B Directigen Meningitis Combo Test За откриване на Haemophilus influenzae, тип b, Streptococcus pneumoniae,

Escherichia coli K1, Streptococcus от група B и Neisseria meningitidis, групи A, B, C, Y и W135.

ПРЕДНАЗНАЧЕНИЕDirectigen Meningitis Combo Test (Комбиниран тест за менингит Directigen) е ориентировъчен латекс-аглутинационни тест за пряко качествено определяне на антигени за H. influenzae, тип b, S. pneumoniae, N. meningitidis, групи A, B, C, Y или W135 и за Escherichia coli K1 в гръбначномозъчна течност (ликвор), серум или урина. Тестът може да се използва и за пряко качествено определяне на антигени за Streptococcus от група В, в ликвор и серум. В допълнение, комплектът за тестване дава възможност да се извършат потвърждаване и определяне на серогруповите свойства на суспектни колонии на H. influenzaе, тип b, S. pneumoniae, Streptococcus от група B и N. meningitidis, групи A/Y, B или C/W135. Аглутинация, видима с просто око, се получава, когато дадена проба, съдържаща който и да е от тези антигени, реагира с латексните частици, покрити със съответното антитяло.

ОБЩО ОПИСАНИЕ И ОБЯСНЕНИЕПоставянето на диагноза при бактериемия и менингит, особено при малките деца, може да бъде трудно. Цели 55% от децата биват преглеждани от лекар и започват антибиотична терапия, преди да бъде открит менингитът.1 Откриването на микробни антигени в ликвора е бърз и полезен метод за микробиологична диагностика. Това може би е единственият най-важен тест в случаите на частично лекуван менингит, тъй като оцветяването по Грам и културелните методи може да дадат отрицателен резултат. Откриването на специфичен антиген е важна клинична находка и ценно помощно средство при избора на антимикробна терапия.2

Съобщава се, че Haemophilus influenzae, тип b, Neisseria meningitidis и Streptococcus pneumoniae са трите причинителя, на които се дължат приблизително 84% от случаите на бактериален менингит.3

Streptococcus от група B и Escherichia coli K1 са основните бактериални причинители при новородените.4–7 Някои щамове стрептококи от група В и E. coli K1 често колонизират вагината и/или ректума и могат да се свържат с родилна септицемия и септицемия при новородено, пневмония и менингит.8 Установено е, че полизахаридният антиген на E. coli K1 е структурно и имунологично сходен на антигена на Neisseria meningitidis, група B.9,10 Реагентът Directigen Neisseria meningitidis group B Latex не може да различи двата антигена, но е полезен при диагноза на неонатални менингити, причинени от E. coli K1. Високата заболевамост и смъртност, свързани със стрептококи от група В и E. coli K1 при новородени, определят изключително голямото значение на бързата и точна идентификация на тези микроорганизми.4

Типично за имунологичните методи за откриване на характерни екзоантигени на патогенни микроорганизми в телесни течности от пациента (ликвор, серум, урина) е, че те са по-бързи от традиционни методи като културелното изследване. Тези техники включват насрещна имуноелектрофореза (CIE) и латекс-аглутинация.11-14

Установено е, че методът на базата на латекс-аглутинация е по-бърз и по-чувствителен от CIE при откриване на пречистен антиген.15-17

ПРИНЦИПИ НА ПРОЦЕДУРАТАСпецифичните антитела се свързват към повърхността на латексните перли. Съвкупността от латексни частици става достатъчно голяма, което позволява бързото отчитане с просто око на позитивна аглутинация в присъствието на специфични антигени. Посочените специфични разтворими полизахаридни антигени се натрупват в ликвора, серума или урината в резултат на инфекция от H. influenzae, тип b, S. pneumoniae и N. meningitidis, групи A, B, C, Y или W135, и Escherichia coli K1; и в ликвора и/или серума вследствие на инфекция от Streptococcus, група В. Всички тези антигени могат да се открият с комплекта Directigen Meningitis Combo Test.

РЕАГЕНТИКомплект Directigen Meningitis Combo

Реагент 1 (1,0 mL), Латексна суспензия, покрита със заешки поликлонални антитела против H. influenzae, тип b,

Реагент 2 (1,0 mL), Латексна суспензия, покрита със заешки поликлонални антитела против S. pneumoniae,

Реагент 3 (1,0 mL), Латексна суспензия, покрита със заешки поликлонални антитела против Streptococcus от група В,

Реагент 4 (1,0 mL), Латексна суспензия, покрита със заешки поликлонални антитела против N. meningitidis, групи C и W135,

Реагент 5 (1,0 mL), Латексна суспензия, покрита със заешки поликлонални антитела против N. meningitidis, групи A и Y,

Реагент 6 (1,0 mL), Латексна суспензия, покрита с миши моноклонални антитела против N. meningitidis, група B/E. coli K1,

Реагент А (0,5 mL), Латексна суспензия, покрита със заешки имуноглобулин – латексна контрола,Реагент B (0,5 mL), Латексна суспензия, покрита с миши имуноглобулин, всяка от горепосочените с 0,2%

разтвор на натриев азид (консерванти) – латексна контрола,Контрола (+) (9,0 mL), Поливалентна положителна антигенна контрола, съдържаща антигени от

H. influenzae тип b, S. pneumoniae, Streptococcus от група В и N. meningitidis, групи A, B, C, Y и W135,

0214011JAA 2008/02

БългарскиU

2

Контрола (–) (9,0 mL), Отрицателна антигенна контрола, физиологичен разтвор, буфериран с глицерол, всяка от горепосочените с 0,2% натриев азид (консервант),

Буфер за проби

(8,0 mL), Буферен разтвор за проби, съдържащ ЕДТА.

Предпазни мерки: За употреба при in vitro диагностика.Предупреждение! В клиничните проби може да присъстват патогенни микроорганизми, включително вируси на хепатит и човешки имунодефицитен вирус. При работа с всякакви материали и предмети, замърсени с кръв или други телесни течности, трябва да се спазват “Стандартни предпазни мерки”18-21 и ведомствените правила. Преди изхвърляне стерилизирайте контейнерите за проби и други замърсени материали в автоклав.Реагенти: Не използвайте след изтичане на срока на годност. При изваждане от хладилник оставете реагентите да се затоплят до стайна температура (15 – 30°C) преди употреба.За да се осигури правилно подаване на капки, бутилката за накапване на реагента трябва да се държи вертикално, за да може капките да падат свободно една по една.Предупреждение! Реагентите съдържат натриев азид, който е силно токсичен при вдишване, при контакт с кожата и при поглъщане. При контакт с киселини се отделя силно токсичен газ. При контакт с кожата незабавно измийте обилно с вода. Натриевият азид може да реагира с олово и мед от тръбите на канализацията и да образува силно експлозивни метални азиди. При изхвърляне отмийте с много вода, за да предотвратите натрупване на азиди.Контроли: Не използвайте комплекта, ако контрола (+) и контрола (–) не дават подходящи резултати.Тестови карти: За правилно осъществяване на реакциите картите трябва да са гладки и в хоризонтално положение. Ако е необходимо, изгладете картите, като ги огънете в посока, обратна на съществуващата дъга. Трябва да се внимава да не се докосват с пръсти тестовите полета, тъй като това може да доведе до отлагане на мазнини и до неточни резултати от теста. Използвайте всяка карта еднократно, след което я изхвърлете. Съхранявайте картите в оригиналната опаковка, на сухо място, при стайна температура. При разнасяне на пробата в границите на тестовите полета не допускайте издраскване на повърхността на картата с пластмасовите бъркалки. Ако пробата не се разстеле до външния периметър на тестовото поле, използвайте друго тестово поле на картата.Тестови предметни стъкла: Ако се използва предметното стъкло, дезинфекцирайте го след всяка употреба и го измивайте преди повторна употреба. Препоръчва се фенолов дезинфектант. Уверявайте се, че всички детергенти и/или дезинфектанти са напълно изплакнати от стъклата преди повторната им употреба.Ротация: Препоръчителната скорост за механична ротация е 100 ± 2 об/мин, но ротация в границите между 95 и 110 об/мин не оказва съществено влияние върху получените резултати. Ротаторът трябва да описва кръг с диаметър приблизително 2 cm в хоризонталната равнина. За да се предотврати изсушаване на тестова проба по време на въртене, трябва да се постави навлажнено овлажняващо покривало.Съхранение на реагентите: При получаване извадете реагентите от кашона и поставете в хладилник при 2 – 8°C. НЕ ЗАМРАЗЯВАЙТЕ. Когато не се използват, реагентите трябва да се затварят и поставят обратно в хладилника, като се внимава да не се объркат цветнокодираните капачки.

ВЗЕМАНЕ И МАНИПУЛИРАНЕ НА ПРОБИЗа подробно описание на процедурата за вземане и манипулиране на проби виж съответните текстове. Пробите трябва да се тестват колкото е възможно най-бързо; ако обаче пробата не може да тества веднага, тя трябва да се съхранява при 2 – 8°C (за срок до 48 часа) или при -20°C.Преди тестване или съхранение серумът трябва да се отдели от пробата цяла кръв.

ПРЕДВАРИТЕЛНА ОБРАБОТКА НА ПРОБАТАНай-ефективният начин за предварителна обработка на пробата е поставянето й в затворени стъклени епруветки (боросиликат) и третирането във водна баня при 100°C (кипяща вода). Възможно е да се използват стъклени тестови епруветки, които да се третират в сух термостат, но при този начин на обработка са наблюдавани по-големи отклонения и неравномерно нагряване на пробите, което се дължи на разлика в размерите на епруветките и обема на пробата.

ПРОЦЕДУРИПо време на употреба тестовото поле, реагентите, изследваните проби и компонентите на теста трябва да са със стайна температура (15 – 30°C).Предоставени материали: Всички материали, изброени в “Реагенти”, работен комплект, консумативи за еднократна употреба и допълнителни принадлежности.Необходими, но непредоставени материали: Предметно стъкло Directigen Meningitis Test, ротатор, овлажняващо покривало, микропипетор за обеми по 50 µL, накрайници за пипети (виж “Налични артикули”).Изискват се също необходимото оборудване и лабораторна апаратура за подготовка, съхранение и манипулиране на проби от ликвор, серум и урина.

Подготовка на проби (ликвор):1. Нагрейте пробите за 3 минути при 100°C (на водна баня или в термостат) и ги оставете да изстинат до стайна

температура преди употреба. За оптимална чувствителност тестването за N. meningitidis, група B, и E. coli K1 трябва да се прави на ненагрявани проби (виж “Ограничения на процедурата”).

2. Проби от ликвор, които са видимо мътни, след нагряването трябва да се центрофугират за 10 минути при 1400 x g преди тестването. Като тестова проба трябва да се използва супернатант.

3. Тествайте пробите така, както е описано в “Тестова процедура”.

3

Подготовка на проби (серум):1. Разредете серумните проби с минимален обем от 0,6 mL в съотношение 1 : 1 с Directigen Specimen Buffer

(Буфер за проби Directigen) и разбъркайте.2. Нагрейте пробите за 5 минути при 100°C (на водна баня или в термостат) и ги оставете да изстинат до стайна

температура преди употреба.3. Разбийте с дървена пръчка образувания протеинов “съсирек” и енергично разбъркайте на вортекс (за около

5 секунди).4. Центрофугирайте при минимум 1400 x g за 15 минути.5. Тествайте супернатанта, както е описано в “Тестова процедура”.

Подготовка на проби (неконцентрирана урина):1. Разредете пробите урина с минимален обем 0,4 mL в съотношение 1 : 1 с Directigen Specimen Buffer и

разбъркайте.2. Нагрейте пробите за 5 минути при 100°C (на водна баня или в термостат) и ги оставете да изстинат до стайна

температура преди употреба.3. Центрофугирайте при минимум 1400 x g за 10 минути.4. Тествайте супернатанта, както е описано в “Тестова процедура”.

Подготовка на проби (концентрирана урина):1. Пробите урина, които са мътни или имат частици, трябва да се центрофугират при 1400 x g за 10 минути,

преди да се премине към концентрирането им.2. Пробите урина може да се концентрират 25-кратно с концентратор Minicon B-15 (Amicon Corporation, Danvers,

Massachusetts).3. Разредете минимум 200 µL концентрат урина в съотношение 1 : 1 с Directigen Specimen Buffer и разбъркайте.4. Нагрейте пробите за 5 минути при 100°C (на водна баня или в термостат) и ги оставете да изстинат до стайна

температура преди употреба.5. Центрофугирайте при минимум 1400 x g за 10 минути.6. Тествайте супернатанта, както е описано в “Тестова процедура”.

Подготовка за потвърждаване на колонии от култура:1. Локализирайте подозрителните колонии по повърхността на агара от култури на 18 – 24 часа, които по

морфология и по оцветяване по Грам отговарят на характеристиките за микроорганизми, подходящи за тестване с Directigen Meningitis latex reagents (Латексни реагенти за менингит Directigen). Забележка. Оцветяване по метода на Грам трябва да се извършва преди тестването, за да се гарантира, че микроорганизмите са подходящи за тестване с Directigen Meningitis latex reagents.

2. Поставете с пипета 0,5 mL (приблизително 10 капки) реагент контрола (–) в малка стъклена епруветка (10 x 75 mm или еквивалентна).

3. Изберете няколко (2 – 3) единични колонии със сходна морфология от петрито с първична култура или субкултура, като използвате стерилна примка, и суспендирайте в гореспоменатата епруветка, за да получите суспензия, равна на стандарт за мътност McFarland No1. Забележка. Прекомерната инокулация ще доведе до прекалено гъста суспензия, което може да породи грешни резултати.

4. Нагрейте суспензията за 3 минути при 100°C (на кипяща водна баня или в термостат) и я оставете да изстине до стайна температура преди тестване.

5. Центрофугирайте при минимум 1400 x g за 10 минути.6. Тествайте супернатанта, както е описано в “Тестова процедура”. Забележка. Ако се наблюдава атипична на

вид аглутинация, виж “Ограничения на процедурата”.

Потребителски качествен контрол:Включвайте тестване на контрола (+) и на контрола (–) за всяка партида изследвани проби, както е описано в стъпка 1 “Тестова процедура”.Необходимо е спазване на изискванията за качествен контрол според приложимите местни, щатски и/или федерални норми или изискванията за качество и стандартните процедури за качествен контрол във вашата лаборатория. Препоръчва се потребителят да ползва за справка правилата на CLSI (бившето NCCLS) и регламентите на CLIA за подходящи практики за качествен контрол.

Тестова процедура (ликвор, серум, урина, концентрирана урина и потвърждаване на колония):Извадете реагенти от хладилника и ги поставете върху картата (или върху тестовото предметно стъкло) в надписаните гнезда на таблата от работния комплект.Използвайте само тестовата карта или предметното стъкло, които се препоръчват за този комплект. Избършете старателно предметното стъкло с немъхеста тъкан, преди да го използвате.

Виж схематичните илюстрации за процедурата, стр. 10 от диплянката.

1. Поставете по една капка от контрола (+) в ямките с номера от 1 до 6 на реда, обозначен с “+”. Поставете по една капка от контрола (–) в ямките с номера от 1 до 6 на реда, обозначен с “-”.

2. С микропипета поставете по 50 µL от пробите за изследване в ямките с номера от 1 до 6 на реда, обозначен със “S” (проба), както и в ямките, обозначени с “A” и “B”. За контроли се ползват редовете “+” (положителна контрола) и “–” (отрицателна контрола): Последващи тествания на проби могат да се правят, като се ползват редове +, – и S на нови (или почистени) тестови карти (предметни стъкла).

4

3. Като държите бутилката за накапване за капачката, разклатете я енергично (без да я обръщате), за да се разбъркат добре Реагенти от 1 – 6 включително, а също и Реагенти А и В. Преди да отворите капачката, леко потупайте основата й върху плота, за да сте сигурни, че в накрайника не е останал латекс.

4. Поставете една капка от Реагент А (контролна латексна суспензия) в ямка “А”. Повторете процедурата, като поставите една капка от Реагент В (контролна латексна суспензия) в ямка “В”.5. Поставете по една капка от латексна суспензия на Реагент 1 в ямките в колона 1, на редовете, обозначени с

“+” (положителна), “–” (отрицателна) и “S” (проба). Повторете процедурата и с останалите латексни суспензии (Реагенти от 2 – 6 включително) за редовете,

обозначени с “+”, “–” и “S” в колони от 2 до 6 включително.6. Смесете пробите и латексните реагенти във всяка ямка с помощта на пластмасова бъркалка, като ползвате

първо единия, а след това другия й край за следващата ямка. Изхвърлете бъркалката.7. Поставете картата или предметното стъкло на механичен ротатор и въртете със скорост от 100 ± 2 об/мин за

10 минути. Използвайте намокрено овлажняващо покривало, за да предотвратите изпаряване.8. Веднага след като изтекат 10 минути, отчетете резултатите с микроскоп при силно до белота осветление с

висок интензитет.Забележка. При тестване на проби (ликвор, серум, урина,концентрирана урина и потвърждаване на колония)

с един индивидуален Реагент от 1 – 5 трябва да се ползва Реагент А. При тестване с един индивидуален Реагент 6 трябва да се ползва Реагент В. Прилагайте гореописаната процедура.

ИНТЕРПРЕТИРАНЕ НА РЕЗУЛТАТИТЕПърво запишете тестовите резултати от контрола (+) и контрола (–). Контрола (+) трябва да доведе до масивна аглутинация в ямките от реда “+” в срок до 10 минути. Контрола (–) не трябва да дава аглутинация в ямките в реда, обозначен с “–”. Наличието на аглутинация в някоя от ямките, съдържащи контрола (–), води до невъзможност за интерпретация на реакцията.Запишете резултатите от теста на пробата:Положителен тест – трябва да даде аглутинация. Аглутинация в каквато и да е степен с някой от латексните реагенти показва наличие на съответния антиген. Аглутинация с два или повече латексни реагента или със съответстващите им Реагент А (Реагенти 1 – 5) или Реагент В (Реагент 6) води до невъзможност за интерпретиране на реакцията.Отрицателен тест – трябва да покаже липса на аглутинация.

ОГРАНИЧЕНИЯ НА ПРОЦЕДУРАТАПосочените латекс-аглутинационни тестове не са предназначени да служат като заместител на бактериална култура. Потвърдителната диагноза на бактериална менингитна инфекция е възможна само чрез подходящи процедури на култивиране.Проби с изключително ниски нива на антиген, например в началото на инфекцията, може да доведат до фалшиво отрицателни резултати. Освен това проби с изключително високи концентрации на антигени може да предизвикат прозонови ефекти, като покажат фалшиво отрицателни резултати. Въпреки че не са обширно проучени, прозоновите явления са наблюдавани само при проби от посявка с изключително високи нива на антиген, но не и в клинични материали.Този анализ е за качествено определяне на антигени на H. influenzaе, тип b, S. pneumoniae, N. meningitidis, групи А, B, C, Y или W135 и E. coli K1 в ликвор, серум или урина; и на Streptococcus от група B в ликвор и серум. Освен това комплектът за тестване може да се ползва и при подозрителни колонии на H. influenzaе, тип b, S. pneumoniae, Streptococcus от група B и N. meningitidis, групи A, B, C, Y или W135. Действия с други видове проби не са оценявани.Directigen Meningitis Combo Test не може да се използва в съдържащи кръв среди за култивиране.Положителен или отрицателен резултат за стрептококи от група В е показателен само за присъствието или отсъствието на антиген от стрептококи от група В и няма диагностична стойност за наличието или липсата на болест, причинена от стрептококи от тази група.Този способ не трябва да се използва като заместител на бактериална култура при диагноза на септицемия от стрептококи от Група В и/или менингит.Положителен или отрицателен резултат е предварителен резултат за наличие на антиген на стрептококи от група В. Резултатът трябва да се потвърди чрез култура.При пеленачета единствените материали, които се препоръчва да се ползват за директно качествено определяне на антигени на стрептококи от група В, са серум и гръбначномозъчна течност. На този етап не може да се препоръча инструментално тестване на урина от пеленачета за пряко количествено откриване на стрептококов антиген от група В; към този момент няма достатъчно данни за работните характеристики, които да подкрепят употребата на този тест за надеждно прогнозиране на наличието на болест, причинена от стрептококи от група В.Щамовете пневмококи и H. influenzae, тип b, които не притежават капсулен антиген, може да не се открият с имунологични методики.Знае се, че се появяват кръстосани реакции на реагента с H. influenzae в присъствието на Escherichia coli K100. Знае се, че се появяват кръстосани реакции на реагента с N. meningitidis, групи C и W135 в присъствието на Escherichia coli K92. Възможно е да възникнат други кръстосани реакции, които не подлежат на интерпретация или фалшиво положителни, но броят им се свежда до миниум или те напълно се избягват чрез правилна подготовка на пробите за изследване (виж “Предварителна подготовка на проби” и “Процедури – подготовка на проби”).Проучвания относно проби от ликвор, в който са посети антигени с N. meningitides, група B, и E. coli K1, показват, че може да има някакво намаление на чувствителността след нагряване в сравнение с ненагрети проби.

5

Необработени проби серум и урина може да дадат негодни за интерпретиране резултати с латексните реагенти и те трябва да се третират, както е описано в “Процедури – подготовка на проби”. Проби от ликвор, които са видимо мътни, преди тестването трябва да се центрофугират за 10 минути при 1400 x g след нагряването. Като тестова проба трябва да се използва супернатант.Проби урина, обработени съобразно с “Процедури – подготовка на проби”, при които резултатите са негодни за интерпретация или се подозира, че са фалшиво положителни, може да се филтрират с филтър MILLIporE Millex-HA 0,45 µm (#SLHA-0250S) и да се тестват повторно с латексните тестови реактиви и съответните латексни контроли.Пробите за потвърждение на колония, които дават негодни за интерпретация резултати или нетипични реакции на аглутинация, може да изискват разреждане на супернатант с реагента контрола (–) в съотношение 1 : 10. Трябва да се внимава да се избягват бактериални суспензии с мътност, която е по-висока от стандарта за McFarland No1.Латекс-аглутинационните тестове на урина могат да са евентуално от полза като подкрепящо доказателство за наличие на патогенни микроорганизми у пеленачета, при които се е появила висока температура без признаци за локализация.22 Отделянето на пикочен антиген при пеленачета обаче може да продължава 3 – 14 дни или до 30 дни след прилагането на ваксина за Haemophilus influenzae, тип b (Hib). Честотата и продължителността на антигенурията зависят от пациента и типа на приложената ваксина. Ваксинационната анамнеза на пациента е важна за коректното интерпретиране на положителни резултати за Hib антигени в урината при ваксинирани пеленачета.22 – 24

Получени са кръстосани реакции от някои щамове от групата на зеленеещите се стрептококи (т.е. S. mitis, S. sanguis II, S. salivarius)25 с латексния реагент S. pneumoniae Directigen. Може да са необходими допълнителни тестове, за да се диференцира групата зеленеещи се стрептококи от S. pneumoniae.Оцветяването по Грам трябва да се извършва преди ползването им в процедурата за потвърждение на колония. Определени изолати от бактерии, получени от петрита с кръвна култура, които са морфологично подобни, но показват оцветяване по Грам, което е несъвместимо с подозрителната колония, може да покажат неспецифична аглутинация и/или фалшиво положителни реакции (т.е. бета-хемолитични, непатогенни видове Neisseria) с латекс на стрептококи от група В.

ОЧАКВАНИ СТОЙНОСТИСъобщава се, че Haemophilus influenzae, тип b, Neisseria meningitidis и Streptococcus pneumoniae са трите причинителя, на които се дължат приблизително 84% от случаите на бактериален менингит.3

Streptococcus от група В и Escherichia coli K1 са основните бактериални патогени сред новородените.4-7 Щамове стрептококи от група В и от E. coli K1 често колонизират вагината и/или ректума и може да са в причинно-следствена връзка с майчината септицемия и неонаталните септицемия, пневмония и менингит.8

РАБОТНИ ХАРАКТЕРИСТИКИЧувствителност: При серия от ретроспективни клинични оценки с Directigen Meningitis latex reagents са били изследвани проби от гръбначномозъчна течност (нагрявана и ненагрявана), серум и урина. Тестваните проби са първичен материал от пациенти, при които е получено потвърждение от култура, от CIE или от търговски предлагани латексни реагенти за инфекция от Haemophilus influenzae, тип b, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, група A, B, C, W135 или стрептококи от група В. Резултатите от латекса са били сравнявани и с насрещна имуноелектрофореза (CIE), но не всички проби са били тествани със CIE (Таблица 1, виж стр. 8). Directigen Meningitis latex reagents са показали еднаква или по-висока чувствителност от CIE при откриването на антиген в пробите от ликвор, серум и урина.Чувствителността за E. coli K1 е била определяна чрез използване на цяла клетка на E. coli K1, посята в телесни течности, и е била сравнена с търговски предлаганите латекс-аглутинационни реагенти. С латексния реагент N. meningitidis, група B, Directigen е било възможно да се открива E. coli K1 в ликвор (4/4), серум (4/4), урина (3/4) и концентрирана урина (4/4). Показателите по критериите за чувствителност са били равни или по-добри от тези, получени с други налични търговски латексни реагенти.15

Всеки латексен реагент Directigen е бил сравняван също и със CIE относно способността да се открива частично пречистен антиген, посят в ликвор, серум, урина и концентрирана урина. За теста със CIE е бил използван търговски предлаган антисерум. Directigen latex reagents са се оказали по-чувствителни от CIE.15

Специфичност: Специфичността на Directigen Meningitis reagents е била определена при множество клинични проучвания чрез ретроспективно и проследяващо тестване на проби от ликвор, серум, урина и концентрирана урина (Таблица 2, виж стр. 9). Изследвани са както проби, дали негативни култури, така и неиндексирани проби, дали положителни култури. Данните показват обхват на специфичността от 97 – 100% в зависимост от латекса и изследваната проба.Потвърждение на колонии: Латексните реагенти са тествани чрез използване на суспензии от единични колонии, отговарящи на морфологичните характеристики на микроорганизмите. Работните характеристики са описани в Таблица 3 (виж стр. 9).

6

НАЛИЧНОСТ

Кат. No Описание252360 Directigen Meningitis Combo Test (30 изследвания на пациенти, 60 контроли).255460 Directigen Group B Strep Test (30 изследвания на пациенти, 60 контроли).252260 Directigen H. influenzae type b Test (30 изследвания на пациенти, 60 контроли).255560 Directigen N. meningitidis group B / E. coli K1 Test (30 изследвания на пациенти, 60 контроли).250160 Directigen N. meningitidis groups A, C, Y and W135 Test (30 изследвания на пациенти, 60 контроли).251960 Directigen S. pneumoniae Test (30 изследвания на пациенти, 60 контроли).256391 Directigen Specimen Buffer, 8 mL.252350 Directigen Meningitis Negative Control reagent, 9 mL, в кутия по 4 бр.278051 Macro-Vue Card Test rotator (с овлажнително покривало), 100 ± 2 об/мин, автоматичен таймер,

фрикционно задвижване, модел 51-ІІ (110 V). 250780 Directigen Meningitis, generic, 12 броя, в кутия по 30 броя.

СПРАВОЧНА ЛИТЕРАТУРА1. rothrock, S.G., S.M. Green, J. Wren, D. Letai, L. Daniel-Underwood, E. pillar: pediatric bacterial meningitis: is prior

antibiotic therapy associated with unaltered clinical presentation?, Annals Emerg. Med. 21:146-152, 1992.2. Fasola, E. and p. Ferrieri: Laboratory diagnostic methods for central nervous system infections, Neuro. Clinics

N. Amer. 3:279-290, 1992.3. Morbidity and Mortality Weekly report (CDC), Surveillance summary: bacterial meningitis and meningococcemia,

United States, 28:277-279, 1978.4. Finegold, S.M. and Martin, W.J.: Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology, Sixth Ed., C.V. Mosby Co., 1982.5. Baker, C.J.: Summary of the workshop on perinatal infections due to group B Streptococcus, NIH News, J. Infec.

Dis., 136:137-152, 1977.6. Mulder, C.J.J., Van Alphen, L. and Zanen, H.C.: Neonatal meningitis caused by Escherichia coli in the Netherlands,

J. Infect. Dis., 150:935, 1984.7. Sarff, L.D., McCracken, G.H., Jr., Schiffer, M.S., Glocle, M.p., robbins, J.B. and orskov, F.: Epidemiology of

Escherichia coli K1 in healthy and diseased newborns, Lancet, 1:1099-1104, 1975.8. Blaunstein, H., Tucker, E.B., and Gibson, B.C.: Identification and significance of Streptococcus agalactiae, Am. J.

Clin. path., 51:207-213, 1969.9. Kasper, D.L., Winkelhake, J.L., Zollinger, W.D., Brandt, B.L. and Artenstein, M.S.: Immunochemical similarity

between polysaccharide antigens of Escherichia coli: 07:K1 (L): NM and group B Neisseria meningitidis, J. Immunol., 110:262-268, 1973.

10. Lifely, M.r., Gilbert, A.S. and Moreno, C.: Sialic Acid polysaccharide antigens of Neisseria meningitidis and Escherichia coli: esterification between adjacent residues, Carbohydr. res., 94:193-203, 1981.

11. Edwards, E.A.: Immunologic investigations of meningococcal disease, group-specific Neisseria meningitidis antigens present in the serum of patients with fulminant meningococcemia, J. Immunol. 106:314-317, 1971.

12. Whittle, H.C., Egler, J.J., Tugwell, p. and Greenwood, B.M.: rapid bacteriological diagnosis of pyogenic meningitis by latex agglutination, Lancet, 2:619-621, 1974.

13. Ingram, D.L., Anderson, p. and Smith, D.H.: Countercurrent Immunoelectrophoresis in the diagnosis of disease caused by Haemophilus influenzae type b, J. ped., 81:1156-1159, 1972.

14. Newman, r.B., Stevens, r.W. and Gaafar, H.H.: Latex agglutination test for the diagnosis of Haemophilus influenzae meningitis, J. Lab. Clin. Med., 76:107-113, 1970.

15. Data on file at BD Diagnostic Systems.16. Tilton, r.C., Dias, F. and ryan, r.W.: Comparative evaluation of three commercial products and counterimmunoel

ectrophoresis for the detection of antigens in cerebrospinal fluid, J. Clin. Microbiol., 20:231-234, 1984.17. rench, M.A., Metzger, T.G. and Baker, C.J.: Detection of group B streptococcal antigen in body fluids by a latex-

coupled monoclonal antibody assay, J. Clin. Microbiol., 20:852-854, 1984.18. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2005. Approved Guideline M29-A3. protection of laboratory workers from

occupationally acquired infections, 3rd ed. CLSI, Wayne, pa.19. Garner, J.S. 1996. Hospital Infection Control practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human

Services, Centers for Disease Control and prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17:53-80.

20. U.S. Department of Health and Human Services. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS publication (CDC), 4th ed. U.S. Government printing office, Washington, D.C.

21. Directive 2000/54/EC of the European parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045.

22. Jones, r.G., Bass, J.W., Weisse, M.E., and Vincent, J.M. Antigenuria after immunization with Haemophilus influenzae oligosaccharide CrM197 conjugate (HboC) vaccine. pediatr. Inf. Dis. J. 1991; 10:557-559.

23. Goepp, J.G., Hohenboken, M., Almeido-Hill, J., and Santocham, M. persistent urinary antigen excretion to infants vaccinated with Haemophilus influenzae type b capsular polysaccharide conjugated with outer membrane protein from Neisseria meningitidis. pediatr. Inf. Dis. J. 1992; 11:2-5.

24. rothstein, E.p., Madore, D.V., et. al. Comparison of antigenuria after immunization with three Haemophilus influenzae type b conjugate vaccines. pediatr. Inf. Dis. J. 1991; 10:311-314.

7

25. Holmberg, H., Danielsson, D., Hardie, J., Krook, A., Whiley, r.: Cross-reactions between α-streptococci and omniserum, a polyvalent pneumococcal serum, demonstrated by direct immunofluorescence, immunoelectroosmophoresis, and latex agglutination, J. Clin. Microbiol., 21:745-748, 1985.

8

Таблица 1

Сравнение на Directigen и CIE при съхранявани проби

Материал за проба

Наличен антиген Методи Брой положителни Брой отрицателни

Ликвор

H. influenzae, тип b Directigen CIE

8366

1431

S. pneumoniae Directigen CIE

3633

912

Streptococcus от група B Directigen CIE

182

64

N. meningitidis, група A Directigen CIE

22Не е изследвано

3Не е изследвано

N. meningitidis, група В Directigen CIE

117

1620

N. meningitidis, група C или W135

Directigen CIE

82

04

Серум

H. influenzae, тип b Directigen CIE

75

24

S. pneumoniae Directigen CIE

1717

55

N. meningitidis, група A, B, C или W135

Directigen CIE

127

913

Урина

H. influenzae, тип b Directigen CIE

122

414

S. pneumoniae Directigen CIE

71

1218

Streptococcus от група B Directigen CIE

412

163

N. meningitidis, група A или С

Directigen CIE

51

24

9

Таблица 2

Изследване за специфичност на проби от клиничен материал, дали отрицателни и дали положителни култури

Материал за проба

Латексен реагент Брой изследвани Брой отрицателни

Специфичност %

Ликвор H. influenzae, тип b 146146127236

75148

146146127232

74148

100100100

98,3 98,7

100

S. pneumoniaeStreptococcus, група ВN. meningitides, група C/W135N. meningitides, групи A/YN. meningitidis, група B/E. coli K1

Серум H. influenzae, тип b 124125

64143

36126

124125

64143

35126

100100100100

97,2100

S. pneumoniaeStreptococcus, група ВN. meningitides, група C/W135N. meningitides, групи A/YN. meningitidis, група B/E. coli K1

Урина H. influenzae, тип b 120120

82147

51120

11911981

14750

120

99 99

98,7100 98100

S. pneumoniaeStreptococcus от група ВN. meningitides, група C/W135N. meningitides, групи A/YN. meningitidis, група B/E. coli K1

Урина (концентрирана)

H. influenzae, тип b 303041533730

302940523730

100 97 97,5 98,1

100100

S. pneumoniaeStreptococcus от група ВN. meningitides, групи C/W135N. meningitides, групи A/YN. meningitidis, групи B/E. coli K1

Таблица 3

Работни характеристики на потвърждение на колонияDirectigen Meningitis спрямо биохимична идентификация

Предполагаем организъм NoБрой изследвани

Относителна чувствителност

(95% доверителен интервал)

Относителна специфичност

(95% доверителен интервал)

% негодни за интерпретация

първични тестове

H. influenzae, тип b 112 100% (92 – 100) 98,5% (92 – 100)2 3,6%S. pneumoniae 124 93% (84 – 98) 79,0% (66 – 88)1 0%Streptococcus от група В 129 100% (95 – 100) 90,5% (80 – 96)1 0%Neisseria meningitides, групи A/Y 106 100% (83 – 100) 100% (96 – 100)2 10,4%

Neisseria meningitides, група C/W135 94 96% (82 – 100) 98,5% (92 – 100)2 11,7%

Neisseria meningitidis, група B 106 85% (55 – 98) 100% (96 – 100)2 4,7%

1 Виж “Ограничения на процедурата”.2 Резултати при повторно тестване с разреждане 1 : 10.

10

Схема на процедуритеИзпълнение на изследването

1 2

3 4

5 6

7

+

-

Directigen™ MENI Directigen™ MENIN

+

-

S

Becton, Dickinson and Company�

Directigen™ MENINGITIS TEST

+

-

S

Becton, Dickinson and Company

�

Directigen™ MENI

+

-

Directigen™

+

-

Directigen™ MENINGITIS TEST

S

+

11

m Becton, Dickinson and Company A BENEX Limited 7 Loveton Circle Bay K 1a/d, Shannon Industrial Estate Sparks, Maryland 21152 USA Shannon, County Clare, Ireland 800-638-8663 Tel: 353-61-47-29-20 Fax: 353-61-47-25-46

MILLIPORE is a trademark of Millipore Corporation.BD, BD Logo, Directigen and Macro-Vue are trademarks of Becton, Dickinson and Company. © 2008 BD