Asparagus officinalis L. y su potencial como promotoras de

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE MICROBIOLOGÍA

Y PARASITOLOGÍA

Actinobacterias aisladas de rizoplano y rizósfera de

Asparagus officinalis L. y su potencial como promotoras de

crecimiento en plantas

TESIS

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE LICENCIADO EN

BIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA - PARASITOLOGÍA

PRESENTADA POR:

Br. Basty Berenize Sánchez Villarreal

LAMBAYEQUE, PERÚ

2017

Actinobacterias aisladas de rizoplano y rizósfera de

Asparagus officinalis L. y su potencial como promotoras de

crecimiento en plantas

TESIS

PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE LICENCIADO EN BIOLOGÍA

MICROBIOLOGÍA - PARASITOLOGÍA

APROBADO POR:

Dr. Eduardo Tejada Sánchez

PRESIDENTE

MSc. Consuelo Rojas Idrogo

SECRETARIA

Dra. Gianina Llontop Barandiaran

VOCAL

Dra. Carmen Carreño Farfán

PATROCINADORA

LAMBAYEQUE, PERÚ

2017

Índice

I. INTRODUCCIÓN .............................................................................................. 1

II. MARCO TEÓRICO ............................................................................................ 3

2.1 Antecedentes de la investigación ........................................................................................... 3

2.2 Base teórica .................................................................................................................................... 7

2.2.1 Actinobacteerias………………………………….…….………………….…..9

III. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................... 14

3.1 Material ............................................................................................................................................ 14

3.1.1 Muestra biológica…………………….…………………..……………….….14

3.1.2 Población y muestra .............................................................................. 14

3.2 Métodos .......................................................................................................................................... 14

3.2.1 Variable de la fase descriptiva ............................................................... 14

3.2.2 Variables de la fase experimental .......................................................... 14

3.2.3 Tipo de estudio y diseño de contrastación de hipótesis ......................... 15

3.2.4 Lugar de muestreo ................................................................................ 15

3.2.5 Obtención de muestras ......................................................................... 18

3.2.6 Aislamiento e identificación fenotípica de Actinobacterias.……………..18

3.2.7 Mantenimiento de cultivos de Actinobacterias.……………………………22

3.2.8 Cuantificación de nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e indoles

producidos ............................................................................................. 22

3.2.9 Selección de Actinobacterias……………………………………………….. 27

3.2.10 Efecto de Actinobacterias en plantas de espárrago ............................. 27

3.2.11 Análisis estadisticos de los datos ....................................................... 32

IV RESULTADOS ................................................................................................ 33

4.1 Actinobacterias aisladas e identificadas en Asparagus officinalis L…………...33

4.2 Nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e indoles producidos por

Actinobacteria ............................................................................................................................. 41

4.3 Cultivos de Actinobacterias seleccionados ...................................................................... 41

4.4 Efecto de Actinobacterias en la altura y número de tallos de Asparagus

officinalis L. ………………………………………………………………………….41

V. DISCUSIÓN ..................................................................................................... 60

VI. CONCLUSIONES ........................................................................................... 64

VII. RECOMENDACIONES .................................................................................. 65

VIII. RESUMEN .................................................................................................... 66

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 67

X. ANEXOS.......................................................................................................... 75

Índice de tablas

Tabla 1. Lote de procedencia demuestras de raíces con suelo rizosferico de

Asparagus officinalis L. en el fundo Josymar, Viru, La

Libertad……………………………………………………………………... 17

Tabla 2. Analisis físico – químico de suelo rizosferico de Asparagus officinalis L.

en Viru, La Libetad, 2016 …...…………………..………………………….. 19

Tabla 3. Frecuencia de morfotipos de colonias de Actinobacterias aislados de

rizoplano y rizosféra de Asparagus officinalis L. …………………………. 35

Tabla 4. Frecuencia de géneros identificados en Actinobacterias aisladas de

rizoplano y rizosféra de Asparagus officinalis L. …………………………. 37

Tabla 5. Nitrógeno fijado como amonio (ppm) por Actinobacterias aisladas de

rizoplano y rizosféra de Asparagus officinalis L. ……………………........ 43

Tabla 6. Fósforo cuantificado (ppm) en la solubilización por Actinobacterias

aisladas de rizoplano y rizosféra de Asparagus officinalis L. ……........... 46

Tabla 7. Indoles producidos (ppm) por Actinobacterias aisladas de rizoplano y

rizosféra de Asparagus officinalis L. ………………………………………. 48

Tabla 8. Valores (ppm) de amonio, fósforo soluble e indoles correspondientes a

cultivos de Actinobacterias seleccionados. ………………………..……... 49

Tabla 9. Índices de efectividad (%) de Actinobacterias en la altura de

Asparagus officinalis L. a los 30, 45 y 60 días. …..………....................... 52

Tabla 10. Prueba de Tukey de la altura de plantas de Asparagus officinalis L. a

los 30, 45 y 60 días después de la inoculación de Actinobacteria. ......... 53

Tabla 11. Índices de efectividad (%) de Actinobacterias en el número de tallos de

Asparagus officinalis L. a los 30, 45 y 60 días. …………………….......... 54

Índice de figuras

Figura 1. Diseño completamente aleatorio para determinar el efecto de Actinobacterias en Asparagus officinalis L. ………………………… 16

Figura 2.

Ubicación de la provincia de Virú, región La Libertad, abril 2016 (https://www.google.com.pe/maps/place/Vir%C3%BA/@-8.5664616,78.794859,10z/data=!4m5!3m4!1s0x91ac59407c7b0391:0x6c172095672753ce!8m2!3d-8.5528417!4d-78.6254767).........

17

Figura 3. Extraccion de raíces con suelo rizosférico de Asparagus officinalis L. …………………………………………………………………………

19

Figura 4. Raíces con suelo rizosférico de Asparagus officinalis L. deshidratadas…………………………………………………..………..

20

Figura 5. Suspensión de raíces y suelo rizosférico de Asparagus officinalis L. en solución salina esterilizada………………..…………………….. 20

Figura 6. Siembra en agar avena mediante la técnica de agotamiento y estria …………………………………………………………………….. 21

Figura 7. Actinobacterias desarrolladas en agar avena.……………………….. 21

Figura 8. Cultivo de Actinobacterias en agar avena para la caracterización macroscópica. ……………………………………………………………

23

Figura 9. Láminas portaobjetos lista para la observación microscópica.…………………………………………………………….. 23

Figura 10. Cultivos puros de Actinobacterias en agar avena…………............... 24

Figura 11. Caldo extracto de suelo cultivado con Actinobacterias.………….…. 26

Figura 12. Caldo National Botanical Research Institute’s phosphate cultivado con Actinobacterias..……….............................................................. 26

Figura 13. Caldo tripticasa soya suplementado con triptofano cultivado con Actinobacterias.……………..…………………………………………… 28

Figura 14. Coronas de Asparagus officinalis L. ………………………………….. 28

https://www.google.com.pe/maps/place/Vir%C3%BA/@-8.5664616,78.794859,10z/data=!4m5!3m4!1s0x91ac59407c7b0391:0x6c172095672753ce!8m2!3d-8.5528417!4d-78.6254767



Figura 15. Inmersión de coronas de Asparagus officinalis L. en solución de fungicida.…………………………………………………………………. 30

Figura 16. Inoculo bacteriano asperjado en coronas de Asparagus officinalis L…………………………………………………………………………… 30

Figura 17. Medición de altura de tallos de Asparagus officinalis L. ……………. 31

Figura 18. Conteo del número de tallos de Asparagus officinalis L…………….. 31

Figura 19. Frecuencia de muestras de rizoplano y rizósfera de Asparagus officinalis L. positivas al aislamiento de Actinobacterias en agar avena.……………….......................................................................... 34

Figura 20. Colonias de Actinobacterias desarrolladas en agar avena…………. 34

Figura 21. Observación microscópica de los esporóforos de Streptomyces sp. no espiralados (a), espirales primitivos (b), espirales abiertos (c), espirales cerrados (d). …….……………………………………………. 38

Figura 22. Observación microscópica de Nocardia sp…………………………… 39

Figura 23. Observación microscópica de Micromonospora sp........................... 39

Figura 24. Observación microscópica de Nocardioides sp. …………………….. 40

Figura 25. Observación microscópica de Pseudonocardia sp. …………………. 40

Figura 26. Porcentaje de Actinobacterias aisladas de Asparagus officinalis L. que fijaron nitrógeno in vitro.…………………………………............... 42

Figura 27. Coloración observada en la cuantificación de amonio…................... 42

Figura 28. Porcentaje de Actinobacterias aisladas de Asparagus officinalis L. que solubilizaron fosfato in vitro.………………………………………. 45

Figura 29. Coloración observada en la cuantificación de fósforo soluble........... 45

Figura 30. Coloración observada en la cuantificación de indoles.……………… 47

Figura 31. Plantas de Asparagus officinalis L. 30 días después de la siembra de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Streptomyces sp.5.5. …………………………………………………… 51

Figura 32. Plantas de Asparagus officinalis L. 30 días después de la siembra de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Nocardia sp.4.3. ……………………………………………………………………. 51

Figura 33. Altura (cm) de Asparagus officinalis L., 30 días después de la inoculación de Actinobacterias.………………………………………… 52

Figura 34. Número de tallos de Asparagus officinalis L., 30 días después de la inoculación de Actinobacterias. ……............................................. 53

Figura 35. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Streptomyces sp.5.5. ……………………........................................... 54

Figura 36. Plantas de Asparagus officinalis L. 45 días después de la siembra de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Nocardia sp.44.2. …………………………………………………………………... 55

Figura 37. Altura (cm) de Asparagus officinalis L., 45 días después de la inoculación de Actinobacterias. ………………………………………. 55

Figura 38. Número de tallos de Asparagus officinalis L., 45 días después de la inoculación de Actinobacterias……………………………………… 56

Figura 39. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Streptomyces sp.5.5. …………………………………………………… 56

Figura 40. Plantas de Asparagus officinalis L. 60 días después de la siembra de coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Streptomyces sp.50.1. ……............................................................... 57

Figura 41. Altura (cm) de Asparagus officinalis L., 60 días después de la inoculación de Actinobacterias. ……………………………………….. 57

Figura 42. Número de tallos de Asparagus officinalis L., 60 días después de la inoculación de Actinobacterias. …………………………………….. 59

1

I. INTRODUCCIÓN

El cultivo de Asparagus officinalis L. “espárrago” es el producto abanderado

de las exportaciones hortofrutícolas peruanas (Canto et al., 2008), alcanzando uno

de los mayores rendimientos a nivel mundial (2,2 tha-1). Éste, como en la mayoría

de países depende de la aplicación de insumos químicos como los fertilizantes

(Altamirano et al., 2014), que correctamente utilizados incrementan la

productividad y rentabilidad de los cultivos agrícolas como el espárrago; no

obstante, cada año aumenta la cantidad de fertilizantes por aplicar, debido a la

menor eficacia de adsorción en el suelo y absorción por la planta (Nicolalde &

Quintana, 2010), a la vez que también se incrementa la contaminación del

ambiente (Perleche & Rentería, 2013).

Con el objetivo de mitigar el impacto ambiental causado por el uso de

fertilizantes en la agricultura, se investiga la diversidad de microorganismos

rizosféricos como las rizobacterias promotoras de crecimiento en plantas (Plant

Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR), que incluyen especies de

Actinobacterias. Estas bacterias estimulan los ciclos biogeoquímicos de los

nutrientes, fijan nitrógeno atmosférico, solubilizan fosfatos, producen reguladores

de crecimiento y sideróforos así como también reducen el ataque de

fitopatógenos e insectos (Hernández et al., 2006; Bhattacharyya & Jha, 2012).

Las Actinobacterias se encuentran ampliamente distribuidas por su

versatilidad y formación de esporas que les permiten sobrevivir en condiciones

adversas. Estas bacterias tienen potencial para la promoción de crecimiento en

plantas, debido a la producción de reguladores de crecimiento (Franco, 2008;

Cabrera & Paredes, 2013), solubilización de fosfatos (Rico, 2009; Otero, 2011),

fijación de nitrógeno (Otero, 2011; Cabrera & Paredes, 2013) y control biológico

2

de fitopatógenos (Anitha & Rabeeth 2009; Otero, 2011; Suwan et al., 2012). Se

han reportado investigaciones sobre Actinobacterias, en las que se ha

demostrado incremento en la germinación (Cabrera & Paredes, 2013) y

emergencia (Aguilar & Deza, 2014), desarrollo vegetativo (Julón, 2014; Ramírez,

2015) y rendimiento (Paredes, 2014) de los cultivos agrícolas.

En el rizoplano y rizósfera de las plantas de espárrago se encuentran

especies de Actinobacterias con características de promotoras de crecimiento en

plantas; sin embargo, no se ha realizado investigación para aislarlas y determinar

su potencial, con la perspectiva de aplicarlas en los cultivos agrícolas como

biofertilizantes. La presente investigación permitirá identificar especies de

Actinobacterias propias de la región, con potencial para la biofertilización,

generando valor agregado a la biodiversidad regional, a la vez que se disminuye

el riesgo de la salud de los seres vivos y el efecto negativo de los insumos

químicos en el ambiente. Por lo expuesto, se planteó el siguiente problema;

¿Cúales son las Actinobacterias aisladas en el rizoplano y rizosfera de espárrago

y cuál es su potencial como promotoras de crecimiento en plantas?

El objetivo general fue: Aislar e identificar Actinobacterias en el rizoplano y

rizósfera de espárrago y determinar su potencial como promotoras de crecimiento

en plantas. Los objetivos específicos fueron: Aislar e identificar fenotípicamente

Actinobacterias en el rizoplano y rizósfera de plantas de espárrago, cuantificar el

nitrógeno fijado, fosfato solubilizado, indoles producidos in vitro por las

Actinobacterias, seleccionar los seis cultivos de Actinobacterias con los mayores

valores en el nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e indoles producidos y

determinar el efecto de las Actinobacterias seleccionadas en la altura y número de

tallos de plantas de espárrago. La hipótesis planteada fue: Las Actinobacterias

aisladas del rizoplano y rizósfera de espárrago fijan nitrógeno, solubilizan fosfatos,

producen indoles e incrementan la altura y número de tallos de las plantas de

espárrago.

3

II. MARCO TEÓRICO

2.1 Antecedentes de la investigación

Las especies de Actinobacterias son ubicuas y pueden ser aisladas de raíces

y rizósfera de diversos cultivos agrícolas como Dianthus caryophyllus “clavel”

(Márquez et al., 2002), Trifolium repens L. “trébol blanco” (Franco, 2008),

Theobroma cacao “cacao” (Barreto et al., 2008), Solanum tuberosum L. “papa”

(Rico, 2009), Physalis peruviana L. “uchuva” (Venner & Martin, 2009), Musa sp.

(Otero, 2011), Capsicum sp. (Srividya et al., 2012), Triticum aestivum L. “trigo” (Aly

et al., 2012), Zea mays L. “maíz” (Cabrera & Paredes, 2013), Lycopersicon

esculentum Mill “tomate” (Núñez & Vásquez, 2013), Jatropha curcas L. “piñón

blanco” (Aguilar & Deza, 2014) e incluso de suelos sin cultivos establecidos

(Huamán & Lupuche, 2002), suelos degradados (Sandoval & Vásquez, 2001),

malezas (Arrunátegui, 2015) y hormigas de la tribu Attini (Horna & Sialer, 2002).

Las Actinobacterias favorecen el crecimiento de las plantas a través de

mecanismos directos e indirectos. Los directos son: fijación de nitrógeno (Otero,

2011; Cabrera & Paredes, 2013; Nuñez & Vásquez, 2013; Gómez & Yarlaqué,

2013), solubilización de fosfato (Rico, 2009; Otero, 2011; Cabrera & Paredes,

2013) y producción de ácido indolacético (Núñez & Vásquez, 2013). En los

mecanismos indirectos o de control biológico destaca la antibiosis (Rico, 2009;

Anitha & Rabeeth, 2009; Otero, 2011; Suwan et al., 2012). Los compuestos

sintetizados por las Actinobacterias tiene amplia diversidad química y actividad

biológica de aplicación en la agricultura, como insecticidas (Hernández &

Mondragón, 2002), fungicidas (Anitha & Rabeeth, 2009; Hassan et al., 2011),

herbicidas (Doumbou et al., 2002) y reguladores del crecimiento (Franco, 2008;

Cabrera & Paredes, 2013).

4

En la literatura científica se encuentran reportes del beneficio de las

Actinobacterias en diferentes cultivos agrícolas, mencionándose incremento en el

poder germinativo de tomate (Núñez & Vásquez, 2013), emergencia de piñón

blanco (Gómez & Yarlaqué, 2013), número de radículas de Latuca sativa L.

“lechuga” (Salazar & Ordóñez, 2013), longitud de raíces de Capsicum annuum “ají

chili” (Suwan et al., 2012), número de tubérculos, peso fresco y seco de tubérculos

e índice de cosecha de papa (Rico, 2009; Stechmann, 2011), rendimiento de

Cucumis sativus L. “pepino” (Pérez, 2012) y tomate (Anitha & Rabeeth, 2009).

El marchitamiento vascular causado por Fusarium oxysporum f. sp.dianthi

(Foxd) es uno de los problemas mas limitantes en el cultivo de clavel. En la

búsqueda de alternativas de control a los fungicidas químicos, se aislaron

actinomicetos de clavel para investigar su capacidad antagónica in vitro sobre el

fitopatógeno. Las pruebas de antagonismo in vitro se realizaron en agar papa

dextrosa, PDA, mediante la técnica de enfrentamiento en cultivo dual. Se

obtuvieron diez aislados de actinomicetos, entre los que 70% presentó actividad

antagónica a F. oxysporum después de 8 días. El porcentaje de inhibición micelial

fue de 56-91%. El mayor valor correspondió a Streptomyces sp., con un halo de

inhibición de 1,2 cm, demostrándose el potencial de esta bacteria para el control

de F. oxysporum (Márquez et al., 2002).

Los biofertilizantes posibilitan la disminución del fertilizante químico. En este

contexto, se investigó el potencial de Actinobacterias de la rizósfera de malezas

asociadas a maíz. Las bacterias se aislaron en agar avena y se reconocieron por

el micelio aéreo y de sustrato, la pigmentación y morfología de los esporóforos. Se

identificaron los géneros Streptomyces (32%), Nocardia (30,5%), Pseudonocardia

(22,5%), Nocardioides (13,5%) y Micromonospora (1,5%). Se cuantificaron

1,0-38,75 ppm de ácido indolacético; 1,5-31,10 ppm de nitrógeno fijado como

amonio y 5,27 ppm de fósforo solubilizado, así como también se determinó

actividad proteolítica, quitinolítica y antagónica a Fusarium verticillioides. El 73%

de las bacterias incrementó la emergencia y ninguna afectó negativamente la

5

sobrevivencia de las plantas de maíz. Se demostró la posibilidad de utilizar

Actinobacterias como promotores de crecimiento en maíz (Infante & Zurita, 2013).

En la rizósfera de plantas de piñón blanco se aislaron bacterias del género

Streptomyces, con el objetivo de investigar su potencial biológico y efecto en la

emergencia de semillas. Se colectaron muestras de suelo rizosférico, se

diluyeron en solución salina esterilizada, se tomaron alícuotas y se sembraron en

agar avena, obteniéndose 245 aislados. Según los morfotipos se seleccionaron

100 estreptomicetos, determinándose que el 65% presentó actividad proteolítica,

38% actividad quitinolítica, 100% sintetizó ácido indolacético, 38% fijó nitrógeno,

4% solubilizó fosfato dicálcico y 10% incrementó la emergencia de semillas de

piñón blanco, alcanzando 100%, en comparación con 66% del testigo agua

destilada. Las bacterias investigadas pueden ser utilizadas para acelerar la

emergencia y desarrollo vegetativo del piñón blanco (Gómez & Yarlaqué, 2013).

En la rizósfera de tomate se investigaron actinomicetos del género

Streptomyces para determinar su potencial como rizobacterias promotoras de

crecimiento en plantas. Se colectaron muestras de suelo rizosférico y se

sembraron en agar avena, obteniéndose 282 cultivos de actinomicetos, entre los

que se identificó Streptomyces (42,91%), Nocardia (31,56%), Pseudonocardia

(22,34%), Streptosporangium (2,13%) y Micromonospora (1,06%). Con los

estreptomicetos se detectó actividad proteolítica, quitinolítica, antagónica a

Fusarium verticillioides, producción de ácido indolacético (33 ppm), fijación de

nitrógeno (34ppm amonio), fosfato solubilizado (16ppm) e incremento del poder

germinativo de semillas de tomate. Los resultados evidenciaron que las bacterias

investigadas tienen la capacidad para promover el crecimiento de plantas de

tomate (Núñez & Vásquez, 2013).

El cultivo de piñón blanco importante para la obtención de biodiesel puede

ser mejorado con bacterias promotoras de crecimiento en plantas. En este

contexto, se investigaron 30 cultivos de bacterias del género Streptomyces

previamente aisladas, con el objetivo de verificar la producción de ácido

6

indolacético, AIA, fijación de nitrógeno, solubilización de fosfatos y determinar el

efecto en la emergencia, supervivencia y altura de las plantas. El AIA se

cuantificó mediante la reacción colorimétrica de Salkowski, el nitrógeno fijado

como amonio por el método del fenolhipoclorito y el fosfato solubilizado por el

método del molibdato. Las bacterias del género Streptomyces sintetizaron 48,20-

69,75 ppm de AIA, fijaron nitrógeno, cuantificándose 1,49-21,0 ppm de amonio y

14,80-38,75 ppm de fósforo soluble. Asimismo, incrementaron la emergencia y la

altura de las plántulas de piñón, alcanzando índices de efectividad de 25-245%.

Los resultados mostraron que los estreptomicetos pueden mejorar el desarrollo

de las plantas de piñón (Aguilar & Deza, 2014).

En el suelo rizosférico de maíz y malezas asociadas se aislaron bacterias del

género Streptomyces y se investigó el potencial como promotoras de crecimiento

en plantas. El aislamiento de actinomicetos se realizó en agar avena,

identificando el género Streptomyces en el 88% de los actinomicetos aislados de

maíz y 32% de malezas. Con Streptomyces spp. se detectó actividad proteolítica

y quitinolítica y se cuantificaron 1,00-38,75ppm de ácido indolacético; 1,5-31,10

ppm de nitrógeno fijado como amonio y 0,64-11,21 ppm de fósforo soluble.

Streptomyces spp. 1ML, 1M y 2ML inoculados en las semillas incrementaron la

altura (IE máximo= 25,98%), peso de la biomasa aérea (IE= 69,93%) y radicular

(IE=75,87%), así como también disminuyeron el número de días a la floración de

maíz amarillo duro simple. Se demostró el potencial de Streptomyces spp.

nativas como promotores de crecimiento en maíz (Arrunátegui, 2015).

La producción de ácidos orgánicos como un mecanismo de solubilización de

fosfatos se investigó en 15 Actinobacterias previamente aisladas de la rizósfera

de plantas nativas. Las bacterias se cultivaron con fosfato tricálcico y fosfato de

aluminio y los ácidos orgánicos producidos se identificaron por cromatografía

líquida de alta eficiencia (HPLC). La Actinobacterias con el mayor valor en la

eficiencia de solubilización, se cultivó en caldo NBRIP con fosfato tricálcico,

fosfato de aluminio y roca fosfórica, a 23°C, 120 rpm, durante 7 días y cada 24

horas se cuantificó el fósforo soluble. Las Actinobacterias identificadas como

7

Streptomyces spp. solubilizaron los fosfatos minerales, con producción de ácido

oxálico, cítrico, glucónico y succínico. El fósforo soluble liberado con

Streptomyces sp.T3A fue 122 mg PL−1 con fosfato tricálcico, 14 mg PL−1 con

fosfato de aluminio y 19,6 mg PL−1 con roca fosfórica. Se demostró la capacidad

de las Actinobacterias para solubilizar fosfatos minerales, pudiendo constituir

biofertilizantes para los cultivos agrícolas (Prieto et al., 2015).

2.2 Base teórica

La implementación de la fertilización orgánica, como una forma de agricultura

ecológica sostenible, donde se utilizan abonos verdes, humus, compost o

microorganismos como las PGPR, para movilizar y reciclar nutrientes y

aprovechar la fertilidad del suelo, es importante y de gran interés como una

alternativa ecológica de la cual se van a generar mejores resultados que los

obtenidos por el uso de fertilizantes convencionales (Barrer, 2009).

En la rizósfera de las plantas se consideran tres componentes: el suelo

rizosférico, el rizoplano y la raíz misma. El suelo rizosférico es la zona del suelo

influenciada por las raíces, a través de la liberación de exudados por efecto de la

actividad microbiana. El rizoplano es la superficie de la raíz, incluidas las

partículas fuertemente adheridas a la raíz, La raíz misma también forma parte de

la rizósfera, porque determinados microorganismos son capaces de colonizar los

tejidos internos (Nihorimbere et al., 2011).

Kloepper & Schroth (1978), mencionados por Bhattacharyya & Jha (2012),

propusieron el término rizobacterias para las bacterias del suelo que

competitivamente colonizaban las raices, estimulaban el crecimiento de las

plantas y a la vez reducían la incidencia de las enfermedades. En 1981, estos

mismos investigadores denominaron a estas bacterias promotoras de

crecimiento en plantas (Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR). En la

actualidad, este concepto se usa para las bacterias que cumplen con dos de las

tres criterios establecidos, como son colonización agresiva, estimulación del

crecimiento vegetal y biocontrol.

8

Las PGPR benefician a los cultivos agrícolas a través de mecanismos

directos e indirectos. La promoción directa ocurre cuando las PGPR sintetizan

metabolitos y facilitan a las plantas la toma de nutrientes, mientras que la

promoción indirecta es consecuencia de la disminución o prevención del efecto

deletéreo de fitopatógenos. Los mecanismos directos incluyen la síntesis de

reguladores del crecimiento (auxinas, giberelinas, citoquininas), solubilización de

fosfatos minerales, fijación de nitrógeno atmosférico, producción de sideróforos y

estimulación del sistema de absorción de iones. Entre los mecanismos indirectos

o de biocontrol se encuentran la competencia por un nicho ecológico o por

nutrientes, interacción directa con los patógenos (parasitismo y lisis enzimática),

antibiosis o amensalismo, producción de sideróforos e inducción de resistencia

sistémica a la planta (Delgado et al., 2003; Hernández et al., 2006;

Bhattacharyya & Jha, 2012).

El efecto positivo de las PGPR está relacionado con el aumento en el

número y longitud de raíces laterales y pelos radiculares, cambios que se

asocian con la síntesis de auxinas, citoquininas y giberelinas. En un modelo

hipotético, el AIA sintetizado por una bacteria adherida a las semillas o raices, es

tomado por la planta y junto con el AIA endógeno (de la planta) puede estimular

la división y alargamiento de las células o bien promover la síntesis de ácido

1-amino-ciclopropano-1-carboxílico (ACC), con la activación de la enzima ACC

sintasa. Por lo tanto, aumenta el ACC, que es un precursor del etileno y que a su

vez inhibe la elongación de las raíces. El ACC es hidrolizado por las bacterias

(enzima amino ciclopropano carboxilasa desaminasa, ACC desaminasa),

transformándose en alfa-cetobutirato y amonio. Las bacterias inducen a la planta

a sintetizar más ACC de lo que necesita para que éstas tengan una fuente de

nitrógeno disponible. Una consecuencia directa de la disminución del ACC

(endógeno y bacteriano) es la reducción de etileno, con incremento significativo

en la formación de los pelos radiculares (Loredo et al., 2004).

La solubilización de fosfatos precipitados consiste en la liberación de fosfato

inorgánico soluble a partir de fosfatos insolubles y las PGPR responsables del

9

proceso se denominan solubilizadoras del fósforo. El principal mecanismo para la

solubilización de fosfatos, es la producción de ácidos orgánicos, aunque también

se consideran los ácidos inorgánicos como el sulfhídrico, nítrico y carbónico, la

excreción de protones acompañada de la asimilación del ion amonio y la acción

de mecanismos reductores de los cationes. Por su parte, en el proceso de

mineralización del fósforo, las PGPR pueden movilizar el fósforo de la materia

orgánica no soluble del suelo y convertirlo en fósforo inorgánico soluble,

mediante la excreción de las enzimas hidrolíticas fosfatasas, fitasas y

fosfonatasas (Carreño, 2009).

La fijación de nitrógeno es catalizada por el complejo enzimático nitrogenasa,

estrictamente procariotico compuesto por dos proteínas solubles la proteína de

hierro (dinitrogenasa reductasa o Componente II) y la proteína del MoFe

(dinitrogenesa o Componente I). El hierro y molibdeno son cofactores esenciales

en la dinitrogenasa. Algunos fijadores de nitrógeno tienen una dinitrogenasa

alternativa que contiene vanadio, en lugar de molibdeno; no obstante, esta clase

de dinitrogenasa solo es sintetizada en ausencia de molibdeno disponible. Las

dos enzimas del complejo funcionan conjuntamente: la dinitrogenasa reductasa

reduce la dinitrogenasa y ésta ultima reduce el nitrógeno hasta amoniaco

(Coyne, 2000; Altamirano et al., 2014).

2.2.1 Actinobacterias

Las Actinobacterias son bacterias Gram positivas ubicuas, que se

encuentran en la gran mayoría de sustratos naturales, ampliamente distribuidos

en una variedad de hábitats diferentes: suelo, agua marina, agua dulce, aire,

estiércol, fango de los ríos y fondo de los lagos. Son saprófitos y algunas

especies producen enfermedades a las plantas, animales domésticos e incluso al

hombre. Se encuentran en casi todos los tipos de suelo y bajo condiciones

extremas disminuyen levemente la concentración de su población. Su número

varía en gran proporción según el caso, pero es común encontrarlos en suelos

fértiles en una concentración de 106 UFC g-1 de suelo seco (Balakrishna et al.,

2012).

10

Por lo general, se aíslan Actinobacterias en la superficie del suelo y en

profundidades entre 2 y 15 cm. Más allá de esta profundidad disminuyen las

poblaciones. El tamaño de la comunidad depende del tipo de suelo,

particularmente de algunas de las características físicas, del contenido de

materia orgánica y pH del medio ambiente. Los principales géneros aislados a

partir de suelos son Streptomyces, Nocardia y Micromonospora, que pueden

estar presentes como conidias o como hifas vegetativas; sin embargo, los

métodos de aislamiento convencionales muestran que el 95% de los

actinomicetos aislados a partir de suelo pertenecen al género Streptomyces

(Franco, 2008).

Una espora típica de Streptomyces en condiciones favorables, germina,

emergiendo uno o dos tubos germinativos, que a su vez crecen por alargamineto

apical y se ramifican formando el micelio vegetativo, que se introduce en el

sustrato. Después, debido a la disminución de nutrientes, se inica la producción

de metabolitos secundarios y la diferenciación morfológica. Las hifas aéreas

rompen la tensión superficial, escapan del ambiente acuoso del micelio de

sustrato y crecen hacia arriba. Este micelio aéreo después es dividido por septas,

originándose los compartimientos de las pre-esporas, que a su vez desarrollan

paredes gruesas, sintetizan un pigmentos gris y adquieren las caracterisiticas de

esporas maduras, que pueden sobrevivir por largos periodos de sequedad

(Flardh & Buttner, 2009).

En medio sólido las Actinobacterias crecen como formas miceliales

constituidas por filamentos ramificados carentes de septas internas. Sus paredes

celulares están compuestas de una capa simple de peptidoglicano, carente de

membrana externa, organización que facilita la liberación de proteínas al medio

extracelular. Además, secretan una amplia variedad de metabolitos que incluyen

antimicrobianos, antifúngicos, inmunosupresores, enzimas hidrolíticas e

inhibidores enzimáticos proteicos. Asimismo, los buenos resultados obtenidos en

la producción de enzimas homólogas y algunas heterólogas han estimulado que

en los últimos años se investigue la habilidad natural de secretar proteínas

11

biológicamente activas por algunas especies de actinomicetos como

Streptomyces lividans y S. coelicolor (Pimienta & Vallin, 2005).

Los actinomicetos tienen gran importancia por su participación en la

degradación de la materia orgánica, además de ciertas propiedades fisiológicas

que los hacen particulares, como la producción de un olor típico a suelo húmedo,

debido a la síntesis de un metabolito denominado geosmina. Asimismo,

producen terpenoides, pigmentos y enzimas extracelulares, con las que son

capaces de degradar los residuos de origen vegetal y animal (Ezziyyani et al.,

2004).

2.2.2 Asparagus officinalis L.

El espárrago es una planta herbácea perenne, formada por tallos aéreos

ramificados y una parte subterránea denominada comúnmente “garra” constituida

por un tallo subterráneo, corona o rizoma, a partir del cual se producen yemas

que originarán los turiones o espárragos y las raíces principales o de

almacenamiento (Borrego, 2014). Éstas son cilíndricas, gruesas y carnosas y

acumulan reservas para la produccion de turiones. Los turiones son la parte

comestible y comercializable y cuando se dejan vegetar son los futuros tallos

ramificados (Kirschenbilder et al., 2015).

El ciclo vital de las plantas de espárrago verde se divide en cuatro fases: de

crecimiento temprano, los primeros 2 años desde la plantación, caracterizados

por un fuerte desarrollo vegetativo; de productividad creciente (3º-4ºaños) que

correspondan a los 2 primeros años de cosecha; de productividad estable

(4º-10º años) y finalmente de productivdad decreciente (más de 10 años). El

aumento de temperatura propicia la emergencia de brotes jóvenes llamados

turiones a partir del rizoma. Despues, de la cosecha, los turiones se desarrollan y

forman el follaje o helecho (Asprelli et al., 2005). Las plantas son diocas, siendo

más productivas las plantas masculinas que femeninas. Las estaminadas tienen

mayor número de turiones mientras que en las pistiladas los turiones tienen

mayor diámetro (Kirschenbilder et al., 2015).

12

La siembra del espárrago puede ser directa por semillas o por trasplante de

plántulas o de garras. Las plántulas se obtienen de semillas hibridas, al momento

del trasplante presentan plumerillos de 10-12cm de longitud y después de

1-2 años se cosecha. Las garras se obtienen en los semilleros y después de

1 año se realiza la primera recolección. El primer riego tiene lugar en la

plantación, para mantener la humedad del sistema radicular y favorecer la

formación de la garra. Los otros dos riegos corresponden a la recolección y al

desarrollo anual de la parte aérea. El riego de recolección debe mantener la

humedad en la zona donde van a emerger los turiones y el riego de desarrollo de

la parte aérea se debe hacer por gravedad sino se dispone de riego por goteo;

aplicando 1-2 riegos semanales. El ultimo riego se realiza 3 meses antes de la

cosecha para evitar las brotaciones tardías que puedan consumir las reservas de

las raíces (Reyes, 2006; Delgado, 2007; Vallejo et al., 2009).

Según el manejo agronómico, los espárragos son blancos, morados y

verdes. Los blancos se cultivan bajo la tierra, sin recibir la luz del sol y se

cosechan cuando la tierra se eleva ligeramente, antes que la yema esté en

contacto con la luz. Los espárragos morados se cultivan igual que los blancos,

pero se recolectan cuando la yema ha traspasado la superficie de la tierra y ha

entrado en contacto con la luz solar. Los espárragos verdes se cultivan al aire

libre, reciben su color de la luz solar y se recolectan cuando sobresalen

20-25cm de la tierra. Su sabor es más aromático, parecido al espárrago silvestre

y contienen mayor cantidad de vitaminas por la clorofila (Reyes 2006; Delgado,

2007).

La producción nacional de espárrago está centralizada en la costa, siendo

La Libertad la región con mayores rendimientos y producción. Desde enero a

abril existe una alta productividad, pero con una baja calidad del cultivo,

incrementándose el porcentaje de descarte. Por el contrario, de mayo a

setiembre la calidad es mayor, pero con menor productividad. Los mejores

meses para cosechar son octubre a diciembre. Casi la totalidad del volumen de

producción, a diferencia de China, esta destinada al mercado externo porque el

13

consumo local es menor a 1 Kg percápita anual, evidenciándose que este

producto no es habitualmente consumido por el poblador peruano (Agrobanco,

2007).

14

III. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Materiales

3.1.1 Material biológico

El material biológico estuvo constituido por raíces con suelo rizosférico

adherido de espárrago, cultivos puros de Actinobacterias y coronas de espárrago

cultivar UC-157 F2.

3.1.2 Población y muestra

En la investigación descriptiva la población estuvo constituida por las plantas

de espárrago del fundo Josymar (50ha) en Virú, Trujillo y se investigó una

muestra no probabilística de 96 plantas colectadas durante abril de 2016. El

número de muestras fue calculado, tomando en cuenta una prevalencia de 90%

(Vásquez et al., 2012), determinada en un estudio piloto por los investigadores

(Anexo 1). En la investigación explicativa la población fueron las Actinobacterias

aisladas e identificadas en el rizoplano y rizósfera de espárrago durante abril de

2016 y la muestra no probabilística y por conveniencia estuvo constituida por seis

cultivos de Actinobacterias seleccionados.

3.2 Métodos

3.2.1 Variable de la fase descriptiva

Variable cuantitativa: Potencial como promotoras de crecimiento en plantas

(nitrógeno fijado, fosfato solubilizado, indoles producidos).

3.2.2 Variables de la fase explicativa

Variable independiente: Cultivos (6) de Actinobacterias.

Variable dependiente: Desarrollo vegetativo de plantas de espárrago (altura

y número de tallos).

15

3.2.3 Tipo de estudio y diseño de contrastación de hipótesis

La investigación se realizó en dos fases. La primera fase descriptiva

correspondió al aislamiento e identificación de Actinobacterias, cuantificación de

nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e indoles producidos. En la segunda fase

explicativa se determinó el efecto de seis cultivos de Actinobacterias en la altura y

número de tallos de plantas de espárrago, durante 60 días, en invernadero.

La hipótesis en la primera fase se contrastó con el diseño no experimental de

“Solo Después” (Vásquez et al., 2012) y en la segunda fase con el diseño

experimental completamente aleatorio, DCA (Hernández et al., 2014). Los

tratamientos fueron ocho correspondientes a T1: Testigo absoluto (agua destilada),

T2: Testigo químico (urea 46% N), T3 a T8 Actinobacterias. En cada tratamiento se

consideraron tres repeticiones, totalizando 24 unidades experimentales (Figura 1).

3.2.4 Lugar de muestreo

Las 96 muestras de raíces con suelo rizósferico de espárrago se colectaron

en el fundo Josymar, ubicado en el lote 10,6 del sector IV, Proyecto Especial

Chavimochic, en la provincia Virú, región La Libertad (Figura 2, tabla 1). Virú tiene

una superficie de 3218,74 km2 y limita por el norte con la provincia de Trujillo, por el

este con las provincias de Julcán y Santiago de Chuco, por el sur con la región de

Ancash y por el oeste con el océano Pacífico (Municipalidad Distrital de

Guadalupito,2016). El fundo Josymar tiene 50 ha, distribuidas en 24 lotes de

aproximadamente 1,5 ha cada uno. Al momento del muestreo 19 lotes estaban

sembrados con espárrago cultivar UC-157 F2 (cuatro plantas por metro lineal), con

1,8-2,5 años transcurridos después del transplante de coronas y una población

promedio de 30 000 plantas ha-1.

https://es.wikipedia.org/wiki/Provincia_de_Trujillo_(Per%C3%BA)

https://es.wikipedia.org/wiki/Provincia_de_Julc%C3%A1n

https://es.wikipedia.org/wiki/Provincia_de_Santiago_de_Chuco

https://es.wikipedia.org/wiki/Departamento_de_Ancash

https://es.wikipedia.org/wiki/Departamento_de_Ancash

https://es.wikipedia.org/wiki/Oc%C3%A9ano_Pac%C3%ADfico

16

T1: Testigo absoluto

T2: Testigo químico

T3 – T8: Actinobacterias.

Figura 1. Diseño completamente aleatorio para determinar el efecto de Actinobacterias en Asparagus officinalis L.

1

2

3

4

5

6

7

8

2

3

4

5

6

7

8

1

3

4

5

6

7

8

1

2

17

Figura 2. Ubicación de la provincia de Virú, región La Libertad, abril, 2016 (https://www.google.com.pe/maps/place/Provincia+de+Vir%C3%BA/@8.

4182934,78.5870067,10.34z/data=!4m5!3m4!1s0x91ac59407c7b0391:

0x6c172095672753ce!8m2!3d-8.5410584!4d-78.6757807).

Tabla 1. Lote de procedencia de muestras de raíces con suelo rizósferico de

Asparagus officinalis en el Fundo Josymar, Virú, La Libertad

Lote

No de surcos

No de muestras

A1-B1-C1

54

15 (1-15)

A2-B2-C3 61 15 (16-30)

A3-B3-C3 62 15 (31-45)

A4-B4-C4 63 15 (46-60)

C5 56 5 (61-65)

A6-B6-C6 64 15 (66-88)

C7 49 5 (81-85)

C8 55 6 (86-91)

C9 51 5 (92-96)

Total: 19 lotes 515 96

http://www.google.com.pe/maps/place/Provincia+de+Vir%C3%BA/@8.418293

http://www.google.com.pe/maps/place/Provincia+de+Vir%C3%BA/@8.418293

18

3.2.5 Obtención de muestras

En el campo de cultivo de espárrago, cada cinco surcos se seleccionó la

planta más vigorosa y se extrajeron aproximadamente 50g de raíces con suelo

adherido (Figura 3), se depositaron en bolsas de polietileno debidamente

identificadas e inmediatamente se transportaron en una caja térmica (10 ± 1°C)

hacia el Laboratorio de Microbiología y Parasitología, sección Biotecnología

Microbiana de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Pedro Ruíz

Gallo en Lambayeque.

En simultáneo al muestreo de raíces con suelo rizosférico de espárrago para

el aislamiento de Actinobacterias, se colectó una muestra representativa de 1kg

de suelo para realizar el análisis físico-químico en el Instituto Nacional de

Innovación y Extensión Agraria, Estación Experimental Vista Florida de Chiclayo.

Según los resultados (Tabla 2), el suelo es ligeramente ácido (pH 6,5) y

ligeramente salino (CE 3,06 dSm-1), con textura arenosa, niveles bajos de materia

orgánica (0,23%), nitrógeno (0,103ppm), fósforo disponible (6,0ppm) y potasio

(203,0ppm).

3.2.6 Aislamiento e identificación fenotípica de Actinobacterias

Para el aislamiento de Actinobacterias (Cabrera & Paredes, 2013) las

muestras de raíces con suelo adherido (Figura 4) se deshidrataron bajo sombra a

temperatura ambiente, por 72 horas y después, se cortaron en fragmentos de

aproximadamente 5 cm. Aleatoriamente se tomaron submuestras de 10g de raíces

junto con el suelo adherido y se depositaron en frascos de 250 mL de capacidad,

conteniendo 90 mL de solución salina esterilizada, NaCl 0,85% p/v (Figura 5).

Después de agitar el contenido de los frascos (10-1), se tomaron alícuotas y se

sembraron mediante la técnica de agotamiento y estría en agar avena con

antimicótico (Figura 6, anexo 2), se incubaron a 30ºC, hasta por 7 días y se

seleccionaron las colonias típicas de Actinobacterias (Figura 7), tomando en cuenta

la textura, coloración del micelo aéreo y de sustrato, forma y tamaño de las

colonias y los pigmentos producidos. Las colonias desarrolladas se agruparon

según sus características y se seleccionó una representativa de cada grupo para

su posterior siembra en agar avena, constituyendo los aislados de Actinobacterias.

19

Figura 3. Extraccion de raíces con suelo rizosférico de Asparagus officinalis L.

Tabla 2. Análisis físico-químico de suelo rizosférico de Asparagus officinalis L. en Virú, La Libertad, 2016

Clase

Textural

pH

CE

(dSm-1)

MO

(%)

N

(%)

P

(ppm)

K

(ppm)

Arenosa

6,5

3,06

0.23

0,103

6,0

203,0

20

Figura 4. Raíces con suelo rizosférico de Asparagus officinalis L. deshidratadas.

Figura 5. Suspensión de raíces y suelo rizosférico de Asparagus officinalis L. en

solución salina est erilizada.

21

Figura 6. Siembra en agar avena mediante la técnica de agotamiento y estría.

Figura 7. Actinobacterias desarrolladas en agar avena.

22

Para la caracterización macroscópica de las Actinobacterias (Franco, 2008),

se observaron las colonias desarrolladas en agar avena durante 5 días y se

registró la textura y la coloración del micelio aéreo y de sustrato en el medio de

cultivo. Para la caracterización microscópica, las Actinobacterias fueron

sembradas en agar avena y en la zona central se introdujo una lámina

cubreobjetos previamente esterilizada, dispuesta con una inclinación de 45º,

respecto a la superficie del agar (Figura 8). Después de la incubación a 30ºC, por

5 días, se retiraron los cubreobjetos y se depositaron sobre una lámina

portaobjetos con una gota de cristal violeta (Figura 9), para la observación bajo el

microscopio (40x) del tipo de micelio vegetativo, fragmentación y características

del micelio aéreo.

3.2.7 Mantenimiento de cultivos de Actinobacterias

Los cultivos puros de Actinobacterias identificados se sembraron en el

medio sólido agar avena (Figura 10) y se mantuvieron a temperatura ambiente

(28°C) y en refrigeración (8°C), realizándose subcultivos cada 30 días.

3.2.8 Cuantificación de nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e indoles

producidos

Con las Actinobacterias aisladas e identificadas se cuantificó el amonio,

producto de la fijación de nitrógeno, el fósforo soluble producto de la solubilización

de fosfatos y los indoles producidos. Para la obtención del inóculo, cada bacteria se

cultivó en 5mL de agar avena a 30°C, durante 96 horas (Córdova, 2016).

Posteriormente, se agregó solución salina esterilizada (NaCl 0,85% p/v), se

centrifugó (3500 rpm) durante 3 minutos, el sobrenadante se eliminó, el sedimento

se lavó con solución salina esterilizada (NaCl 0,85% p/v) y su concentración se

estandarizó a 108 cel mL-1 por turbidimetría con el espectrofotómetro de luz visible a

540nm: absorbancia = 0,20, equivalente a 108 células mL-1 (Rodríguez, 2013).

23

Figura 8. Cultivo de Actinobacterias en agar avena para la caracterización

macroscópica.

Figura 9. Láminas portaobjetos listas para la observación microscópica.

.

24

Figura 10. Cultivos puros de Actinobacterias en agar avena.

25

a. Cuantificación del nitrógeno fijado in vitro

La cuantificación del nitrógeno fijado in vitro por las Actinobacterias

investigadas se realizó con el método colorimétrico de Berthelot o fenol hipoclorito

(Lara et al., 2007; Cadena & Martínez, 2011). El inóculo (5%:0,15mL) de cada

cultivo de Actinobacterias fue sembrado por triplicado en tubos de 15x150mL

conteniendo 3mL de caldo extracto de suelo 10% (Figura 11, anexo 3) y se

incubaron a 30°C, por 192 horas (8 días), con agitación constante (150rpm). A

continuación, se agregaron 9mL de KCl 2M, se agitaron a 150rpm durante 1 hora

y se dejaron en reposo 1 hora adicional, para después tomar 10mL de

sobrenadante y centrifugarlos (3000rpm) durante 5 minutos.

Los sobrenadantes se vertieron en tubos de dilución y se añadieron 0,4mL de

solución alcohólica de fenol al 10%; 0,4mL de nitroprusiato de sodio al 0,5% y

1mL de solución oxidante. Los tubos se agitaron manualmente por 2 minutos y se

dejaron en reposo durante 1 hora adicional. La reacción se consideró positiva a la

fijación de nitrógeno por la aparición de una coloración azul, leyéndose la

absorbancia en espectrofotómetro de luz visible a 632,9nm. Las concentraciones

de amonio se calcularon con la ecuación de la curva de calibración, obtenida

previamente con diluciones sucesivas de una solución de 100ppm de cloruro de

amonio (Anexo 3).

b. Cuantificación del fosfato solubilizado in vitro

La cuantificación de fosfato solubilizado in vitro por las Actinobacterias

investigadas se realizó con el método colorimétrico del molibdato (Alvarado &

Valderrama, 2014). El inóculo (5%: 0,25mL) de cada cultivo bacteriano se sembró

por triplicado en 5mL de caldo National Botanical Research Institute’s phosphate,

NBRIP (Figura 12, anexo 4) y se incubaron a 30°C, con agitación (150rpm), por

192 horas (8 días). Después, los caldos fueron centrifugados a 3000rpm por 5

minutos y en el sobrenadante se cuantificó el fósforo soluble (Rodier & Rodi,

2005), considerándose una coloración azul positiva a la solubilización del fosfato.

La absorbancia se leyó en espectrofotómetro de luz visible a 690nm y las

concentraciones de fósforo soluble se calcularon con la ecuación de la curva de

calibración, obtenida previamente con diluciones sucesivas de una solución de

10ppm de fósforo (Anexo 4).

26

Figura 11. Caldo extracto de suelo cultivado con Actinobacterias.

Figura 12. Caldo National Botanical Research Institute’s phosphate cultivado

con Actinobacterias.

27

c. Cuantificación de indoles producidos in vitro

La cuantificación de indoles producidos in vitro se realizó según la reacción

colorimétrica de Salkowski (Mantilla, 2007; García & Muñoz, 2010). El inóculo

(5%:0,25mL) de cada cultivo bacteriano fue sembrado por triplicado en 5mL de

caldo tripticasa soya suplementado con triptófano (Figura 13, anexo 5). Después

de la incubación a 30°C, por 192 horas (8 días), en agitación constante (150rpm),

los cultivos se centrifugaron a 3000rpm, durante 5 minutos. A continuación, 0,4mL

de cada sobrenadante se depositaron en tubos, se agregaron 1,6mL de reactivo

de Salkowski modificado, se mezclaron y se dejaron en reposo durante

30 minutos en oscuridad. La reacción se consideró positiva a la producción de

indoles por la aparición de una coloración grosella, leyéndose la absorbancia en

espectrofotómetro de luz visible a 530nm. Las concentraciones de indoles se

calcularon con la ecuación de la curva de calibración obtenida previamente con

diluciones sucesivas de una solución de 100ppm de ácido indolacético (Anexo 5).

3.2.9 Selección de Actinobacterias

Los cultivos de Actinobacterias seleccionados para la fase explicativa de la

investigación fueron seis, correspondientes a los valores máximos en la

concentración de nitrógeno fijado (dos cultivos), fosfato solubilizado (dos cultivos),

indoles producidos (dos cultivos).

3.2.10 Efecto de Actinobacterias en plantas de espárrago

Los seis cultivos de Actinobacterias seleccionados se inocularon en

coronas de espárrago (Figura 14), determinándose, durante 60 días el efecto en

el desarrollo vegetatiivo de las plantas, en condiciones de invernadero. El suelo

experimental estuvo constituido por 96 kg de una mezcla de suelo agrícola,

arena de río y humus en la proporción 2:1:1, que fue distribuido en macetas de

arcilla de 4,5kg de capacidad, a razón a 4kg por maceta. El cultivo de espárrago

y la inoculación de Actinobacterias se realizó entre el 19 de octubre de 2017 al

17 de diciembre de 2017, registrándose las temperaturas máximas (25 °C),

mínima (17 °C) y media (21,4 °C), valores obtenidos por la Estación

Meteorológica de la universidad Nacional Pedro Ruíz Gallo, ubicado en el fundo

“El Cienago” de Lambayeque (Anexo 6).

28

Figura 13. Caldo tripticasa soya suplementado con triptofano cultivado con

Actinobacterias.

Figura 14. Coronas de Asparagus officinalis L.

29

En el ensayo se sembraron coronas de espárrago cultivar UC-157 F2,

luego de ser tratadas por inmersión durante 5 minutos (Figura 15), en una

solución del fungicida Benomyl polvo mojable-WP (Benlate), en la dosis de 2gL-1

de agua declorada previamente durante 24 horas. El cultivar UC-157 fue obtenido

en 1980 en Estados Unidos (Farias et al., 2004). Es específico para la producción

de turiones verdes. Se comercializan los híbridos F1 y F2 y son los más precoces

y productivos del mercado (Delgado, 2007).

El inóculo fue obtenido con las Actinobacterias cultivadas en agar avena, a

300C. Después de 96 horas se agregó solución salina esterilizada

(NaCl 0,85% p/v), se centrifugó (3500 rpm) por 3 minutos, el sedimento

nuevamente se lavó con la misma solución y su concentración se estandarizó por

turbidimetría en el espectofotómetro a 600nm (Córdova, 2016).

Transcurridos 30 minutos del tratamiento con fungicida, las coronas de

espárrago se asperjaron con el inóculo bacteriano (100mL por corona), con ayuda

de un pulverizador de plástico de 500mL de capacidad (Figura 16). Después de

30 minutos de reposo a temperatura ambiental (250C), se sembraron en el suelo

experimental, a razón de una corona por maceta. Los riegos se realizaron cada

3 días con agua potable declorada, tomando en cuenta los requerimientos

hídricos de las plantas. Después de 15 días de la siembra, en el testigo químico

se aplicaron 250mL de una solución de fertilizante nitrogenado (Urea 46%), en la

dosis de 5gL-1 de agua, cada 30 días (Regalado, 1999).

Transcurridos 30, 45 y 60 días después de la siembra, se midió la altura de

las plantas (Figura 17) y se contaron los tallos (Figura 18). La altura se expresó en

cm, considerando desde la base del tallo más alto hasta la yema terminal

(Puicón, 2014). Con los valores de altura y número de tallos se calculó el índice

de efectividad de la inoculación (IEI) en porcentaje, mediante la fórmula (Carreño,

2009) siguiente:

IEI (%) =Tratamiento con inoculación − Control sin inoculación

Control sin inoculaciónx100

30

Figura 15. Inmersión de coronas de Asparagus officinalis L. en solución de

fungicida.

Figura 16. Aplicación del inóculo bacteriano en la corona de Asparagus officinalis L.

31

Figura 17. Medición de altura de tallo de Asparagus officinalis L.

Figura 18. Conteo del número de tallos de Asparagus officinalis L.

32

3.2.11 Análisis estadístico de los datos

Para el diseño experimental completamente aleatorio, el modelo aditivo

lineal fue:

Yij = u + ti + Eij

Dónde:

Yij = observación del i- ésimo tratamiento, J- enésima repetición

u = media general de la variable respuesta.

ti = efecto I- ésimo tratamiento, siendo i = 1, 2, 3, … 8

Eij = error experimental en el i- ésimo tratamiento, j- ésima repetición

H0 = u1 = u2 = u3,… = u8

Ha = al menos una media diferente

Con los valores de altura y número de tallos de las plantas se realizaron las

pruebas de normalidad y homogeneidad de varianza y según los resultados se

llevaron a cabo análisis paramétricos y no paramétricos (Hernández et al., 2014).

En el presente trabajo se utilizó el software estadístico SPSS versión 15,0 así como

los programas de Microsoft Office Word, Excel versión 2013 y Minitab 15.

33

IV RESULTADOS

4.1 Actinobacterias aisladas e identificadas en Asparagus officinalis L.

En el 78,13% (75) de las muestras de raíces y suelo rizosférico de espárrago se

aislaron Actinobacterias (Figura 19) que se desarrollaron en agar avena (Figura 20).

Se obtuvieron 110 cultivos puros, agrupados en 31 morfotipos de colonias, según el

color del micelio aéreo, micelio de sustrato, pigmento difusible en el medio de cultivo

y características microscópicas (Tabla 3). Se identificaron (Tabla 4) Streptomyces

(39,09%), Nocardia (37,27%), Micromonospora (9,09%), Nocardioides (8,18%) y

Pseudonocardia (6,37%).

El género Streptomyces se reconoció por el micelio aéreo con esporóforos no

espiralados y espiralados (Figura 21). En estos últimos se observaron espirales

primitivos, abiertos y cerrados. Nocardia presentó micelio de sustrato con tendencia

a fragmentarse en bacilos y elementos cocoides y un micelio aéreo que puede

originar cadenas de esporas (Figura 22). En Micromonospora el micelio aéreo

generalmente estuvo ausente y se observaron esporas aisladas formadas sobre el

micelio de sustrato (Figura 23). Nocardioides se caracterizó por la fragmentación del

micelio aéreo, poco desarrollado y de sustrato en elementos cocoides y bastoncillos

(Figura 24). Pseudonocardia presentó el micelio aéreo no fragmentado con largas

cadenas de esporas (Figura 25).

34

78,13%

21,87%

Positivas

Negativas

Figura 19. Frecuencia de muestras de rizoplano y rizósfera de Asparagus officinalis

L. positivas al aislamiento de Actinobacterias en agar avena.

Figura 20. Colonias de Actinobacterias desarrolladas en agar avena.

35

Tabla 3. Frecuencia de morfotipos de colonias de Actinobacterias aislados de

rizoplano y rizosféra de Asparagus officinalis L.

Morfotipo

Micelio

Observación n

microscópica

% Aéreo Sustrato Pigmento

difusible

1 Blanco No

pigmentado

No Espirales abiertos 15,45

2 Gris Marrón No Esporas cilíndricas 13,64

3 Gris Marrón No Espirales primitivos 11,82

4 Gris Verde claro No Espirales abiertos 9,09

5 Blanco No

pigmentado

No No espiralado 5,45

6 Gris No

pigmentado

No Espirales abiertos 4,55

7 Crema No

pigmentado

No Micelio sustrato

fragmentado

3,64

8 Gris Crema No Espirales abiertos 3,64

9 Blanco Anaranjado No Espirales cerrado 2,73

10 Gris Marrón No Esporas cilíndricas 2,73

11 Crema No

pigmentado

No Micelio sustrato

fragmentado

1,82

12 Blanco No

pigmentado

No No espiralado 1,82

13 Blanco No

pigmentado

No Micelio sustrato

fragmentado

1,82

14 Gris Rosado No No espiralado 1,82

15 Blanco No

pigmentado

No Espirales primitivos 1,82

16 Gris Rosado Si No espiralado 1,82

36

Continuacion…

Morfotipo

Micelio

Observación n

microscópica

% Aéreo Sustrato Pigmento

difusible

17 Blanco Negro Si Esporas

unicelulares

1,82

18 Blanco Rojo No Micelio sustrato

fragmentado

1,82

19 Marrón No

pigmentado

No Esporas cilíndricas 1,82

20 Gris No

pigmentado

Si Micelio sustrato

fragmentado

0,91

21 Gris Negro No Espirales cerrados 0,91

22 Marrón Negro No Espirales primitivos 0,91

23 Negro No

pigmentado

No Espirales primitivos 0,91

24 Blancos Anaranjado Si Espirales abiertos 0,91

25 Marrón Negro No Micelio sustrato

fragmentado

0,91

26 Marrón Negro Si Micelio sustrato

fragmentado

0,91

27 Granate No

pigmentado

Si Espirales cerrados 0,91

28 Verde

Oscuro

Marrón Si Espirales primitivos 0,91

29 Granate No

pigmentado

No Micelio aéreo

fragmentado

0,91

30 Gris Amarrillo Si No espiralado 0,91

31 Blanco Rosado Si Micelio sustrato

fragmentado

0,91

37

Tabla 4. Frecuencia de géneros identificados en Actinobacterias aisladas de

rizoplano y rizosféra de Asparagus officinalis L.

Género

Cultivo puros

Número %

Streptomyces 43 40,03

Nocardia 41 37,27

Micromonospora 10 9,09

Nocardioides 9 8,18

Pseudonocardia 7 6,36

38

.

Figura 21. Observación microscópica de los esporóforos de Streptomyces sp. no

espiralados (a), espirales primitivos (b), espirales abiertos (c), espirales

cerrados (d).

b

c d

a b

d

39

Figura 22. Observación microscópica de Nocardia sp.

Figura 23. Observacion microscópica de Micromonospora sp.

40

Figura 24. Observación microscópica de Nocardioides sp.

Figura 25. Observación microscópicas de Pseudonocardia sp.

41

4.2 Nitrógeno fijado, fosfato solubilizado e indoles producidos por

Actinobacterias

El 92,73% (102) de los cultivos de Actinobacterias (Figura 26) fijaron

nitrógeno in vitro y como producto de la fijación se detectó amonio, evidenciado

por una coloración azul (Figura 27). La concentración de amonio osciló entre

2,267 a 31,513 ppm con Micromonospora sp.10.1 y Nocardia sp.4.3,

respectivamente (Tabla 5).

El 67,27% (74) de los cultivos de Actinobacterias (Figura 28), solubilizaron

fosfato in vitro y como producto de la solubilización se detectó fósforo soluble,

evidenciado por una coloración azul (Figura 29). La concentración de fósforo

soluble osciló entre 0,058 a 4,725 ppm con Streptomyces sp.19.1 y Nocardia

sp.44.2, respectivamente (Tabla 6).

Todos los cultivos de Actinobacterias produjeron indoles in vitro,

evidenciados por una coloración grosella (Figura 30). La concentración de

indoles producidos osciló entre 30,022 a 58,911 ppm con Streptomyces sp.9.3 y

Streptomyces sp.50.1, respectivamente (Tabla 7).

4.3 Cultivos de Actinobacterias seleccionados

Los seis cultivos de Actinobacterias seleccionados correspondieron a

Nocardia sp.4.3 y Streptomyces sp.5.5 con 31,513 y 31,256 ppm de amonio;

Nocardia sp.44.2 y Nocardia sp.35.6 con 4,725 y 4,379 ppm de fósforo soluble;

Streptomyces sp.50.1 y Streptomyces sp.11.3 con 58,911 y 58,466 ppm de

indoles (Tabla 8).

4.4 Efecto de Actinobacterias en la altura y número de tallos de Asparagus

officinalis L.

Los valores de altura y número de tallos de las plantas de espárrago

presentaron distribución normal (p>0,05) y homogeneidad de varianza (p>0,05),

por lo que se realizó el análisis de varianza de un solo factor y la prueba

múltiple de Tukey (Anexos 7 a 12).

42

92,73%

7,27%

Fijaron

No fijaron

Figura 26. Porcentaje de Actinobacterias aisladas de Asparagus officinalis L. que

fijaron nitrógeno in vitro.

Figura 27. Coloración observada en la cuantificación de amonio

43

Tabla 5. Nitrógeno fijado como amonio (ppm) por Actinobacterias aisladas de rizoplano y rizosféra de Asparagus officinalis L.

Actinobacterias código UNPRG

Amonio (ppm)


Amonio (ppm)


Amonio (ppm)

Nocardia sp.4.3

31,513

Streptomyces sp.4.1

19,803

Nocardia sp.15.5

14,803

Streptomyces sp.5.5

31,256

Nocardia sp.41.4

19,307

Nocardioides sp.41.3

14,802

Streptomyces sp.39.1

30,667

Micromonospora sp.40.4

19,142


14,711


29,528

Nocardia sp.40.5

18,921

Streptomyces sp.9.2

14.252


29,307


18,847

Pseudonocardia sp. 47.3

13.829

Streptomyces sp.1.3

29,050


18,847


13,792

Nocardia sp.13.4

28,572

Nocardia sp.29.3

18,700


13,627

Nocardioides sp.4.2

28,167

Nocardia sp.29.7

18,296

Nocardia sp.44.2

13,167

Nocardia sp.40.2

27,965

Nocardia sp.5.3

18,276

Nocardia sp.4.5

13,039

Pseudonocardia sp.22.1

27,432

Nocardia sp.38.1

18,167


12,873


27,175

Nocardia sp.5.6

17,910

Nocardia sp.18.2

12,138

Nocardia sp.40.3

26,899

Nocardia sp.35.1

17,910


11,844

Streptomyces sp.1.4

26,219

Nocardia sp.15.4

17,322


11,733

Nocardia sp.37.1

25,741

Streptomyces sp.5.4

17,211


11,697


25,097

Nocardia sp.31.1

17,119

Nocardia sp.43.1

11,384


25,006


17,064

Nocardia sp.7.1

11,347


24,472


16,770

Nocardia sp.35.6

11,256


24,454

Nocardia sp.48.1

16,495


11,090

Nocardia sp.18.3

24,086


16,439

Streptomyces sp.1.1

10,502


23,792

Streptomyces sp.8.1

16,439

Streptomyces sp.3.1

10,483


23,039


16,403


9,893


22,542

Nocardia sp.11.1

16,200

Nocardia sp.30.2

9,436


22,285


16,145

Nocardia sp.45.3

8,737

Nocardia sp.11.8

23,733

Streptomyces sp.8.2

16,108


7,744

44

Continuación…


Amonio (ppm)


Amonio (ppm)


Amonio (ppm)


21.642


16,108


7,542


21.439


16,072

Nocardia sp.35.4

5,520


21,403

Streptomyces sp.5.2

16,053


4,233


21,108

Streptomyces sp.9.3

16,017

Nocardia sp.39.6

4,159


20,869


15,978


3,719


20,575


15,906


3,425

Nocardia sp.44.4

20,465


15,778


3,314

Nocardia sp.39.2

20,281

Nocardia sp.49.1

15,759


2,726

Nocardia sp.15.6

20,171

Nocardia sp.45.2

15,722


2,629

Streptomyces sp.9.1

19,969

Nocardia sp.13.3

15,686


2,267

45

67,27%

32,73%

Solubilizaron

No solubilizaron

Figura 28. Porcentaje de Actinobacterias aisladas de Asparagus officinalis L. que

solubilizaron fosfato in vitro.

Figura 29. Coloración observada en la cuantificación de fósforo soluble.

46

Tabla 6. Fósforo cuantificado (ppm) en la solubilización por Actinobacterias aisladas de rizoplano y rizosféra de Asparagus officinalis L.


P soluble (ppm)


P soluble (ppm)


P soluble (ppm)

Nocardia sp.44.2

4,725

Nocardia sp.48.1

4,092

Streptomyces sp.1.3

1,228

Nocardia sp.35.6

4,379

Nocardia sp.37.1

3,020

Streptomyces sp.8.1

1,012


4,292


2,991

Nocardia sp.5.6

0,997

Nocardia sp.39.2

4,205

Nocardia sp.39.6

2,919


0,896

Nocardia sp.49.1

4,118

Nocardia sp.15.6

2,905

Nocardia sp.18.2

0,838


4,031

Nocardia sp.45.2

2,861

Nocardia sp.11.1

0,737

Streptomyces sp.9.2

4,017


2,832


0,665

Nocardia sp.43.1

3,988


2,760

Nocardia sp.40.2

0,650


3,931


2,746


0,607


3,916


2,673


0,607


3,873

Nocardia sp.13.4

2,601


0,592


3,873

Streptomyces sp.4.1

2,298

Streptomyces sp.1.4

0,520

Nocardia sp.35.4

3,858


2,283


0,491


3,858


2,124

Nocardia sp.38.1

0,434

Nocardia sp.15.4

3,699


2,081


0,434


3,699

Nocardia sp.41.4

2,052


0,419


3,613

Nocardioides sp.5.7

1,951

Streptomyces sp.9.1

0,419

Nocardia sp.4.3

3,598


1,821

Nocardia sp.31.1

0,332

Nocardia sp.15.5

3,353

Nocardia sp.35.1

1,806


0,332

Nocardia sp.39.4

3,338


1,720


0,332


3,295

Nocardia sp.4.5

1,618


0,275


3,237

Streptomyces sp.8.2

1,503

Nocardia sp.30.6

0,202


3,179

Streptomyces sp.3.1

1,286


0,058

Nocardia sp.45.3

3,150


1,257


3,107


1,229

47

Figura 30. Coloración observada en la cuantificación de indoles.

48

Tabla 7. Indoles producidos (ppm) por Actinobacterias aisladas de rizoplano y rizosféra de

Asparagus officinalis L.


Indoles (ppm)


Indoles (ppm)


Indoles (ppm)


58,911

Norcardioides sp.50.4

39,800

Nocardia sp.39.6

37,356


58,466


39,578

Pseudonocardia sp 24.6

36,911

Nocardia sp.39.2

48,911

Nocardia sp.34.2

39,578


36,689


48,244


39,578

Nocardia sp.13.3

36,689

Streptomyces sp.1.1

47,133

Streptomyces sp 46.2

39,578


36,467

Nocardia sp.30.6

46,022

Nocardia sp.5.3

39,578

Streptomyces sp.8.2

36,467


44,911


39,578

Nocardia sp 13.4

36,244


44,689


39,356


36,244

Streptomyces sp.3.1

44,689

Nocardia sp.43.1

39,356


36,022

Nocardia sp.35.4

44,467


39,356


36,022


44,022

Nocardia sp.30.2

39,133


36,022

Nocardia sp.29.3

43,578

Streptomyces sp.1.3

38,911

Nocardia sp.35.2

35,800

Nocardia sp.38.1

43,578


38,911

Nocardia sp.41.4

35,578

Nocardia sp.15.4

43,356

Nocardia sp.37.1

38,911

Nocardia sp.7.1

35,578


43,356

Nocardia sp.48.1

38,911


35,356


43,356


38,687


35,356

Streptomyces sp. 5.4

43,133


38,687


35,133

Micromonosporas sp.41.5

42,689


38,467


35,133

Nocardia sp.45.3

42,689

Nocardia sp.39.4

38,467

Nocardia sp.4.3

34,911


42,244


38,467

Nocardia sp.35.1

34,689


42,022

Nocardia sp.15.6

38,244


34,689

Nocardia sp.40.3

41,800

Nocardia sp.18.3

38,244

Streptomyces sp.5.2

34,689

Streptomyces sp.9.1

41,578


38,244


34,467

Nocardia sp.15.5

41,356


38,244


34,467

49

Continuación…


Indoles (ppm)


Indoles (ppm)


Indoles (ppm)

Nocardia sp.49.1

41,133


38,244

Nocardia sp.11.8

34,244

Streptomyces sp.8.1

41,133

Streptomyces sp.4.1

38,244


33,800


40,911

Nocardia sp.5.6

38,244

Streptomyces sp.1.4

33,356

Nocardia sp.31.1

40,911


38,022


33,356


40,911


38,022


33,133


40,911

Nocardia sp.4.5

38,022

Nocardia sp.40.5

32,911

Streptomyces sp.9.2

40,911


38,022

Nocardioides sp.5.7

32,911

Nocardia sp.40.2

40,689


37,800


32,244


40,467

Nocardia sp.44.2

37,800


31,133

Nocardia sp.41.5

40,467

Nocardia sp.18.2

37,577

Nocardia sp.29.7

31,133


40,244


37,577

Nocardia sp.35.6

30,022

Nocardia sp.38.1

40,244

Streptomyces sp.5.5

37,577

Streptomyces sp.9.3

30,022

Nocardia sp.11.1

40,022


37,356

Tabla 8. Valores (ppm) de amonio, fósforo soluble e indoles correspondientes a

cultivos de Actinobacterias seleccionados.


Amonio (ppm)

Fósforo soluble (ppm)

Indoles (ppm)

Nocardia sp.4.3 31,513 3,598 34,911

Streptomyces sp.5.5 31,256 0 37,577

Nocardia sp.44.2 13,167 4,725 37,800

Nocardia sp.35.6 11,256 4,379 30,022

Streptomyces sp.50.1 22,542 0,275 58,911

Streptomyces sp.11.3 23,039 4,292 58,466

50

La altura de las plantas de espárrago a los 30 días fue de 19,00 a 32,00 cm

con las Actinobacterias; 16,00 cm en el testigo absoluto y 21,67 cm en el testigo

químico (Figuras 31 a 33), registrándose índices de efectividad de 18,8% con

Nocardia sp.35.6 y 100,0% con Streptomyces sp.5.5 (Tabla 9). El análisis de

varianza de los valores de altura demostró alta significancia (Anexo 7) y según la

prueba múltiple de Tukey (Tabla 10) los mayores valores se alcanzaron con

Streptomyces sp.5.5 y Nocardia sp.4.3, sin diferencias significativas entre ellos,

pero si con los demás tratamientos.

El número de tallos de las plantas de espárrago a los 30 días fue de 1,67 a

4,33 con las Actinobacterias; 2,00 tallos en el testigo absoluto y 2,00 tallos en el

testigo químico (Figura 34), registrándose índices de efectividad de 50,0% con

Streptomyces sp.5.5 y Nocardia sp.4.3 y 116,5% con Streptomyces sp.11.3 (Tabla

11). El análisis de varianza de los valores del número de tallos no demostró

significancia (Anexo 8).

La altura de las plantas de espárrago a los 45 días fue de 21,85 a 37,44cm




varianza de los valores de altura demostró alta significancia (Anexo 9) y según la

prueba múltiple de Tukey (Tabla 10) los mayores valores se alcanzaron con

Nocardia sp.4.3 y Streptomyces sp.5.5, sin diferencias significativas entre ellos,

pero si con los demás tratamientos.





varianza de los valores del número de tallos no demostró significancia (Anexo 10).

La altura de las plantas de espárrago a los 60 días fue de 30,37 a 51,80cm



Nocardia sp.44.2 y 83,1% con Nocardia sp.4.3 (Tabla 9).

51

Figura 31. Plantas de Asparagus officinalis L. 30 días después de la siembra de

coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Streptomyces

sp.5.5.


coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Nocardia sp.4.3.

52

Figura 33. Altura (cm) de Asparagus officinalis L., 30 días después de la inoculación de

Actinobacterias.

Tabla 9. Índices de efectividad (%) de Actinobacterias en la altura de Asparagus

officinalis L. a los 30, 45 y 60 días. aaaaaaaaaaaaaaaaa


30 días

IE%

45 días

60 días

Nocardia sp.4.3 92,7 77,9 83,1

Streptomyces sp.5.5 100,0 80,0 78,6

Nocardia sp.44.2 22,8 5,1 7,4

Nocardia sp.35.6 18,8 14,4 13,6

Streptomyces 50.1 56,3 39,4 43,5


Testigo químico 35,4 13,6 4,4

32,0030,83

25,00 24,67

21,6719,67 19,00

16,00

0

5

10

15

20

25

30

35A

ltu

ra (

cm

)

53

Tabla 10. Prueba de Tukey de la altura de plantas de Asparagus officinalis L. a los

30, 45 y 60 días después de la inoculación de Actinobacterias

Figura 34. Número de tallos de Asparagus officinalis L., 30 días después de la

inoculación de Actinobacterias.


30 días

Sign.

45 días Sign.

.

60 días Sign.

Nocardia sp.4.3 30,83 a 37,00 a 51,80 a

Streptomyces sp.5.5 32,00 a 37,44 a 50,54 a

Nocardia sp.44.2 19,00 cd 21,85 cd 30,37 c

Nocardia sp.35.6 19,67 bcd 23,80 bcd 32,13 c

Streptomyces 50.1 25,00 b 29,00 b 40,60 b

Streptomyces sp.11.3 24,67 b 27,88 b 39,88 b

Testigo quimico 21,67 bc 23,62 bcd 29,52 c

Testigo absoluto 16,00 c 20,80 d 28,29 c

4,33

3,67

3,00 3,00

2,332,00 2,00

1,67

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

Nú

me

ro d

e t

allo

s

Altura (cm)

54

Tabla 11. Índices de efectividad (%) de Actinobacterias en el número de tallos de

Asparagus officinalis L. a los 30, 45 y 60 días.



sp.5.5.


30 días

IE%

45 días

60 días


Nocardia sp.4.3 50,0 71,8 62,2

Nocardia sp.44.2 0 0 0


Nocardia sp.35.6 0 14,6 12,4

Streptomyces sp.11.3 116,5 100.4 99,6

Testigo químico 16,5 14,6 12,4

55


coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Nocardia

sp.44.2.


Actinobacterias.

Altu

ra (

cm

)

37,44 37,00

29,00 27,88

23,80 23,6221,85 20,80

0

5

10

15

20

25

30

35

40

56





sp.5.5.

4,674,33

4,003,67

2,67 2,672,33 2,33

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5N

úm

ero

de

tallo

s

57


coronas, a) Testigo absoluto, b) Testigo quimico, c) Nocardia sp.4.3


Actinobacterias.

Altu

ra (

cm

)

51,80 50,54

40,60 39,88

32,13 30,37 29,52 28,29

0

10

20

30

40

50

60

58

El análisis de varianza de los valores de altura demostró alta significancia

(Anexo 11) y según la prueba múltiple de Tukey (Tabla 10) los mayores valores se

alcanzaron con Streptomyces sp.5.5 y Nocardia sp.4.3, sin diferencias

significativas entre ellos, pero si con los demás tratamientos.





varianza de los valores del número de tallos no demostró significancia (Anexo 12).

59



5,33

4,674,33

4,00

3,00 3,002,67 2,67

0

1

2

3

4

5

6

Nú

me

ro d

e t

allo

s

60

V. DISCUSIÓN

En las raíces y suelo rizosférico de espárrago se aislaron Actinobacterias,

microorganismos que también fueron reportados en cultivos agrícolas como

Capsicum annuum L. “pimiento” (Ezziyani et al., 2004), Theobroma cacao “cacao”

(Barreto et al., 2008), Vitis sp. “vid” (Franco et al., 2009), Solanum tuberosum L.

“papa” (Rico, 2009), Lycopersicon esculentum Mill “tomate” (Núñez & Vásquez,

2013), Zea mays L. “maíz” (Arrunátegui, 2015). Asimismo, las Actinobacterias se

aislaron de malezas (Infante & Zurita, 2013), estiércol (Piñero & Rivas, 2004) y

sedimentos de ríos, lagos (Leiva et al., 2004) y litoral marino (León et al., 2007).

Las Actinobacterias son abundantes en el suelo, pero también en los

ambientes acuáticos, dulces y marinos (Leyva et al., 2004; León et al., 2007;

Franco, 2008). En el suelo se encuentran en una concentración promedio de 106

UFC g-1 de suelo seco (Franco, 2008) y sobreviven frente a condiciones adversas

gracias a su versatilidad metabólica (Ezziyani et al., 2004), formación de esporas

(Flardh & Buttner, 2009) y gránulos de polihidroxialcanoatos, PHA (Franco et al.,

2009).

Las Actinobacterias se identificaron fenotípicamente, coincidiendo con

Farfán & Gutiérrez (2009), Salazar & Ordóñez (2013) y Prieto et al. (2015); no

obstante, cuando las condiciones lo permiten se debe realizar la caracterización

molecular (Barreto et al., 2008; Franco, 2008; Prieto et al., 2015). Se identificaron

cinco géneros, previamente reportados por Salazar & Ordóñez (2013) en suelos

de un jardín botánico (Streptomyces, Nocardia), Núñez & Vásquez (2013) en la

61

rizósfera de tomate (Micromonospora, Pseudonocardia) e Infante & Zurita (2013)

en suelo rizosférico de malezas (Norcadioides).

El género Streptomyces predominó en las Actinobacterias investigadas,

coincidiendo con Rico (2009), Salazar & Ordóñez (2013), Infante & Zurita (2013) y

Núñez & Vásquez (2013). Según Franco (2008), con los métodos convencionales

de aislamiento, el 95% de los actinomicetos pertenece al género Streptomyces,

seguido de Nocardia y Micromonospora.

En la caracterización fisiológica de las Actinobacterias se investigó la

fijación de nitrógeno, solubilización de fosfatos y producción de indoles, al igual

que Infante & Zurita (2013) y Núñez & Vásquez (2013); no obstante, también se

puede investigar la actividad enzimática (Moya, 2011; Srividya et al., 2012),

producción de sideróforos (Franco, 2008; Srividya et al., 2012) y actividad

antifungica (Farfán & Gutiérrez, 2009; Rico, 2009).

El 92,73% de los cultivos de Actinobacterias fijaron nitrógeno in vitro,

desarrollando en medio de cultivo sin nitrógeno. De igual forma, Franco (2008)

demostró la fijación de nitrógeno por Actinobacterias aisladas de la rizósfera de

papa y cultivadas en medio mineral sin nitrógeno durante 10 días. Por su parte,

Núñez & Vásquez (2013), Aguilar & Deza (2014) y Arrunátegui (2015) reportaron

la fijación de nitrógeno por bacterias aisladas de tomate, piñon blanco y maíz,

respectivamente.

El amonio producido durante la fijación de nitrógeno se cuantificó

indirectamente con el método colorimétrico del fenol hipoclorito (Cadena &

Martínez, 2011); sin embargo, también se puede realizar la prueba de reducción

de acetileno y la detección del gen nifH, que codifica para la enzima nitrogenasa

(Franco, 2008). La concentración máxima de amonio fue de 31,513 ppm, valor que

se encuentra en el rango 1,4-34,0 ppm registrado para Actinobacterias aisladas de

tomate (Núñez & Vásquez, 2013) y maíz (Arrunátegui, 2015).

El 67,27% de los cultivos de Actinobacterias solubilizaron fosfato,

superando a Rico (2009) quien reportó que el 46,7% de las Actinobacterias

aisladas de la rizósfera de papa fue positivo para la solubilizacion de fosfato

62

tricálcico. De igual manera, Barreto et al. (2008), López (2013) y Prieto et al.

(2015) demostraron la solubilización de fosfatos por estas bacterias. Al respecto,

Prieto et al. (2015) determinaron la producción de ácidos oxálico, cítrico y

glucónico por Actinobacterias solubilizadoras de fósforo. Asimismo, Rico (2009)

demostró la disminución del pH neutro hasta 5,5 del caldo de cultivo con fosfato

tricálcico, evidenciando la acidez generada por las bacterias durante la

solubilizacion; no obstante, Hamdali et al. (2012) reportaron que los sideróforos o

iones queladores, productores de alcalinidad son responsables de la solubilización

de fosfatos por las Actinobacterias.aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

Todos los cultivos de Actinobacterias produjeron indoles, superando a Rico

(2009) quien determinó que el 48,8% de las Actinobacterias aisladas de la

rizósfera de papa fue positivo para la producción de estos compuestos. De igual

manera, Barreto et al. (2008), Castellanos et al. (2009), Srividya et al. (2012) y

López (2013) demostraron la producción de indoles por las Actinobacterias. La

concentración máxima de indoles fue de 58,911 ppm valor superior a 51,78 ppm

reportadas por Rico (2009) para aislados de papa.a

Las Actinobacterias fijadoras de nitrógeno, solubilizadoras de fosfato y

productoras de indol incrementaron la altura y número de tallos de las plantas de

espárrago, demostrándose su potencial como promotoras de crecimiento en

plantas. Asimismo, el efecto positivo de las Actinobacterias fue reportado por

Stechmann (2011) en papa, Pérez (2012) en pepino, Suwan et al (2012) en chili,

Cabrera & Paredes (2013) en maíz y Salazar & Ordóñez (2013) en lechuga.

La promoción del crecimiento de las plantas por las Actinobacterias está

asociada a mecanismos directos como la síntesis de auxinas (Otero, 2011),

fijación de nitrógeno (Salazar & Ordóñez, 2013), solubilización de fosfatos (Núñez

& Vásquez, 2013) y también presentan mecanismos indirectos o de control

biológico (Srividya et al., 2012) que disminuyen la agresividad de los fitopatógenos

radiculares (Anitha & Rabeeth, 2009; Cabrera & Paredes, 2013) y foliares (Srividya

et al., 2012).

63

Los mayores índices de efectividad en altura y número de tallos se

alcanzaron con Streptomyces spp. Este género agrupa bacterias con una amplia

actividad biológica de aplicación en la agricultura, como insecticidas (Hernández &

Mondragón, 2002), fungicidas (Hassan et al., 2011), herbicidas (Doumbou et al.,

2002) y reguladores del crecimiento (Balakrishna et al., 2012; Cabrera & Paredes,

2013).

64

VI. CONCLUSIONES

En el rizoplano y rizósfera de espárrago fueron aisladas Actinobacterias,

del género Streptomyces (39,09%), Nocardia (37,27%), Micromonospora

(9,09%), Nocardioides (8,18%) y Pseudonocardia (6,37%).

Las Actinobacterias aisladas e identificadas fijaron in vitro nitrógeno

(2,257 a 31,513 ppm de amonio), solubilizaron fosfato tricálcico (0,058 a

4,725 ppm de fósforo soluble) y produjeron indoles (30,022 a 58,911 ppm

de índoles).

Los cultivos de Actinobacterias seleccionados fueron los que alcanzaron

los mayores valores en la concentración de amonio: Nocardia sp.4.3 y

Streptomyces sp.5.5; concentración de fosforo soluble: Nocardia spp.44.2

y 35.6 y concentración de indoles: Streptomyces spp.50.1 y 11.3.

Las Actinobacterias demostraron su potencial como promotoras de

crecimiento en plantas, al incrementar la altura con IE= 19 a 51% y el

número de tallos con IE= 5,1 a 116% de plantas de espárrago, en

condiciones de invernadero.

65

VII. RECOMENDACIONES

Identificar a nivel molecular Streptomyces spp. 5.5; 50.1; 11.3 y

Nocardia spp. 4.3; 44.2 y 35.6.

Determinar el efecto de Streptomyces spp. 5.5; 50.1; 11.3 y Nocardia

spp. 4.3; 44.2 y 35.6 en el desarrollo vegetativo y rendimiento de

espárrago en condiciones de campo, con y sin fertilizante químico.

Investigar sustratos orgánicos de bajo costo para el incremento masivo

de Streptomyces spp. 5.5; 50.1; 11.3 y Nocardia spp. 4.3; 44.2 y 35.6.

66

VIII. RESUMEN

En el rizoplano y rizósfera de Asparagus officinalis L. “espárrago” se aislaron

Actinobacterias, con el objetivo de determinar su potencial como promotoras de

crecimiento en plantas. Las bacterias se aislaron en agar avena y las colonias

desarrolladas se identificaron fenotípicamente. Se cuantificó el nitrógeno fijado

como amonio, fósforo soluble producto de la solubilización de fosfato tricálcico

e indoles producidos por las bacterias in vitro. Los seis cultivos de

Actinobacterias que alcanzaron los mayores valores, se inocularon por

aspersión en coronas de espárrago cultivar UC-157 F2 y se determinó el efecto

en la altura y número de tallos, durante 60 días en invernadero. Se aislaron

Actinobacterias, identificándose Streptomyces (39,09%), Nocardia (37,27%),

Micromonospora (9,09%), Nocardioides (8,18%) y Pseudonocardia (6,37%).

Las Actinobacterias fijaron nitrógeno, solubilizaron fosfato tricálcico y

produjeron indoles in vitro, cuantificándose 2,257 a 31,513 ppm de amonio;

0,058 a 4,725 ppm de fósforo soluble y 30,022 a 58,911 ppm de indoles. Los

seis cultivos con los mayores valores demostraron su potencial como

promotores de crecimiento en plantas, incrementando la altura (IE= 19 a 51%)

y el número de tallos (IE= 5,1 a 116%) de plantas de espárrago, en condiciones

de invernadero.

67

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73

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74

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Universidad Javeriana, Bogotá, Colombia.

75

X. ANEXOS

76

ANEXO 1

Cálculo del número de muestras para el aislamiento de Actinobacterias

(en Vásquez et al., 2012)

n= Z2 p.q

T2 n= (1,96)2 (0,90. 0,10)

(0,06)2

n = 96,04 muestras

Dónde:

n = Tamaño de la muestra

Z = 1,96 (α= 0,05) valor estándar

p = Prevalencia de Actinobacterias promotaras del crecimiento en

plantas (0,90).

q = 1-p, ausencia (0,10).

T= Error estimado (6%).

77

ANEXO 2

Medios de cultivo y soluciones para el aislamiento, identificación y

mantenimiento de Actinobacterias

a. Agar avena (en Franco, 2008)

En 600mL de agua destilada agregar 60g de avena dejar hervir por

30 minutos, después colar y completar hasta 1000mL.

b. Agar nutritivo (en Escobar & Horna, 2011)

c. Caldo extracto de suelo al 10% (en García & Muñoz, 2010)

Ajustar a pH 7,3. Para obtener extracto de suelo al 10%, depositar en un

matraz 250g de suelo agrícola y 500mL de agua destilada. Hervir 2 horas,

completar a 500mL con agua destilada y filtrar el sobrenadante. Tomar 25mL

del filtrado y completar a 500mL con agua destilada.

Componentes gL-1

Avena

Agar

1000mL

15,0

Componentes gL-1

Peptona

Extracto de carne

Agar agar

Agua destilada csp

5,0

3,0

15,0

1000 mL

Componentes gL-1

K2HPO4

MgCl2

MgSO4. 7H2O

FeCl3

CaCl2

Triptona

Extracto de levadura

Extracto de suelo al 10 %

Agua destilada

0,4

0,1

0,05

0,01

0,1

1,0

1,0

250mL

750mL

78

d. Medio de cultivo National Botanical Research Institute, NBRIP (en

Alvarado & Valderrama, 2014)

Solución de antimicótico (en Alvarado & Valderrama, 2014)

Disolver una capsula de 150mg de Fluconazol en 10mL de alcohol al 95%.

Agregar 2mL de solución de antimicótico por litro de medio de cultivo para

tener 45mg de Fluconazol por litro.

e. Caldo tripticasa Soya suplementado con triptófano (en Escobar &

Horna, 2011)

Disolver por calentamiento y ajustar a pH 7,3

Componentes gL-1

Glucosa

Ca3(PO4)2

(NH4)2SO4

MgSO4. 7H2O

KCl

MgCl2. 6H2O

Agar agar

Agua destilada

10,0

5,0

0,1

0,25

0,2

5,0

15,0

1000mL

Componentes gL-1

Peptona de caseína

Peptona de harina de Soya

D (+) glucosa (dextrosa)

Cloruro de sodio

Fosofato dipotasico

Triptofano

Agua destilada cps

17,0

3,0

2,5

5,0

2,5

0,01

1000 mL

79

ANEXO 3

Procedimiento para elaborar la curva de calibración para cuantificar el ion

amonio

a. Reactivos (en Lara et al; 2007., Cadena & Martínez, 2011)

• Cloruro de potasio 2M

Cloruro de potasio 149,12g

Agua destilada 1000mL

• Solución alcohólica de fenol 10%

Fenol concentrado 10mL

Alcohol 97º 90mL

• Nitroprusiato de sodio 0,5%

Nitroprusiato de sodio 0,5g


• Solución oxidante

Citrato de sodio 20,0g

Hidróxido de sodio 1,0g

Hipoclorito de sodio 5% (lejía comercial) 2mL


b. Método colorimétrico de Berthelot para cuantificar el nitrógeno en

amonio (en Lara et al., 2007)

b.1 Fundamento del método colorimétrico de Berthelot (fenolhipoclorito)

Se basa en la formación de un color azul intenso de indofenol, que resulta

de la reacción del ión amonio (NH4) con los compuestos fenólicos, en

presencia de un agente oxidante como el hipoclorito de sodio u o-fenol y un

catalizador, principalmente nitroprusiato de sodio o de potasio. El mecanismo

de la reacción depende de la luz presente, la temperatura ambiente,

catalizadores y pH alcalino. Cuando se utiliza fenol o sodio la reacción puede

ser representada de la siguiente manera:

NH3 + 2C6H60-+ 3ClO- O= C6H4= N-C6H4-O + 2H2O + OH- + 3Cl-

b.2 Preparación de diluciones a partir de una solución madre de NH4Cl

Para obtener la curva patrón se prepara una solución madre de 100ppm

de NH4CI, para lo cual se pesa 0,1g de NH4CI y se disuelve en 1L de agua

bidestilada. Posteriormente, a partir de la solución madre se efectúan las

siguientes diluciones:

80

N° de tubo Solución patrón

[mL]

H2O bidestilada

[mL]

NH4Cl

(Ug/mL = ppm)

NH4Cl

[µg /mL= ppm]

1 0,0 10,0 0

2 0,2 9,8 2

3 0,4 9,6 4

4 0,6 9,4 6

5 0,8 9,2 8

6 1,0 9,0 10

7 1,5 8,5 15

8 2,0 8,0 20

b.3 Procedimiento para la cuantificación de amonio por colorimetría

Obtenidas las diluciones, agregar a cada tubo 0,4mL de solución

alcohólica de fenol al 10%; 0,4mL de nitroprusiato de sodio al 0,5% y 1mL de

solución oxidante, luego agitar para mezclar y dejar en reposo durante 1 hora.

Observar una coloración que varía del verde azul al azul intenso según la

concentración de amonio. Leer la absorbancia de cada dilución en el

espectrofotómetro a 632,9nm.

Una vez obtenida la absorbancia de todas las concentraciones de

amonio, corregir los valores y mediante regresión lineal con el programa

Microsoft Excel 2010, obtener la ecuación de la recta y el coeficiente de

determinación (R2) que deberá ser mayor a 0,9 para demostrar una dispersión

homogénea de los valores sobre la recta.

Nº tubo NH4 100 (ppm) Absorbancia Absorbancia corregida

01 0 0,058 0,000

02 2 0,199 0,141

03 4 0,311 0,253

04 6 0,480 0,422

05 8 0,576 0,518

06 10 0,619 0,561

07 15 0,884 0,826

81

y = 0.0544x + 0.0387R² = 0.9829

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 5 10 15 20

Absorb

ancia

NH4 100 ppm

Obtenida la absorbancia de las siete concentraciones de amonio, introducir

los datos el el programa Microsoft Office Excel 2007 y construir la curva

patrón de calibración:

En la ecuación obtenida:

Donde:

y: representa la absorbancia captada (variable dependiente).

x: cantidad de amonio en ppm (variable independiente).

Despejar “x” para obtener la cantidad de amonio (ppm) fijado por cada bacteria

nativa.

𝒚 = 𝟎, 𝟎𝟓𝟒𝟒𝒙 + 𝟎, 𝟎𝟑𝟖𝟕

𝐱 = y - 0,0387

0,0544

82

ANEXO 4

Cuantificación de fósforo solubilizado in vitro

a. Reactivos (en Rodier & Rodi, 2005)

Solución de ácido sulfúrico 5N

Ácido sulfúrico (d = 1,84) 14 mL

Agua destilada hasta enrase 100 mL

Solución de molibdato amónico 4 % 20 mL

Solución de ácido ascórbico

Ácido ascórbico 1,76 mL


Solución de amético (Preparar al momento del uso)

Tartrato doble de antimonio y potasio 0,0274 g


Reactivo para determinación de ortofosfatos

Ácido sulfúrico 5 N 40 mL

Solución de Molibdato amónico 12 mL

Solución de ácido ascórbico 24 mL

Solución de emético 4 mL

Solución madre de 0,2 mgL-1 de fósforo

Fosfato monopotásico previamente desecado

en estufa a 100 °C 877 g


Solución hija de 2mgL-1 de fósforo

Diluir 1mL de solución madre en 99mL de agua destilada

(1/100)

b. Método colorimétrico del Molibdato para cuantificar fósforo soluble

( en Rodier Rodi, 2005)

b.1. Fundamento

En medio ácido y en presencia de molibdato amónico, los ortofosfatos

forman un complejo fosfomolíbdico que, reducido por el ácido ascórbico,

83

desarrolla una coloración azul susceptible de una determinación colorimétrica

y cuya aparición se acelera utilizando el catalizador emético, tartrato doble de

antimonio y potasio.

b.2. Limpieza de los recipientes de vidrio

Para la limpieza del material de vidrio no utilizar detergentes que

contengan fosfato. Lavados con ácido clorhídrico diluido y enjuagados

cuidadosamente con agua destilada.

b.3. Preparación de la curva de calibración

Colocar en una serie de matraces aforados de 25 mL:

Número de matraces T I II III

Solución salina de fósforo de 2 mgL-1 (mL) 0 1 2 5

Agua bidestilada (mL) 20 19 18 15

Reactivo indicador (mL) 4 4 4 4

Agua destilada hasta enrase (mL) 25 25 25 25

Correspondencia de fósforo en mgL-1 0 0,1 0,2 0,5

Esperar 20 minutos y efectuar las lecturas en el espectrofotómetro a la

longitud de onda de 690nm en cubetas de 10cm. Construir la curva de

calibración. Los datos de la absorbancia corregida se analizan mediante

regresión lineal con el programa Microsoft Excel 2007 para obtener la

ecuación de la recta y el coeficiente (R2) que deberá ser mayor a 0,9 para

demostrar una dispersión homogénea de los valores sobre la recta.

b.4. Procedimiento para cuantificar fosfatos en la muestra

Introducir 20mL de la muestra a analizar en un matraz aforado de 25mL

Añadir 4mL de reactivo indicador, completar el volumen a 25mL con agua

destilada. Esperar 20 minutos y efectuar la lectura en el espectrofotómetro de

luz visible con una longitud de onda de 690nm. Tener en cuenta el valor leído

para el testigo. Obtener los resultados en la curva de calibración. Para una

muestra de 20mL, la curva indica el contenido de fósforo expresado en

miligramos por litro.

84

N° de tubo Fósforo soluble Absorbancia

(ppm)

1 0,1 0,077

2 0,2 0,085

3 0,5 0,105

Una vez obtenida la absorbancia de las tres concentraciones de fosfato

dicálcico, introducir los datos en el programa Micrsoft Office Excel 2007 y

construir la curva patrón de calibración:


Donde:

y: representa la absorbancia captada (variable dependiente)

x: cantidad de fósforo en ppm (variable independiente)

Despejar “x” para obtener la cantidad de fósforo (ppm) producido por cada

bacteria nativa.

y = 0.0692x + 0.0705R² = 0.9985

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

Ab

sorb

anci

a 69

0 n

m

Fósforo (ppm)

𝐲 = 𝟎, 𝟎𝟔𝟗𝟐𝐱 + 𝟎, 𝟎𝟕𝟏

𝐱 = 𝐲 − 𝟎, 𝟎𝟕𝟏

𝟎, 𝟎𝟔𝟗𝟐

85

ANEXO 5

Procedimiento para elaborar la curva de calibración para cuantificar indoles

a. Rectivos

Reactivo de Salkowski (en García & Muñoz, 2010)

Al momento de la preparación, verter el acido sulfúrico concentrado en un

balón con 250mL de agua destilada y simultáneamente enfriar con chorro de

agua constante. Finalmente agregar el cloruro férrico al 0,5 M.

Utilizar 4mL del reactivo para 1mL de la muestra investigada.

b. Método colorimétrico de Salkowski para cuantificar índoles (en Mantilla,

2007)

b.1. Fundamento de la reacción de Salkowski

Mediante la reacción de Salkowski se detectan grupos indol presentes en

el medio de cultivo y la concentración de indol es directamente proporcional a

la intensidad de color rojo producido. A su vez, el cambio de color es el

resultado de una reacción oxidativa con el ácido sulfúrico, donde por medio de

una transaminación un grupo amino es sustituido por el cloro proveniente del

FeCl3, originando un compuesto visible de color rosado a rojo en el caso del

indolacético. Otras coloraciones indican la presencia de productos intermedios

de la síntesis del ácido indolacético, que pueden ser generados a partir del

triptófano.

b.2. Preparación de diluciones a partir de una solución madre de AlA

Para obtener una curva patrón de ácido indolacético, preparar una solución

madre de 100ppm, para lo cual se pesan 10mg de ácido indolacético y se

disuelven con unas gotas de NaOH en un matraz aforado a 100mL.

Componentes gL-1

H2SO4 concentrado

Agua destilada

FeCl3 0,5M en Agua destilada

150 mL

250 mL

7,5 mL

86

A continuación, enrasar con agua bidestilada y agitar hasta homogenizar.

Posteriormente se realizan las siguientes diluciones:

N° de tubo Solución patrón H2O bidestilada Concentración

(100 µgmL-1) [µL]* AIA (mgL-1)

1 0 1000 0

2 20 980 2

3 40 960 4

4 60 940 6

5 80 920 8

6 100 900 10

7 150 850 15

8 200 800 20

9 300 700 30

10 400 600 40

11 500 500 50

12 600 400 60

*1000 µL = 1 mL

b.3. Procedimiento para la cuantificación de AIA por colorimetría

Obtenidas las concentraciones parciales de AIA extraer de cada tubo

0,4mL de solución, verter en tubos de 13 x 75mm y agregar 1,6mL de reactivo

de Salkowski (1:4). Dejar en reposo en oscuridad por 30 minutos. Observar la

presencia de una coloración rojiza en los tubos. A continuación, leer la

absorbancia de cada dilución en espectrofotómetro a 530nm.

Una vez obtenida la absorbancia en todas las concentraciones de ácido

indolacético, corregir los valores y mediante regresión lineal en el programa

Microsoft Excel 2007, obtener la ecuación de la recta y el coeficiente (R2) que

deberá ser mayor a 0,9 para demostrar una dispersión homogénea de los

valores sobre la recta.

87

N° de tubo AIA (µg/mL) Absorbancia

01 0 0,000

02 2 0,013

03 4 0,023

04 6 0,034

05 8 0,043

06 10 0,060

07 15 0,087

08 20 0,110

09 30 0,141

10 40 0,202

11 50 0,229

12 60 0,273

Obtenida la absorbancia de las doce concentraciones de ácido indol

acético, introducir los datos en el programa Microsoft Office Excel 2007 y y

construir la curva patrón de calibración:


Donde:

y: representa la absorbancia captada (variable dependiente)

x: ácido indol acético en ppm (variable independiente)

y = 0.0045x + 0.0089R² = 0.9931

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0 10 20 30 40 50 60 70

Ab

sorb

anci

a

AIA ug/mL

y = 0,0045x + 0,0089

88

Despejar “x” para obtener la cantidad de ácido indol acético (ppm) producido por

cada bacteria nativa.

𝐱 = y - 0,0089

0,0045

89

ANEXO 6

Temperaturas minima, media y máxima durante el cultivo de Asparagus

officinalis L.

Fecha Temperatura Temperatura Temperatura

minima (0C) media (0C) máxima (0C)

19/10/16 18 21 24

20/10/16 17 21 25

21/10/16 17 20,5 24

22/10/16 17 21 25

23/10/16 17 20,5 24

24/10/16 17 20,5 24

25/10/16 17 21 25

26/10/16 16 20 24

27/10/16 17 21 25

28/10/16 16 20 24

29/10/16 16 20 24

30/10/16 16 20 24

31/10/16 16 20 24

01/11/16 16 20 24

02/11/16 15 19,5 24

03/11/16 16 19,5 23

04/11/16 17 20,5 24

05/11/16 17 20,5 24

06/11/16 16 20,5 24

07/11/16 16 20,5 25

08/11/16 17 22 27

09/11/16 17 21,5 26

10/11/16 17 21,5 26

11/11/16 17 21,5 26

12/11/16 17 21,5 26

13/11/16 18 21,5 25

14/11/16 18 21,5 25

15/11/16 17 21 25

16/11/16 17 20,5 24

17/11/16 17 20,5 24

90

Continuación…

Fecha Temperatura Temperatura Temperatura

minima (0C) media (0C) máxima (0C)

18/11/16 16 19 22

19/11/16 14 19,5 25

20/11/16 13 18,5 24

21/11/16 14 19,5 25

22/11/16 16 20 24

23/11/16 16 20 24

24/11/16 17 21 25

25/11/16 18 21,5 25

26/11/16 16 21 26

27/11/16 18 21,5 25

28/11/16 18 21,5 25

29/11/16 17 21 25

30/11/16 18 22 27

01/12/16 18 22 26

02/12/16 19 23 27

03/12/16 18 22,5 27

04/12/16 18 22 26

05/12/16 18 22 26

06/12/16 18 22 26

07/12/16 19 22 25

08/12/16 18 22 26

09/12/16 19 22 25

10/12/16 19 23 27

11/12/16 18 21,5 25

12/12/16 18 22 26

13/12/16 18 22 26

14/12/16 18 22 26

15/12/16 18 21,5 25

16/12/16 19 22,5 26

17/12/16 19 22,5 25

91

Anexo 7

Prueba de normalidad, homogeneidad de varianzas y análisis de varianza

de la altura de Asparagus officinalis L. a los 30 días

Tests of Normality a los 30 días

Tratamiento Kolmogorov-Smirnova

Statistic df Sig.

1 ,189 3 ,906

2 ,148 3 ,989

3 ,208 3 ,832

4 ,199 3 ,868

5 ,246 3 ,649

6 ,222 3 ,765

7 ,216 3 ,794

8 ,208 3 ,830

Prueba de homogeneidad de varianzas

ALTURA A LOS 30 DÍAS

Estadístico de Levene g/1 g/2 Sig.

,687 7 16 ,682

92

Anova de un Factor


Suma de cuadrados

gl Media cuadrática

F Sig.

Inter-grupos 672,323 7 96,046 25,124 ,000

Intra-grupos 61,167 16 3,823

Total 733,490 23

93

Anexo 8


del número de tallos de Asparagus officinalis L. a los 30 días



Statistic df Sig.

1 ,272 3 ,520

2 ,351 3 ,217

3 ,280 3 ,478

4 ,234 3 ,706

5 ,229 3 ,238

6 ,206 3 ,842

7 ,396 3 ,118

8 ,297 3 ,404


NÚMERO DE TALLOS A LOS 30 DÍAS


1,935 7 16 ,130

94

Anova de un Factor


Suma de cuadrados


F Sig.

Inter-grupos 20,667 7 2,952 1,107 ,405

Intra-grupos 42,667 16 2,667

Total 63,333 23

95

Anexo 9





Statistic df Sig.

1 ,214 3 ,827

2 ,232 3 ,997

3 ,299 3 ,952

4 ,175 3 ,999

5 ,253 3 ,991

6 ,179 3 ,923

7 ,231 3 ,979

8 ,243 3 ,871




1,503 7 16 ,235

96

Anova de un Factor


Suma de cuadrados


F Sig.

Inter-grupos 889,790 7 127,113 25,047 ,000

Intra-grupos 81,200 16 5,075

Total 970,990 23

97

Anexo 10





Statistic df Sig.

1 ,175 3 1,000

2 ,253 3 ,991

3 ,292 3 ,960

4 ,175 3 1,000

5 ,276 3 ,976

6 ,304 3 ,929

7 ,328 3 ,904

8 ,385 3 ,766




2,118 7 16 ,101

98

Anova de un Factor


Suma de cuadrados


F Sig.

Inter-grupos 20,292 7 2,899 1,512 ,233

Intra-grupos 30,667 16 1,917

Total 50,958 23

99

Anexo 11







1,357 7 16 ,288


Statistic df Sig.

1 ,253 3 ,834

2 ,191 3 ,997

3 ,253 3 ,871

4 ,343 3 ,999

5 ,229 3 ,872

6 ,175 3 ,997

7 ,200 3 ,997

8 ,191 3 ,999

100

Anova de un Factor


Suma de cuadrados


F Sig.

Inter-grupos 1850,080 7 264,297 114,518 ,000

Intra-grupos 36,927 16 2,308

Total 1887,006 23

101

Anexo 12







3,810 7 16 ,013


Statistic df Sig.

1 ,253 3 ,766

2 ,385 3 ,991

3 ,276 3 ,978

4 ,175 3 ,976

5 ,337 3 ,766

6 ,292 3 ,886

7 ,385 3 ,991

8 ,314 3 ,926

102

Anova de un Factor


Suma de cuadrados


F Sig.

Inter-grupos 25,625 7 3,661 2,440 ,066

Intra-grupos 24,000 16 1,500

Total 49,625 23

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Asparagus officinalis L. y su potencial como promotoras de