PCR-SSCP Yöntemiyle, Türk Charcot-Marie-Tooth Hastalarının

MPZ, PMP22 ve Cx32 Genlerinin Mutasyon Analizi

Ayaz Najafov, İbrahim Barış, Esra Battaloğlu

Boğazici Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü

CMT Nedir? Charcot-Marie-Tooth (CMT) = Herediter

Motor ve Duysal Nöropati (HSMN) Görülme frekansı ~ 1/2500 Distal kol ve bacak kas zayıflığı ve duysal

bozukluklar Genetiksel ve kliniksel olarak heterojen bir

hastalıktır 17 farklı gen Otozomal baskın, otozomal çekinik ve X-

linked

Gen-Hastalık

Gen Sebep Olduğu Hastalık

Myelin Protein Zero (MPZ)

CMT1B, CMT2, DSS

Peripheral Myelin Protein 22 (PMP22)

CMT1A, DSS, HNPP

Connexin 32 (Cx32) CMTX

3 genin taranması 51 hastanın subtype tanımlanması MPZ, PMP22 ve Cx32 PCR-SSCP noktasal mutasyonlar

PMP22 17p12-11.2 ~40 kb = 2 intron ve 4 ekson 160 aa / 22 kDa protein 4 transmembran bölge Miyelin proteinlerinin 5-10% Schwann hücrelerinin ER’unda anlatılıyor Farklılaşmış Schwann hücrelerinin Go fazında

devamlılığı Adhesyonda fonksiyon Noktasal mutasyonlar ve gen kopya dozu

MPZ 1q22~23 7 Kb / 6 ekson 219 aa / ~28 kDa protein 1 transmembran bölge İmmunoglobulin ailesinin üyesi Miyelin proteinlerinin 50-60% Periferik sinir miyelinin yapısı ve fonksiyonu Kültür hücrelerinde hemofilik adhesiyonu sağlıyor Diğer Schwann hücresi proteinlerinin doğru

yerlere dağıtılması

Cx32 Xq13.1 283 aa / ~32 kDa protein 2 kodlamayan (alternatif spicing ile doku-

spesifik anlatılıyor) ve 1 kodlayan ekson var

4 transmembran bölge, 1 hücreiçi ve 2 hücredışı bölge ve termini

Gap junction proteinleri ailesi Gap junctionlar’ın bozulması halinde,

önemli hücreiçi pathway’ların bozuluyor

Metotlar

Bir eksonun PCR ürünü

2% agarose gel check

SSCP boyası: Formamide, EDTA, BPB, XC

Hasta genomik DNA’sı

PCR ürünü +8% non-denaturing acrylamide:bisacrylamide (29:1) gels

16 saat oda sıcaklığında 10-15V/cm 0.6X TBE buffer

Gümüş nitrat boyaması

Sonuçlar

Sonuçlar – Dizi Analizi

Sonuçlar – Restriksiyon Analizi

Sonuçlar P126 no’lu hastada, Cx32 geninin

ikinci eksonunda, ikinci hücredışı bölgesini etkileyen hemizigot 556 GA 186 glutaminelysine mutasyonu bulundu.

P180 no’lu hastanın Cx32 geninde yeni mutasyon çeşidi bulundu: 472 CA (Pro158Thr).

Tartışma 2/51, ~4% henüz belirlenmemiş genetik

bölgeler SSCP tekniğinin mutasyon tespit

edebilme yüzdesi Gliserol (5%) bazı fragmanlar için

olumlu, bazıları için ise olumsuz sonuçlar verdi.

Referanslar Baris I., 2002, “Short Tandem Repeat And

Mutation Analyses In Turkish Charcot-Marie-Tooth Patients”, MS Thesis, Bogazici University, Department of Molecular Biology and Genetics.

Shapiro, H., J. P. Doyle, P. Hensley, D. R. Colman and W. A. Hendrickson, 1996, “ Crystal Structure of the Extracellular Domain from P0, the Major Structural Protein of Peripheral Nerve Myelin”, Neuron, Vol. 17, pp. 435-449.

Filbin, M. T., F. S. Walsh, B. D. Trapp, J. A. Pizzey and G. I. Tennekoon, 1990, “Role of Myelin P0 Protein as a Homophilic Adhesion Molecule”, Nature, Vol. 344, pp. 871-872.

Giese, K. P., R. Martini, G. Lemke, P. Soriano and M. Schachner, 1992 “Mouse P0 Gene Disruption Leads to Hypomyelination, Abnormal Expression of Recognition Molecules, and Degeneration of Myelin and Axons”, Cell, Vol. 71, pp. 565-576.