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Impact of the bioprocess on theImpact of the bioprocess on the
glycosylation glycosylation of recombinant proteinsof recombinant proteins::
the the case case of recombinant erythropoietinof recombinant erythropoietin
Laura A. Palomares
Departamento de Medicina Molecular yBioprocesos
Instituto de Biotecnología
Universidad Nacional Autónoma de México
Sistemas protSistemas proteicos eicos multiméricosmultiméricos
Ensamblaje-desensamblajeIn vitro
Cuantificación y caracterización
Estrategias de purificación
Construcción de vectores
Estrategias racionales de producción
Funcionalización
Genotipificación
PPV RotavirusVacunas
Nanomateriales
Vectores viralesVAA-2
Terapia génica
HA Virus de la influenza
Vacuna
HOY…
1. Las glicoproteínas
2. La N-glicosilación de proteínas
3. Factores que determinan el patrón de glcosilación de proteínas recombinantes
• Sistema de expresión
• El bioproceso
4. Ejemplos:
• Alcalino fosfatasa
• Eritropoyetina
Importancia de las glicoproteínas• ~ 50% proteínas humanas están glicosiladas
• Biofarmacéuticos para terapia humana> 165 aprobados> 500 en pruebas clínicasMercado total > USD $ 50,000 X 106
Crecimiento anual > 20%~ 70 % en pruebas clínicas son glicoproteínas
• Grupo principal:Anticuerpos monoclonales19 en el mercado> 370 en desarrollo
Hepatitis!
Cáncer!
Deficiencia de hGH!
Diabetes !
Infarto al miocardio!
Hemofilia!
Medicamentos recombinantesy su aplicación
0
25
50
75
100
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15
19
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20
03
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04
Acumulados
Aprobados por año
Med
icam
ento
s re
c.ap
rob
ado
s ac
um
ula
do
s
Med
icam
ento
s re
c.ap
rob
ado
s p
or
año
Tabla 1. Las proteínas recombinantes farmacéuticas de más venta en el mundo son
glicoproteínas. Las glicoproteínas se muestran en negrillas.
Proteína Marca registrada Ventas mundiales 2004
(millones de USD)
Eritropoyetina Bioyetin, Epogen, Procrit,
Eprex*
4,700
Maba vs CD20 Rituxan 2,989
Maba vs TNF
b Remicade 2,891
Darbopoyetina Aranesp 2,473
Insulina Glinux, Novolin, Humulin* 2,097
Maba vs receptor TNF
b Enbrel 1,800
G-CSFc pegilado Neulasta 1,700
Interferon -1a Avonex 1,417
Maba vs receptorHER2 Herceptin 1,279
G-CSFc Filatil, Neupogen 1,180
Insulina LisPro Humalog 1,102
Interferon -1a Emaxem, Rebif 1,091
Interferon -1b Urbieta, Betaseron 1,057
Insulina glarginina Lantus 1,053
Interferon -2a pegilado Pegasys 1,000
Maba vs RSV
d Synagis 943
* Algunas de las marcas comerciales existentes
a. Anticuerpo monoclonal.
b. Factor de necrosis tumoral.
c. Factor estimulador de granulocitos
d. Virus sincitial respiratorio Palomares y Ramírez, 2007
La La glicosilaciónglicosilación
• Modificación postraduccional
• Oligosacárido unido a un aminoácido
• O-glicosilación: unión a OH- de Ser/Thr
• C-glicosilación: unión a C2 de Trp
•• N-glicosilaciónN-glicosilación: unión a amida de Asn en
secuencia Asn-Xaa-Ser/Thr, Xaa ! Pro
La La glicosilación glicosilación de de proteproteínasínas
GP120 del HIV
GP120 del HIV
Reconocimiento específico• Reconocimiento endógeno (propio)
Vida media en el torrente sanguíneo;Tráfico intercelular; Recambio de moléculas
• Reconocimiento exógeno (ajeno)Bacterias, virus, toxinas; Antigenicidad
Funciones estructurales y regulatorias• Correcto plegamiento y transporte• Estabilidad (Temp., pH, etc.)• Solubilidad• Funcionalidad
actividad específica, potencia• Estructura• Reconocimiento por anticuerpos• Resistencia/reconocimiento por proteasas
¿Por qu¿Por qué es necesaria la é es necesaria la glicosilaciónglicosilación??
Muchas proteínas terapéuticas requieren una glicosilación auténticaMuchas proteínas terapéuticas requieren una glicosilación auténtica
Tipos Tipos de de N-glicanos N-glicanos y y su nomenclaturasu nomenclatura
ALTOS EN MANOSA HÍBRIDOS COMPLEJOS
PAUCIMANOSA
Núcleo deN,N"-diacetilquitobiosa
(uniones ! (1-4)
Pentasacáridocomún
La
L
a N
-gli
co
sil
ac
ión
N-g
lic
os
ila
ció
n
P
P
mRNA
P
PP
Calnexina
Calreticulina
Retículo endoplásmico
Trans Golgi
1 2 3
4
5
6 7
8
910
111213
14
12
17
17
14
15
15
15
15
16Fuc
Man
NAcGlc
Gal
Sia
Glu
13
Medial Golgi
Cis Golgi
Palomares y Ramírez, 2007
N-glicosilaciónN-glicosilación:: ModificaciModificación cotraduccionalón cotraduccional
Calnexina
Calreticulina
PP
mRNA
PP
Retículo endoplásmico
Oligosacaril
transferasa
Monosacaril
transferasa
Monosacaril
transferasa
Flipasa ATP -
dependiente
P
Fuc
Man
NAcGlc
Gal
Glc
Palomares y Ramírez, 2007
Procesamiento de glicanos en el Golgi
1 52
78
7
3
4
10
6
9
78
8
11
78
Cis Golgi
Medial Golgi
Trans Golgi
Azúcar + ATP Azúcar-P Azúcar NDPNTP PPi
Azúcar(A)-NDP Azúcar(B)- NDP
UDP-GlucosaUDP-GalactosaUDP-N-acetilglucosaminaGDP-FucosaCMP-Acido siálico
Fuc
Man
NAcGlc
Gal
Sial Palomares y Ramírez, 2007
N-glicosilación
NeuNAc-9-P
ManNAc
ManNAc-6-P
UDP-GlcNAc
ATP
PEP
CDP
CMP
Citidina
Transp
Man
Man-6-P
Man-1-P
GDP-Man
ATP
GTP
AcCoA
Gluc
Fru-6-P
GlcN-6-P
GlcNAc-6-P
GlcNAc-1-P
UTP
NH4+
Transp
NeuNAc CTP
CMP-NeuNAc
Núcleo
ManN
Citoplasma
NTP= cualquier nucleótido
A.Golgi
Celular Actividades enzimáticasEstado fisiológico=> Condición y Tipo de Célula
Entorno Disponibilidad de precursoresEstado energéticoGlicosidasas extracelularesInhibidores/ tóxicos=> Condición y Modo de Cultivo
Proteína SecuenciaEstructura
Factores que potencialmente afectanFactores que potencialmente afectanla glicosilaciónla glicosilación
Selección del sistema de expresión
BuenaExcelenteMuy buenaMuy buenaSeguridad
ExcelenteMuy buenaMuy buenaBajaExcreción osecreción
Muy bajaMuy bajaBajaBaja-aceptable
Degradaciónproteolítica
SiSi*NoNoGlicosilacióncompleja
SiSiSiNoGlicosilaciónsimple
ExcelenteMuy bueno,excelente
AdecuadoOcasionalPlegamiento deproteína
AltoAltoMuy bajoMuy bajoCosto del medio
Bajo - buenoMuy bueno-excellente
Muy bueno,excelente
ExcelenteNivel de expresión
SuficienteSuficienteMuy buenoExcelenteAlta µ
MamíferosInsectosP. pastorisE. coliCaracterística
* Diferente a células de mamífero Adaptedo de Shuler y Kargi, 2002
Rutas Rutas de de N-glicosilación predominantes N-glicosilación predominantes enendiferentes taxadiferentes taxa
Fuc
Man
NAcGlc
Gal
Sia
Glu
Xil
Levaduras
"6"3
Hongos
filamentosos
Vertebrados
"6"3
Insectos Plantas
"3
Productividad vs Cantidad
Productividad
Calidad
Células de mamífero
Bacterias
Levaduras
Animales transgénicos
Células de insecto
Palomares et al., 2003; Lipscomb et al., 2005
ComparaciComparación entre células CHO y de insectoón entre células CHO y de insecto
Concentración máxima de SeAP
producida por células CHO: 14 mg/L
producida por células de insecto: 240 mg/L
SeAP células insecto
SeAP células CHO= 17 !!!!!17 !!!!!
Pa
uc
i-
ma
no
se
Alt
os
en
ma
no
sa
Hib
rid
os
G0
G1
G2
G4
G3
Sia
lila
do
s
0
20
40
60
80
High Five
CHO
Ab
un
da
nc
ia,
%
EjemploEjemplo: : Anticuerpos Anticuerpos ((IgGIgG))
! N-glicosilación y función efectora del Ac
" Lisis mediada por complemento
" Unión y activación de receptores Fc#
Serrato et al., 2004, Instituto Bioclón, Grupo Alagón
0
10
20
30
40
50
60
Caballo
Ratón
Ab
un
da
nc
ia,
%
Pa
uc
ima
n
Alt
a m
an
G0
G1
G2
G3
Sia
l
• Determina las características del producto recombinante
• Determina el proceso de producción
El El hospederohospedero
REGLA
Utilizar el sistema más simple que cumpla con todos los
requisitos del producto deseado
Las Las células células CHOCHO
Células de ovario de hamster chino
# Las células animales más utilizadas para la producción de
proteínas recombinantes a nivel industrial
Patrón de glicosilación por hámsters
• Tipo de siálico (glicolilneuramínico vs. acetil neuramínico)
• Galactosa en enlace !1-3 en lugar de !1-4
• Alta fucosilación de proteínas
• No bisectados
Estructuras potencialmente inmunogénicas en humanos
Producción de Glicoproteínas Terapéuticaspor Cultivo de Células Animales
• Estrés hidrodinámico
– diseño biorreactor
– parámetros operación
• Modo de operación
– lote, lote-alim., perfusión
• Control Medio Ambiente
– glucosa > lactato
– glutamina > amonio
• Precursores
– nucleótidos azúcares
• Tiempo residencia-cosecha
• Inhibidores glicosidasas
Importancia Importancia del del bioproceso sobre bioproceso sobre el el patrpatrón ón dede
glicosilación glicosilación de de proteínas proteínas recombinantesrecombinantesCondición Causa Ref.
____________________________________________________________________________________________
Limitación de glucosa Glicosilación deficiente (interferon #) 1
Presencia/ausencia suplementos (SFB) Cambios en la microheterogeneidad, contenido 1, 2
de glicanos concentración de exoglicosidasas
pH menor a 6.9 o mayor a 8.2 Disminuye procesamiento 3
Baja temperatura (33 ºC) Incrementa ocupación de sitios N-glicosilación (tPA) 4
Baja temperatura Aumento en sialilación (alcalino fosfatasa) 5
Acumulación de amonio Disminuye galactosilación y sialilación (AcM) 6, 7
Oxígeno disuelto menor a 10% Disminuye galactosilación y actividad sialilT (AcM) 8
Gradientes de TOD > 7000 s Galactosilación y sialilación afectadas (AcM) 9
Osmolaridad > 400 mOsm/Kg Disminuye galactosilación (AcM) 10
Tiempo de cultivo Afecta la ocupación de sitios de N-glicosilación (tPA) 4
Modo cultivo:perfusión, lote-alimentado Afecta sialilación (alcalino fosfatasa) 11
Adición de N-acetilmanosamina Aumento de sialilación de células CHO e insecto 12, 13
Tiempo de cultivo Liberación exoglicosidasas y reducción sialilación 14
(antitrombina)
____________________________________________________________________________________________Referencias. 1) Xie et al., 1997. 2) Serrato et al., 2007. 3) Borys et al. 1993. 4) Andersen et al., 2000. 5) Kaufmann et al., 2001.
6) Gawlitzek et al., 2000. 7) Yang y Butler, 2000. 8) Kunkel et al., 1998. 9) Serrato et al., 2004. 10) Schmelzer y Miller 2002.
11) Lipscomb et al., 2005. 12) Gu y Wang, 1998. 13) Lawrence et al., 2000. 14) Munzert et al., 1997.
Tomado de Palomares et al., 2004 y Palomares y Ramírez, 2007
Perfusión discontinuaLote-alimentado cíclico
Efecto del Modo de Cultivo en la GlicosilaciEfecto del Modo de Cultivo en la Glicosilaciónón
ProducciProducción de Alcalino Fosfatasa en Células CHOón de Alcalino Fosfatasa en Células CHOLote
Alcalino fosfatasa (trunca)
Lipscomb et al., 2005
Characterizing N-glycosylationCharacterizing N-glycosylation
Weak ion exchange HPLCSialic acid content
0
25
50
75
100
0 5 10 15 20 25
Time, min
Rela
tive fl
uore
scence
units
S0
S1
S2
S3
S4
2-D HPLCStructure confirmation
0
25
50
75
100
0 5 10 15 20 25
Time, min
0
10
20
30
10 11 12 13 14 15 16 17
Glucose units
Weak ion exchange
Normal phase
Normal phase HPLC + exoglycosidasedigestionsStructure identification
0
10
20
30
40
50
60
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
Glucose units
Sample
Galactosidase digestion
Rela
tive fl
uore
scence
units
Rela
tive fl
uore
scence
units
Rela
tive fl
uore
scence
units
ProducciProducción de alcalino ón de alcalino fosfatasa fosfatasa en células CHOen células CHO
Lipscomb et al., 2005
Perfusión
Discontinua
Lote-
alimentado
cíclico
Lote
1.04 ± 0.053.9 ± 0.341.6 ± 0.6
Rendimiento
equivalente volumen-
día, mg
0.13 ± 0.050.1 ± 0.060.21 ± 0.04Productividad
específica, pg/cel d
0.18 ± 0.040.25 ± 0.030.79 ± 0.2!max, d-1
3.3 ± 0.41.5 ± 0.22.3 ± 0.1Xv max, x106 cel/mL
0
20
40
60
80
Perfusión
Lote alimentado
Lote
0
25
50
75
100
No sialidados Parcialmente sial. Totalmente sial.
Perfusión
Lote-alimentado
Lote
Ab
un
da
ncia
re
lativa,
%
Ab
un
da
ncia
re
lativa,
%
0
25
50
75
100
Lote Lote alimentado Perfusion
Ocu
pa
ció
n d
e s
itio
s,
%
No amplificado
1.6 ± 0.613.7 ± 2.5Rendimiento equivalente
volumen-día, mg
0.21 ± 0.041.9 ± 0.1Productividad específica,
pg/cel d
0.79 ± 0.20.34 ± 0.09!max, d-1
2.3 ± 0.11.1 ± 0.2Xv max, x106 cel/mL
Amplificado
0
25
50
75
100
No sialidado Parcialmente sial. Totalmente sial.
Lote amplificadas
Lote
Ab
un
da
ncia
Re
lativa
, %
AmplificaciAmplificación de Plásmidoón de Plásmido
No amplificado
Amplificado
0
10
20
30
40
50
Lote amplificadas
Lote
Ab
un
da
ncia
Re
lativa
, % No amplificado
Amplificado
No sialidados Totalmente sial.Parcial sial
Lipscomb et al., 2005
16.6 ± 3.413.4 ± 2.48.3 ± 5.66.8 ± 0.4Totalmente sialidadas
Perfusión
discontinua
Lote alimentado
cíclicoLote
87.9 ± 5.835.6 ± 9.517.9 ± 113.8 ± 1.9% de ocupación de sitios
34.4 ± 12.718.2 ± 0.89.5 ± 5.26.4 ± 0.8Parcialmente sialidadas
49.1 ± 16.168.4 ± 3.282.4 ± 10.886.9 ± 1.2Formas no sialidadas
Contenido de ácido siálico
7.2 ± 0.68.2 ± 0.65.6 ± 0.114.2 ± 1.6Tetraantenarias, %
61.4 ± 10.550.6 ± 1.437.0 ± 6.341.2 ± 2.9Triantenarias, %
25.2 ± 8.332.6 ± 2.329.0 ± 4.024.8 ± 1.2Biantenarias, %
Formas complejas
6.2 ± 2.88.6 ± 2.128.0 ± 2.219.9 ± 0.57Manosa terminal, %
Perfil de N-glicosilación
1.04 ± 0.053.9 ± 0.341.6 ± 0.613.7 ± 2.5Rendimiento volumen-día
equivalente, mg
0.13 ± 0.050.1 ± 0.060.21 ± 0.041.9 ± 0.1Productividad específica,
pg/cel d
0.18 ± 0.040.25 ± 0.030.79 ± 0.20.34 ± 0.09!max, d-1
3.3 ± 0.41.5 ± 0.22.3 ± 0.11.1 ± 0.2Xv max, x106 cel/mL
No amplificadasAmplificadas
Lote
¿¿Calidad vs cantidadCalidad vs cantidad??¿¿AcercamientoAcercamiento molecular molecular vs acercamiento operativo vs acercamiento operativo??
ProducciónProducción de de SeAP SeAP en en células células CHO CHO
Lipscomb et al., 2005
Promotor del virus mamario de ratón (receptor glucocorticoide)1x10-6 M metrotexatoInductor 1x10-6 M dexametasona
Producción Producción de de SeAP SeAP en en células células CHOCHO
Calidad Perfusión > Lote alimentado > Lote
• Modo de cultivo afecta sustancialmente:Perfil de glicanos% de ocupación de sitios de N-glicosilación(mayor sialidación y ocupación en perfusión)
¿Por qué?# µ baja# Estado pseudoestacionario# Substratos clave abundantes# Subproductos tóxicos bajos# Mayor viabilidad y menor lisis y muerte celular# Menor concentración de exoglicosidasas
• Amplificación de copias del gen heterólogo:aumento 10X productividad específica
No satura capacidad de glicosilación de línea celular
• Producida principalmente en riñones
• Inducida por hipoxia
• Se une a receptores en UFB-E y UFC-E
• Activa ciclo celular en células blanco
• Estimula proliferación, diferenciación y maduración
de células eritroides
• USOS: Anemia crónica por falla renal, por
tratamiento contra SIDA, por quimioterapia;
transfusión sanguínea alogénica en cirugía
EritropoyetinaEritropoyetina:: La La reinareina
Tabla 1. Las proteínas recombinantes farmacéuticas de más venta en el mundo son
glicoproteínas. Las glicoproteínas se muestran en negrillas.
Proteína Marca registrada Ventas mundiales 2004
(millones de USD)
Eritropoyetina Bioyetin, Epogen, Procrit,
Eprex*
4,700
Maba vs CD20 Rituxan 2,989
Maba vs TNF
b Remicade 2,891
Darbopoyetina Aranesp 2,473
Insulina Glinux, Novolin, Humulin* 2,097
Maba vs receptor TNF
b Enbrel 1,800
G-CSFc pegilado Neulasta 1,700
Interferon -1a Avonex 1,417
Maba vs receptorHER2 Herceptin 1,279
G-CSFc Filatil, Neupogen 1,180
Insulina LisPro Humalog 1,102
Interferon -1a Emaxem, Rebif 1,091
Interferon -1b Urbieta, Betaseron 1,057
Insulina glarginina Lantus 1,053
Interferon -2a pegilado Pegasys 1,000
Maba vs RSV
d Synagis 943
* Algunas de las marcas comerciales existentes
a. Anticuerpo monoclonal.
b. Factor de necrosis tumoral.
c. Factor estimulador de granulocitos
d. Virus sincitial respiratorio
• 165 aminoácidos; 34 - 39 kDa• Ac. siálicos indispensables para actividad
biológica• 2 puentes S-S• Glicosilación
> 31% alfa; 24% beta N- (asn 24, 38, 83) O- (ser 126)• Actividad requiere glicosilación
EritropoyetinaEritropoyetina:: La La reinareina
• N-glicosilación en Asn 38 y 83 se requiere para secreción de EPO
• El tiempo de circulación de EPO depende del contenido de ácidos
siálicos (galactosas expuestas se unen a lectinas hepáticas)
• La estructura del oligosacárido (número de antenas) afectan la
actividad in vivo (tetraantenarios más activos que biantenarios) (Carga
de la molécula)
ConclusionsConclusions! Higher content of G4 and S4 glycans in EPO fromserum-free vs serum-containing media
! Suspended cultures in SFM were the most productiveand had a higher content of totally sialylated G4 glycans
! EPO from controlled, instrumented bioreactors hadhigher content of totally sialylated glycans thannon-controlled cultures
! A higher content of S4 glycans occurred at the stationaryphase of perfusion cultures
! Decreased temperature increased the content of G4glycans
! EPO glycosylation profile can be controlled by thepurification protocol
! Suitable up-stream and down-stream process design toimprove EPO productivity and quality
Gracias…
Vanessa Hernández, Karin Levy, Javier Dorantes
Apoyo económico: CONACyT, DGAPA-UNAM,Instituto Bioclón, Probiomed