sử dụng thêm chất đối chiếu là các thành phần có hàm lượ ng cao và đều là các

thành phần có vai trò quan tr ọng trong các mẫu tinh dầu nghiên cứu như: patchoulialcol trong tinh dầu Hoắc hương, carvacrol trong tinh dầu Húng chanh, eugenol trong

tinh dầu Hương nhu trắng, Hương nhu tía, 1,8-cineol và 4-terpineol trong tinh dầu

Tràm Úc và Tràm lá dài giúp tăng tính chính xác cho việc kiểm nghiệm tinh dầu bằng

SKLM.

Sau quá trình thực nghiệm, có thể nhận thấy việc kiểm nghiệm tinh dầu bằng

bằng phương pháp SKLM vừa đơn giản lại tiết kiệm thời gian và chi phí hơn rất nhiều

so với phương pháp GC-MS. Mặc dù khả năng phát hiện các chất có giớ i hạn, chỉ phát

hiện đượ c chất có hàm lượng đủ lớn nhưng hoàn toàn có thể sử dụng phương pháp này

để định tính một số thành phần đặc trưng trong mỗi loại tinh dầu.

3.4.3. Về định tính các thành phần trong tinh dầu bằng phƣơng pháp GC-MS

* Về phương pháp:

GC-MS là phương pháp một kĩ thuật phân tích hiện đại và r ất hiệu quả trong

phân tích tinh dầu nên ngày càng đượ c sử dụng r ộng rãi. Mặc dù thiết bị này đắt tiền,





45

không phải tất cả các cơ sở nghiên cứu hay sử dụng tinh dầu đều có thể trang bị đượ c,

nhưng cùng vớ i sự phát triển của nền kinh tế, và đòi hỏi ngày càng cao của các tiêu

chuẩn kiểm nghiệm để tránh việc nhầm lẫn, giả mạo trong dượ c liệu nói chung và tinh

dầu nói riêng, thì việc xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm bằng GC-MS là cần thiết.

Hiện nay, trong tất cả các chuyên luận DĐVN IV quy định tiêu chuẩn tinh dầu đều

chưa sử dụng kĩ thuật này, nhưng đây lại là tiêu chuẩn bắt buộc được quy định trong

Dược điển Trung Quốc và Dược điển Châu Âu.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã khảo sát các điều kiện tiến hành sắc kí khí

như cách chuẩn bị mẫu thử, lựa chọn cột sắc kí, chế độ tiêm mẫu, chương trình nhiệt

độ của cột sắc kí đối vớ i từng mẫu tinh dầu và đã lựa chọn đượ c các điều kiện sắc kí

tối ưu nhất cho mỗi loại tinh dầu đảm bảo các thành phần tách khỏi nhau rõ ràng trên

hình ảnh sắc kí đồ.

Đặc biệt đối vớ i tinh dầu Tràm Úc và tinh dầu Tràm lá dài, trong nghiên cứu này

trình bày k ết quả phân tích tinh dầu bằng cả hai loại cột sắc kí HP-5MS và DB-WAX,

trong đó HP-5MS là cột đượ c trang bị cùng vớ i hệ thống GC-MS, còn DB-WAX là

cột đặt mua thêm, vì vậy ở các cơ sở phân tích tinh dầu bằng GC-MS hiện nay ở Việt Nam, cột HP-5MS đượ c dùng phổ biến. Tuy nhiên vấn đề gặ p phải khi sử dụng loại

cột này để phân tích tinh dầu Tràm Úc và Tràm lá dài là hai thành phần dl-limonen và

1,8-cineol không tách khỏi nhau hoàn toàn, phần chân hai pic này chồng chéo lên nhau

mặc dù đã khảo sát vớ i nhiều điều kiện sắc kí khác nhau, điều này sẽ ảnh hưởng đến

k ết quả phân tích, đặc biệt là gây sai số khi xác định hàm lượ ng từng thành (phụ lục 14

và phụ lục 16). Vấn đề này đã đượ c giải quyết khi thay cột HP-5MS bằng cột DB-

WAX (phụ lục 15 và phụ lục 17). Do vậy, đối vớ i tinh dầu Tràm, việc sử dụng cột sắc

kí DB-WAX sẽ cho k ết quả phân tích chính xác hơn.

* Về k ết quả phân tích tinh dầu

- Tinh d ầu Ho ắc hương

Qua k ết quả phân tích ba mẫu tinh dầu Hoắc hương tươi, Hoắc hương khô và

Hoắc hương ủ bằng GC-MS, nhận thấy thành phần hoá học của 3 mẫu tinh dầu tương

tự như nhau. Thành phần chính của các mẫu tinh dầu đều là patchouli alcol vớ i hàm





46

lượ ng cao (>60%). Ngoài ra còn có các thành phần có hàm lượ ng cao trên 1% là α-

bulnesen, α-guaien, seychellen, α-patchoulen, pogostol, caryophyllen, selinen. K ết quả

này phù hợ p vớ i k ết quả phân tích tinh dầu Hoắc hương đượ c công bố trong một số tài

liệu tham khảo [7]. Tinh dầu Hoắc hương có giá trị cao, là một trong số r ất ít tinh dầu

có tác dụng định hương, rất quan tr ọng trong k ỹ nghệ nước hoa và xà phòng. Đặc biệt,

patchouli alcol là hợ p chất có vai trò quyết định phẩm chất của tinh dầu, theo quy định

của dượ c điển Trung Quốc thì tinh dầu Hoắc hương chứa không ít hơn 26% patchouli

alcol [15]. Như vậy mẫu dượ c liệu Hoắc hương sử dụng trong nghiên cứu vừa có hàm

lượ ng tinh dầu cao, lại có chất lượ ng tốt với hàm lượ ng patchouli alcol r ất cao.

- Tinh d ầu Húng chanh

K ết quả phân tích tinh dầu Húng chanh bằng phương pháp GC-MS cho thấy

trong mẫu tinh dầu nghiên cứu có thành phần chính là carvacrol (52,22%). Ngoài ra

còn có các thành phần khác phù hợ p vớ i công bố trong các tài liệu tham khảo như

terpinen, caryophyllen, caryophyllen oxid, α-humulen, 4-terpineol, cymen, eugenol

[8]. Tinh dầu Húng chanh hiện có giá tr ị kinh tế r ất cao, và theo các thành tựu nghiên

cứu gần đây về tác dụng sinh học cho thấy đây là nguồn tài nguyên có nhiều triểnvọng để khai thác và phát triển ở quy mô sản xuất hàng hóa. Mẫu dượ c liệu sử dụng

trong nghiên cứu có hàm lượ ng tinh dầu chưa cao, nhưng lại chứa thành phần chủ yếu

là carvacrol - hợ p chất có tác dụng quyết định giá tr ị sử dụng của tinh dầu này.

- Tinh d ầu Hương nhu trắng và Hương nhu tía

K ết quả phân tích bằng GC-MS cho thấy thành phần chính của tinh dầu Hương

nhu tr ắng và Hương nhu tía đều là eugenol (lần lượ t là 84,98% và 62,39%). Dược điển

Trung Quốc quy định hàm lượ ng eugenol trong tinh dầu Hương nhu trắng không đượ c

ít hơn 65% [15]. Ngoài ra trong tinh dầu Hương nhu trắng còn có các thành phần đáng

k ể khác là germacren D và ocimen, tinh dầu Hương nhu tía có β-caryophyllen, elemen,

caryophyllen oxid. Các k ết quả phân tích này đều phù hợ p vớ i những công bố trong

các tài liệu tham khảo về thành phần tinh dầu Hương nhu trắng và Hương nhu tía [3],

[7]. Như vậy, mẫu dượ c liệu Hương nhu trắng và Hương nhu tía sử dụng trong nghiên





47

cứu có hàm lượ ng tinh dầu cao. Đặc biệt là tinh dầu Hương nhu trắng với hàm lượ ng

eugenol cao cho thấy chất lượng cũng như tiềm năng khai thác nguyên liệu này r ất lớ n.

- Tinh d ầu Tràm Úc

Tinh dầu Tràm Úc có giá tr ị sử dụng cao trong y học cũng như trong kỹ nghệ

hương liệu. Ở Việt Nam đang có kế hoạch tr ồng cây này để khai thác tinh dầu [10].

Tuy nhiên dượ c liệu này chưa đượ c có tiêu chuẩn kiểm nghiệm trong DĐVN IV.

K ết quả phân tích mẫu tinh dầu Tràm Úc bằng GC-MS cho thấy thành phần

chính trong tinh dầu Tràm Úc là 4-terpineol với hàm lượ ng trên 30%, ngoài ra có

cineol (trên 20%). Những k ết quả trên có thể đóng góp bước đầu cho việc xây dựng

tiêu chuẩn kiểm nghiệm tinh dầu khai thác từ dượ c liệu này.

- Tinh d ầu Tràm lá dài

Việt Nam và Inđônêsia là hai nướ c có diện tích Tràm lớ n nhất. Đây là một cây có

giá tr ị sử dụng cao. Tinh dầu Tràm cũng đượ c khai thác và sử dụng r ất nhiều trong y

học dân tộc ở nước ta cũng như nhiều nướ c trong khu vực Đông Nam Á. Vì vậy, các

tiêu chuẩn kiểm nghiệm tinh dầu Tràm đã được quy định trong DĐVN IV vớ i hàm

lượ ng 1,8-cineol không ít hơn 40%. Theo k ết quả trong nghiên cứu này, thành phầnchính của tinh dầu Tràm nghiên cứu là 1,8-cineol (hàm lượ ng 34,17% vớ i cột HP-5MS

và 41,03% vớ i cột DB-WAX). Như vậy dượ c liệu sử dụng trong nghiên cứu có thể đạt

tiêu chuẩn về hàm lượ ng 1,8-cineol, nhưng ở mức giớ i hạn dướ i.





48

K ẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

K ết luận

Sau một thờ i gian tiến hành thực nghiệm, đề tài đã đạt đượ c các mục tiêu đề ra

của khoá luận:

- Đã chiết xuất, xác định được hàm lượ ng tinh dầu trong các mẫu dượ c liệu

nghiên cứu, với hàm lượ ng cụ thể từng mẫu như sau: Hoắc hương tươ i chứa 1,89%,

Hoắc hương khô chứa 1,19%, Hoắc hương ủ chứa 2,92%, Húng chanh chứa 0,08%,

Hương nhu trắng chứa 2,64%, Hương nhu tía chứa 2,53%, Tràm Úc chứa 3,85%,

Tràm lá dài chứa 1,33%.

- Đã lựa chọn được các điều kiện tối ưu nhất để áp dụng phương pháp SKLM

định tính các mẫu tinh dầu. Đồng thời đã phân lập đượ c các thành phần chính từ các

mẫu tinh dầu gồm: patchouli alcol từ tinh dầu Hoắc hương, carvacrol từ tinh dầu

Húng chanh, eugenol từ tinh dầu Hương nhu trắng, 1,8-cineol và 4-terpineol từ tinh

dầu Tràm Úc.

Sử dụng các thành phần vừa phân lập để làm chất đối chiếu trong định tính các

mẫu tinh dầu nghiên cứu bằng SKLM.- Đã lựa chọn được các điều kiện để áp dụng phương pháp GC-MS định tính

các thành phần trong mẫu tinh dầu nghiên cứu. K ết quả phân tích cho thấy tinh dầu

Hoắc hương có hàm lượ ng patchouli alcol cao (trên 60%), tinh dầu Húng chanh có

hàm lượ ng carvacrol cao (52,29%), tinh dầu Hương nhu trắng có hàm lượ ng

eugenol cao (84,98%) trong khi hàm lượ ng này ở Hương nhu tía là 62,39%, Tràm

Úc có hàm lượ ng 4-terpineol và 1,8-cineol lần lượ t là trên 30% và trên 23%, Tràm

lá dài có hàm lượ ng 1,8-cineol chưa cao (trên 34%).

Đề xuất

Trong khuôn khổ khoá luận, chỉ có 6 dượ c liệu được đưa vào nghiên cứu,

trong khi nguồn tài nguyên tinh dầu ở Việt Nam r ất là phong phú và ngày càng có

nhiều sản phẩm tinh dầu được lưu hành trên thị trường, nên để góp phần bổ sung cơ

sở dượ c liệu về sắc kí lớ p mỏng và sắc kí khí trong kiểm nghiệm một số dượ c liệu

chứa tinh dầu, chúng tôi xin đưa ra các đề xuất sau:





49

- Thu hái thêm các mẫu dượ c liệu trong nghiên cứu này ở các địa điểm khác

nhau, vào các thời kì khác nhau để có thể đưa ra tiêu chuẩn kiểm nghiệm một cách

chính xác hơn.

- Tiế p tục ứng dụng phương pháp SKLM và GC-MS để phân tích và đánh giá

các mẫu tinh dầu lưu hành phổ biến trên thị trườ ng hiện nay.





TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1.

Tr ần Tử An (2006), Hoá phân tích - T ậ p II , Trườ ng Đại học Dượ c Hà Nội,

tr108, 117, 161-163, 214-222.

2. Bộ môn Dượ c liệu (2006), Thự c t ập dượ c liệu (phần hóa học), Trung tâm

thông tin thư viện - Trường Đại học Dượ c Hà Nội, tr 83-84.

3. Bộ Y tế (2007), Dượ c liệu học - T ậ p II, NXB Y học, tr 231-232, 225-226.

4. Uông Thị Ngọc Hà, Lê Ngọc Thạch (2012), ―Khảo sát tinh dầu từ cây Hoắc

hương (Pogostemon cablin Benth.) thu hái tại thị tr ấn Cai Lậy‖, T ạ p chí

Dượ c học, T.52, (S.10).

5. Hội Đồng Dược điển (2010), Dược Điể n Việt Nam, NXB Y học, PL 12.13,

PLL- 240, PLPL 5.2, PL 5.4.

6. Nguyễn Thị Bích Huyền, Nguyễn Thị Diệu Thuý, Châu Thị Thuý Hằng

(2012), ―Khảo sát thành phần hoá học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh

dầu Húng chanh (Plectranthus amboinicus Lour.)‖, T ạ p chí khoa học, tr.144-

147.7. Lã Đình Mỡ i và cộng sự (2001), Tài nguyên thự c vật có tinh d ầu ở Việt Nam

- T ậ p I, NXB Nông nghiệ p, tr 120-133, 154-161, 274-284.

8. Lã Đình Mỡ i và cộng sự (2002), Tài nguyên thự c vật có tinh d ầu ở Việt Nam

T ậ p II, NXB Nông nghiệ p, tr 189-192.

9. Tr ần Cao Sơn (2010), Định lượ ng một số acid béo omega 3, omega 6 và

omega 9 trong đậu tương và các sản phẩ m t ừ đậu tương bằ ng k ỹ thuật sắ c kí

khí khố i phổ , Luận văn thạc sĩ dượ c học, Đại học Dượ c Hà Nội.

10. Nguyễn Thị Tâm (2003), Nhữ ng tinh d ầu lưu hành trên thị trườ ng, NXB

Khoa học và k ỹ thuật.

11. Viện Dượ c liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuố c ở Việt Nam, NXB

Khoa học và k ỹ thuật, trtr 965-968.

12. Phạm Hùng Việt (2005), S ắ c kí khí - Cơ sở lý thuyế t và khả năng ứ ng d ụng,

NXB Đại học quốc gia.





Tiếng anh

13. Carson, C.F. Riley, T.V. (2001), Safety, efficacy and provenance of tea tree

(Melaleuca alternifolia) oil , Contact Dermatitis, 45(2):24 p.65-7.

14. Carson, C.F.and Riley, T.V. (1995), ―Antimicrobial activity of the major

components of the essential oil of Melaleuca alternifolia‖, Journal of Applied

Bacteriology, 78: 264 – 269.

15. Chinese pharmacopoeia commission (2010), Pharmacopoeia of the people’s

republic of China - volume I, The people’s republic of China.

16. Hussin, N.Mondello, L. Costa, R. Dugo, P. Yusoff, N.I.Yarmo,

M.A.AbWahab, A.Said (2012), ―Quantitative and physical evaluation of

patchouli essential oils obtained from different sources of Pogostemon

cablin‖, Nat Prod Commun, 7(7): p. 927-30.

17. Joseph Sherma (2006), Thin-Layer chromatography, in Encyclopedia of

Analytical Chemistry.

18. K. Husnu Can Baser, Gerhard Buchbauer (2009), Handbook of essential oils:

Science, Technology, and Applications, CRC Press. 991.19. Khan, A.Ahmad, A.Xess, I.Khan, L.A.Manzoor, N.(2014), ―Ocimum

sanctum essential oil inhibits virulence attributes in Candida albicans‖,

Phytomedicine, 21(4); p. 448-52.

20. Marriott, Philip J.Shellie, Robert Cornwell, Charles (2001), ―Gas

chromatographic technologies for the analysis of essential oils‖, Journal of

Chromatography A, 936(1 – 2): p. 1-22.

21.

O.Motil, J.Hodacova, K.Ubik (1990), ―Composition of Vietnamese cajuput

essential oil‖, Flavour and Fragrance Journal , 5(1): p. 39-42.

22. Pamela M. Gorman, Hong Jiang (2004), Separation Science and Technology

- volum 5, p. 203-230.

23. Poole, C.F. (2013), THIN-LAYER CHROMATOGRAPHY | Principles, in

Reference Module in Chemistry, Molecular Sciences and Chemical

Engineering , Elsevier.





24. Santiago, Marina Strobel, Scott (2013), Chapter Twenty-Four - Thin Layer

Chromatography, in Methods in Enzymology, L. Editor by Jon, Lorsch;

Academic Press, p. 303-324.9

25. Sherma, Joseph Fried, Bernard (2003), Handbook of thin-layer

chromatography - Vol. 89, CRC press.





PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Giấy chứng nhận mã số tiêu bản

Phụ lục 2. Biên bản giám định tên khoa học

Phụ lục 3. Hình ảnh sắc kí đồ patchouli alcol phân tích bằng GC-MS

Phụ lục 4. Hình ảnh sắc kí đồ carvacrol phân tích bằng GC-MS

Phụ lục 5. Hình ảnh sắc kí đồ eugenol phân tích bằng GC-MS

Phụ lục 6. Hình ảnh sắc kí đồ 1,8-cineol phân tích bằng GC-MS

Phụ lục 7. Hình ảnh sắc kí đồ 4-terpineol phân tích bằng GC-MS

Phụ lục 8. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hoắc hương tươi phân tích bằng GC-MS

Phụ lục 9. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hoắc hương khô phân tích bằng GC-MS

Phụ lục 10. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hoắc hương ủ phân tích bằng GC-MS

Phụ lục 11. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Húng chanh phân tích bằng GC-MS

Phụ lục 12. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hương nhu trắng phân tích bằng GC-MS

Phụ lục 13. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Hương nhu tía phân tích bằng GC-MS

Phụ lục 14. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Tràm Úc phân tích bằng GC-MS sử dụng

cột HP-5MSPhụ lục 15. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Tràm Úc phân tích bằng GC-MS sử dụng

cột DB-WAX

Phụ lục 16. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Tràm lá dài phân tích bằng GC-MS sử dụng

cột HP-5MS

Phụ lục 17. Hình ảnh sắc kí đồ tinh dầu Tràm lá dài phân tích bằng GC-MS sử dụng

cột DB-WAX


Documents

Ứng dụng sắc ký lớp mỏng và sắc ký khí trong kiểm nghiệm một số loại tinh dầu