AUTOA�TITESTEK VIZSGÁLATAÉS KLI�IKAI ÉRTÉKELÉSE

Gergely Péter dr

Semmelweis Egyetem

Központi Immunológiai

Laboratórium

Immunológiai Laboratóriumi vizsgálatok(WHO/IUIS/AACI, 1993)

ImmunglobulinokAntitestek• autoantitestek• antibakteriális stb. antitestekCytokinek és receptoraikEffektorsejtek és termékeikKomplementAkut fázis reakcióLymphocyta (CD) markerekLymphocyta funkcionális tesztekCytotoxikus tesztekPhagocyta tesztekBasophil, eosinophil funkciókImmunhisztológiaImmungenetika

Mit vár el a klinikus az autoantitest vizsgálatoktól?

1) legyen könnyen hozzáférhető (térben és időben)- a legtöbb csak néhány centrumban elérhető2) olcsó- nagyon sok teszt költséges (és a laboratóriumnak

sem éri meg)3) megbízható- ma még nagyon sok a technikai probléma4) legyen kellően informatív (specifikus és szenzitív)- a legtöbb teszt nem eléggé specifikus és/vagy

szenzitív

NÉHÁNY TECHNIKAI PROBLÉMA1. Antigén forrás

teljes antigéntisztított antigénrekombináns antigén

2. Antitest forrásteljes (IgG, IgA, IgM)tisztított (pl. csak IgG)monoklonális/poliklonális

3. TechnikaIFEIA (ELISA)blot (dot blot/ WB)

4. Reprodukálhatóságinterobserver (laboratóriumok között)intraobserver (laboratóriumon belül)

INFORMÁCIÓS INDEXEK

Pozitív betegek számaSzenzitivitás = -----------------------------

Összes beteg száma

�egatív betegek számaSpecificitás = --------------------------------

Összes nem-beteg (kontroll) száma

Pozitív prediktív érték (PPV) = Annak valószínűsége,hogy pozitivitás esetén az adott betegség fennáll

�egatív prediktív érték (�PV) = Annak valószínűsége,hogy negativitás esetén a betegség nem áll fenn

Az indexek kiszámítása:

TP T�SZE�ZITIVITÁS = --------- SPECIFICITÁS = ---------

TP + F� T� + FP

TP T�PPV = --------- �PV = ----------

TP + FP F� + T�

-----------------------------TP = Pozitív esetek számaFP = Fals-pozitív esetek számaF� = Fals-negatív esetek számaT� = �egatív esetek száma

100%

100%100 - specificitás

AUC

Receiver Operating Characteristic (ROC) görbe(a specificitás & szenzitivitás összefüggése)

Különféle tesztek diagnosztikus értéke az SLE aktivitás megítéséban (a tesztek specificitása és szenzitivitása különböző cut-off értékek mellett)

Teszt Cut-off Specificitás Szenzitivitás

Anti-DNS 56 U/ml 85% 57%35 79% 70%26 50% 77%

C3 0.71 g/l 68% 46%0.84 60% 57%0.101 49% 77%

C4 35 % 80% 42%57 63% 54%74 51% 79%

1.1. AzAz antinukleáris antitest (ANA) antinukleáris antitest (ANA) GGyüjtőfogalom, mely nagyon sokféle specificitású antitestetjelent. Az ANA sokféle szisztémás (és nem szisztémás) autoimmun betegségben, tumorokban, gyulladásokban is pozitív lehet. Az 1:40 titerben észlelt pozitivitás sok esetben önmagában nem jelent betegséget, de az 1:160 titerben pozitív lelet mindenképpen további diagnosztikai lépéseket indokol. Az ANA vizsgálat elvégzendő szisztémás autoimmun betegségek, SLE és rokon kórképek, ill. autoimmun hepatitis gyanúja esetén, valamint JIA diagnózisa esetén differenciáldiagnosztikai és prognosztikai céllal.Mintázat: a) homogén (a DNS/hiszton elleni antitesteket jelzi és gyakori SLE-ben), b) perifériás (natív DNS elleni anti-testeket jelzi és SLE-ben fordul elő), c) pettyes/granuláris (ez a leggyakoribb és ENA-ra: pl. Sm, RNP, SS-A/B-re, stb. utal), d) nucleolaris (elsősorban sclerodermában fordul elő). A mintázat csupán orientációra szolgál, nem diagnózisra!

Az ANA meghatározásMiért IIF módszerrel? miért HEp-2 sejten?

Az alábbi információk nyerhetők:

1. ANA pozitivitás/titer (≥1:160)

2. kromatin pozitivitás/negativitás,

kromatin festődés (pl. anti-centromer)

3. a mitózisban szepet játszó különféle

proteinek elleni antitestek kimutatása

4. ANA mintázat (pl. homogén, pettyes, stb)

5. különleges ANA formák (pl. PCNA, CENP-F)

6. citoplazma mintázat (mitokondrium, riboszóma, aktin, aminoacil tRNS

szintetáz, stb)

7. citoszkeleton festődés

ANA mintázatok: a) homogén, b) perifériás, c) granuláris, d) nucleolaris

a) homogén b) perifériás

c) granuláris (pettyes) d) nucleolaris

POZITÍV ANA KÜLÖNFÉLE BETEGSÉGEKBEN(%-ban)

SLE 80-100Gyógyszer-indukálta LE 70MCTD 100Sjögren syndroma 70Felty syndroma 70-100PSS 75-85PM/DM 30RA 15-30CAH 40-60Tüdőfibrosis 20Tuberculosis 50Neoplasia 10Kontroll <5

02468

101214161820

-5 -10 -15 -20 -40 >40

Pozitív ANA titer egészséges gyermekekben és felnőttekben

(HEp-2, 1:32 hígítás)

korcsoportok

%

Craig et al, J Rheumatol 26:914, 1999

0102030405060708090

100

1 2 3 4 5 6 7

SLE

Egyéb

Kontroll

% pozitiv

IF A�A ELISA

ANA pozitivitás SLE-ben, egyéb autoimmunbetegségekben és kontrollokban

Emlen & �eill, Arthritis Rheum 40:1612, 1997

0

20

40

60

80

100

I II III IV V VI VII IX

Szenzitivitás

Specificitás

Anti-DNS EIA kitek szenzitivitása és specificitása

%

Kit �r.

Tan et al. Arthritis Rheum 42:455, 1999

egyezés %

70

72

74

76

78

80

82

IIF-1 IIF-2 1-2

egyezés %

kappa

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

IIF-1 IIF-2 1-2

kappa

ANA vizsgálatok összehasonlítása

IIF: indirekt immunfloreszcencia (HEp2 sejteken)1 és 2: ELISA teljes HEp-2 sejtmag bevonaton

Kappa koefficiens (Cohen):

>0,2 gyenge egyezés

0,2-0,4 mérsékelt egyezés

0,4-0,6 közepes egyezés

0,6-0,8 jó egyezés

0,8-1,0 nagyon jó egyezés

Az ANA nagyon sokféle antitestet foglal magába,a legfontosabbak:

• Anti-(natív) DNS antitest• Hiszton antitest• Centromer antitest• ENA (extrahálható nukleáris antigének elleni

antitestek)• PCNA antitest• Ku antitest• Kromatin elleni antitestek

Továbbiak: coilin, DEK, egyesláncú-DNS, IFI 16,

Mi-2, nucleosoma, nucleoláris antitestek

ANA pozitivitás esetén az antitest típusát meg kell határozni!

Algoritmus az ANA további vizsgálatára(Golightly & Golightly, 2002)

AntiAnti--(natív) DNS antitest: (natív) DNS antitest: (kettősszálú DNS elleni antitest) (kettősszálú DNS elleni antitest) az SLE diagnózisához szükséges, és a betegség monitorozásárais alkalmas. Negativitása gyakorlatilag kizárja az aktív SLE-t. A jelentősen magasabb érték nagyon nagy valószínűséggel SLE-tjelez. A 100-at meghaladó érték általában betegségaktivitás mellett szól.Hiszton antitest: (H1, H2, H3, H4 elleni antitestek) nagyon sok szisztémás autoimmun betegségben (SLE, gyógyszer-indukálta lupus, RA, JIA , PSS , stb), előfordul. Diagnosztikai jelentősége a gyógyszer-indukálta lupus diagnózisa.

Crithidia luciliae

teszt

A nucleosoma szerkezete

A nucleosoma elleni antitestek és a natív D�S elleni antitestek kapcsolata SLE-ben

Paraméter Aktív SLE Inaktív SLE Összesen

1 Anti-DNS +, anti-Nuc + 5 42 47

2 Anti-DNS-,anti-Nuc + 4 18 22

3 Anti-DNS +,anti-Nuc - 0 4 4

4 Anti-DNS -,anti-Nuc - 0 41 41

Összesen 9 105 114

Centromer antitest: (60 kDa centromer protein elleni antitest)

elsősorban sclerodermában (CREST szindrómában) ritkábban PBC-

ben fordul elő.

Diagnosztikai jelentősége: scleroderma gyanúja,

differenciáldiagnózisa (CREST vs. PSS), Raynaud syndroma

differenciáldiagnózisa – a pozitivitás a scleroderma későbbi

kialakulását jelzi, ill. PBC prognosztikája – a pozitív lelet a

scleroderma egyidejű fennállására utal.

Jellegzetes kromatin festődés

ENA (extrahálható nukleáris antigének elleni antitestek):

1. SS-A (Ro) és SS-B (La) – nonhiszton nukleoproteinek

2. Scl-70 – DNS topoizomeráz I

3. Jo-1 – (aminoacil (hisztidil) tRNS szintetáz)

4. RNP (U1-RNP) - különféle uridinban gazdag

nukleoproteinek

5. Sm – 29 kDa nukleoprotein

6. Egyéb: PCNA, Ku, Mi-2, PMScl, PM-1

SS-A (Ro) és SS-B (La) antitestek:Diagnosztikai jelentősége: primer vagy szekunder Sjögren syndroma (SS), SLE, SCLE, neonatalis lupus gyanúja ill. diagnózisa esetén van. Az SS-A és B nagyon gyakran együtt fordul elő.

Scl-70 antitest : PSS-ben fordul elő, és rossz prognosztikai faktor. A Raynaudos betegek egy része pozitív, ezekben a PSS kialakulásának kockázata nagy.

Jo-1 antitest: myositisben (anti-szintetáz szindrómában) fordul elő. Diagnosztikai jelentősége: myositis (anti-szintetáz syndroma) diagnózisa/differenciáldiagnózisa, ismeretlen eredetű fibrotizáló alveolitis differenciáldiagnosztikája. Ha a Jo-1 negatívmyositisban alveolitis van, a HEp-2 sejtek cytoplazmájának mintázata diagnosztikai jelentőségű lehet.

ENA (folytatás)ENA (folytatás)

(U1)-RNP antitest: MCTD-ben diagnosztikai kritérium, SLE-ben gyakran pozitív és elsősorban a bőr-nyálkahártya laesiokkalfügg össze, PSS-ben kevésbé gyakori és a tüdőfibrosissalkapcsolatos..Sm antitest: SLE-ben diagnosztikai és prognosztikai marker (CNS, vese, ill. bőr involvatio előfordulását jelzi).

További ENA-k: PCNA, Ku, MI-2, PMScl, PM-1, stb.

Anti szintetáz antitestek (a HEp-2 sejtekcitoplazmájában, ANA negatív)

PCNA („proliferating cell nuclear antigen”) antitest:SLE-re specifikus. A PCNA+ betegeknek vese és CNSinvolvatioja van. Diagnosztikai jelentősége: SLE gyanúja (kivált anti-DNS és Sm negativitás esetén) van.

Ku antitest: az antigének: különféle DNS-kötő/dependens non-hiszton proteinek (valójában nem ANA).Az antitestek polymyositis/scleroderma overlap szindrómáiban fordulnak elő.

Riboszomális proteinek elleni antitestek: szintén gyüjtőnév, szisztémás autoimmun betegségekben, elsősorban SLE-benfordulnak elő.

riboszóma

elleni antitestek PCNA

kromatin elleni antitestek

(a nyíl az osztódó sejt kromatin

pozitivitását mutatja)

ANA pozitív, kromatin

negatív

(a kromatin nem festődik )

Citoplazma elleni antitestek: pl. AMA, Jo-1Citoszkeleton elleni antitestek: pl. cytokeratin, actin, tropomyosin, vimentin, vinculin, stb.

AMA actin

vimentin

2. Anti-neutrofil citoplazma antitestek (ANCA): neutrofilek cito-plazmájában lévő antigének gyüjtőneve. Fontosabb formái: proteináz 3 (PR3), myeloperoxidáz (MPO), elasztáz, laktoferrin, baktericid permeabilitást fokozó protein (BPI). A festődés mintázata háromféle: citoplazma (c), perinuclearis (p) és atípusos lehet. A c-ANCA mintázat leggyakrabban a PR3 és BPI, a p-ANCA mintázat pedig leggyakrabban a MPO jelenlétére utal, deilyet ad az elasztáz és laktoferrin is. A BPI gyakran atípusos festődést ad.

c-ANCA p-ANCA

Az ANCA screen indikációi: ANCA pozitív vasculitisek (Wegener granulomatosis, mikroszkopikus polyangiitis) gyanúja, nephritisek differenciáldiagnosztikája, krónikus gyulladásos bélbetegség (IBD) gyanúja, primer sclerotizáló cholangitis gyanúja, vérzéses alveolitis differenciál-diagnosztikája.

Proteináz 3 (PR3) antitest: nagyon specifikus Wegener granulomatosisra (>95%), még az atípusos formákra (pl. izolált perifériás neuritis, idiopathiás necrotizáló nephritis, stb) is. Gyakran pozitÍv IBD-ben is. Előfordul még egyéb vasculitisekben is.Myeloperoxidáz (MPO) antitest: Előfordulás: mikroszkópikus polyangiitisben (60-80%), egyéb eredetű focalis necrotizáló glomerulonephritisben, gyorsprogressziójú glomerulo-nephritisekben, ritkán Wegener granulomatosisban, Churg-Strauss syndromában. Goodpasture syndromában (30-40%), illetve a szisztémás autoimmun betegségek (RA, SLE, stb) bizonyos százalékában.

3. Antifoszfolipid antitestek: Szintén gyüjtőfogalom, különféle anionos és neutrális foszfo-lipidek, illetve az ezeket kötő különféle glikoproteinek elleni antitestek. A legfontosabb formái: a cardiolipin, ill. a foszfatidilszerin elleni antitestek, valamint a béta-2-glikoprotein I és a protrombin elleni antitestek – melyeket enzim immunesszével (EIA) mérünk, illetve a lupus antikoaguláns (LA), és. hexagonális foszfolipid teszt, melyeket funkcionális tesztben mérünk.Diagnosztikai jelentőség: Az antitestek a primer és szekunderantifoszfolipid syndromában (APS) fordulnak elő. A tesztek (anti-cardiolipin + anti-β2GPI + LA) elvégzendők: primer vagy szekunder APS gyanúja esetén, SLE-ben a thrombosisveszély rizikójának felmérésére, valamint ismeretlen thrombopeniában, SLE gyanúja esetén (diagnosztikai kritérium), esetleg az APS kezelés monitorozására.

4. Szervspecifikus antitestek:Az antimitokondriális antitest (AMA) - pozitivitása primer biliáris cirrhosisban (PBC) diagnosztikus értékű, de ritkán a teszt pozitív lehet egyéb autoimmun (u.n. overlap) hepatitisben is.A símaizom elleni antitest (SMA) PBC-ben, autoimmun hepatitisben szinte mindig pozitív, de számos (vírusos, alkoholos) májbetegségben is lehet pozitív, ezért diagnosztikus értéke csekély. Az ANA-val együtt az autoimmun hepatitis osztályozására használható: az 1. típusban pozitív.Az anti-mikroszómális antitest (LKM-1) krónikus hepatitisekbenfordul elő, a 2. típusú autoimmun hepatitisre jellemző.A májspecifikus proteinek elleni antitestek szintén a 2. típusú autoimmun hepatitisre jellemzők.Az anti-reticulin antitestek jelenléte felveti coeliakia gyanúját.A parietális sejt elleni antitestek autoimmun eredetű krónikusatrophiás gastritisre (ill. idiopathiás anaemia pernicosára) jellemzőek.

(patkány vese, ill. gyomor metszeten)

AMA

anti-reticulin PCAPCAanti-reticulin

SMA

A pajzsmirígy elleni antitestek: az anti-thyreoglobulin és anti-microsomális antitestek (más néven anti-peroxidáz, TPO antitestek) autoimmun pajzsmirígy betegségekben (Hashimoto thyreoiditisben és idiopathiás myxoedemában) diagnosztikus értékűek. Gyakran pozitívak, habár mennyiségük kisebb Graves kórban és néha pajzsmirígy adenocarcinomában is.

A mellékvese (kéreg) elleni antitestek autoimmun (idiopathiás) Addison kórban mutathatók ki. A diagnózishoz nem szükségesek, csak a betegség kóreredetére utalnak.

Az anti-glomeruláris bazálismembrán (GBM) antitestGoodpasture syndromában (illetve anti GBM nephritisekben) pozitív és egyben diagnosztikus értékű.

Mellékvese elleni antitest, Anti-GBM antitest

Anti-TG Anti-TPO

Majom pajzsmirígy, mellékvese és vese metszet

Coeliakia (gluten szenzitivitás) diagnosztika:Ezek az antitestek a coeliakia (gluten-szenzitív enteropathia) és a vele rokon bőrbetegségek (pl. dermatitis herpetiformis) diagnózisára, ill. monitorozására szolgálnak. Az anti retikulin antitest kevésbé specifikus, elsősorban szűrővizsgálatra szolgál. A gliadin, endomysium, illetve szöveti transzglutamináz (tTG) elleni antitestek közül az utóbbiak a leginkább specifikusak. Az IgA tTG magas szintje önmagában jelzi a coeliakia meglétét.Az IgG tTG meghatározására IgA hiányban van szükség.

Endomysium elleniantitestek

Acetilkolin receptor elleni antitestek:

Myasthenia gravisban a betegség kialakulásáért felelős antitestek. Ennek

ellenére nem mindig sikerül az antitesteket kimutatni, kimutathatóságuk a

betegség súlyosságától is függ.

Hámantigének elleni antitestek:

A desmosoma (desmoglein 1 és 3) elleni antitestek pemphigus vulgarisban

és foliaceusban fordulnak elő. Az epidermalis basalmembrán elleni antitestek

bullosus pemphigoidban és rokon betegségekben (pl. dermatitis

herpetiformisban) észlelhetők.

Intercelluláris festődés pemphigusban EBM festődés pemphigoidban

5. A rheumatoid faktor (RF) pozitív rheumatoid arthritisben (RA-ban) (pontosabban a betegek nagyobb részében), és egyúttal az RA-ban diagnosztikai kritérium is. Igen gyakran pozitív Sjögren syndromában és esszenciális kevert kryoglobulinaemiában, negativitása azonban nem kizáró. Az RF nagyon sok betegségben (autoimmun betegségekben, infekciókban, stb.) lehet pozitív, specificitása nagyon alacsony.

6. CCP (ciklikus citrullinált peptid) antitestRA-ra jellemző antitest, mely specifikusabb, mint az RF.A RA korai (nemspecifikus) stádiumában gyakranpozitív. A CCP pozitivitás rossz prognosztikai tényező.

POZITÍV RF KÜLÖ�FÉLE BETEGSÉGEKBE� (%-ban)

RA 50-90SLE 15-35SS 75-95PSS 20-30Kryoglobulinaemia 40-100MCTD 50-60Vírus infekciók 15-65Endocarditis 25-50Májcirrhosis 15-40Sarcoidosis 3-33Tüdőfibrosis 10-50Silicosis 30-50Neoplasia 5-25Kontroll <5

7. C1q antitest:a hypocomplementaemiás urticaria-vasculitisben (HUV)100%-ban pozitív. SLE-ben 17-58%-ban fordul elő (elsősorban veseérintettségben), szintje a betegség aktivitásával laza kapcsolatban van.Membranoproliferativ glomerulonephritisben 88%-ban fordul elő. A HUV diagnózisához szükséges vizsgálat.

Javasolt tesztek különféle autoimmun betegségekben:

SLE ANA, anti-DNS, anti-Sm, anti-CL/LA, CH50, C3, C4(neopterin, sIL-2R, SS-A, SS-B, RF, CRP)

RA RF, CRP (ANA, C3, C4)JCA RF, ANA, CRPSS SS-A, SS-B, ANA, RFPSS Scl-70, anti-centromer, ANA ( anti-(U1) RNP)MCTD ANA, anti-(U1) RNPPM/DM ANA, Jo-1^

Vasculitisek ANCA, CRP, ANA, RF, kryoglobulin

Autoimmun hepatitisek ANA, AMA, LKM-1, SMA, egyéb máj-specifikus autoantitestek, kryoglobulin

Hashimoto thyreoiditis anti-TPO, anti-TG

KONKLÚZIÓK

• Egyetlen immunológiai teszt sem helyettesíti a klinikai adatokés egyéb vizsgálatok gondos analízisét, illetve a diagnosztikusGONDOLKODÁST

• Nincs autoimmun diagnosztikus teszt panel!

• A legtöbb diagnózis a klinikum és rutin laboratóriumi tesztekalapján születik meg. Az immunológiai tesztek kb. 20%-banjárulnak hozzá a diagnózishoz.

• Csak néhány olyan teszt van, melynek megfelelő a szenzitivitásaés a specificitása (pl. az anti-DNS tesztnek SLE-ben). Ezértlegyünk óvatosak a pozitív és negatív eredményekinterpretálásakor!

• A (nem immunológus) orvosoknak is ismerniük kell a teszteket,de legalább azok interpretálását.

• Ne kérjünk fölöslegesen immunológiai laboratóriumi teszteket!