BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA …gust.edu.vn/media/26/uftai-ve-tai-day26217.pdfLỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

KHIẾU THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY

ĐỘC TẾ BÀO CỦA 3 LOÀI: NGOẠI MỘC TÁI (ALLOPHYLUS

LIVESCENS GAGNEP.), CÀY RI TA HẠ LONG (CHIRITA

HALONGENSIS KIEW& T.H.NGUYEN) VÀ AN ĐIỀN LÁ

THÔNG [OLDENLANDIA PINIFOLIA (WALL. EX G.DON)

KUNTZE] CỦA VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

HÀ NỘI - 2018

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

……..….***…………

KHIẾU THỊ TÂM

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH GÂY

ĐỘC TẾ BÀO CỦA 3 LOÀI: NGOẠI MỘC TÁI (ALLOPHYLUS

LIVESCENS GAGNEP.), CÀY RI TA HẠ LONG (CHIRITA

HALONGENSIS KIEW& T.H.NGUYEN) VÀ AN ĐIỀN LÁ

THÔNG [OLDENLANDIA PINIFOLIA (WALL. EX G.DON)

KUNTZE] CỦA VIỆT NAM

Chuyên ngành: Hóa hữu cơ

Mã số: 62.44.01.14

LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1. PGS. TS. Nguyễn Thị Hoàng Anh

2. PGS. TS. Trần Văn Lộc

HÀ NỘI – 5/2018

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng

dẫn của PGS. TS. Nguyễn Thị Hoàng Anh và PGS. TS. Trần Văn Lộc.

Các số liệu và kết quả nghiên cứu nêu trong luận án là trung thực, được đồng

tác giả cho phép sử dụng và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình

nào khác.

Tác giả

Khiếu Thị Tâm

LỜI CẢM ƠN

Luận án được hoàn thành tại phòng Nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên và

phòng Tổng hợp hữu cơ – Viện Hóa học thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Thị Hoàng Anh và

PGS. TS. Trần Văn Lộc những thầy cô đã từng bước hướng dẫn và tận tình giúp đỡ

tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến tất cả các cô chú, anh chị phòng

Nghiên cứu các Hợp chất Thiên nhiên và phòng Tổng hợp Hữu cơ – Viện Hóa học

đã hết lòng chỉ bảo và giúp đỡ tôi trong thời gian tôi tiến hành thực nghiệm tại Viện

Hóa học.

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Hóa học và Học viện Khoa

học và Công nghệ đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình tôi học tập, nghiên cứu

và hoàn thành luận án.

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Khoa học đã tạo điều

kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đối với sự động viên, giúp đỡ của gia đình, bạn bè

và đồng nghiệp trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án này.

Xin trân trọng cảm ơn!

Tác giả

Khiếu Thị Tâm

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................ i

DANH MỤC CÁC BẢNG ........................................................................................ii

DANH MỤC CÁC HÌNH ....................................................................................... iii

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .................................................................................... 3

1.1. Tổng quan về chi Allophylus..............................................................................3

1.1.1. Giới thiệu về thực vật chi Allophylus ................................................................ 3

1.1.2. Ứng dụng của chi Allophylus trong y học cổ truyền ......................................... 3

1.1.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Allophylus ........................ 4

1 1 3 1 Hợp chất phenol ............................................................................................. 4

1 1 3 2 Hợp chất terpenoid và steroid ........................................................................ 7

1 1 3 3 Các hợp chất khác .......................................................................................... 9

1.1.4. Tình hình nghiên cứu cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep) ...... 11

1.2. Tổng quan về chi Chirita..................................................................................11

1.2.1. Giới thiệu về thực vật chi Chirita ................................................................... 11

1.2.2. Ứng dụng của chi Chirita trong y học cổ truyền ............................................ 12

1.2.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Chirita

................................................................................................................................... 12

1.2.3.1. Các hợp chất phenylethanoid ....................................................................... 13

1 2 3 2 Các hợp chất quinone ................................................................................... 14

1 2 3 3 Các hợp chất flavonoid ................................................................................ 16

1 2 3 4 Các hợp chất triterpenoid ............................................................................. 16

1 2 3 5 Các nhóm chất khác ..................................................................................... 18

1.2.4. Tình hình nghiên cứu cây Cày ri ta Hạ long (Chirita halongensis Tên tác giả)

................................................................................................................................... 19

1.3. Tổng quan về chi Oldenlandia.........................................................................19

1.3.1. Giới thiệu thực vật về chi Oldenlandia ........................................................... 19

1.3.2. Ứng dụng của chi Oldenlandia trong y học cổ truyền .................................... 21

1.3.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Oldenlandia ................... 22

1.3 3 1 Các alkaloid từ chi Oldenlandia .................................................................. 22

1.3 3 2 Các anthraquinone từ chi Oldenlandia ........................................................ 23

1.3 3 3 Các flavonoid từ chi Oldenlandia ................................................................ 26

1.3 3 4 Các iridoid từ chi Oldenlandia ..................................................................... 28

1.3.3.5 Các hợp chất khác từ chi Oldenlandia ......................................................... 32

1.3.4. Tình hình nghiên cứu về cây An điền lá thông [Oldenlandia pinifolia (Wall.

Ex G. Don) Kuntze] ................................................................................................... 32

1.4. Hợp chất iridoid...............................................................................................33

1.4.1. Giới thiệu chung về hợp chất iridoid .............................................................. 33

1.4.2. Phân loại các hợp chất iridoid ........................................................................ 34

1.4.2.1. Iridoid glycoside ........................................................................................... 34

1.4.2.2. Iridoid aglycone .......................................................................................... 35

1.4.2.3. Secoiridoid ................................................................................................... 35

1.4.2.4. Bis iridoid ..................................................................................................... 35

1.4.3. Hoạt tính sinh học các iridoid ......................................................................... 36

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 37

2.1. Thu hái mẫu thực vật và xác định tên khoa học...........................................37

2.2. Phƣơng pháp xử lý và chiết mẫu....................................................................38

2.3. Phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất

từ mẫu thực vật.......................................................................................................38

2.4. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập đƣợc.......39

2.5. Phƣơng pháp thử hoạt tính gây độc tế bào....................................................39

2.6.. Phƣơng pháp thử hoạt tính cảm ứng apoptosis ........................................... 42

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM ............................................................................. 44

3.1. Tách chiết, phân lập các chất từ cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens).44

3.1.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách ..................................................................... 44

3.1.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ cây Ngoại mộc tái ....................... 46

3 1 2 1 Hợp chất 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1) ............................................... 46

3 1 2 2 Hợp chất catechin (AL2).............................................................................. 46

3 1 2 3 Chất stigmasterol (AL3) .............................................................................. 46

3 1 2 4 Hợp chất β-sitosterol (AL4) ......................................................................... 46

3 1 2 5 Hợp chất β-sitosterol glucoside (AL5) ........................................................ 46

3.1.3. Hoạt tính gây độc tế bào của chất AL1 ......................................................... 47

3.2. Tách chiết, phân lập các chất từ cây Cày ri ta Hạ long ...............................47


3.2.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ cây Cày ri ta Hạ long .................. 50

3 2 2 1 Hợp chất 7-hydroxytectoquinone (CH1): .................................................... 50

3 2 2 2 Hợp chất 3α,24-dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid (CH2) .......................... 50

3 2 2 3 Hợp chất ursolic acid (CH3) ........................................................................ 50

3 2 2 4 Hợp chất oleanolic acid (CH4) .................................................................... 51

3 2 2 5 Hợp chất 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethyl-β-D-glucopyranoside (CH5) ...... 50

3 2 2 6 Hợp chất acteoside (CH6)............................................................................ 52

3 2 2 7 Hợp chất isoacteoside (CH7) ....................................................................... 52

3 2 2 8 Hợp chất decaffeoylacteoside (CH8) ........................................................... 52

3 2 2 9 Hợp chất β-hydroxyacteoside (CH9) ........................................................... 52

3.2.3. Thử hoạt tính độc tế bào ................................................................................. 52

3.3. Tách chiết, phân lập các chất từ cây An điền lá thông (Oldenlandia

pinifolia)...................................................................................................................52


3.3.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ cây An điền lá thông .................... 56

3 3 2 1 Hợp chất 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone (HP1) ........................ 56

3 3 2 3 Hợp chất 1,6-dihydroxy-2-methylanthraquinone (HP3) ............................. 56

3 3 2 4 Hợp chất digiferruginol (HP4) ..................................................................... 56

3 3 2 5 Hợp chất lutein (HP5) .................................................................................. 57

3 3 2 6 Hợp chất ursolic acid (HP6) ........................................................................ 57

3 3 2 7 Hợp chất oleanolic acid (HP7) .................................................................... 57

3 3 2 8 Hợp chất asperuloside (HP8) ....................................................................... 57

3 3 2 9 Hợp chất deacetyl asperuloside (HP9) ........................................................ 57

3 3 2 10 Hợp chất asperulosidic acid (HP10) .......................................................... 57

3 3 2 11 Hợp chất scandoside methyl ester (HP11)................................................. 57

3 3 2 11 Hợp chất afzelin (HP12) ............................................................................ 58

3 3 2 13 Hợp chất isorhamnetin-3-O-β-rutinoside (HP13) ...................................... 58

3 3 2 14 Hợp chất rutin (HP14) ............................................................................... 58

3.3.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết và các chất phân lập từ cây An

điền lá thông ............................................................................................................. 58

CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 60

4.1. Kết quả nghiên cứu về cây Ngoại mộc tái......................................................60

4.1.1. Các hợp chất phân lập từ cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens) ............ 60

4 1 1 1 Hợp chất 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1) ............................................... 60

4 1 1 2 Hợp chất catechin (AL2).............................................................................. 64

4 1 1 3 Hợp chất stigmasterol và β-sitosterol (AL3 và AL4) .................................. 65

4 1 1 4 Hợp chất β-sitosterol glucoside (AL5) ........................................................ 66

4.1.2. Hoạt tính gây độc tế bào của AL1 được phân lập từ cây Ngoại mộc tái ........ 66

4.2. Kết quả nghiên cứu về cây Cày ri ta Hạ

long................................................607

4.2.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được ............................................. 67

4.2.1.1. Hợp chất 7-hydroxytectoquinone (CH1) ..................................................... 68

4.2.1.2. Hợp chất 3α,24-dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid (CH2) .......................... 70

4 2 1 3 Hợp chất ursolic acid (CH3) ........................................................................ 73

4 2 1 4 Hợp chất oleanolic acid (CH4) .................................................................... 73

4.2.1 5 Hợp chất 2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl-β-D-glucopyranoside (CH5) ....... 74

4 2 1 6 Hợp chất acteoside (CH6)............................................................................ 76

4 2 1 7 Hợp chất isoacteoside (CH7) ....................................................................... 79

4 2 1 8 Hợp chất decaffeoylacteoside (CH8) ........................................................... 80

4.2.1.9. Hợp chất β-hydroxyacteoside (CH9) ........................................................... 81

4.3. Kết quả nghiên cứu về cây An điền lá thông.................................................84

4.3.1. Các hợp chất phân lập từ cây An điền lá thông .............................................. 85

4 3 1 1 Hợp chất 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone (HP1) ........................ 86

4 3 1 2 Hợp chất 2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone (HP2) ............................... 90

4 3 1 3 Hợp chất 1,6-dihydroxy-2-methylanthraquinone (HP3) ............................. 93

4 3 1 4 Hợp chất digiferruginol (HP4) ..................................................................... 94

4 3 1 4 Hợp chất lutein (HP5) .................................................................................. 95

4 3 1 6 Hợp chất ursolic acid (HP6) ...................................................................... 100

4 3 1 7 Hợp chất oleanolic acid (HP7) .................................................................. 101

4.3.1.8. Hợp chất asperuloside (HP8) ..................................................................... 101

4.3.1.9. Deacetyl asperuloside (HP9) ..................................................................... 105

4 3 1 10 Hợp chất asperulosidic acid (HP10) ........................................................ 107

4 3 1 11 Hợp chất scandoside methyl ester (HP11)............................................... 109

4.3.1.12. Hợp chất afzelin (HP12) .......................................................................... 111

4 3 1 13 Hợp chất isorhamnetin-3-O-β-rutinoside (HP13) .................................... 113

4 3 1 14 Hợp chất rutin (HP14) ............................................................................. 116

4.3.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các cao chiết và các hợp chất phân

lập được ................................................................................................................... 118

4 3 2 1 Kết quả thử hoạt tính cảm ứng apoptosis của cao chiết n-butanol trên tế bào

bạch cầu OCI-AML ................................................................................................. 118

4.3.2.2 Kết quả thử hoạt tính cảm ứng apoptosis của cao chiết n-butanol và một số

hợp chất phân lập từ cao chiết này trên dòng tế bào ung thư máu K562 ................ 122

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................................. 129

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN..................................................... 131

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

................................................................................................................................. 133

i

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

1H-NMR Proton Nuclear

MagneticResonance Spectrocopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

proton

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectrocopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

carbon

DEPT

Distortionless Enhancement by

Polarisation Transfer

Phổ DEPT

HMBC Heteronuclear Multiple Bond

Coherence

Phổ HMBC

HSQC Heteronuclear Single Quantum

Coherence

Phổ HSQC

COSY Correlation Spectrocopy Phổ tương tác proton

ESI-MS Electron Spray IonizationMass

Spectrocopy

Phổ khối ion hóa bằng phun mù

điện tử

HR-ESI-

MS

High Resolution ElectronSpray

Ionization- Mass Spectrocopy

Phổ khối phân giải cao ion hóa

bằng phun mù điện tử

IC50 Inhibitory concentration 50% Nồng độ ức chế 50% tế bào thử

nghiệm

KB Human epidermic carcinoma Ung thư biểu mô ở người

HepG2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người

Lu Human lung carcinoma Ung thư phổi ở người

MCF-7 Human breast carcinoma Ung thư vú ở người

HL-60 Human promyeloccytic leukemia Ung thư máu cấp tính ở người

DMSO Dimethyl sulfoxide

CH2Cl2 Diclomethane

CHCl3 Chloroform

EtOAc Ethyl acetate

MeOH Methanol

H2O Nước

TLTK Tài liệu tham khảo

KH Kí hiệu

ii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Các loài thực vật thuộc chi Allophylus ở Việt Nam ................................... 3

Bảng 1.2. Các hợp chất flavonoid được phân lập từ chi Allophylus ........................... 4

Bảng 1.3. Các hợp chất phenolic được phân lập từ chi Allophylus ............................ 6

Bảng 1.4. Các hợp chất steroid và terpenoid được phân lập từ chi Allophylus .......... 7

Bảng 1.5. Các hợp chất khác được phân lập từ chi Allophylus ................................... 9

Bảng 1.6 Danh sách các loài thuộc chi Chirita ở Việt Nam .................................... 12

Bảng 1.7 Các hợp chất phenylethanoid được phân lập từ chi Chirita ..................... 13

Bảng 1.8 Các hợp chất quinone được phân lập từ chi Chirita ................................. 14

Bảng 1.9. Các hợp chất flavonoid được phân lập từ chi Chirita .............................. 16

Bảng 1.10. Các hợp chất triterpenoid được phân lập từ chi Chirita ......................... 17

Bảng 1.11. Các nhóm chất khác được phân lập từ chi Chirita ................................. 18

Bảng 1.12. Các loài thuộc chi Oldenlandia ở Việt Nam .......................................... 20

Bảng 1.13. Các alkaloid được phân lập từ chi Oldenlandia ..................................... 23

Bảng 1.14. Các anthraquinone được phân lập từ chi Hedyotis ................................. 25

Bảng 1.15 Các flavonoid được phân lập từ chi Oldenlandia ................................... 26

Bảng 1.16. Các iridoid được phân lập từ chi Oldenlandia ....................................... 28

Bảng 4.1. Số liệu phổ 1H-và

13C-NMR (500/125 MHz, CDCl3) của chất AL1 ....... 63

Bảng 4.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất AL1 .......................... 67

Bảng 4.3 Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) của CH6-CH9 ...................... 82

Bảng 4.4 Số liệu phổ 13

C-NMR (125 MHz, CD3OD)của CH6-CH9 ...................... 83


13C-NMR (500/125 MHz) của hợp chất HP1 ............. 90


13C-NMR (500/125 MHz, CDCl3) của hợp chất HP2 93

Bảng 4.8 Số liệu phổ 1H-,

13C-NMR (500/125 MHz, CDCl3) của HP5 và lutein 99


13C-NMR (500/125 MHz, CD3OD) của HP8 và HP9. 106


13C-NMR (500/125 MHz, CD3OD) của HP10 và HP11 . 110

Bảng 4.11. Phổ 1H-,

13C-NMR (500/125 MHz, CD3OD) của HP13 và HP14....... 117

Bảng 4.12 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết n-butanol và các hợp

chất phân lập trên dòng tế bào K562 ....................................................................... 122

Bảng 4.13 Tổng kết 26 hợp chất phân lập được từ ba loài nghiên cứu ................. 125

Bảng 4.14 Tổng kết hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết và các hợp chất phân lập

được từ ba loài nghiên cứu ...................................................................................... 125

iii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Các hợp chất flavonoid phân lập được từ chi Allophylus ........................... 6

Hình 1.2. Một số phenol được phân lập từ chi Allophylus ......................................... 7

Hình 1.3. Các hợp chất steroid và terpenoid được phân lập từ chi Allophylus ........... 9

Hình 1.4. Các hợp chất khác được phân lập từ chi Allophylus ................................. 10

Hình 1.5 Cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep.) .................................. 11

Hình 1.6. Các hợp chất phenylethanoid được phân lập từ chi Chirita ..................... 11

Hình 1.7. Các hợp chất quinone được phân lập từ chi Chirita ................................. 11

Hình 1.8. Các hợp chất flavonoid được phân lập từ chi Chirita ............................... 11

Hình 1.9. Các hợp chất triterpenoid được phân lập từ chi Chirita ........................... 17

Hình 1.10. Các nhóm chất khác được phân lập từ chi Chirita .................................. 18

Hình 1.11 Hình ảnh cây Chirita halongensis ........................................................... 19

Hình 1.12 Các hợp chất alkaloid phân lập được từ chi Oldenlandia ....................... 19

Hình 1.13. Các hợp chất anthraquinone phân lập được từ chi Hedyotis ................... 26

Hình 1.14 Các flavonoid được phân lập từ chi Oldenlandia .................................... 27

Hình 1.15. Các iridoid được phân lập từ chi Oldenlandia ........................................ 31

Hình 1.16. Hình ảnh cây An điền lá thông mọc ở Huế ............................................. 33

Hình 2.1 Mẫu tiêu bản cây Ngoại mộc tái ............................................................... 37

Hình 2.2 Mẫu tiêu bản cây Cày ri ta Hạ long .......................................................... 37

Hình 2.3 Mẫu cây An điền lá thông ......................................................................... 38

Hình 3.1 Sơ đồ chiết và phân lập các chất từ cây Ngoại mộc tái ............................. 45

Hình 3.2 Sơ đố chiết và phân lập các chất từ cây Cày ri ta Hạ long ........................ 49

Hình 3.3 Sơ đố chiết và phân lập các chất từ cây An điền lá thông ........................ 55

Hình 4.1 Cấu trúc của các hợp chất được phân lập từ cây Ngoại mộc tái ............... 60

Hình 4.2 Cấu trúc hóa học và một số tương tác chính trên phổ HMBC của AL1 ... 60

Hình 4.3. Phổ ESI-MS của AL1 ............................................................................... 61

Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của AL1 (CDCl3) ............................................................... 61

Hình 4.5. Phổ 13

C-NMR của AL1 (CDCl3) .............................................................. 62

Hình 4.6. Phổ HMBC của AL1 ................................................................................. 62

Hình 4.7. Phổ 1H-NMR của AL2 .............................................................................. 64

Hình 4.8. Phổ 13

C-NMR của AL2 ............................................................................. 65

Hình 4.10 Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ HMBC (HC) của CH1 . 68

iv

Hình 4.11 Phổ 1H-NMR của CH1 (CD3OD) ........................................................... 68

Hình 4.12 Phổ 13

C-NMR của CH1 (CD3OD) .......................................................... 69

Hình 4.13 Phổ HMBC của CH1 .............................................................................. 70

Hình 4.14 Phổ (-)-ESI-MS của CH2 ....................................................................... 71

Hình 4.15 Phổ 1H-NMR của CH2 (CDCl3 + CD3OD) ............................................ 71

Hình 4.16 Phổ 13

C-NMR của CH2 (CDCl3 + CD3OD) ........................................... 72

Hình 4.17 Cấu trúc và một số tương tác chính (HC) trên phổ HMBC của CH5 . 74

Hình 4.18. Phổ 1H NMR của CH5 (CD3OD) ........................................................... 75

Hình 4.19 Phổ 13

C-NMR của CH5 (CD3OD) .......................................................... 75

Hình 4.20. Phổ 1H-NMR của CH6 ........................................................................... 77

Hình 4.21 Phổ 13

C-NMR của CH6 (CD3OD) .......................................................... 78

Hình 4.22 Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ HMBC của CH9 .............. 81

Hình 4.23. Cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ cây An điền lá thông ....... 816

Hình 4.24 Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ HMBC (HC) của HP1 . 86

Hình 4.25 Phổ HR-ESI-MS của HP1 ...................................................................... 87

Hình 4.26 Phổ 1H-NMR của HP1 (CDCl3 + CD3OD) ............................................ 87

Hình 4.27 Phổ 13

C-NMR của HP1 (CDCl3 + CD3OD) ........................................... 88

Hình 4.28 Phổ 1H-NMR của HP1 (DMSO-d6) ........................................................ 89

Hình 4.29 Phổ HMBC của HP1 ............................................................................... 89

Hình 4.30 Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ HMBC (HC) của HP2 . 90

Hình 4.31 Phổ 1H-NMR của HP2 (CDCl3) ............................................................. 91

Hình 4.32 Phổ 13

C-NMR của HP2 (CDCl3) ............................................................ 91


Hình 4.34 Cấu trúc và một số tương tác xa trên phổ HMBC (HC) của HP4 ...... 94

Hình 4.35 Cấu trúc và một số tương tác xa trên phổ HMBC (HC) của HP5 ...... 95

Hình 4.36. Phổ (+) ESI-MS của HP5 ...................................................................... 96

Hình 4.38 Phổ 1H-NMR giãn của HP5 .................................................................... 97

Hình 4.39 Phổ 13

C-NMR của HP5 (CDCl3) ............................................................ 97


Hình 4.41. Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ COSY và HMBC của HP8 ... 101

Hình 4.42 Phổ (-)-ESI-MS của HP8 ...................................................................... 101

Hình 4.43 Phổ 1H-NMR của HP8 (CD3OD) ......................................................... 102

v

Hình 4.44 Phổ 13

C-NMR của HP8 (CD3OD) ........................................................ 103

Hình 4.45 Phổ DEPT của HP8 .............................................................................. 103

Hình 4.46. Phổ HMBC của HP8 ............................................................................. 104

Hình 4.47. Phổ COSY của HP8 .............................................................................. 105

Hình 4.48 Cấu trúc và một số tương tác chính (HC) trên phổ HMBC của HP10 .... 107

Hình 4.49. Phổ 1H-NMR của HP10 (MeOD) ......................................................... 107

Hình 4.50. Phổ 13

C-NMR của HP10 (CD3OD) ...................................................... 108

Hình 4.51. Phổ HMBC của HP10 ........................................................................... 108

Hình 4.52 Phổ ESI-MS của HP12 ........................................................................ 111

Hình 4.53 Phổ 1H-NMR của HP12 (CD3OD) ....................................................... 111

Hình 4.54 Phổ 13

C-NMR của HP12 (CD3OD) ...................................................... 112

Hình 4.55 Cấu trúc và một số tương tác chính (HC) trên phổ HMBC của HP13 .... 113

Hình 4.56 Phổ ESI-MS của HP13 ......................................................................... 113

Hình 4.57 Phổ 1H-NMR của HP13 (CD3OD) ....................................................... 114

Hình 4.58 Phổ DEPT của HP13 ............................................................................ 115

Hình 4.59 Phổ 13

C-NMR của HP13 (CD3OD) ...................................................... 115

Hình 4.60. Phổ HMBC của HP13 ........................................................................... 116

Hình 4.61. Số tế bào sống sót sau 24 giờ nuôi cấy ở 5 nồng độ khác nhau của cao

chiết n-butanol so với EtOH/H2O ........................................................................... 118

Hình 4.62. Phần trăm tế bào có hiện tượng apoptosis sau 24 giờ nuôi cấy với các

nồng 300, 150, 75, 37,5, 18,75 μg/mL của cao chiết n-butanol so với EtOH/H2O 119

Hình 4.63: Số tế bào trong pha G0/G1 của chu kỳ tế bào....................................... 120

Hình 4.64: Số tế bào trong pha S của chu kỳ tế bào ............................................... 120

Hình 4.65. Số tế bào trong pha G2/M của chu kỳ tế bào ......................................... 120

Hình 4.66. Cao chiết n-butanol và các hợp chất HP9, HP11, HP13, HP14 ức chế

tăng sinh tế bào K562 trong thời gian 72 giờ .......................................................... 121

Hình 4.67. Phần trăm tế bào K562 apoptosis gây ra bởi cao chiết n-butanol và các

hợp chất HP9, HP11, HP13, HP14 sau 24 giờ ...................................................... 123

Hình 4.68 Hình ảnh tế bào nhuộm Hoechst 33342 dưới tác động của cao chiết n-

butanol và các hợp chất HP9, HP11, HP13, HP14................................................ 123

Hình 4.69. Hoạt tính caspase 3 của cao chiết n-butanol và các hợp chất HP9, HP11,

HP13, HP14 trên tế bào K562 trong thời gian 24 giờ. ........................................... 124

1

MỞ ĐẦU

Ngày nay, kinh tế càng phát triển thì nhu cầu chăm sóc và bảo vệ sức khỏe

của cộng đồng càng trở nên cấp thiết Do đó, nhu cầu sử dụng thuốc để phòng ngừa

và chữa trị những căn bệnh nan y đặc biệt là bệnh ung thư ngày càng cao Theo Tổ

chức Y tế thế giới (WHO), ung thư là nguyên nhân gây tử vong thứ hai sau tim

mạch. Mỗi năm thế giới có thêm 14,1 triệu bệnh nhân mắc ung thư, 8,2 triệu người

tử vong vì căn bệnh này.

Hiện nay, một trong những hướng nghiên cứu thu hút các nhà khoa học để

tìm ra thuốc phòng ngừa và chữa trị ung thư là đi từ các hợp chất có nguồn gốc

thiên nhiên. Đến nay, nhiều hợp chất thiên nhiên hoặc các sản phẩm được tổng hợp,

bán tổng hợp từ các hợp chất tự nhiên đã được sử dụng một cách hiệu quả trong

việc điều trị, phòng ngừa bệnh ung thư và các bệnh tật khác giúp con người chống

lại bệnh tật, nâng cao sức khỏe cộng đồng. Các nhà khoa học vẫn đang cố gắng tìm

hiểu, khám phá tác dụng chống ung thư và các hoạt tính sinh học khác của các hợp

chất được phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau.

Việt Nam có nguồn thực vật phong phú và đa dạng với khoảng 12.000 loài

trong đó đã điều tra có gần 3 900 loài được sử dụng làm thuốc thuộc 309 họ. Song

bản chất hóa học của chúng cũng như mối quan hệ giữa cấu trúc hóa học và tác

dụng dược lý thì mới được biết rất ít hoặc chưa biết. Do đó, việc nghiên cứu về

thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thực vật nhằm tìm kiếm các

chất có hoạt tính có giá trị là rất cần thiết.

Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep.), Cày ri ta Hạ Long (Chirita

halongenis Kiew & T. H. Nguyen) là hai loài thực vật đặc hữu của Vịnh Hạ Long,

chưa được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. An điền lá

thông [Oldenlandia pinifolia (Wall. ex G. Don) Kuntze] có tác dụng thanh nhiệt,

giảm đau và chữa vết thương, tuy nhiên cho đến nay chỉ có một thông báo kết quả

ban đầu về thành phần hóa học và chưa có nghiên cứu nào về hoạt tính sinh học của

loài này.

Để đóng góp vào việc tìm hiểu, nghiên cứu, đánh giá, góp phần bảo tồn

những loài thực vật quý hiếm, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu thành phần

hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của ba loài: Ngoại mộc tái (Allophylus

2

livescens Gagnep.), Cày ri ta Hạ Long (Chirita halongenis Kiew & T. H.

Nguyen) và An điền lá thông [Oldenlandia pinifolia (Wall. ex G. Don) Kuntze]

của Việt Nam”.

Mục tiêu của luận án: Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế

bào của ba loài nêu trên của Việt Nam nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính gây

độc tế bào, làm cơ sở khoa học cho những nghiên cứu tiếp theo.

Nội dung luận án bao gồm:

1. Phân lập các hợp chất từ ba loài Allophylus livescens, Chirita halongensis

và Oldenlandia pinifolia ở Việt Nam bằng phương pháp sắc ký cột.

2 Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất phân lập được bằng các phương

pháp phổ MS, 1D-NMR, 2D-NMR.

3 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các dịch chiết và các hợp chất phân

lập được.

3

CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về chi Allophylus

1.1.1. Giới thiệu về thực vật chi Allophylus

Chi Allophylus là một trong những chi lớn nhất thuộc họ Bồ hòn

(Sapindaceae), gồm khoảng 255 loài [1], phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận

nhiệt đới, trong đó có khoảng 55 loài được tìm thấy ở Châu Á và Châu Đại Dương và

26 loài (Bảng 1.1) ở Việt Nam phân bố tại Bắc Giang, Lạng Sơn, Cao Bằng, Quảng

Ninh, Hà Nội [2a, 3].

Bảng 1.1. Các loài thực vật thuộc chi Allophylus ở Việt Nam

KH Tên Khoa học KH Tên Khoa học

1 A. brachypetalus Gagnep. 14 A. hirsutus Radlk.

2 A. brachystachyus Radlk. 15 A. laxiflorus Gagnep.

3 A. caudatus Radlk. 16 A. livescens Gagnep.

4 A. capillipes Gagnep. 17 A. longifolius Radlk.

5 A. cobbe (L.) Raeusch. 18 A.longipes Radlk.

6 A. cochinchinensis Lecomte. 19 A. macrodontus Merr.

7 A. dimorphus Radlk. 20 A. pallidus Radlk.

8 A. eustachys Radlk. 21 A. petelotii Merr.

9 A. fuscus Radlk. 22 A. racemosus Boerl.

10 A. glaber var acutissimus Radlk. 23 A. salinarius Gagnep.

11 A. grandiflorus Radlk. 24 A. serratus (Hiern.) Kurz.

12 A. grossedentatus (Turcz.) Fern.-Vill. 25 A. serrulatus Radlk.

13 A. hayatae Gagnep. 26 A. viridis Radlk.

Về đặc điểm thực vật, các loài thuộc chi Allophylus mọc hoang dưới tán rừng

thưa, trong lùm bụi, thường là những cây nhỏ hay cây bụi hay cây dây leo, có từ 3 -

5 lá chét. Hoa nhỏ, hình cầu, có cuống, cánh hoa đơn hay kép, nhị 8. Quả hạch hình

trứng ngược hay hình cầu [3].

1.1.2. Ứng dụng của chi Allophylus trong y học cổ truyền

Từ xa xưa, các loài thuộc chi Allophylus là những bài thuốc quý được con

người dùng để chữa các bệnh như kiết lỵ, điều trị gãy xương, phong thấp, viêm

thận, viêm gan [4]. Ở Ấn độ, lá của A. serratus được dùng để chữa bệnh vảy nến,

4

phù nề, gãy xương, phát ban, biếng ăn, một số rối loạn tiêu hóa [5]. Ở Việt Nam, vỏ

thân A. glaber dùng sắc uống chữa kiết lỵ [3]. Tuy nhiên, cho đến nay, trên thế giới

chỉ có rất ít công trình công bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi

Allophylus. Mặc dù vậy, các kết quả nghiên cứu cho thấy các loài thuộc chi này có

cấu trúc hóa học đa dạng và nhiều hoạt tính sinh học đáng quý

1.1.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Allophylus

Cho đến nay, trong số 255 loài của chi Allophylus, chỉ có rất ít loài được

nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học Đó là các loài A. longipes,

A. serratus, A. edulis, A. cobbe. Bộ phận của cây được nghiên cứu chủ yếu là hoa và

lá. Kết quả nghiên cứu cho thấy chúng là nguồn của các hợp chất phenol thuộc

nhóm chất flavonoid; các hợp chất ligan và tannin, terpenoid và các hợp chất khác.

1.1.3.1. Hợp chất phenol

Hợp chất flavonoid

Có 18 hợp chất flavonoid được phân lập từ các loài A. serratus, A. edulis và

A. laevigatus thuộc các khung chất tiêu biểu là flavonol và flavone, chủ yếu là các

C-glycosylflavone.

Bảng 1.2. Các hợp chất flavonoid được phân lập từ chi Allophylus

KH Hợp chất Tên loài TLTK

1 Luteolin-7-O--D-glucoside A. serratus [6]

2 Apigenin-4’-O--D-glucoside A. serratus [7]

3 Quercetin A. serratus [7]

4 Rutin A. serratus [7]

5 Vitexin 2"-O-rhamnoside A. edulis [8, 9]

6 Isovitexin A. edulis [8]

7 Vicenin -2 A. edulis [8]

8 Vitexin A. edulis [8]

9 Quercetin 3-O-(2"-O-galloyl)-glucoside A. edulis [8]

10 Mollupentin 2"-O-rhamnoside A. edulis [9]

11 Schaftoside A. edulis [9]

12 Lucenin-2 A. edulis [9]

5

13 Isovitexin 2"-O-rhamnoside A. edulis [9]

14 Isoorientin 2"-O-rhamnoside A. edulis [9]

15 Cerarvensin 2"-O-rhamnoside A. edulis [9]

16 Orientin 2"-O-rhamnoside A. edulis [9]

17 Saponarin A. edulis [9]

18 Apigenin-8-C-- rhamnoside A. laevigatus [10]

O

O

OH

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OO

OH

OH

OH

OH

O

O

R5

R4

R2

R1

R3

OOH

OH O

OH

O

OH

OH

OH

OH

O

O

OH

OH

OHO ORha

OHOH

O

O

OH

OH

OHO OH

OHOH

O

OH

OHOH

OH

OH

OOH

OH O

OH

O

OH

OH

OH

OH

OOH

OH

OH

OH

OOH

OH O

OHOOH

OH

OH

OH

O

OH

OHOH

OH O

OO

O

OHOH

O

OH

OH

HOH2C

OH

O

O

OH

OH

GlcO

OH

OH

OOH

OHOH

CH2OH

1 R1 = R2 = R4 = OH, R3 = H, R5 = OGlc

2 R1 = R3 = OH, R2 = OGlc, R4 =R5 = OH

3 R1 = R2 = R3 = R4 = R5 = OH

4

6

O

OH

OHOH

OH O

O

O

OHOH

CH2OH

O

OH

OH

OH

5

7

8 9 10

11 12

6

O

O

OH

OH

O

ORha

OH

OH

OH

OH

R

13 R = H

14 R = OH

O

O

OH

OH

OHO ORha

OH

OH

OH OH

O

O

OH

OH

O

ORha

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH

O

OOHO

OH

OH

OH

OH

OH

O

OH

O

OH

OH

O OH

OH

OH

15

16

17

18

Hình 1.1. Các hợp chất flavonoid phân lập được từ chi Allophylus

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được từ dịch

chiết n-butanol của cây A. edulis gồm vitexin 2"-O-rhamnoside (5), isovitexin (6),

vicenin-2 (7), vitexin (8) cho thấy chúng ức chế enzyme chuyển hóa angiotensin

(ACE) với giá trị IC50 tương đương với giá trị IC50 của geraniin và (±)-catechin

[10]. Một nghiên cứu khác cho thấy các hợp chất flavonoid vitexin 2"-O-

rhamnoside (5), isovitexin 2"-O-rhamnoside (13), isoorientin 2"-O-rhamnoside (14),

cerarvensin 2"-O-rhamnoside (15) và saponarin (17) có hoạt tính bảo vệ gan mạnh

trong phép thử CCl4 và galactosamine. Như vậy, hợp chất C-glycosylflavone là

thành phần chính bảo vệ gan của A. edulis [9]. Một công bố khác cho thấy hợp chất

rutin (4) phân lập được từ A. serratus có hoạt tính chống loãng xương đáng kể [11].

Các hợp chất phenol khác

Ngoài ra, có nhiều các hợp chất phenol thuộc lớp chất phenolic acid,

polyphenol cũng được phân lập từ chi Allophylus.

Bảng 1.3. Các hợp chất phenol được phân lập từ chi Allophylus


19 Bergenin A. edulis [8]

20 11-O-galloylbergenin A. edulis [9]

21 Gallic acid A. edulis [9]

22 4-Hydroxy-3-methoxybenzaldehyde A. longipes [12]

7

23 4-Hydroxy-3-methoxycinnamaldehyde A. longipes [12]

24 2',6'-dihydroxy-4'-

methoxyacetophenone

A. longipes [12]

25 4-Hydroxy-3-methoxybenzoic acid A. longipes [12]

26 Methyl asterrate A. longipes [12]

27 Scopoletin A. longipes [12]

28 Cleomiscosin A A. longipes [12]

O

O

O

O

OCH3

OH

O

OH

CH3

OO OH

OCH3

R3

R1

R5

R2

R4

21 R1 = R2 = R3 = OH, R4 = H, R5 = COOH

22 R1 = CHO, R2 = R5 = H, R3 = OCH3, R4 = OH

23 R1 = OCH3, R2 = OH, R3 = R4 = H, R5 = CH=CHCHO

24 R1 = R3 = OH, R2 = COCH3, R4 = H, R5 = OCH3

25 R1 = COOH, R2 = R5 = H, R3 = OCH3, R4 = OH

O

O

OH

MeO

O

OH

H

H

OH

OH

CH2OH

O

O

OH

MeO

O

OH

H

H

OH

OH

O

OH

OH

OH

O

O

OCH3

OH

OCH3

OHMeOOC

19 20

26

27

28

Hình 1.2. Một số hợp chất phenol được phân lập từ chi Allophylus

1.1.3.2. Hợp chất terpenoid và steroid

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi Allophylus cho

thấy chúng đều chứa thành phần steroid và terpenoid mà chủ yếu là triterpenoid.

Chúng được phân lập từ các loài Allophylus serratus, A. edulis, A. longipes và A.

africanus.

Bảng 1.4. Các hợp chất steroid và terpenoid được phân lập từ chi Allophylus


29 -sitosterol A. serratus [13, 14, 15]

30 Stigmasterol A. edulis [8]

31 Sitosterone A. edulis [14]

8

32 Lupeol A. edulis [14]

33 Cycloart-24-en-3, 26-diol A. longipes [12]

34 3-Oxotrirucalla-7, 24-dien-21-oic acid A. longipes [12]

35 Zizyberenalic acid A. longipes [12]

36 Colubrinic acid A. longipes [12]

37 Betulin A. longipes [12]

38 Aldehyde betulinic A. longipes [12]

39 Betulinic acid A. longipes [12]

40 3-hydroxy-5α, 8α -epidioxyergosta-6,

22-dien

A. longipes [12]

41 3-oxo-19-hydroxyurs-12-en-28-oic acid A. longipes [12]

42 Ursolic acid A. longipes [12]

43 Stigmastane-3β, 4β-diol A. africanus [16]

44 Hancokinoside A. africanus [16]

45 Allotaraxerolide A. africanus [16]

46 Alloprenol-11 A. caudatus [15]

47 Ficaprenol-11 A. caudatus [15]

OH

OH

OH

OH

HOOC

H

H

HO

OH

OH

H H

H

H H

H

29 30 31

3233 34

H

OH

HOH

O

H

H

OH

H

OH

HOH

O

H

H

OHH

H

H

H R

37 R = CH2OH

38 R = CHO

39 R = COOH35 36

9

OH

H

H

H

OO

OH

COOH

O

H

HCOOH

OH

H

H

OH

OH

H

H H

GlcO GlcO

40 41 42

43 44 45

OH5

OH3 6

46 47

Hình 1.3. Các hợp chất steroid và terpenoid được phân lập từ chi Allophylus

Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất -sitosterol (29) và lupeol (32) cho thấy

chúng có tác dụng tiêu diệt rệp Myzus persicae và bọ Epilachna paenulata [14].

1.1.3.3. Các hợp chất khác

Ngoài các lớp chất nêu trên, từ chi Allophylus còn phân lập được các hợp chất khác

Bảng 1.5. Các hợp chất khác được phân lập từ chi Allophylus


48 Phenacetamide A. serratus [13]

49 Pinitol A. serratus, A. edulis [7, 17]

50 Cardiospermin A. edulis [17]

51 4-O--D-glucopyranosyloxy-3-

hydroxymethyl butyronitrile-2-ene

A. edulis [17]

52 3-O--D-glucopyranosyloxy-4-

methyl-2(5H)-furanone

A. edulis [17]

53 L-quebrachitol A. edulis [18]

54 6,7-Epoxicaryophyllene A. edulis [14]

55 Spathulenol A. edulis [14]

56 2-Oxo-13-hydroxy-neo-cleroda-3,14- A. edulis [14]

10

dien

57 11-acetoxy-4-methoxyeudesmane A. laevigatus [10]

58 Carissone A. laevigatus [10]

59 Cyanolipidtyp I A. natalensis, A. dregenus [19]

60 Cyanolipidtyp III A. natalensis, A. dregenus [19]

61 4(15)- eudesmene-1,8α -diol A. longipes [12]

62 4(15)-eudesmene-1,5α -diol A. longipes [12]

63 Fraxidin A. longipes [12]

64 Alloeudesmenol A. africanus [16]

65 Alloaminoacetaldehyde A. africanus [16]

OHOH

OH

OCH3OH

OH

NHCOCH 3

CN

CH2OHO

OH

OHOH

OH

OGlc

CH2 OH

CN

H

O

CH3

O

OOH

OHOH

OH

O

OH

OH OOH OCOCH 3OMe

OH

H

H

H

H

OH

OHOH

OCH3OH

OH

OH48 49 50 51

52

53 54 55

56

5758

NC

H

O

O

CH2(CH2)17CH3

CH2(CH2)17CH3

O

O

O

ONCH

CH2(CH2)17CH3

O

CH2(CH2)17CH3

O

OHH

H

OH

59

60

61

OH

CH2

H

OH HH

OH

OHN

O

OO OH

OCH3

62

63

6465

Hình 1.4. Các hợp chất khác được phân lập từ chi Allophylus

11

1.1.4. Tình hình nghiên cứu cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep.)

Cây ngoại mộc tái có tên khoa học là Allophylus livescens tiểu mộc, nhánh

không lông, có bì khẩu nhỏ. Lá phụ bầu dục, to 7-10 x 3,5 – 4 cm, không lông, mặt

trên nâu, mặt dưới xanh, gân nâu, bìa có răng thấp, gân phụ 6 -7, cuống phụ 7 – 15

mm, cuống vàng nâu. Phát hoa dài 10 cm, nụ tròn to 2 mm, lá đài 4, rìa lông, cánh

hoa 4, cao 1mm, tiểu nhụy 8. Ở Việt Nam chỉ gặp cây này ở Vịnh Hạ Long [2]. Cho

đến nay, theo tra cứu tài liệu của chúng tôi chưa có một công bố nào về thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học của loài này.

Hình 1.5 Cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep.)

Nhận xét: Qua tra cứu tài liệu cho thấy một số loài thuộc chi Allophylus có

thành phần hóa học đa dạng, tuy nhiên, các nghiên cứu về hoạt tính sinh học các

loài thuộc chi Allophylus còn rất hạn chế. Ở Việt Nam và trên thế giới chưa có công

trình nào công bố về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học loài

Allophylus livescens. Việc nghiên cứu loài này sẽ góp phần làm sáng tỏ thêm thành

phần hóa học và hoạt tính sinh học, tạo cơ sở khoa học để có thể tìm kiếm được

những loại thuốc mới cho các bệnh như bệnh tim mạch, tiểu đường, nhiễm trùng do

vi khuẩn, bệnh đau đớn như loãng xương, viêm khớp, bỏng, vết cắt, vết thương và

gãy xương

1.2. Tổng quan về chi Chirita

1.2.1. Giới thiệu về thực vật chi Chirita

Chi Chirita thuộc họ Rau tai voi (Gesneriaceae) có nguồn gốc từ Indonesia,

Malaysia và miền Nam Trung Quốc. Theo các tài liệu đã công bố, đến nay các nhà

khoa học đã phát hiện được trên 182 loài và khoảng 100 loài trong số đó là cây đặc

hữu của Trung Quốc [1]. Ở Việt Nam có 21 loài thuộc chi Chirita [2b, 20] được

trình bày ở bảng 1.6.

12

Bảng 1.6 Danh sách các loài thuộc chi Chirita ở Việt Nam

STT Tên loài STT Tên loài

1 C. anachoreta Hance. 12 C. involucrata Craib.

2 C. annamensis Pellegr. 13 C. lavandulacea Stapf.

3 C. aratriformis D. Wood. 14 C. macrophylla Wall.

4 C. balansae Drake. 15 C. minutihamata D. Wood.

5 C. colaniae Pellegr. 16 C. poilanei Pellegr.

6 C. corniculata Pellegr. 17 C. pumila D. Don.

7 C. cycnostyla B.L. Burtt. 18 C. semicontorta Pellegr.

8 C. drakei B.L. Burtt. 19 C. speciosa Kurz.

9 C. eberhardtii Pellegr. 20 C. pellegriniana B.L.Burtt.

10 C. gemella D. Wood. 21 C. halongensis Kiew & T. H. Nguyen.

11 C. hamosa R. Brown.

Về đặc điểm thực vật, hầu hết các loài thuộc chi này thường là cây thân thảo,

sống trên đất hoặc đá, cây cao từ 40–50 cm, thân mềm, dễ gãy, có lông mịn, lá hình

trái tim, hoa hình ống với năm thùy cánh hoa, thường thuôn tròn, có màu sắc sặc sỡ,

đa số có màu xanh tím sẫm, ngoài ra còn có những màu khác [21].

1.2.2. Ứng dụng của chi Chirita trong y học cổ truyền

Trong số 182 loài thuộc chi Chirita đã biết, có một số loài được sử dụng

trong y học dân gian làm thuốc chữa lao, cao huyết áp, cầm máu hoặc đắp ngoài vết

thương [3, 21]. Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Chirita eburnea được dùng làm

thuốc trị ho ra máu và các bệnh suy giảm miễn dịch [22-24]. C. fimbrisepala được

dùng làm thuốc kháng viêm như viêm gan, viêm ruột [25]. C. hamosa chữa vết

thương nhiễm trùng [26]. Ở Việt Nam, dân gian dùng cây C. hamosa trị tiểu tiện bất

lợi và rắn cắn. Cho đến nay, trên thế giới chỉ có rất ít công trình công bố về nghiên

cứu hóa học và hoạt tính sinh học của các loài trong chi Chirita. Mặc dù vậy, các

nghiên cứu đó đã chỉ ra các kết quả đáng quan tâm.

1.2.3. Các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi

Chirita

Trong tổng số 182 loài của chi Chirita cho đến nay mới chỉ có sáu loài công

bố kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học, đó là các loài C. calignosa, C.

13

eburnea, C. fimbrisepala, C. longgangensis, C. sinensis và C. drakei. Các nghiên

cứu về thành phần hóa học cho thấy lớp chất trong chi này bao gồm phenylethanoid,

quinone, flavonoid, triterpenoid và một số nhóm chất khác.

1.2.3.1. Các hợp chất phenylethanoid

Các phenylethanoid được phân lập chủ yếu ở dạng phenylethanoid monoglycoside

và diglycoside với các gốc caffeoyl, feruloyl thường gắn ở các vị trí C-2, C-3, C-4

và C-6 của đơn vị đường glucose trong phân tử [27, 28].

Bảng 1.7 Các hợp chất phenylethanoid được phân lập từ chi Chirita

Ký hiệu Tên chất TLTK

66 3,4-Dihydroxyphenyl alcohol β-D-glucopyranoside [29]

67 Plantainoside B [22]

68 Plantainoside A [22, 30]

69 Calceolarioside A [30]

70 Calceolarioside B [30]

71 Plantainoside D [29]

72 Scroside E [29]

73 Plantamajoside [29]

74 Chiritoside A [29]

75 Chiritoside B [30]

76 Chiritoside C [30, 31]

77 Cusianoside B [31]

78 Chiridrakoside A [31]

79 Chiridrakoside B [31]

80 2-(3,4-Dihydroxyphenyl) ethyl-β-D-glucopyranoside [31]

81 Desrhamnosyl isoacteoside [31]

82 Brachyanin D [31]

O

OR1

R2O

R3O

OR4

O OH

OH

OH

OH O

GluO

OH O

OH

H3CO O

Caffeoyl Glucaff Feruloyl

14

OH

OH

OO O

O

OHO

O

OH

OHOH

OH

OH

OH

OH

OH

OO O

O

OHO

O

OH

OHOH

OH

OH

OH

OH

77 78

8079

OH

OHO

OH

OH

OH

O

OHOH

OH

O

O

O O

O

OHOR

O

OH

OHOH

OH

OH

66 R1 = R2 = R3 = R4 = H 72 R1 = R3 = H, R2 = Glc, R4 = feruloyl

67 R1 = caffeoyl, R2 = R3 = R4 = H 73 R1 = R4 = H, R2 = Glc, R3 = caffeoyl

68 R1 = R3 = R4 = H, R2 = caffeoyl 74 R1 = R3 = R4 = H, R2 = glucaff



71 R1 = R3 = H, R2 = Glc, R4 = caffeoyl

OH

OH

O

O

O O

OH

OHOH

OH

OH

OO

OHOH

OH

OHOOH

OH

OH

O

81 82

Hình 1.6. Các hợp chất phenylethanoid được phân lập từ chi Chirita

Hai hợp chất chiridrakoside A (78) và chiridrakoside B (79) lần đầu tiên

được phân lập và chỉ thấy ở chi Chirita trong đó chất (79) là một chất hấp thụ ánh

sáng cực tím tiềm năng [31].

1.2.3.2. Các hợp chất quinone

Các hợp chất khung anthraquinone được tìm thấy khá phổ biến trong các loài

thuộc chi Chirita. Các dẫn xuất này thường có nhóm hydroxyl hoặc hydroxymethyl,

methoxy gắn vào các vị trí trên khung anthraquinone. Các hợp chất này được phân

lập từ các loài C. eburnea và C. longgangensis.

Bảng 1.8 Các hợp chất quinone được phân lập từ chi Chirita

KH Tên chất TLTK

83 1,7-Dihydroxy-2-hydroxymethylanthraquinone [23]

84 1-Hydroxy-2-hydroxymethylanthraquinone [23]

85 1,4-Dihydroxy-2-hydroxymethylanthraquinone [23]

15

86 1,7-Dihydroxy-2-methylanthraquinone [23]

87 1,7-Dihydroxy-6-methoxy-2-methylanthraquinone [23]

88 1-Hydroxy-2-methoxy-7-methylanthraquinone [23]

89 1,2-Dihydroxy-6-methylanthraquinone [23]

90 2-Hydroxy-7-methylanthraquinone [32]

91 2-Methylanthraquinone [32]

92 (R)-7-hydroxy-α-dunnione [32]

93 (R)-8-hydroxy-α-dunnione [32]

94 (R)-7,8-dihydroxy-α-dunnione [32]

95 (R)-7-methoxy-6,8-dihydroxy-α-dunnione [32]

96 (R)-α-dunnione [32]

97 (-)-8-hydroxy-α-dunnione [33]

98 Chiritalone A [33]

99 Chiritalone B [33]

100 2,5-dimethoxy-1,4-benzoquinone [33]

101 Methyl 3-(4’-hydroxyphenethylamino)-1,4-dihydro-

1,4-dioxonaphthalene-2-carboxylate

[24]

102 Digiferruginol [31]

O

O

R1

R2

R3

R4

R5

O

O

O

R1

R2

R3

83 R1 = R5 = OH, R2 = CH2OH, R3 = R4 = H

84 R1 = OH, R2 = CH2OH, R3 = R4 = R5 = H

85 R1 = OH, R2 = CH2OH, R3 = OH, R4 = R5 = H

86 R1 = R5 = OH, R2 = Me, R3 = R4 = H

87 R1 = R5 = OH, R2 = Me, R3 = H R4 = OMe

88 R1 = OH, R2 = OMe, R3 = R4 = H, R5 = Me

89 R1= R2 = OH, R3 = R5 = H, R4 = Me

90 R1 = R3 = R4 = H, R2 = OH, R5 = Me

91 R1 = R3 = R4 = R5 = H, R2 = Me

92 R1 = R3 = H, R2 = OH

93 R1 = R2 = H, R3 = OH

94 R1 = H, R2 = R3 = OH

95 R1 = R3 = OH, R2 = OMe

96 R1 = R2 = R3 = H

97 R1 = R2 = H, R3 = OH

O

O

OMe

MeO

O

OH O OH

OHR

2R1

N

O

O

O O

H

10098 R1 = R2 = OH

99 R1 = OH, R2 = H

101

O

O

OH

OH

102

Hình 1.7. Các hợp chất quinone được phân lập từ chi Chirita

16

Hai hợp chất mới (R)-7,8-dihydroxy-α-dunnione (94) và (R)-7-methoxy-6,8-

dihydroxy-α-dunnione (95) của cây C. eburnea đều thể hiện hoạt tính tiêu diệt gốc tự

do với giá trị IC50 tương ứng là 124,82 ± 8,4 µM, và 45,72 ± 3,6 µM, trong khi của

ascorbat là 86,91 ± 6,8 µM [32].

1.2.3.3. Các hợp chất flavonoid

Có bốn hợp chất flavonoid được phân lập từ các loài C. fimbrisepala và

C.calignosa thuộc ba loại khung chất tiêu biểu là flavone, flavonol và

anthocyanidin.

Bảng 1.9. Các hợp chất flavonoid được phân lập từ chi Chirita

KH Tên chất TLTK

103 Kaempferol [25]

104 Hispidulin [25]

105 Malvidin 3-O-β-D-arabinopyranosyl-5-O-β-D-glucopyranoside [26]

106 Mahuangchiside [25]

OOH

OH O

OH

R1R

2 O+

OH

OGlcOAra

OMe

OH

OH

OH OO

O

OH O

OH

O

OO

OHOH

OH

105106

103 R1 = OH, R2 = H

104 R1 = H, R2 = OMe

Hình 1.8. Các hợp chất flavonoid được phân lập từ chi Chirita

Các nghiên cứu cho thấy hợp chất kaempferol (103) thể hiện nhiều hoạt tính

sinh học đáng quan tâm như hoạt tính chống oxi hóa [34], ức chế sự tăng sinh của tế

bào ung thư ở người như ung thư vú (MCF-7), ung thư dạ dày (SGC-7901), ung thư

biểu mô cổ tử cung (Hela) và ung thư phổi (A549) và kháng viêm [35].

1.2.3.4. Các hợp chất triterpenoid

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi Chirita cho

thấy chúng đều chứa thành phần triterpenoid Chúng được phân lập được từ các loài

C. eburnea, C. fimbrisepala và C. longgangensis, C. drakei.

17

Bảng 1.10. Các hợp chất triterpenoid được phân lập từ chi Chirita

KH Tên chất TLTK

42 Ursolic acid [32]

107 β-Sideosteryl-D-glucoside-6’-palmitate [32]

108 Cycloart-23-ene-3β,25-diol [26]

109 Ikshusterol [26]

110 3β-Hydroxystigmast-4-en-7-one [26]

111 6β-Hydroxystigmast-4-en-3-one [26]

112 5α,8α-Peroxyergosterol [26]

113 Ergosta-5,22-diene-3β,7β-diol [26]

114 Ergost-4-en-3-one [26]

115 24-Methylene-lanost-8-en-3β-ol [31]

116 3α,24-Dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid [31]

OO

OHOH

OH

OCOC 15H31

110

OH

H

H

H

O

H

111

O

H

H

H

H

OH109

OH

H

H

H

OH

H

107108

OH

H

H

OHH

OH

H

H

H

H

OH

113

O

H

H

H

H

114OH

O

H

H

H

O

112

OH

H H

CH2OH

OH

COOH

115 116

Hình 1.9. Các hợp chất triterpenoid được phân lập từ chi Chirita

18

1.2.3.5. Các nhóm chất khác

Ngoài các lớp chất nêu trên, từ chi Chirita còn phân lập được các hợp chất khác.

Bảng 1.11. Các nhóm chất khác được phân lập từ chi Chirita

KH Tên chất TLTK

117 1,4-Dihydroxy-2-naphthalenecarboxylic methyl ester 4-O-α-L-

rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside acid

[36]

118 Isotaxiresinol 4-O-methyl ether [32]

119 Vanilic acid [32]

120 7'E-4,9-Dihydroxy-3,3',5'-trimethoxy-8,4'-oxyneolign-7'-en-9'-al [33]

121 (+)-Lariciresinol [31]

122 (+)-Isolariciresinol [31]

123 Cannabiside B [31]

124 Epoxyconiferyl alcohol [31]

OH

COOCH 3

OOO

OHOH

OH O

OH

OH

OH

H3CO

H3CO

CH2OH

CH2OH

H

H

OH

OH

H

COOH

OCH3

OH117 118 119

OH

O

OH

OH

MeOO

MeO

MeO

120

OH

O

O

OH

OH

O

H

H

121

O

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

OO

O

OH

OH

OHOH

O

O

122 123 124

Hình 1.10. Các nhóm chất khác được phân lập từ chi Chirita

Hợp chất ursolic acid (42) thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với các tế

bào dòng ung thư phổi dòng A-549, tế bào bạch cầu lympho P-388 và L-1210 và tế

bào ung thư biểu mô KB khi tiến hành thử nghiệm trên các tế bào da chuột [37, 38].

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên bốn dòng tế bào ung thư: ung thư

biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (LU-1) và MCF7 cho thấy

19

epoxyconiferyl alcohol (124), một phenylpropanoid với nhóm epoxy và hydroxyl

trong phân tử ức chế mạnh đối với tất cả các dòng tế bào thử nghiệm với IC50 đạt

46-128 μM [31].

1.2.4. Tình hình nghiên cứu cây Cày ri ta Hạ long (Chirita halongensis)

Đặc điểm mô tả: Cây Chirita halongensis Kiew & T. H. Nguyen thuộc họ

Gesneriaceae, tên đồng nghĩa là Primulina halongensis (Kiew & T. H. Nguyen

Mich) Möller & A.Weber, là thực vật đặc hữu của Cát Bà, Hạ Long, cây thân rễ lớn

khoảng 11x 2-2,5 cm Lá đa dạng, đối diện nhau, to 4 x 0,75 cm. Hoa dạng chùm,

màu tím. Quả với cuống dài 13-30 mm, quả nang hình trụ hẹp, màu nâu đỏ [20].

Hình 1.11. Hình ảnh cây Chirita halongensis

Theo tra cứu tài liệu của chúng tôi, cho đến nay chưa có công bố nào về

thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài C. halongensis và chỉ có duy nhất

loài C. drakei Burtt ở Việt Nam được nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt

tính sinh học [31, 39, 40].

Nhận xét: Một số loài thuộc chi Chirita được sử dụng trong y học cổ truyền

có tác dụng chữa bệnh như viêm gan, trị ho, viêm khớp, thiếu máu, gãy xương

Các công trình công bố về thành phần hóa học các loài thuộc chi Chirita cho thấy

chúng chứa nhiều lớp chất với cấu trúc đa dạng như các hợp chất phenylethanoid

glycoside, quinone, flavonoid, triterpenoid và các hợp chất khác. Tuy nhiên, các

nghiên cứu về hoạt tính sinh học các loài thuộc chi Chirita còn rất hạn chế. Ở Việt

Nam và trên thế giới chưa có công trình nào công bố về thành phần hóa học cũng

như hoạt tính sinh học loài C. halongensis. Việc nghiên cứu loài này sẽ góp phần

làm sáng tỏ thêm thành phần hóa học và định hướng nghiên cứu ứng dụng tiếp theo.

1.3. Tổng quan về chi Oldenlandia

1.3.1. Giới thiệu thực vật về chi Oldenlandia

20

Chi Oldenlandia thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) có khoảng 276 loài, phân bố

rộng ở khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới, chủ yếu ở Châu Phi và Châu Á, thường

mọc ở trong rừng, ven rừng nơi đất ẩm, từ vùng núi cao, đất cát ven biển [41].

Trước đây, nhiều loài thuộc chi Oldenlandia được đặt vào chi Hedyotis và ngược lại

[42]. Ở Việt Nam, chi Oldenlandia có 58 loài (Bảng 1.12) [2c, 43].

Bảng 1.12. Các loài thuộc chi Oldenlandia ở Việt Nam

STT Tên loài Tên đồng nghĩa

1 O. acutangula (Champ. ex Benth) Hook. Hedyotis acutangula Champ. ex

Benth.

2 O. auricularia (L.) K. Schum H. auricularia L.

3 O. biflora L. H. biflora (L.) Lamk.

4 O. brachiata (Wight) Hook. f. H. brachiata Wight in Wight &

Arn.

5 O. capitellata (Wall. ex G. Don) Kuntze H. capitellata Wall. ex G. Don

6 O. chereevensis Pierre ex Pit. H.chereevensis (Pierre ex Pit.)

Fukuoka

7 O. chevalieri Pit. H. chevalieri (Pitard) Phamh.

8 O. contracta Pierre ex Pit. H. contracta (Pierre ex Pit.) Phamh.

9 O. corymbosa L. H.corymbosa (L.) Lamk.

10 O. crassifolia DC. O. strigulosa Bartl. ex DC

11 O. diffusa (Willd.) Roxb Hedyotis diffusa Willd.

12 O. elegans (Wall. ex Hook. f.) Kuntze H. elegans Wall. ex Hook. f.

13 O. fraterna Pierre ex Pitard. H. fraterna (Pierre ex Pit.) Phamh

14 O. grandis Pit. H. grandis Pit..

15 O. havilandii (King) Pitard H. havilandii King

16 O. hedyotidea (DC.) Hand. H. hedyotidea (DC.) Merr.

17 O. herbacea (L.) Roxb. H. herbacea L.

18 O. heynii (R. Br. ex Wight & Arn.) Hook.f. H. heynii R. Br. ex Wight & Arn.

19 O. hirsuta L. f. H. hirsuta (L. f.) Spreng.

20 O. justiciformis Pierre ex Pit. H. justiciformis Pit.

21 O. krewanhensis Pierre ex Pit. H. krewanhensis Pit.

22 O. labialis Pierre ex Pit. H. labialis (Pierre ex Pit.) Phamh.

23 O. lecomtei Pit. H. lecomtei Pit.

24 O. leptoneura Pit. H. leptoneura Pit.

25 O. linneata Roxb H. linneata (Roxb) Kuntze

26 O. macrosepala Pit. H. macrosepala Pit.

27 O. coronate Williams H. merguensis Hook.f.

21

28 O. microcephala Pierre ex Pit. H. microcephala Pierre ex Pit.

29 O. mouretii Pit. H. mouretii (Pit.)Phamh.

30 O. multiglomerulata Pit. H. multiglomerulata (Pit.) Phamh

31 O. nudicaulis Roth. H. ovatifolia Cav.

32 O. oligocephala Pierre ex Pit. H. oligocephala (Pit.) Phamh.

33 O. ovatifolia (Cav.) DC. H. ovatifolia Cav.

34 O. congesta (G.Don) Kuntze H. philippensis (Spreng) Merr.

35 O. pierrei Pit. H. pierrei (Pit.) Phamh.

36 O. pilulifera Pit. H. pilulifera (Pit.) T. N. Ninh

37 O. pinifolia (G.Don) Kuntze H. pinifolia G.Don.

38 O. precox Pierre ex Pit. H. precox Pit.

39 O. pressa Pierre ex Pit. H. pressa Pierre ex Pit.

40 O. pruinosa (Wight & Arn) Kuntze H. pruinosa Wight & Arn

41 O. quocensis Pierre ex Pit. H. quocensis Pierre ex Pit.

42 O. racemosa (Lamk.) Pierre ex Pit. H. racemosa Lamk.

43 O. robinsonii Pit. H. robinsonii (Pit.) T. N. Ninh

44 O. rudis Pierre ex Pit. H. rudis Pierre ex Pit.

45 O. scandens Kuntze H. scandens Roxb

46 O. scoparia Pierre ex Pit. H. scoparia Pit.

47 O. stipulate (R. Br. ex Hook. f) Pitard H. stipulate R. Br. ex Hook. f.

Pitard

48 O. symplociformis Pierre ex Pit. H. symplociformis Pit.

49 O. tenelliflora (Blume) Kuntze H. tenelliflora Blume

50 O. ternate Pierre ex Pit. H. ternate Pit.

51 O. tetrangualaris Korth. H. tetrangualaris (Korth.) Walp.

52 O. tonkinensis Pitard H. tonkinensis (Pitard) Phamh.

53 O. trinerva Retz H. trinerva (Retz) Roem & Schult

54 O. valeriahelloides Pit. H. valeriahelloides Pit.

55 O. valida Pitard H. valida Pierre ex Pitard

56 O. hispida Benth. H. hispida Retz.

57 O. vestita (R. Br. ex G. Don) Drake H. vestita R. Br. ex Hook. f.

58 O. wallichii (Kurz) Pitard H. wallichii Kurz

Các loài thuộc chi Oldenlandia thường là cây thảo mộc nhỏ, cây phát triển

dạng bò hoặc leo. Lá mọc đối, hoa dạng chùm tán ở ngọn, tràng hoa hình ống khác

nhau, nhị 4 hoặc 5. Quả tròn hay hình xoan [3].

1.2.2. Ứng dụng của chi Oldenlandia trong y học cổ truyền

Theo y học cổ truyền trên thế giới, các loài trong chi Oldenlandia có nhiều

22

công dụng khác nhau được biết đến. Ở Ấn Độ, lá cây O. diffusa được dùng để chữa

bệnh lậu, sốt, máu xấu. Lá cây O. biflora được dùng để hạ sốt, điều trị viêm nhiễm

dạ dày và trầm cảm [44]. Ở Trung Quốc, hơn 20 loài thuộc chi này đã được sử dụng

làm thuốc. Phổ biến nhất là O. diffusa và O. corymbosa, được xem là thành phần

chính có hoạt tính của một số loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc, điển hình như O.

diffusa được dùng chữa ung thư [45]. Ở Việt Nam, nhiều loài thuộc chi Oldenlandia

đã được sử dụng làm thuốc như bách hoa xà thiệt thảo (O. diffusa) có tác dụng

thanh nhiệt, giải độc, giảm đau, tiêu ung tán kết, chữa viêm gan, viêm họng, lợi tiểu

và trị ung nhọt, u bướu [2c]. Cho đến nay, trên thế giới đã có nhiều công trình

nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài trong chi

Oldenlandia. Các nghiên cứu đó đã chỉ ra các kết quả đáng quan tâm.

1.2.3. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi Oldenlandia

Cho đến nay, mới có khoảng hơn 20 loài thuộc chi Oldenlandia được nghiên

cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, đối tượng được nghiên cứu nhiều

nhất là Oldenlandia diffusa. Các nghiên cứu về chi Oldenlandia tập trung chủ yếu

của các tác giả nước ngoài như Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan, Malaysia Bộ phận

của cây được nghiên cứu rất đa dạng: toàn cây, lá, rễ hoặc kết hợp cả thân và rễ.

Nghiên cứu đầu tiên về chi Oldenlandia được công bố năm 1933 ở Ấn Độ bởi Dey và

Lakshminarayan [46]. Cấu trúc của các hợp chất được phân lập từ chi Oldenlandia

rất đa dạng và phong phú gồm các lớp chất anthraquinone, flavonoid, iridoid, ligan,

các terpenoid và steroid, saponin và một số hợp chất khác với phổ hoạt tính sinh học

rộng và mạnh. Mỗi lớp chất chứa nhiều đặc điểm lý thú về mặt cấu trúc do xuất hiện

nhiều trung tâm lập thể, nhiều dạng đồng phân và sự đa dạng các loại nhóm thế.

1.2.3.1. Các alkaloid từ chi Oldenlandia

Alkaloid xuất hiện ở một số loài thuộc chi Oldenlandia như O. auricularia,

O. chrysotricha (tên đồng nghĩa Hedyotis chrysotricha) và O. capitellata var. mollis

Pierre ex Pit., tồn tại ở một số khung cơ bản như bis-indole, β-carboline Điểm đáng

lưu ý của các khung này là hiện tượng đồng phân hóa làm cho cấu trúc của chúng

thêm đa dạng Cho đến nay, có 9 hợp chất alkaloid được phân lập từ chi Oldenlandia

trong đó có 5 chất mới.

23

Bảng 1.13. Các alkaloid được phân lập từ chi Oldenlandia

KH Tên hợp chất Tên loài TLTK

125 10(S)-hydroxy pheophytin a O. diffusa [47]

126 Auricularine O. auricularia [48]

127 Chrysotricine O. chrysotricha, O. capitellata [49-51]

128 Capitelline O. capitellata [51]

129 (-)-Isocyclocapitelline O.capitellata [51]

130 (+)-Cyclocapitelline O. capitellata [51]

131 Isochrysotricine O. capitellata [51]

132 Hedyocapitelline O. capitellata [51]

133 Hedyocapitine O. capitellata [51]

NH

CH3 O

O

CH3

CH3

NCH3

CH3 133

NN

O

OH

Me

131

NN

H

O

OH

130

NN

CH3

O

CH3

CH3

132

126

125

HH

NH

N

H

NHN

NH N

NH

OO

NH

OOH

O O

127

NNH

Me

O

OH

NN

OH

OH

H

128

NN

H

O

OH

129

Hình 1.12 Các hợp chất alkaloid phân lập được từ chi Oldenlandia

Hợp chất chrysotricine (127) có tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư

máu HL-60 đạt tỉ lệ 63% ở nồng độ 10µM [49].

1.2.3.2. Các anthraquinone từ chi Oldenlandia

Anthraquinone (AQ), là hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng khối u

24

mạnh, là nhóm hợp chất lớn được tìm thấy nhiều ở chi Oldenlandia. Theo thống kê của

chúng tôi về các công trình đã công bố có 33 hợp chất anthraquinone được phân lập

từ chi Oldenlandia. Các hợp chất này là dẫn xuất của 9, 10-anthraquinone với các

nhóm thế là hydroxyl, methyl, methoxy và hydroxymethyl, chỉ có hợp chất (150),

(151) là dẫn xuất của 1,4-anthraquinone.

KH Tên hợp chất Tên loài TLTK

134 2,3-Dimethoxy-6-methyl-9,10-AQ O. diffusa [52]

135 2-Methyl-3-methoxy-9,10- AQ O. diffusa [52]

136 2-Methyl-3-hydroxy-9,10- AQ O. diffusa [52]

137 2-Methyl-3-hydroxy-4-methoxy-9,10- AQ O. diffusa [52]

138 3-Hydroxy-2-formyl-1-methoxy-9,10- AQ O. diffusa [53]

139 3-Hydroxy-2-methyl-1-methoxy-9,10- AQ O. diffusa [53]

140 2,6-Dihydroxy-3-methyl-4-methoxy-9,10- AQ O. diffusa [54]

141 2,7- Dihydroxy-3-methyl -9,10-AQ O. diffusa [54, 55]

142 2-Hydroxy-3-methoxy-6-methyl-9,10- AQ O. diffusa [55, 56]

143 2-Hydroxy-3-methoxy-7-methyl-9,10- AQ O. diffusa [55, 56]

144 2-Hydroxy-6-methyl-9,10- AQ O. diffusa [55, 56]

145 2-Hydroxy-7-hydromethyl-3-methoxy-9,10-AQ O. diffusa [55, 56]

146 Anthragallol 1,2-dimethyl ether O. umbellata [57]

147 Anthragallol 1,3-dimethyl ether O. umbellata [57]

148 2-Hydroxy-1-methoxy-3-methyl-9,10- AQ O. diffusa [56]

149 2,3-Dimethoxy-9-hydroxy-l,4- AQ O. dichotoma,

O. herbacea

[58, 59]

150 2-Hydroxymethyl-10-hydroxy-l,4- AQ O. herbacea [59]

151 1,4-Dihydroxy-2,3-dimethoxy-AQ O. dichotoma,

O. herbacea

[58, 59]

85 l,4-Dihydroxy-2-hydroxymethyl-AQ O. herbacea [59]

152 Lucidin-3-O-β-glucoside O. capitellata [60]

153 Rubiadin O. capitellata [60]

154 Anthragallol 2-methyl ether O. capitellata [60]

155 Rubiadin 1-methyl ether O. capitellata [60]

156 2-Hydroxy-3-methyl-9,10- AQ O. capitellata [60]

157 Capitellataquinone A O. capitellata [60]

25

158 Capitellataquinone B O. capitellata [60]

159 Capitellataquinone C O. capitellata [60]

160 Capitellataquinone D O. capitellata [60]

161 1,6-Dihydroxy-7-methoxy-2-methyl-9,10- AQ O. pinifolia [61]

162 1,6-Dihydroxy-2-methyl-9,10- AQ O. pinifolia [61]

163 3,6-Dihydroxy-2-methyl-9,10- AQ O. pinifolia [61]

164 1,3,6-Trihydroxy-2-methyl-9,10- AQ O. pinifolia [61]

165 1-Methoxy-2-hydroxy-9,10- AQ O. corymbosa

O. diffusa

[62, 63]

Bảng 1.14. Các anthraquinone được phân lập từ chi Oldenlandia

8

5

7

6

92

3

1

4

O

O

R2

R3

R6

R5

R4

R1

R1 R2 R3 R4 R5 R6 R1 R2 R3 R4 R5 R6

134 H OMe OMe H Me H 147 OMe OH OMe H H H

135 H Me OMe H H H 148 OMe OH Me H H H

136 H Me OH H H H 151 OH OMe OMe OH H H

137 H Me OH OMe H H 152 OH CH2OH OGlc H H H

138 OMe CHO OH H H H 153 OH Me OH H H H

139 OMe Me OH H H H 154 OH OMe OH H H H

140 H OH Me OMe OH H 155 OMe Me OH H H H

141 H OH Me H H OH 156 H OH Me H H H

142 H OH OMe H Me H 161 OH Me H H OH OMe

143 H OH OMe H H Me 162 OH Me H H OH H

144 H OH H H Me H 163 H Me OH H OH H

145 H OH OMe H H CH2OH 164 OH Me OH H OH H

146 OMe OMe OH H H H 165 OMe OH H H H

10

R3

O

O

R1

O

OH

HR

2

R3

R4

R1

R2

O

O

149 R1 = OMe, R2 = OMe, R3 = OH, R4 = H

150 R1 = CH2OH, R2 = R3 = H, R4 = OH

157 R1 = CH2OH, R2 = H, R3 = OH

158 R1 = CH2OH, R2 = OH, R3 = OH

159 R1 = CH2OH, R2 = R3 = H

160 R1 = Me, R2 = R3 = H

Hình 1.13. Các hợp chất anthraquinone phân lập được từ chi Oldenlandia

Hai hợp chất 2-hydroxy-3-methyl-9,10-anthraquinone (156) và 1-methoxy-2-

26

hydroxy-9,10-anthraquinone (165) được nhóm nghiên cứu của Shi phân lập từ O.

diffusa có hoạt tính ức chế protein tyrosine kinase v-src và pp60src và ngăn chặn sự

phát triển của dòng tế bào ung thư phổi SPC-1-A, tế bào ung thư vú Bcap-37 và tế

bào ung thư gan HepG2, trong đó hợp chất (156) thể hiện hoạt tính ức chế sự phát

triển của 3 dòng ung thư này mạnh hơn hợp chất (165) [63]. Ngoài ra, hợp chất

(146) còn có khả năng tiêu diệt tế bào ung thư vú ở người MCF-7 với giá trị EC50

đạt 18,62 ± 2,71 µM và 42,19 ± 3,4µM trong thời gian 24 và 48 giờ qua con đường

Ca2+

/calpain/caspase-4 [64]. Hai hợp chất (146) và (147) thể hiện hoạt tính ức chế

đáng kể dòng tế bào gây ung thư biểu mô phổi A549 và tế bào ung thư biểu mô

tuyến vú MDA-MB-231 [57].

1.2.3.3. Các flavonoid từ chi Oldenlandia

Flavonoid là lớp chất được tìm thấy nhiều trong họ Cà phê và có trong 7 loài

loài thuộc chi Oldenlandia: O. diffusa, O. herbacea, O. cristata (tên đồng nghĩa

Hedyotis vestita), O. verticillata, O. pressa và O. dichotoma. Nhìn chung, các

flavonoid phân lập từ chi Oldenlandia đều thuộc nhóm flavonol. Bên cạnh các

flavonol thường gặp còn xuất hiện nhiều hợp chất flavonoid glycoside có chứa hợp

phần feruloyl khá đặc trưng Có 23 hợp chất flavonoid được phân lập từ các loài này.

Bảng 1.15 Các flavonoid được phân lập từ chi Oldenlandia


166 Kaempferol-3-O-arabinopyranoside O. herbacea [65]

167 Kaempferol-3-O-rutinoside O. herbacea [65]

168 Kaempferol 3-O-[2-O-(6-O-E-feruloyl)-β-D-

glucopyranosyl]-β-D-galactopyranoside

O. herbacea [65]

169 Isorhamnetin-3-O- β-rutinoside O. cristita [66]

170 Quercetin 3-O-sambubioside O. diffusa [67]

171 Quercetin 3-O-sophoroside O. diffusa [67]

172 Quercetin 3-O-[2-O-(6-O-E-feruloyl)-β-D-


O. diffusa [68]

173 Quercetin 3-O-[2-O-(6-O-E-feruloyl)-β-D-

glucopyranosyl]-β-D-glucopyranoside

O. diffusa [68]

174 Kaempferol 3-O-(2-O-β-D-glucopyranosyl)-β-

D-galactopyranoside

O. diffusa [68]

27

175 Quercetin 3-O-(2-O-β-D-glucopyranosyl)-β-D-

galactopyranoside

O. diffusa [68]

176 Quercetin 3-O-β-glucopyranoside O. diffusa [69]

177 Quercetin-3-O-[2-O-(6-O-E-sinapoyl)-β-D-


O. diffusa [69]

4 Rutin O. diffusa [69]

178 Kaempferol 3-O-glucoside O. herbacea [59]

179 Quercetin 3-O-galactoside O. herbacea [59]

180 Kaempferitrin O. verticillata [70]

6 Isovitexin O. dichotoma [71]

181 3,5,7,4′-Tetrahydroxyflavon O. pressa [72]

182 3,5,7,4′-Tetrahydroxyflavon-3-O-β-D-

glucopyranoside

O. pressa [72]

183 Amentoflavon O. pressa [72]

R1 R2 R1 R2

166 H -D-Ara 173 OH 6'-O-E-feruloyl- -D-Glc-(1 2)-D-Gal

167 H -D-Glc-(1 6)-D-Rha 174 H -D-Glc-(1 2)-D-Gal

168 H 6'-O-E-feruloyl- -D-Glc-(1 2)-D-Gal 175 OH -D-Glc-(1 2)-D-Gal

169 OH -D-Glc-(1 6)-D-Rha 176 OH -D-Glc

170 OH -D-Xyl-(1 2)-D-Glc 177 OH 6'-O-E-sinapoyl- -D-Glc-(1 2)-D-Gal

171 OH -D-Glc-(1 2)-D-Glc 178 H -D-Glc

172 OH 6'-O-E-feruloyl- -D-Glc-(1 2)-D-Gal 179 OH -D-Gal

181 H H 182 H Glc

OOH

OH O

OR2

OH

R1

180

ORhaO

OH O

O

OH

O

CH2ORha

OHOH

OH

O

OOH

OH

OHOH

O

O

OH

OH

183

Hình 1.14 Các flavonoid được phân lập từ chi Oldenlandia

28

Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của các flavonoid phân lập được từ O.

diffusa cho thấy hợp chất quercetin-3-O-sambubioside (170) và quercetin-3-O-

sophoroside (171) có khả năng bắt anion gốc superoxide và hợp chất quercetin-3-O-

β-glucopyranoside (176) và rutin (4) có tác dụng ức chế tốt đối với quá trình

peroxide hóa linoleic trên mô hình ferric thiocyanate (FTC) và loại bỏ gốc tự do

diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) đạt 87- 88% gần tương đương với vitamin C (93%)

[66, 69].

Ngoài ra, các flavonoid glycoside có tác dụng bảo vệ thần kinh. Hai hợp chất

(172) và (173) thể hiện hoạt tính bảo vệ tế bào vỏ não chuột gây tổn thương bằng L-

glutamate ở liều 0,1-10 µM. Nghiên cứu mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính

sinh học, các nhà khoa học nhận thấy các flavonoid glycoside có 2 nhóm hydroxy ở

vòng B và một nhóm thế acyl là yếu tố chính làm tăng khả năng bảo vệ thần kinh của

các flavonoid [68].

Bằng phương pháp phân tích HPLC-Q-TOF-MS cho thấy dịch chiết có thành

phần là 13 flavonoid [73]. Công bố mới nhất cho rằng O. diffusa còn có khả năng

chống ung thư vòm họng [74].

1.2.3.4. Các iridoid từ chi Oldenlandia

Iridoid là lớp chất được tìm thấy nhiều trong họ Cà phê. Cho đến nay, có 51

iridoid chủ yếu là iridoid glycoside được phân lập từ 6 loài gồm O. diffusa, O.

hedyotidea, O. chrysotricha, O. corymbosa, O. tenelliflora, O. pilulifera, trong đó

có 29 hợp chất mới tại thời điểm được phân lập. Iridoid là lớp chất có nhiều nhất

trong chi Oldenlandia và đặc biệt có nhiều trong loài O. diffusa.

Bảng 1.16. Các iridoid được phân lập từ chi Oldenlandia

KH Tên hợp chất iridoid Tên loài TLTK

184 Hedyotoside O. hedyotidea [75]

185 Deacetyl asperulosidic acid ethyl este O. hedyotidea [75]

186 Asperulosidic acid O. umbellata, O.

chrysotricha, O. corymbosa

[57,

76,77]

187 Asperuloside O. hedyotidea, O.

chrysotricha, O. corymbosa

[66,

75-77]

188 Deacetyl asperuloside O. chrysotricha, O. [76-

29

corymbosa, O. tenelliflora 78]

189 Asperulosidic acid ethyl ester O. chrysotricha [79]

190 6’-Acetyl deacetylasperuloside O. chrysotricha [79]

191 Scandoside methyl ester O. chrysotricha, O.

tenelliflora, O. corymbosa

[75-

77]

192 Deacetyl asperulosidic acid O. chrysotricha, O.

corymbosa

[76,

80]

193 Loganin O. chrysotricha [76]

194 Acetyl scandoside methyl ester O. chrysotricha [76]

195 6-hydroxygenipin O. chrysotricha [76]

196 Hedyoside O. chrysotricha [76]

197 6’-Acetylasperuloside O. chrysotricha [76]

198 Teneoside A O. tenelliflora [76]

199 Teneoside B O. tenelliflora [78]

200 Teneoside C O. tenelliflora [81]

201 Teneoside D O. tenelliflora [81]

22 Teneoside E O. tenelliflora [81]

203 6-Hydroxygeniposide O. tenelliflora [81]

204 10-Acetylborreriagenin O. pilulifera [82]

205 6-O-Methyldeacetylasperulosidic

acid methyl ester

O. tenelliflora [81]

206 6-O-Methylscandoside methyl ester O. tenelliflora [81]

207 6-Methoxygeniposidic acid O. tenelliflora [81]

208 Daphylloside O. tenelliflora [81]

209 Mollugoside methyl ester O. tenelliflora [81]

210 Z-6-O-p-methoxycinnamoyl

scandoside metyl ester

O. diffusa [83]

211 Z-6-O-feruloyl scandoside methyl ester O. diffusa [83]

212 Z-6-O-p-coumaroyl scandoside

metyl ester

O. diffusa [83]

213 E-6-O-p-metoxycinnamoyl

scandoside metyl ester

O. diffusa [83]

214 E-6-O-feruloyl scandoside metyl ester O. diffusa [83]

215 E-6-O-p-coumaroyl scandoside

metyl ester

O. diffusa [83]

216 Iridoids V3 O. diffusa [66]

30

217 Diffusoside A O. diffusa [84]

218 Diffusoside B O. diffusa [84]

219 10-O-Benzoyl-6′-O-α-L-arabino(1

6)-β-D-glucopyranosylgeniposidic acid

O. diffusa [85]

220 6-Ethoxy deacetylasperulosidic acid

methyl ester

O. diffusa [85]

221 Galioside O. diffusa [85]

222 Gardenoside O. diffusa [85]

223 4-Epiborreriagenin O. diffusa [85]

224 Scandoside O. diffusa [85]

225 Asperulosidic acid methyl ester O. diffusa [66,

85]

226 10-O-Benzoyl deacetyl

asperulosidic acid methyl ester

O. corymbosa [77]

227 10-O-Benzoyl scandoside methyl ester O. corymbosa [77]

228 10-O-p-Hydroxybenzoyl scandoside

methyl ester

O. corymbosa [77]

229 10-O-p-trans-Coumaroyl scandoside

methyl ester

O. corymbosa [77]

230 10-O-p-cis-Coumaroyl scandoside

methyl ester

O. corymbosa [77]

231 Hedycoryside A O. corymbosa [86]

232 Hedycoryside B O. corymbosa [86]

233 Hedycoryside C O. corymbosa [86]

234 Oldenlandoside III O. diffusa [87]

O

COOR1

OGlcR

2OCH2

R3O

H

H

185 R1 = Et, R2 = H, R3 = H 207 R1 = H, R2 = H, R3 = Me

186 R1 = H, R2 = Ac, R3 = H 208 R1 = Me, R2 = Ac, R3 = H

189 R1 =Et, R2 = Ac, R3 = H 220 R1 = Me, R2 = H, R3 = Et

192 R1 = H, R2 = H, R3 = H 225 R1 = Me, R2 = Ac, R3 = H

203 R1 = Me, R2 = H, R3 = H 226 R1 = Me, R2 = Bz, R3 = H

205 R1 = Me, R2 = H, R3 = Me

O

OROCH 2

O

O

O

OHOHOH

CH2OAc

190 R = H

197 R = Ac

O

OGlcR

2OCH2

O

O

R1

187 R1 = H, R2 = Ac

188 R1 = H, R2 = H

198 R1 = H, R2 = Rha

216 R1 = Me, R2 = Ac

O

HOH2C

COOMe

OGlc

184

31

O

COOR1

OGlcR

2OCH2

R3O

H

H

R

1 R

2 R

3 R

1 R

2 R

3

191 Me H H 213 Me H E-p-methoxycinnamoyl

192 Me Ac H 214 Me H E-feruloyl

199 Me Rha H 215 Me H E-p-coumaroyl

206 Me H Me 224 H H H

210 Me H Z-p-methoxycinnamoyl 227 Me H C6H5CO

211 Me H Z-feruloyl 228 Me H p-HO-C6H4CO

212 Me H Z-p-coumaroyl 229 Me H p-trans-coumaroyl

230 Me H p-cis-coumaroyl

O

COOMe

OGlc

H

H

OHO

OH

H2COH

COOMe

OH

O

COOMe

OGlcO

O

193 195 196

O

COONa

OGlc

H

H

RO

HOH2C

201 R = H

202 R = Me 204

O

O

OH

O

Ac

H

HOH

H

O

COONa

OGlc

H

H

OH

HOH2C

200

209

O

COOMe

OGlcOH

H

HH3COOC

O

O

HOH2C

COOMeH

HOGlc

217

O

H

OHH

OH

OH

HHH

H

O

HOH

OHOH

OO

BzO

COOH

O218

O

O

HOH2C

COOMeH

HOGlc

219

O

COOMe

OGlc

H

HOH

OH

221

O

COOR1

OGlcO

R2

O

131 R1 = H, R2 = Me

132 R1 = OH, R2 = Me

133 R1 = R2 = H

O

COOMe

OGlc

H

HOH

OH

OH

H

O

OH

OH

OH

222 223

O

COOH

OGlc - AraBzOH2C

H

H

134

Hình 1.15. Các iridoid được phân lập từ chi Oldenlandia

32

Hợp chất asperuloside (187) được phân lập từ dịch chiết dichloromethane

của loài O. corymbosa có hoạt tính ức chế khá tốt đối với sự phát triển của 2 dòng tế

bào ưng thư ở người: ung thư vú YMB-1 và ung thư máu HL60 với IC50 lần lượt là

0,7 và 11,0 µg/mL [88]. Hợp chất 186 có hoạt tính ức chế mạnh dòng tế bào ung

thư đại tràng HT-29 với giá trị IC50 đạt 6,1 µg/mL [57]. Hợp chất 213 thể hiện hoạt

tính bảo vệ tế bào vỏ não chuột gây tổn thương bằng L-glutamate mạnh ở liều 0,1-

10 µM. Kết quả này chứng minh rằng các hợp chất iridoid glycoside có nhóm p-

methoxy ở vòng thơm và liên kết đôi có cấu hình trans là yếu tố chính làm tăng khả

năng bảo vệ thần kinh của các iridoid [68]. Ngoài ra, các hợp chất 192 và 224 thể

hiện sự ức chế quá trình oxi hóa lipoprotein mật độ thấp (LDL) với mức độ oxi hóa

lần lượt là 63,3±2,0; 62,2±1,6 và 63,8±1,5% ở nồng độ 20 µg/mL [87].

1.2.3.5. Các hợp chất khác từ chi Oldenlandia

Steroid là lớp chất xuất hiện trong hầu hết các loài thực vật Đặc biệt,

stigmasterol (13) và β-sitosterol (1) [89] là những sterol xuất hiện phổ biến trong

thành phần hóa học của chi Oldenlandia. Hai triterpen là oleanolic acid (235) và

ursolic acid (42) [89, 90] cũng được tìm thấy trong nhiều loài thuộc chi

Oldenlandia. Ngoài các hợp chất thuộc lớp chất trên, từ chi Oldenlandia còn phân

lập được một số hợp chất glycoside, các acid phenolic và các hợp chất thơm khác

235OH

COOH

Ursolic acid (42) có tác dụng ức chế sự phát triển tế bào Caco-2 với IC50 là

45 µM [91]. Oleanoic acid thể hiện tác dụng ức chế sự phát triển của các nguyên bào

sợi chuyển hóa ras ở liều không độc đối với các nguyên bào sợi bình thường [92].

1.2.4. Tình hình nghiên cứu về cây An điền lá thông (Oldenlandia pinifolia

(Wall. Ex G. Don) Kuntze

Cây An điền lá thông có tên khoa học là Oldenlandia pinifolia (Wall. Ex G.

Don) Kuntze, tên đồng nghĩa là Hedyotis pinifolia Wall. Ex G. Don. Là cây thân cỏ,

cao đến 25 cm, có lông ở cạnh. Lá có phiến hẹp dài 2-4,5 cm, cưng cứng, gân phụ

33

không rõ, lá bẹ chẻ làm thùy nhọn. Chụm 1-10 hoa trắng, lá đài có lông, tai vành

cao 1,5 mm. Nang tụ khai, to 3 x 2 mm, trong đài, hột nhiều. Cây mọc nhiều ở đồi

cát dự biển, từ Huế vào Nam [2c].

Hình 1.16. Hình ảnh cây An điền lá thông mọc ở Huế

Theo tra cứu tài liệu, trên thế giới chưa có công bố nào về thành phần hóa

học và hoạt tính sinh học của Oldenlandia pinifolia. Ở Việt Nam, có duy nhất một

bài báo công bố về thành phần hóa học của O. pinifolia của nhóm tác giả Lê Hoàng

Duy [61]. Việc nghiên cứu loài này sẽ góp phần làm sáng tỏ thêm thành phần hóa

học và định hướng nghiên cứu ứng dụng tiếp theo.

Kết luận: Các công bố về chi Oldenlandia cho thấy một số lượng lớn các

hợp chất đã được phân lập với cấu trúc đa dạng, gần nửa trong số đó là các chất mới

và có nhiều hoạt tính đáng quý có thể dùng trong sản xuất thuốc. Điều này, chứng tỏ

chi Oldenlandia là nguồn tài nguyên triển vọng cho công cuộc tìm kiếm các hợp

chất có cấu trúc mới phục vụ cho quá trình tìm kiếm thuốc. Tuy nhiên số loài được

nghiên cứu và khai thác làm thuốc còn rất hạn chế tập trung nghiên cứu ở một số

loài như O. diffusa và O. corymbosa. Hơn nữa, các công trình nghiên cứu về chi này

chủ yếu của các tác giả nước ngoài Trong khi đó, các loài thuộc chi Oldenlandia ở

Việt Nam phần lớn được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian, chưa có nhiều nghiên

cứu về hoạt tính sinh học. Vì vậy, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của chi

này cần được tiếp tục nghiên cứu sâu rộng nhằm khám phá các cấu trúc và hoạt tính

mới, làm sáng tỏ cơ chế tác dụng cũng như mối quan hệ cấu trúc - hoạt tính của các

hoạt chất và tìm kiếm những loại thuốc mới.

1.4. Hợp chất iridoid

1.4.1. Giới thiệu chung về hợp chất iridoid

34

Iridoid là các hợp chất thứ cấp được tìm thấy trong nhiều loài thực vật và

một số động vật. Iridoid là lớp chất được phân lập nhiều nhất từ các loài thuộc chi

Oldenlandia. Chúng là các monoterpen được sinh tổng hợp từ isopren và là chất

trung gian trong quá trình sinh tổng hợp alkaloid. Về mặt cấu trúc hóa học, iridoid

thường có một vòng cyclopentan được nối với 1 vòng dị tố 6 cạnh chứa oxi. Chúng

thường có hệ vòng đôi H-5/H-9β, β-cis nối với vòng cyclopentan-pyran [93]. Trong

thực vật, các iridoid tồn tại dưới dạng iridoid glycoside mà hầu hết có gắn đường

glucose hoặc dạng epoxide phức tạp.

Iridoid được tìm thấy trong một số họ thực vật như họ Cà phê (Rubiaceae),

họ Bạc hà (Lamiaceae), họ Long đởm (Gentianaceae), họ Nhài (Oleaceae), họ Giác

mộc (Cornaceae), họ Hoa mõm chó (Scrophulariaceae), họ Mã đề (Plantaginaceae),

họ Đỗ quyên (Ericaceae), họ Mã tiền (Loganiaceae), họ Cỏ roi ngựa (Verbenaceae),

họ Lữ lang (Valerianaceae), họ Thủy nữ (Menyanthaceae). Đặc biệt hợp chất iridoid

là thành phần chính của các loài thuộc chi Oldenlandia, một chi thuộc họ Cà phê.

Cho đến nay, có khoảng 800 iridoid được phân lập từ thực vật và động vật nhưng

chỉ có khoảng 80 iridoid không chứa đường [94].

1.4.2. Phân loại các hợp chất iridoid

Dựa vào sự khác nhau về cấu trúc hóa học, các iridoid được phân thành 4

nhóm là iridoid glycoside, iridoid aglycone, secoiridoid và bis-iridoid. Dựa vào số

carbon trong khung iridane mức độ oxi hóa và các nhóm thế khác nhau thì các

iridoid đó lại được phân nhỏ hơn nữa.

1.4.2.1. Iridoid glycoside

Iridoid glycoside được xuất phát từ iridane {cis-2- oxabicycle-[4.3.0]-nonane.

3

O

4

1

5

98

7

6

35

Một số iridoid glycoside phổ biến được phân lập từ thực vật như

asperulosidic acid (186), scandoside methyl ester (191) và scandoside (224).

1.4.2.2. Iridoid aglycone

Iridoid aglycone là những iridoid không có phần đường. Một số iridoid

aglycone phổ biến được phân lập từ thực vật như genipin (236) và mussaenin (237).

1.4.2.3. Secoiridoid

Secoiridoid là các iridoid mà trong đó vòng cyclopentan đã bị mở vòng. Một

số secoiridoid phổ biến được phân lập từ thực vật như demethylalangiside (238) và

sweroside (239).

1.4.2.4. Bis iridoid

Bis iridoid là các iridoid có cấu tạo gồm hai hợp phần iridoid không đối

xứng. Một số bis iridoid được phân lập từ thực vật như globuloside A (240),

pterocenoid A (241)

O

OH

H

HHOH2C

CH2OH

O

O

OHHOH2C

COOMe

236 237O

N

OGlc

O

OH

OH

238

O

O

O

O

O

OH

OH

OHO

O

OH

OO

AcOH2COGlc

240

O

OOCH3

OH

H

H

OO

N

O

H

241

O

O

OGlc

O

239

Như vậy, đa số các iridoid trong thực vật tồn tại dưới dạng glycoside tạo liên

kết glycoside giữa anomer với C-1 của aglycon. Một số iridoid có gắn đường

oligosaccaride, một số iridoid có đường gắn ở vị trí C-11 Do đó, có thể thấy lớp

chất iridoid có cấu trúc rất phong phú và đa dạng, nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học

cao nên được rất nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu Để hiểu sâu hơn về cấu

trúc các hợp chất iridoid cần nghiên cứu về con đường sinh tổng hợp các hợp chất này.

36

1.4.3. Hoạt tính sinh học các iridoid

Hiện nay một số cao chiết thực vật có chứa iridoid đã và đang được sử dụng

làm thuốc bổ, chất khử trùng, giảm đau, hạ sốt, thuốc ho, thuốc chữa bệnh về da và

giảm huyết áp, trong số đó phải kể đến thực phẩm chức năng Tahitian Noni Pure có

tác dụng tăng sức đề kháng, trung hòa gốc tự do, giảm cholesterol, hỗ trợ hệ tim

mạch và tăng cường sức khỏe được sản xuất từ Mĩ với hàm lượng đáng kể là các

iridoid được chiết xuất từ quả Noni. Thực tế đó đã khuyến khích các nhà khoa học

nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính của các iridoid từ các dịch chiết thực vật. Những

công trình nghiên cứu về hoạt tính sinh học và dược học đã chứng minh rằng iridoid

thể hiện nhiều hoạt tính sinh học thú vị. Theo những báo cáo khoa học gần đây, các

hợp chất iridoid với cấu trúc đa dạng đã thể hiện nhiều hoạt tính đáng chú ý như

hoạt tính kháng viêm, chống ung thư, chống dị ứng, bảo vệ thần kinh [95-100].

Năm 2015, năm hợp chất iridoid là paederosidic acid methyl ester (242),

paederoside (243), asperuloside (187), deacetyl asperulosidic acid methyl ester

(244) và asperuloside acid (186) được Wei Peng và các cộng sự phân lập từ P.

scandens var. tomentosa thể hiện hoạt tính bảo vệ gan đáng kể, chủ yếu làm giảm

mức stress do oxi hóa trong mô gan Do đó, dịch chiết này được xem như tác nhân

đầy hứa hẹn để bảo vệ gan chống lại tổn thương gan cấp tính hoặc mạn tính [100].

O

COOMe

OGlc

HOH2C

OH

O

OGlc

H3CSCOOH 2C

O

O

O

COOMe

OGlc

H3CSCOOH 2C

OHH

H

242 243 244

37

CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Thu hái mẫu thực vật và xác định tên khoa học

- Mẫu cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens Gagnep.), thuộc họ Bồ hòn

(Sapindaceae) được thu hái tại Hạ Long vào tháng 04/2013 do TS. Trần Thị Phương

Anh, Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST xác định tên khoa học. Mẫu tiêu bản số

VHH.HL 4.2013.1 được lưu giữ tại Viện Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam.

Hình 2.1. Mẫu tiêu bản cây Ngoại mộc tái

- Mẫu Cày ri ta Hạ long (Chirita halongensis Kiew & T.H.Nguyen) được thu

hái tại các hòn đảo của vịnh Hạ Long, tỉnh Quảng Ninh, Việt Nam vào tháng 10

năm 2013 Tên khoa học do TS.Trần Thị Phương Anh, Bảo tàng thiên nhiên Việt

Nam, VAST xác định. Tiêu bản số VHH.HL 10.2013.2 được lưu giữ tại Viện Hóa

học, VAST.

Hình 2.2 Mẫu tiêu bản cây Cày ri ta Hạ long

- Mẫu An điền lá thông [Oldenlandia pinifolia (Wall. Ex G. Don) Kuntze]

được thu hái tại Phú Vang, tỉnh Thừa Thiên Huế vào tháng 10 năm 2014 Tên khoa

38

học do TS Đỗ Xuân Cẩm, Đại học Huế xác định. Tiêu bản số VHH.TTH 10.2014.1

được lưu giữ tại Viện Hóa học, VAST.

Hình 2.3 Mẫu cây An điền lá thông thu hái ở Phú Vang tỉnh Thừa Thiên Huế

2.2. Phương pháp xử lý và chiết mẫu

Các mẫu thực vật sau khi thu hái được thái nhỏ, phơi trong bóng mát, sấy

khô ở nhiệt độ 400C, sau đó đem nghiền nhỏ.

Mẫu lá và cành cây Ngoại mộc tái, Cày ri ta Hạ long, An điền lá thông

được ngâm chiết theo quy trình chung: ngâm chiết 4 lần với dung môi methanol:

nước (95:5) ở nhiệt độ thường. Gộp dịch chiết của 4 lần chiết, sau đó cất loại

dung môi dưới áp suất giảm, dịch nước còn lại được chiết lần lượt với n-hexane,

ethyl acetate và n-butanol. Các dịch chiết được gom lại và cất loại dung môi thu

được các cao chiết tương ứng.

2.3. Phƣơng pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp

chất từ mẫu thực vật

Việc phân tích, phân tách các dịch chiết của cây được thực hiện bằng các

phương pháp sắc ký khác nhau: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột với các chất

hấp phụ khác nhau như silica gel, sephadex LH-20, giải hấp bằng các hệ dung

môi thích hợp.

Sắc ký lớp mỏng dùng để khảo sát thành phần được thực hiện trên bản mỏng

đế nhôm tráng sẵn Silica gel 60 F254 của hãng Merck có độ dày 0,25 mm. Dung

môi triển khai là một hoặc hỗn hợp một số dung môi như n-hexane, CH2Cl2, CHCl3,

EtOAc, MeOH, H2O.

39

Sắc ký cột thường, với pha tĩnh là silica gel 60, cỡ hạt 0,040-0,063 mm (230-

400 mesh) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi

với tỉ lệ thích hợp.

Sắc ký sephadex LH-20 được rửa giải bằng dung môi MeOH hoặc hỗn hợp

MeOH/CH2Cl2 (9/1, v/v).

2.4. Các phƣơng pháp xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập đƣợc

Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng cách kết hợp các phương pháp

phổ hiện đại như phổ khối (ESI-, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một

chiều (1H-,

13C-NMR, DEPT) và hai chiều (HSQC, HMBC, COSY).

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi bằng máy Bruker Avance 500

tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ khối ESI-MS được đo trên máy Agilent LC-MSD-Trap SL tại Viện Hóa

học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy AMD 402 (Đức).

Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy Agilent 6530

Accurate-Mass Q-TOF LC/MS, tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam.

Độ quay cực được đo trên thiết bị Jasco P-2000 Polarimeter serial

A060161232, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

2.5. Phƣơng pháp thử hoạt tính gây độc tế bào

Các dòng tế bào ung thư ở người gồm:

Ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (LU-1), ung thư

vú (MCF-7), ung thư da (SK-Mel-2), ung thư máu (K562), tế bào ung thư bạch cầu

(OCI-AML).

Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro

+ Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi

trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM

HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum –

FBS (GIBCO).

+ Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm ở

40

điều kiện 37oC, 5% CO2 và độ ẩm 100%.

Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào (cytotoxic assay)

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(National Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm

sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung

thư ở điều kiện in vitro. Sử dụng phương pháp MTT assay: Tế bào được

nuôi cấy trong môi trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh ở điều kiện 37oC,

5% CO2, độ ẩm 95%. Nồng độ tế bào dùng cho thử độc tính là 3x104/mL. Chất thử

được pha loãng thành một dãy nồng độ thích hợp và được ủ cùng tế bào nuôi ở 37

oC, 5% CO2/3 ngày. Sau 72 giờ nuôi cấy ủ với MTT 0,2 mg/mL trong 4 giờ. Dừng

phản ứng bằng DMSO Đọc mật độ quang (OD-Optical Density) trên máy quang

phổ bước sóng 540 nm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự tăng trưởng của tế bào

thử nghiệm) được tính toán dựa trên số liệu phần trăm kìm hãm phát triển của tế bào

bằng phần mềm máy tính Table curve 2Dv4 [101].

% ức chế = [1-(OD540 xử lý/OD540 đối chứng)]*100%

Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks (1991). Phép thử

tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang đo được

khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị

OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế

bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được

thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

Chất thử (10 L) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay

96 giếng để có nồng độ sàng lọc là 20 g/mL Chất thử có hoạt tính được xác định

IC50 nhờ dải nồng độ 20 g/mL; 4 g/mL; 0,8 g/mL; 0,16 g/mL.

Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm

để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm

Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 L môi

trường) và để chúng phát triển trong vòng từ 3-5 ngày.

Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư

(180L) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ

41

được cố định tế bào bằng trichloracetic acid (TCA).

Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy

giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37oC Đổ bỏ

SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong

không khí ở nhiệt độ phòng.

Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB đã

bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử

dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của

chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế

bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

( ) ( )

( ) ( )

% ức chế = 100% - % sống sót

Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine

(Sigma) luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các

nồng độ 10 g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL DMSO 10% luôn được sử

dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được

xác định nhờ vào phần mềm máy tính Table Curve 2Dv4. Chất thử nào có IC50 < 20

g/mL (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50 54 M (với

hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào và có khả năng ức

chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư.

2.6. Phương pháp thử nghiệm hoạt tính cảm ứng apoptosis

2.6.1. Vật liệu

Mẫu nghiên cứu: cao chiết n-butanol của O. pinifolia, các chất: HP9, HP11,

HP13 và HP14 phân lập từ cao chiết n-butanol của O. pinifolia

Vật liệu và hoá chất:

+ Môi trường nuôi cấy DMEM, huyết thanh phôi bò FBS, Trypsin EDTA

của GIBCO, Invitrogen; Hoechst 33342 (sigma);

+ Đĩa 96 giếng nhựa (Corning, USA), pippette (eppendorf), máy đọc ELISA

96 giếng (Bio-rad);

Chất tham khảo: Camptothecin;

42

Bộ KIT xác định Caspase 3 (Biovision, Chester Springs, PA, USA)

2.6.2. Phương pháp xác định khả năng gây apoptosis của mẫu thử

Khả năng gây apoptosis của hoạt chất được xác định thông qua phương pháp

nhuộm hạt nhân bằng propidium iodide và phân tích tế bào theo dòng chảy, phương

pháp nhuộm Hoechst 33342. Các dòng tế bào ở người gồm: tế bào bạch cầu OCI-

AML, tế bào ung thư máu K562.

* Phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy:

Chết tế bào được đo bằng phương pháp phân tích tế bào theo dòng chảy Các

tế bào được ly tâm và cặn sau khi ly tâm được tạo huyền phù trong 1,5 mL dung

dịch propidium iodide (PI) hypotonic (50 μg/mL trong 0,1% natri citrate và 0,1%

Triton X-100) Các ống đó để qua đêm trong bóng tối ở nhiệt độ 4 0C Huỳnh quang

PI của hạt nhân tách riêng được đo bằng máy phân tích tế bào theo dòng chảy sử

dụng máy đo Coulter Epics XL-MCL (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA).

* Phương pháp nhuộm Hoechst 33342:

Tế bào được nuôi trong đĩa petri 24 giờ ở 370 C sau đó được ủ với mẫu thí

nghiệm Camptothecin được dùng làm đối chứng tham khảo, DMSO 10% được sử

dụng làm đối chứng âm. Sau 48 h ủ mẫu, tế bào được cố định bằng formandehyde

4%. Sau 30 phút, tế bào được rửa lại bằng PBS và nhuộm bằng thuốc nhuộm

Hoechst 33342 (0,5µg/ml) trong 10 phút. Tế bào được quan sát bằng kính hiển vi

huỳnh quang ở bước sóng Excitation⁄Emission (nm) là 350⁄461 Xác định số lượng

tế bào apoptosis trong tổng số 400 tế bào quan sát được qua kính hiển vi. Tế bào

apoptosis được xác định là những tế bào có nhân sáng hơn (do nhiễm sắc chất bị cô

đặc) hay nhân bị phân chia thành mảnh nhỏ.

2.6.3. Phương pháp nuôi cấy tế bào và xử lí mẫu cho thí nghiệm caspase 3

Tế bào được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy DMEM với thành phần kèm

theo gồm 2 mM L-glutamine, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài

ra bổ sung 10% fetal bovine serum – FBS (GIBCO) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều

kiện 37oC, 5% CO2.

Thêm vào các giếng thí nghiệm của đĩa 24 giếng với lượng tế bào phù hợp và

ủ ở 37oC qua đêm cho tế bào ổn định.

Chất thử được pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng ở các nồng độ

khác nhau Giếng tế bào với DMSO 10% được sử dụng làm giếng đối chứng âm

43

Campothecin được sử dụng như là đối chứng dương

Sau 24 h, thu tế bào đã được thử chất để xác định sự có mặt của caspase 3,

caspase 3 có trong tế bào.

2.6.4. Phương pháp xác định caspase 3

Được thực hiện dựa caspase 3, colorimetric assay Kit của Biovision theo

đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.

Tế bào đã được kích thích với mẫu thử sẽ được ly giải với 50 μL cell lysis

buffer trong 10 phút.

Ly tâm thu dịch tế bào Xác định hàm lượng protein trong dịch tế bào

Pha loãng protein với nồng độ 50μg trong 50μL cell lysis buffer cho mỗi

phản ứng.

Cho 50 μL dung dịch 2x Reaction Buffer

Cho 5 μL cơ chất DEVD-pNA ( nồng độ 200 μM) và ủ 370C trong 1 tiếng.

Đọc kết quả trên máy microplate reader ở bước sóng 405 nm

44

CHƢƠNG 3: THỰC NGHIỆM

3.1. Tách chiết, phân lập các chất từ cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens)

3.1.1. Xử lý mẫu thực vật và chiết tách

600 g lá và cành cây Ngoại mộc tái được sấy khô ở 40 0C, xay nhỏ và ngâm

chiết 4 lần (4x1,5 L) với methanol:nước (95:5) ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại

dung môi dưới áp suất giảm, dịch nước còn lại được chiết lần lượt với n-hexane,

ethyl acetat và n-butanol. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được các cặn

chiết tương ứng có khối lượng là 9,0g; 8,0g và 26,3g. Quy trình chiết và phân lập

mẫu cây Ngoại mộc tái được trình bày ở hình 3.1.

+ Quá trình phân lập các chất từ cặn n-hexane: cặn chiết n-hexane (9,0g)

được phân tách trên cột silica gel, hệ dung môi rửa giải gradient n-hexane:EtOAc

(95:5-0:100, v/v) thu được 11 phân đoạn, kí hiệu là H1 - H11 Phân đoạn H3 (1,7g)

được tiếp tục tinh chế trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexane:

dichloromethane (DCM) (95:5) thu được hợp chất AL1 (1,3g). Phân đoạn H4 (1,2g)

được đưa lên cột silica gel, giải hấp bằng hệ dung môi n-hexane:dichloromethane

(90:10) thu được hỗn hợp chất AL3 và AL4 (30mg) dưới dạng bột trắng.

+ Quá trình phân lập các chất từ cặn ethyl acetate: cặn chiết ethyl acetate

(EtOAc) (8g) được tinh chế bằng cột silica gel, hệ dung môi gradient n-hexane:

EtOAc thu được 9 phân đoạn (E1 - E9) Phân đoạn E8 (1,7g) được tinh chế tiếp

trên cột silica gel, hệ dung môi dichloromethane:methanol (95:5) thu 4 phân đoạn

nhỏ, ký hiệu là E8.1-E8.4. Tiếp tục tinh chế phân đoạn E8.2 bằng sắc ký cột với

dung môi gradient n-hexane:EtOAc thu được chất AL2 (63mg). Từ phân đoạn E8.3

tiến hành rửa nhiều lần bằng dung môi MeOH thu được hợp chất AL5 (35mg).

45

EtOAc

Hình 3.1 Sơ đồ chiết và phân lập các chất từ lá và cành cây Ngoại mộc tái

Bột khô Allophylus livescens (0,6 kg)

- Chiết MeOH 95% (4 x 2,0 L)

- Cất loại dung môi

Dịch tổng

ALH (9,0 g)

- Chiết EtOAc


H3 (1,7 g)

n-hexane/EtOAc, 95/50/100

H4 (1,2 g)

n-hexane/DCM, 95/5

AL1

1,3 g

n-hexane/DCM, 9/1

AL3 +AL4

30 mg

ALE (8,0 g)

- Chiết n-BuOH


ALB

26,3 g

Dịch

nƣớc

n-hexane/EtOAc, grad.

H8 (1,7 g)

n-hexane/MeOH, 95/5

AL2

63 mg

AL5

35 mg

- Chiết n-hexane


46

3.1.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ cây Ngoại mộc tái

3.1.2.1. Hợp chất 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1)

Chất dạng dầu, Rf = 0,48 (n-hexane:CH2Cl2 95/5, v/v). ESI-MS, m/z = 291

[M+H]+, phổ NMR đo trong dung môi CDCl3 (Bảng 4.1).

3.1.2.2. Hợp chất catechin (AL2)

Chất bột màu cam, Rf = 0,56 (CHCl3:MeOH:H2O 6,5:3,5:0,5, v/v).

1H-NMR (500 MHz, CD3OD): H (ppm) 4,60 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2); 4,00

(1H, m, H-3); 2,53 (1H, dd, J = 16,0; 8,1 Hz, H-4a); 2,87 (1H, dd, J = 16,0; 8,1 Hz,

H-4b); 5,88 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-6); 5,96 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-8); 6,86 (1H, d, J =

1,9 Hz, H-2’); 6,79 (1H, d, J = 8,1 Hz, H-5’); 6,74 (1H, dd, J = 8,1; 1,9 Hz, H-6’)

13C-NMR (125 MHz, CD3OD): C (ppm) 82,79 (C-2); 68,77 (C-3); 28,5 (C-

4); 156,9 (C-5); 95,5 (C-6); 157,5 (C-7); 96,3 (C-8); 157,8 (C-9); 100,8 (C-10);

132,2 (C-1’); 115,3 (C-2’);146,2 (C-3’); 146,2 (C-4’); 116,1 (C-5’); 120,0 (C-6’).

3.1.2.3. Chất stigmasterol (AL3)

Tinh thể hình kim màu trắng, Rf = 0,55 (n-hexane:EtOAc 3:1, v/v).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): H (ppm) 3,51 (1H, m, H-3); 5,34 (1H, m, H-

5); 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3-19); 5,01 (1H, dd, J = 8,5; 15,0 Hz, H-20); 5,15

(1H, dd, J = 8,5; 15,0 Hz, H-21); 0,84 (3H, t, J = 7,2 Hz, CH3-24); 0,83 (3H, d, J

=6,5 Hz, CH3-26), 0,80 (3H, d, J =6,6 Hz, CH3-27), 0,70 (3H, s, CH3-28), 1,03 (3H,

s, CH3-29).

3.1.2.4. Hợp chất -sitosterol (AL4)

Chất hình kim màu trắng, Rf = 0,55 (n-hexane:EtOAc 3/1, v/v).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): H (ppm) 3,51 (1H, m, H-3); 5,34 (1H, m, H-

5); 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3-19); 0,85 (3H, t, J = 7,2 Hz, CH3-24); 0,83 (3H, d,

J = 6,5 Hz, CH3-26); 0,81 (3H, d, J =6,6 Hz, CH3-27); 0,68 (3H, s, CH3-28); 1,02

(3H, s, CH3-29).

3.1.2.5. Hợp chất -sitosterol glucoside (AL5)

Tinh thể hình kim màu trắng, Rf = 0,45 (CH2Cl2:MeOH 9:1, v/v)

47

3.1.3. Hoạt tính gây độc tế bào của chất AL1

Phép thử hoạt tính sinh học được thực hiện tại Phòng Hóa sinh ứng dụng,

Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam.

Hoạt tính gây độc tế bào được tiến hành theo phương pháp của

Likhiwitayawuid và Skehan trên các dòng tế bào ung thư ở người: ung thư biểu mô

(KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (LU-1), ung thư vú (MCF-7), ung thư da

(SK-Mel-2).

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của chất AL1 được trình bày ở bảng 4.2

3.2. Tách chiết, phân lập các chất từ cây Cày ri ta Hạ long (Chirita halongensis)


Mẫu cây Cày ri ta Hạ long (0,64 kg) được sấy khô ở 400C, xay nhỏ và ngâm

chiết 4 lần với bằng dung môi MeOH 95% ở nhiệt độ phòng Dung môi được cất

loại dưới áp suất giảm, phần dịch nước được chiết lần lượt bằng dung môi n-

hexane, ethyl acetate và n-butanol. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được

các cao chiết n-hexane (6,0 g), EtOAc (9,1 g) và n-BuOH (26,2 g). Quy trình chiết

và phân lập các chất từ cây Cày ri ta Hạ long được trình bày ở hình 3.3.

+ Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-hexane: tiến hành sắc ký cột

cặn chiết n-hexane (6,0 g) với hệ dung môi n-hexane: EtOAc thu được 9 phân đoạn

(H1-H9). Phân đoạn H2 + H3 (900 mg) được tinh chế bằng sắc ký cột với hệ dung

môi n-hexane:CH2Cl2 gradient thu được 4 phân đoạn nhỏ, ký hiệu H2.3.1-H2.3.4.

Từ phân đoạn H2.3.2 (100 mg) tiến hành sắc ký cột sephadex LH-20 với hệ dung

môi CH2Cl2:MeOH (1:9) thu được hợp chất CH1 (12 mg). Phân đoạn H7 + H8 (750

mg) cũng được tinh chế bằng sắc ký cột với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH gradient

thu được 3 phân đoạn nhỏ, ký hiệu H7.8.1-H7.8.3. Phân đoạn H7.8 2 được tiếp tục

tinh chế bằng sắc ký cột sephadex LH-20, hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (1:9) thu

được hợp chất CH2 (15 mg).

+ Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate: cặn chiết EtOAc

(9,0 g) được đưa lên cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH gradient thu

được 7 phân đoạn. Kết quả sắc ký lớp mỏng chỉ ra cao chiết có thành phần chính là

48

ursolic acid và oleanolic acid khi so sánh với chất chuẩn. Kết tinh các phân đoạn

bằng MeOH thu được CH3 (330 mg) và CH4 (700 mg)

+ Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-butanol: cặn chiết n-BuOH

(26,0 g) được tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH

(100:00:100, v/v) cho 13 phân đoạn (B1-B13) Phân đoạn B3 (360 mg) tiếp tục

được làm sạch bằng sắc ký cột silica gel với dung môi CH2Cl2: MeOH gradient thu

được hợp chất CH5 (18 mg) Phân đoạn B8 (750 mg) được đưa lên cột sephadex

LH-20, dung môi MeOH thu được 3 phân đoạn nhỏ, ký hiệu B8.1-B8 3 Phân đoạn

B8.3 (180 mg) tiếp tục được phân tách bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi

CH2Cl2:MeOH:H2O (4:1:0,1) thu được CH6 (25 mg) và CH7 (35 mg). Phân đoạn

B10 (540 mg) được tinh chế bằng cột sephadex LH-20 với dung môi MeOH thu

được CH8 (20 mg) và CH9 (15 mg).

49

Hình 3.2 Sơ đố chiết và phân lập các chất từ cây Cày ri ta Hạ long

CH7

35 mg

Chiết MeOH 95% (4 x 2,0 L)

Dịch tổng

Chiết n-hexane

CHH (6,0 g)

Chiết EtOAc

1. n-hexane/EtOAc, grad.

2. n-hexane/DCM, grad.

3. Sephadex LH-20, DCM/MeOH, 1/9

CH1

12 mg

CH2

15 mg

CH (9,1 g)

DCM/MeOH grad.

CH3

330 mg

CH4

700 mg

Chiết n-BuOH

Dịch

nƣớc

CHB

(26,0 g)

g)mg

DCM/MeOH, 100/00/100

CH5

18 mg CH6

25 mg

CH8

20 mg

CH9

15 mg

Bột khô Chirita halongensis (0,64 kg)

B3

360 mg

B10

540 mg

B8

750 mg

DCM/MeOH grad.

DCM/MeOH grad. Sephadex LH-20, MeOH

50

3.2.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ cây Cày ri ta Hạ long

3.2.2.1. Hợp chất 7-hydroxytectoquinone (CH1):

Tinh thể màu vàng, Rf = 0,30 (CH2Cl2:MeOH 4,8:0,2, v/v).

1H NMR (500 MHz, CD3OD): H (ppm) 8,07 (1H, brs, H-1); 7,68 (1H, dd, J

= 1,0 & 8,0 Hz, H-3); 8,16 (1H, d, J = 8,0 Hz; H-4); 8,17 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5);

7,21 (1H, dd, J = 2,5 & 8,5 Hz, H-6); 7,59 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-8); 2,54 (3H, s, 2-

CH3).

13C NMR (125 MHz, CD3OD): C (ppm) 128,2 CH (C-1); 146,3 C (C-2);

136,1 CH (C-3); 128,2 CH (C-4); 132,8 C (C-4a); 130,9 CH (C-5); 122,3 CH (C-6);

164,7 C (C-7); 113,5 CH (C-8); 137,1 C (C-8a); 184,6 C (C-9); 134,9 C (C-9a);

183,3 C (C-10); 127,2 C (C-10a); 21,8 CH3 (2-Me).

3.2.2.2. Hợp chất 3,24-dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid (CH2)

Chất bột màu trắng, Rf = 0,3 (n-hexane:EtOAc = 1:1). (-)-ESI-MS m/z: 471,0

[M-H]-, công thức phân tử: C30H48O4.

1H-NMR (500 MHz, CDCl3 & CD3OD): H (ppm) 3,83 (1H, br s, H-3); 2,19

(1H, d, J = 11,0 Hz, H-18); 3,70 (2H, d, J = 11,0 Hz, Ha-24); 3,46 (1H, d, J = 11,0

Hz, Hb-24).

13C-NMR (125 MHz, CD3OD): C (ppm) 34,4 (C-1); 24,5 (C-2); 71,3 (C-3),

44,0 (C-4); 50,6 (C-5); 19,5 (C-6); 34,6 (C-7); 40,9 (C-8); 48,8 (C-9, C-17); 37,9

(C-10); 25,3 (C-11); 126,9 (C-12); 139,6 (C-13); 43,3 (C-14); 29,2 (C-15); 26,1 (C-

16); 54,4 (C-18); 40,5 (C-19); 40,4 (C-20); 30,7 (C-21); 38,1 (C-22); 22,8 (C-23);

66,32 (C-24); 16,3 (C-25); 17,6 (C-26); 24,1 (C-27); 181,6 (C-28); 17,7 (C-29);

21,6 (C-30).

3.2.2.3. Hợp chất ursolic acid (CH3)

Chất bột màu trắng, Rf = 0,5 (CH2Cl2: MeOH 94:6, v/v). (-)-ESI-MS m/z:

455,2 [M-H]-, công thức phân tử: C30H48O3

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): H (ppm) 2,98 (1H, m, H-3), 5,11 (1H, m, H-

12); 2,09 (1H, d, J = 11,3 Hz, H-18); 0,88 (3H, s, Me-23); 0,66 (3H, s, Me-24);

51

0,85 (3H, s, Me-25); 0,73 (3H, s, Me-26); 1,02 (3H, s, Me-27); 0,79 (3H, d, J = 6,4

Hz, Me-29); 0,89 (3H, d, J = 8,7 Hz, Me-30).

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): C (ppm) 38,2 (C-1); 26,9 (C-2); 76,9 (C-3);

38,4 (C-4); 54,8 (C-5); 18,0 (C-6); 30,2 (C-7); 39,1 (C-8); 47,0 (C-9); 36,5 (C-10);

23,8 (C-11); 124,6 (C-12); 138,2 (C-13); 41,6 (C-14); 32,7 (C-15); 22,8 (C-16);

46,8 (C-17); 52,4 (C-18); 38,4 (C-19); 38,5 (C-20); 27,5 (C-21); 36,3 (C-22), 28,3

(C-23); 16,9 (C-24); 16,1 (C-25), 15,2 (C-26); 23,3 (C-27); 178,3 (C-28); 17,0 (C-

29); 21,1 (C-30).

3.2.2.4. Hợp chất oleanolic acid (CH4)

Chất bột màu trắng, Rf = 0,48 (CH2Cl2: MeOH 94:6, v/v). (-)-ESI-MS m/z:

455,2 [M-H]-, công thức phân tử: C30H48O3.

1H-NMR (500 MHz, CDCl3): H (ppm) 5,27 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-12); 3,20

(1H, dd, J = 4,0; 11,0 Hz, H-3); 2,81 (1H, dd, J = 4,0; 13,5 Hz, H-18); 1,12; 0,97;

0,91; 0,90; 0,89; 0,76; 0,74 (mỗi tín hiệu 3H, s, Me-23, 24, 25, 26, 27, 29, 30).

13C-NMR (125 MHz, CDCl3): C (ppm) 38,4 (C-1); 27,7 (C-2); 79,1 (C-3);

38,8 (C-4), 55,3 (C-5); 18,3 (C-6); 32,7 (C-7); 39,3 (C-8); 47,7 (C-9); 37,1 (C-10);

23,0 (C-11); 122,7 (C-12); 143,6 (C-13); 41,7 (C-14); 27,2 (C-15); 23,4 (C-16);

46,5 (C-17); 41,1 (C-18); 45,9 (C-19); 30,7 (C-20); 33,8 (C-21); 32,5 (C-22); 28,1

(C-23); 15,6 (C-24); 15,3 (C-25); 17,1 (C-26); 25,9 (C-27); 181,6 (C-28); 33,1 (C-

29); 23,6 (C-30).

3.2.2.5. Hợp chất 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)ethyl--D-glucopyranoside (CH5)

Chất bột màu vàng nhạt, Rf =0,3 (EtOAc:MeOH:H2O = 4:0,5:0,1). ESI-MS

m/z: 315,0 [M-H]-, công thức phân tử C14H20O8.

1H NMR (500 MHz, CD3OD): H (ppm) 6,71 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2); 6,69

(1H, d, J = 8,5 Hz, H-5); 6,57 (1H, dd, J = 1,5 & 8,5 Hz, H-6); 2,80 (2H, m, H-α);

3,72 (2H, m, H-β); 4,05 (1H, m, H-β); 4,31 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1’); 3,20 (1H, t, J

= 8,0 Hz, H-2’); 3,28 – 3,39 (3H, m, H-3’, 4’, 5’); 3,68 (1H, dd, J = 5,0 & 12,0 Hz,

H-6’); 3,88 (1H, dd, J = 1,5 & 12,0 Hz, H-6’).


52

3); 144,6 (C-4); 116,3 (C-5); 121,3 (C-6); 36,6 (C-7); 72,1 (C-8); 104,4 (Glc-1);

75,1 (Glc-2); 77,9 (Glc-3); 71,6 (Glc-4); 78,1 (Glc-5); 62,7 (Glc-6).

3.2.2.6. Hợp chất acteoside (CH6)

Chất bột màu trắng, Rf =0,56 (CH2Cl2: MeOH: H2O = 3,75:1,0:0,1).

1H-NMR (500 MHz, CD3OD) và

13C-NMR (125 MHz, CD3OD) (Bảng 4.3

và Bảng 4.4).

3.2.2.7. Hợp chất isoacteoside (CH7)



13C-NMR (125 MHz, CD3OD) (Bảng 4.3

và Bảng 4.4).

3.2.2.8. Hợp chất decaffeoylacteoside (CH8)

Chất bột màu trắng, Rf =0,56 (CH2Cl2: MeOH: H2O = 3,5:1,0:0,1). (-)-ESI-

MS m/z: 461,0 [M-H]-, công thức phân tử: C20H30O12.


13C-NMR (125 MHz, CD3OD): (Bảng 4.3

và Bảng 4.4).

3.2.2.9. Hợp chất -hydroxyacteoside (CH9)



13C-NMR (125 MHz, CD3OD): (Bảng 4.3

và Bảng 4.4).

3.2.3. Thử hoạt tính độc tế bào

Hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất phân lập được kiểm tra bằng mô

hình MTT. Hoạt tính độc tế bào được thử nghiệm tại viện Công nghệ Sinh học-Viện

Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả thử hoạt tính độc tế bào được

trình bày trong phần 4.2.2.

3.3. Tách chiết, phân lập các chất từ cây An điền lá thông (Oldenlandia

pinifolia)


53

Mẫu cây An điền lá thông (2,1 kg) được sấy khô ở 40 0C, xay nhỏ và ngâm

chiết 3 lần với bằng dung môi MeOH 95% ở nhiệt độ phòng Dung môi được cất

loại dưới áp suất giảm, phần dịch nước được chiết lần lượt bằng dung môi n-

hexane, ethyl acetate và n-butanol. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm thu được

các cao chiết tương ứng có khối lượng là 36,2 g; 34,2 g và 32,0 g. Quy trình chiết

và phân lập các chất từ cây An điền lá thông được trình bày ở hình 3.2.

+ Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-hexane: tiến hành sắc ký cột

silica gel 36,2 g cao chiết n-hexane (HPH) với hệ dung môi n-hexane:EtOAc

(100:0→1:1), thu được 10 phân đoạn H1-H10. Phân đoạn H6 (620 mg) được phân

tách bằng cột silica gel với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (85:15), sau đó tiếp tục bằng

Sephadex LH-20 với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (1:9) thu được 12 mg chất HP1.

Phân đoạn H7 (150 mg) được phân tách bằng cột silica gel với hệ dung môi n-hexane:

EtOAc (15:1), sau đó tiếp tục được tinh chế bằng Sephadex LH-20 với hệ dung môi

CH2Cl2:MeOH (1:9) thu được 5 mg chất HP2. Phân đoạn H10 (410 mg) được phân

tách bằng Sephadex LH-20 với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (1:9) thu được HP3 (6

mg) và HP5 (11mg).

+ Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết ethyl acetate: tiến hành sắc ký

cột silica gel 34,2 g cao chiết ethyl acetate (HPE) với hệ dung môi n-hexane:EtOAc

(100:0→1:1), thu được 7 phân đoạn E1-E7. Phân đoạn E2 (4,42 g) được đưa lên cột

silica gel, giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (10:1) thu được HP6 (30 mg).

Phân đoạn E3 (1,62 g) được tinh chế bằng sắc ký cột silica gel với hệ dung môi

CH2Cl2:MeOH (10:1) thu được HP7 (200 mg). Phân đoạn E4 (1,15 g) tiếp tục được

tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (2:1), sau đó tiếp tục

bằng cột Sephadex LH-20 với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH (1:9) thu được HP4

(10mg).

+ Quy trình phân lập các hợp chất từ cặn chiết n-butanol: cao chiết n-butanol

(32 g) được đưa lên cột silica gel, giải hấp với hệ dung môi CH2Cl2:MeOH:H2O

(9:1:04:1:0,12:1:0,1) thu được 12 phân đoạn (B1-B12). Tinh chế phân đoạn B3

(2,9 g) bằng sắc ký cột sephadex LH-20 với dung môi CH2Cl2:MeOH (1:9) thu

được 3 phân đoạn (B3.1-B3.3). Phân đoạn B3.2 tiếp tục được đưa lên cột sephadex

LH-20, dung môi MeOH thu được HP8 (30 mg). Phân đoạn B6 (2,95) được phân

54

tách bằng sắc ký cột sephadex LH-20, dung môi MeOH thu được HP9 (11 mg). Sắc

ký cột sephadex LH-20 phân đoạn B12 (1,5 g) với dung môi CH2Cl2: MeOH (1:9)

thu được 2 phân đoạn (B12.1-B12.2). Chất HP10 (10 mg) thu được khi tinh chế

phân đoạn B12.2 trên cột sephadex LH-20, dung môi MeOH. Phân đoạn B5 (2,42

g) được đưa lên cột sephadex LH-20, dung môi CH2Cl2: MeOH (1:9) thu được 2

phân đoạn (B5.1-B5.2). Tiếp tục tinh chế phân đoạn B5.2 trên cột sephadex LH-20

với dung môi MeOH thu được HP11 (16 mg). Phân đoạn B10 (1,5 g) được làm

sạch bằng cột sephadex LH-20, dung môi CH2Cl2: MeOH (1:9) thu được 2 phân

đoạn (B10.1-B10.2). Tinh chế phân đoạn B10.2 trên cột sephadex LH-20, MeOH

thu được HP13 (10 mg). Chất HP12 (10 mg) thu được khi tinh chế phân đoạn B4

(1,35 g) bằng sắc ký cột Sephadex LH-20, MeOH. Phân đoạn B9 (3,9 g) được phân

tách bằng sắc ký cột sephadex LH-20 với dung môi CH2Cl2:MeOH (1:9) thu được

HP14 (40 mg).

55

Hình 3.3 Sơ đố chiết và phân lập các chất từ cây An điền lá thông

1. n-hexane/EtOAc,100/01/1

2. Sephadex LH-20, MeOH

Bột khô Oldenlandia pinifolia (2,1 kg)

Chiết MeOH 95% (4 x 3,0 L)

Dịch tổng

Chiết n-hexane

HPH (9,0 g)

Chiết EtOAc

1. n-hexane/EtOAc, grad.

2. Sephadex LH-20, DCM/MeOH,

1/9

HP1

12 mg

HP2

5 mg

HP3

6 mg

HP5

11 mg

HPE (34,2 g)

HP6

30 mg

HP7

200 mg

HP4

10 mg

Chiết n-BuOH

Dịch

nƣớc

HPB

32,0 g

1. DCM/MeOH/H2O,4/1/03/1/0,1

2. Sephadex LH-20, MeOH

HP8

30 mg

HP9

11 mg

HP10

10 mg

HP11

16 mg

HP12

10 mg

HP13

10 mg

HP14

40 mg

56

3.3.2. Dữ liệu phổ của các hợp chất phân lập từ cây An điền lá thông

3.3.2.1. Hợp chất 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone (HP1)

Chất bột màu cam, Rf = 0.45 (n-hexane: CH2Cl2 4:1,v/v).HR-ESI-MS m/z =

269,0464 [M-H]-. Công thức phân tử C15H10O5.

1H-NMR (500 MHz, CDCl3 + CD3OD); (500 MHz, DMSO-d6,) và

13C-NMR

(125 MHz, CDCl3 + CD3OD); (125 MHz, DMSO-d6,) (ppm) (Bảng 4.6).

3.3.2.2. Hợp chất 2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone (HP2)

Chất bột màu đỏ cam, Rf = 0,52 (n-hexane:EtOAc 4,5:1, v/v).

1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và

13C-NMR (125 MHz, CDCl3) (ppm) (Bảng 4.7)

3.3.2.3. Hợp chất 1,6-dihydroxy-2-methylanthraquinone (HP3)

Chất bột màu cam, Rf = 0,47 (n-hexane:CHCl3:EtOAc 1,0:1,5:1,0, v/v). (-)-

ESI-MS m/z: 253,0 [M-H]-, công thức phân tử C15H10O4.

1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6): H (ppm) 7,61 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-3); 7,55

(1H, d, J = 7,5 Hz, H-4); 7,44 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5); 7,21 (1H, dd, J = 2,5; 8,5 Hz,

H-7); 8,08 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-8); 13,08 (1H, s, 1-OH); 2,27 (3H, s, 2-CH3).

13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6): C (ppm) 159,9 (C-1); 114,6 (C-2); 136,8

(C-3); 118,6 (C-4); 112,5 (C-5); 163,9 (C-6); 121,4 (C-7); 129,8 (C-8); 187,6 (C-9);

181,7 (C-10); 131,1 (C-4a); 124,4 (C-8a); 134,2 (C-9a); 135,6 (C-10a); 15,7 (2-CH3).

3.3.2.4. Hợp chất digiferruginol (HP4)

Chất bột, màu vàng da cam, Rf = 0,5 (CH2Cl2: MeOH = 9:1, v/v). (-)-ESI-MS

m/z: 253,0 [M-H]-, công thức phân tử C15H10O4.

1H-NMR (500 MHz, DMSO): δH (ppm) 7,77 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-3); 7,92

(1H, d, J = 8,0 Hz, H-4); 8,20 (1H, m, H-5); 7,95 (1H, m, H-6); 7,92 (1H, m, H-7);

8,25 (1H, m, H-8); 4,66 (2H, d, J = 5,0 Hz, 2 -CH2OH); 5,46 (1H, t, J = 5,5 Hz, 2-

CH2OH); 12,77 (1H, s, 1-OH).

13C NMR (125 MHz, DMSO): C (ppm) 158,4 (C-1); 138,2 (C-2); 131,3 (C-

3); 118,8 (C-4); 126,8 (C-5); 134,5 (C-6); 135,1 (C-7); 126,6 (C-8); 188,7 (C-9);

181,8 (C-10); 133,6 (C-5a); 133,2 (C-8a); 114,9 (C-9a); 132,8 (C-10a); 57,4

57

(CH2OH).

3.3.2.5. Hợp chất lutein (HP5)

Chất bột màu đỏ cam, Rf = 0,44 (n-hexane:EtOAc 3,75:1,25, v/v). (+)-ESI-

MS m/z: 569,3 [M+H]+, công thức phân tử: C40H56O2.

1H-NMR (500 MHz, CDCl3) và

13C-NMR (125 MHz, CDCl3) (ppm) (Bảng 4.8).

3.3.2.6. Hợp chất ursolic acid (HP6)

Chất bột màu trắng, Rf = 0,5 (CH2Cl2:MeOH 94:6, v/v). (-)-ESI-MS m/z:


3.3.2.7. Hợp chất oleanolic acid (HP7)



3.3.2.8. Hợp chất asperuloside (HP8)

Chất bột màu trắng, Rf = 0,54 (CH2Cl2:MeOH:H2O 4,0:1,0:0,1, v/v). ESI-MS

m/z: 437,0 [M+Na]+, công thức phân tử: C18H22O11.


13C-NMR (125 MHz, CD3OD) (ppm)

(Bảng 4.9).

3.3.2.9. Hợp chất deacetyl asperuloside (HP9)



1H-NMR (500 MHz, CD3OD),

13C-NMR (125 MHz, CD3OD) (ppm):

(Bảng 4.9).

3.3.2.10. Hợp chất asperulosidic acid (HP10)

Chất bột màu trắng, Rf = 0,56 (CH2Cl2:MeOH 4:1, v/v).



(Bảng 4.10).

3.3.2.11. Hợp chất scandoside methyl ester (HP11)

Chất bột màu trắng, Rf = 0,48 (CH2Cl2:MeOH 4,5:1, v/v). (-)-ESI-MS m/z:

58




(Bảng 4.10).

3.3.2.11. Hợp chất afzelin (HP12)

Chất bột màu vàng, Rf = 0,51 (CH2Cl2:MeOH 4,25:0,75, v/v). (-)-ESI-MS

m/z: 430,9 [M-H]-, công thức phân tử: C21H20O10

1H-NMR (500 MHz, CD3OD): H (ppm) 6,22 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6); 6,40

(1H, d, J = 2,0 Hz, H-8); 7,79 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2’, 6’); 6,96 (2H, d, J = 9,0 Hz,

H-3’, 5’); 5,40 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1”); 3,73 (1H, dd, J = 3,0; 9,0 Hz, H-2”); 3,36

(1H, d, J = 5,0 Hz, H-3”); 3,35 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-4”); 4,24 (1H, dd, J = 2,0; 4,0

Hz, H-5”); 0,94 (3H, d, J = 6,0 Hz, H-6”)


4); 163,2 (C-5); 99,9 (C-6); 166,1 (C-7); 94,8 (C-8); 158,6 (C-9); 105,9 (C-10);

122,7 (C-1’); 131,9 (C-2’, C-6’); 116,5 (C3’, C-5’); 161,6 (C-4’); 103,5 (C-1”);

72,0 (C-2”); 72,2 (C-3”); 73,2 (C-4”); 71,9 (C-5”); 17,6 (C-6”)

3.3.2.13. Hợp chất isorhamnetin-3-O--rutinoside (HP13)

Chất bột màu vàng, Rf = 0,63 (CH2Cl2:MeOH:H2O 3,75:1:0,1, v/v). (-)-ESI-

MS m/z: 623,2 [M-H]-, công thức phân tử: C28H32O16



(Bảng 4.11).

3.3.2.14. Hợp chất rutin (HP14)

Chất bột màu vàng, Rf = 0,4 (CH2Cl2:MeOH:H2O 2,75:1:0,1, v/v). (-)-ESI-

MS m/z: 609,2 [M-H]-, 633,1 [M+Na]

+ công thức phân tử: C27H30O16



(Bảng 4.11).

3.3.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết và các chất phân lập từ cây An

điền lá thông

3.3.3.1. Thử hoạt tính gây cảm ứng apoptosis

59

Hoạt tính cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào K562 của cao chiết n-butanol

và các hợp chất phân lập từ cao chiết này thông qua phương pháp nhuộm Hoechst

33342 được thử nghiệm tại viện Công nghệ sinh học- Viện Hàn lâm Khoa học và

Công nghệ Việt Nam. Hoạt tính cảm ứng apoptosis trên dòng tế bào OCI-AML của

cao chiết n-butanol thông qua phương pháp nhuộm nuclei bằng propidium iodide và

phân tích tế bào theo dòng chảy được thử nghiệm tại trường Đại học Perugia, Italy.

Kết quả thử hoạt tính cảm ứng apoptosis được trình bày trong phần 4.3.2.1.

3.3.3.2. Thử hoạt tính độc tế bào

Hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết n-butanol và các hợp chất phân lập

được kiểm tra bằng mô hình MTT. Hoạt tính độc tế bào được thử nghiệm tại viện

Công nghệ Sinh học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Kết quả thử

hoạt tính độc tế bào được trình bày trong phần 4.3.2.2.

60

CHƢƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả nghiên cứu về cây Ngoại mộc tái

4.1.1. Các hợp chất phân lập từ cây Ngoại mộc tái (Allophylus livescens)

Từ cây Ngoại mộc tái, một loài thuộc chi Allophylus lần đầu tiên được

nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, bằng phương pháp sắc ký

cột nhiều lần trên cột silica gel và sephadex LH-20 đã phân lập được 5 hợp chất

trong đó có 3 hợp chất từ cao n-hexan, 2 hợp chất từ cao ethyl acetate Sử dụng các

phương pháp phổ MS và NMR đã xác định được cấu trúc của 1 diterpene (AL1), 1

flavonoid (AL2), 3 steroid (AL3-AL5) (Hình 4.1).

OH

13

6101215

16171819

20

O

OH

OH

OH

OH

OH

2

3

45

7 9

10

1' 3'

4'6'

OH

1

3

4 5

6

7

8

9

10

11

12

13

1415

16

17

18

1920

2122

2324

25 26

2728

29

GlcO

OH

1

3

4 5

6

7

8

9

10

11

12

13

1415

16

17

18

1920

2122

2324

25 26

2728

29

AL1AL2

AL3AL4

1

3

4 510

9

6

7

8 14

11

12

13

15

16

1718

1920

2122

23

25 26

27

24

29

28

AL5

Hình 4.1 Cấu trúc của các hợp chất được phân lập từ lá và cành cây Ngoại mộc tái

4.1.1.1. Hợp chất 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1)

OH1

361012

15

16171819

20

OH

Hình 4.2 Cấu trúc hóa học và một số tương tác chính trên phổ HMBC của AL1

61

Hợp chất AL1 (1,3 g) được phân lập dưới dạng dầu từ cao chiết n-hexane.

Phổ khối ESI-MS ion dương cho pic ion giả phân tử ở m/z = 291 [M+H]+ và phân

mảnh ở m/z = 273 [M-OH]+. Kết hợp với phổ

1H-,

13C-NMR dự đoán công thức

phân tử là C20H34O (M = 290).

Hình 4.3. Phổ ESI-MS của AL1

Hình 4.4. Phổ 1H-NMR của AL1 (CDCl3)

Phổ 1H-NMR (Bảng 4.1) cho thấy tín hiệu của 6 proton olefinic trong vùng

từ 5,05 đến 5,21 ppm, tín hiệu của 5 nhóm methyl ở H 1,27; 1,59; 1,68 (mỗi tín

hiệu 3H, s) và 1,60 (s, 6H). Ngoài các tín hiệu trên còn quan sát được 12 proton béo

ở vùng H 1,25 – 2,09 ppm.

62

Hình 4.5. Phổ 13

C-NMR của AL1 (CDCl3)

Phổ 13

C-NMR và DEPT (Bảng 4.1) của AL1 xuất hiện 20 nguyên tử carbon

bao gồm 8 carbon olefin tại C 111,6 (C-1); 124,1 (C-10); 124,2 (C-14); 124,4 (C-

6); 131,2 (C-15); 135,0 (C-11); 135,5 (C-7) và 145,1 (C-2), tương ứng với 4 nối đôi.

Phổ DEPT xác định có 3 carbon olefin bậc bốn, 4 carbon olefin bậc ba và 1 carbon

olefin bậc 2. Một carbon bậc 4 gắn với nguyên tử oxy tại C 73,4 (C-3); 5 nhóm

methyl tại C = 16,0; 16,0 17,6; 25,6 và 27,8 cùng với 6 nhóm methylen aliphatic.

Hình 4.6. Phổ HMBC của AL1

63

Vị trí của nhóm hydroxyl gắn vào carbon C-3 được khẳng định qua tương tác

xa của H-2 (H 5,91); H2-1 (H 5,05; 5,21); H2-4 (H 1,55); H2-5 (H 1,95 – 2,09) và

H3-16 (H 1,27) với C-3 (C 73,41) trong phổ HMBC. Các số liệu phổ phân tích trên

đây kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [101] xác định chất AL1 là 1,6,10,14-

phytatetraene-3-ol hay là geranyl linalool. Việc gán các số liệu phổ 1H và

13C (Bảng

4.1.) của chất AL1 dựa vào việc phân tích phổ 1D-, 2D- NMR và so sánh với tài

liệu tham khảo [102]. Giá trị []D = +13,06 (CH2Cl2, c 0,375), phù hợp với số liệu

của (+)-(S)- geranyl linalool {[]20

D = +18,2 (CHCl3, c 0,06)} trong tài liệu [102]. Chất

này đã được phân lập trước đây từ nhiều chi khác nhau như Picea, Laurencia, [103].


13C-NMR (500/125 MHz, CDCl3) của chất AL1

C 1H-NMR (H, ppm)

13C 1

H-NMR (H, ppm) 13

C

AL1 (S)- geranyl linalool [113, CDCl3]

1 5,21 (d, 17,5)

5,05 (d, 11,0)

111,6 5,21 (bd, 17,3)

5,07 (bd, 10,7)

111,7

2 5,91 (dd, 10,5 & 17,5) 145,1 5,92 (dd, 10,7; 17,3) 145,1

3 - 73,4 - 73,5

4 1,55 (m) 42,1 1,60 - 2,06 (m) 42,1

5 1,95 – 2,09 (m) 22,7 1,60 - 2,06 (m) 22,7

6 5,14 (t, 7,0) 124,4 5,17 (bt, 6,6) 124,4

7 - 135,5 - 135,7

8 1,95 – 2,09 (m) 39,7 1,60 - 2,06 (m) 39,7

9 1,95 – 2,09 (m) 26,5 1,60 - 2,06 (m) 26,6

10 5,11 (t, 6,5) 124,1 5,10 (bt, 6,6) 124,2

11 - 135,0 - 135,6

12 1,95–2,09 (m) 39,7 1,60 - 2,06 (m) 39,7

13 1,95–2,09 (m) 26,7 1,60 - 2,06 (m) 26,8

14 5,11 (t, 6,5) 124,2 5,10 (bt, 6,6) 124,3

15 - 131,2 - 131,2

16 1,68 (s) 25,6 1,68 (s) 25,7

17 1,59 (s) 17,6 1,56 (s) 17,7

18 1,27 (s) 27,8 1,28 (s) 27,9

19

1,60 (s), 6H, 2xCH3

16,0 1,59 (s) 16,0

20 16,0 1,60 (s) 16,0

64

4.1.1.2. Hợp chất catechin (AL2)

O

OH

OH

OH

OH

OH

2

3

45

7 9

10

1' 3'

4'6'

Hình 4.7. Phổ 1H-NMR của AL2

Hợp chất AL2 thu được dưới dạng bột màu vàng sẫm từ cao chiết

ethylacetat. Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 2 proton vòng thơm ở vị trí meta

với nhau tại H 5,88 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-6); 5,96 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-8 và các tín

hiệu của một vòng thơm kiểu ABX tại H 6,86 (1H, d, J = 1,9 Hz, H-2’); 6,79 (1H,

d, J = 8,1 Hz, H-5’), 6,74 (1H, dd, J = 8,1; 1,9 Hz, H-6’) Ngoài ra còn xuất hiện tín

hiệu của hai nhóm oxy-methine tại H 4,60 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2), và 4,00 (1H, m,

H-3); một nhóm methylen tại 2,53 (1H, dd, J = 16,0; 8,1 Hz, H-4a); 2,87 (1H, dd, J

= 16,0; 5,4 Hz, H-4b).

65

Hình 4.8. Phổ 13

C-NMR của AL2

Phổ 13

C-NMR xuất hiện tín hiệu của 15 nguyên tử carbon gồm 2 nhóm

oxymethine tại C 82,8 và 68,8, phù hợp với vị trí C-2 và C-3 của khung 3-

hydroxyflavan, 1 nhóm methylen tại C 28,5; 5 nhóm methine trong vùng 95,5 đến

120,0 ppm và 7 carbon bậc 4. So sánh các dữ kiện phổ của hợp chất AL2 với các

dữ kiện phổ của chất catechin [104] thấy có sự phù hợp hoàn toàn. Catechin là một

flavonoid rất phổ biến trong giới thực vật, có hoạt tính oxi hóa mạnh [104].

4.1.1.3. Hợp chất stigmasterol và -sitosterol (AL3 và AL4)

OH

1

3

4 5

6

7

8

9

10

11

12

13

1415

16

17

18

1920

2122

2324

25 26

2728

29

OH

1

3

4 5

6

7

8

9

10

11

12

13

1415

16

17

18

1920

2122

2324

25 26

2728

29

AL3AL4

Chất AL3 và AL4 thu được dưới dạng bột vô định hình màu trắng. Phổ 1H-

NMR của AL3 và AL4 cho biết đây là hỗn hợp của stigmasterol và -sitosterol theo

tỉ lệ 3:7, tương ứng Điều này được chứng minh qua các tín hiệu sau: hai tín hiệu ở

H = 5,34 (m) và H = 3,51 (m) có cường độ (integral) tương đương 1 proton là tín

66

hiệu H-5 và H-3, tương ứng, của chất AL3 và AL4; tín hiệu ở H = 5,15 (dd, J =

8,5; 15,0 Hz) và 5,01 (dd, J = 8,5; 15,0) với integral tương đương 0,3 H là tín hiệu

H-20 và H-21 của stigmasterol. Bên cạnh đó, tín hiệu 6 nhóm methyl của mỗi chất

AL3 và AL4 cũng được quan sát thấy trên phổ, chúng gồm có 2 tín hiệu singlet của

nhóm methyl bậc ba (CH3-28, CH3-29), 3 tín hiệu doublet của nhóm methyl bậc hai

(CH3-19, CH3-26, CH3-27) và 1 tín hiệu triplet của nhóm methyl bậc một (CH3-24).

Các số liệu phổ của chất AL3 và AL4 (mục 3.1.2.3 và 3.1.2.4) phân tích trên đây

hoàn toàn phù hợp với số liệu trong tài liệu [105]. Stigmasterol và -sitosterol là 2

phytosterol tồn tại rất phổ biến trong thực vật, cấu trúc của chúng chỉ khác nhau ở

một nối đôi nên khó tách từng chất riêng biệt, thường chúng được phân lập dưới

dạng hỗn hợp với các tỉ lệ khác nhau.

4.1.1.4. Hợp chất -sitosterol glucoside (AL5)

GlcO

1

3

4 510

9

6

7

8 14

11

12

13

15

16

1718

1920

2122

23

25 26

27

24

29

28

Hợp chất AL5 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim, màu trắng, có Rf

0,5 với hệ dung môi DCM:MeOH (95/5, v/v) được xác định là -sitosterol

glucoside, khi so sánh với chất chuẩn trên sắc ký lớp mỏng. -Sitosterol glucoside

là một steroid tồn tại phổ biến trong giới thực vật.

Các hợp chất catechin, stigmasterol, -sitosterol và -sitosterol glucoside là

các hợp chất rất phổ biến trong giới thực vật và có nhiều công bố về hoạt tính sinh

học nên chúng tôi chỉ thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất AL1 (geranyl

linalool).

4.1.3. Hoạt tính gây độc tế bào của AL1 được phân lập từ cây Ngoại mộc tái

Hợp chất AL1 (geranyl linalool) được tiến hành thử hoạt tính gây độc tế bào

theo phương pháp của Likhiwitayawuid [106] và Skehan [107] trên các dòng tế bào

ung thư ở người: Ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (LU-

1), ung thư vú (MCF-7), ung thư da (SK-Mel-2). Kết quả cho thấy chất AL1 không

thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên 5 dòng tế bào ung thư thử nghiệm (Bảng 4.2).

67

Bảng 4.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của hợp chất AL1

STT Tên mẫu Giá trị IC50 (g/mL) trên các dòng tế bào

KB HepG2 MCF7 LU-1 SK-Mel-2

1 AL1 >128 >128 >128 >128 >128

Ellipticine 0,40 0,41 0,48 0,45 0,45

Kết luận:

Đây là lần đầu tiên thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Ngoại

mộc tái được nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới

Từ cây Ngoại mộc tái đã phân lập và xác định được cấu trúc hóa học của 5

hợp chất gồm 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1), catechin (AL2), stigmasterol

(AL3), β-sitosterol (AL4) và β-sitosterol glucoside (AL5) trong đó hợp chất

1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1) và catechin (AL2) lần đầu tiên được phân lập từ

chi Allophylus.

Geranyl linalool (AL1) thể hiện kết quả âm tính khi thử hoạt tính gây độc tế

bào trên 5 dòng tế bào ung thư ở người (KB, HepG2, LU-1, MCF-7, SK-Mel-2).

4.2. Các nghiên cứu về cây Cày ri ta Hạ long (Chirita halongensis)

4.2.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập được

Từ cây Cày ri ta Hạ long, một loài thuộc chi Chirita, lần đầu tiên được

nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Bằng phương pháp sắc ký

cột đã phân lập được 9 hợp chất trong đó từ cao n-hexane thu được 2 hợp chất, cao

ethyl acetate thu được 2 hợp chất, cao n-butanol thu được 5 hợp chất. Sử dụng các

phương pháp phổ MS và NMR đã xác định được cấu trúc của chúng là 1

anthraquinone (CH1), 3 triterpenoid (CH2-CH4), 5 phenylethanoid glycoside

(CH5-CH9) (Hình 4.56)

68

O

O

OH1

2

45

6

8 9

10

7 8a 9a

10a 4a

CH1

3

CH2 R1 = -OH, R2 = R3 = CH3, R4

= H, R5

= CH2OH

CH3 R1

= -OH, R2

= R3 = R5 = CH3, R4

= H

CH4 R1

= -OH, R3

= H, R2 = R4

= R5

= CH3

COOH

R5

R2

R3

R1

R4

1

3

57

9

11

12

14 16

1718

1921

22

2324

25 26

27

28

29

30

OOH

OH

OH

O

OH

OH

OH

1

3

4

CH5

O

OH

OH

OR1

O

OH

O

OR2

O

OH

OH

OH

R3

1"'

1"

1

3

4

CH6 R1 = Caffeoyl, R2 = R3 = H


CH8 R1

= R2 = R3

= H

CH6 R1 = Caffeoyl, R2 = H, R3 = OH

Hình 4.9. Cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ cây Cày ri ta Hạ long

4.2.1.1. Hợp chất 7-hydroxytectoquinone (CH1)

O

O

CH3OH1

2

45

6

8 9

10

7 8a 9a

10a 4a3

O

O

CH3OH

HMBC

Hình 4.10 Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ HMBC (HC) của CH1

Hình 4.11 Phổ 1H-NMR của CH1 (CD3OD)

69

Chất CH1 được phân lập dưới dạng tinh thể màu vàng từ cao chiết n-

butanol. Phổ 1H NMR xuất hiện tín hiệu đặc trưng của anthraquinone gồm tín hiệu

các proton vòng thơm tương tác kiểu ABX: 3 proton tại δH 8,07 (br s, H-1), 7,68

(dd, J = 1,0 & 8,0 Hz, H-3); 8,16 (d, J = 8,0 Hz, H-4) của vòng thứ nhất và 3 proton

tại H 7,59 (d, J = 2,5 Hz, H-8); 7,21 (dd, J = 2,5 & 8,5 Hz, H-6); 8,17 (d, J = 8,5

Hz, H-5) của vòng thứ hai và tín hiệu proton của nhóm methyl tại C 2,54 (3H, s).

Hình 4.12 Phổ 13

C-NMR của CH1 (CD3OD)

Phổ 13

C NMR cho thấy sự có mặt của 15 nguyên tử carbon gồm 6 carbon bậc

bốn, 6 carbon bậc ba, 2 carbon carbonyl và một carbon nhóm methyl. Trong số 6

carbon bậc 4 có 2 carbon gắn với nhóm methyl và hydroxy lần lượt tại tại C 146,3

(C-2); 164,7 (C-7) và 4 carbon bậc bốn còn lại trong vùng 127,2 đến 137,1 ppm.

Trên phổ 13

C-NMR còn xuất hiện tín hiệu đặc trưng của 2 carbon carbonyl tại C

184,6 (C-9); 183,3 (C-10) cùng với tín hiệu của sáu nhóm methine tương ứng tại C

128,16 (C-1); 136,07 (C-3); 128,16 (C-4); 130,94 (C-5); 122,32 (C-6); 113,51 (C-8)

và một nhóm methyl tại C 21,76. Các tín hiệu này cho phép dự đoán CH1 có

khung anthraquinone. Sự xuất hiện của nhóm hydroxy được chứng minh bởi sự

chuyển dịch về phía trường thấp của carbon C-7 tại C 164,67.

70

Hình 4.13 Phổ HMBC của CH1

Vị trí của nhóm methyl trong phân tử CH1 được khẳng định bằng các tương

tác trên phổ HMBC bao gồm tương tác giữa proton của nhóm methyl ở H 2,54 với

carbon C-1 (C 128,16) và C-3 (C 136,07) và H-1 (H 8,07) tương tác với C-3 (C

136,07), C-4a (C 132,78) và carbon methyl tại C 21,76 chứng tỏ nhóm methyl gắn

vào carbon C-2.

Phân tích phổ 1D-NMR, 2D-NMR và so sánh tài liệu tham khảo [108] có thể

kết luận CH1 là 7-hydroxytectoquinone. Hợp chất này lần đầu tiên được phân lập từ

dịch chiết chloroform của rễ cây Rubia tinctorum [108].

4.2.1.2. Hợp chất 3α,24-dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid (CH2)

COOH

CH2OH

OH

H

1

3 57

9

11

12

1416

1718

1921

22

2324

2526

27

28

29

30

71

Hình 4.14 Phổ (-)-ESI-MS của CH2

Phổ khối ESI-MS ion âm có pic ion giả phân tử ở m/z = 471 [M-H]-, kết hợp

với phổ 1H-,

13C-NMR cho phép dự đoán công thức phân tử là C30H48O4 (M = 472).

Các số liệu phổ cho phép dự đoán chất CH2 là triterpenoid khung urs-12-en-28-oic

acid Điều này được chứng minh bởi các tín hiệu trên phổ NMR.

Hình 4.15 Phổ 1H-NMR của CH2 (CDCl3 + CD3OD)

72

Hình 4.16 Phổ 13

C-NMR của CH2 (CDCl3 + CD3OD)

Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu proton của nhóm methine tại H 2,19 (d, J =

11,0 Hz, H-18), tín hiệu proton của 6 nhóm methyl gồm bốn singlet tại H 0,79 (3H,

s); 0,90 (3H, s); 1,06 (3H, s); 1,10 (3H, s); hai doublet tại H 0,86 (d, J = 6,5 Hz);

0,93 (d, J = 5,0 Hz). Phổ 13

C-NMR xuất hiện tín hiệu một nối đôi thế 3 lần với độ

dịch chuyển hóa học đặc trưng của urs-12-en với C 126,91 (C-12) và 139,59 (C-13)

cùng với một nhóm carboxyl ở C 181,63 (C-28). Ngoài ra, trên phổ 1H- và

13C-

NMR còn xuất hiện tín hiệu của một nhóm hydroxy-methine tại H 3,83 (brs, H-3),

C 71,3 và một nhóm hydroxymethylene tại H 3,70 (d, J = 11,0 Hz), 3,46 (d, J =

11,0 Hz), C 66,32. Độ dịch chuyển hóa học và dạng pic của proton nhóm

oxymethine đặc trưng cho nhóm hydroxyl gắn vào C-3 với cấu hình α Các tương

tác trong phổ HMBC giữa proton ở H 3,70; 3,46 với carbon ở C 22,81 (C-23), 44,0

(C-4), 70,39 (C-3) cho phép khẳng định nhóm hydroxyl thứ hai gắn ở carbon C-24.

Từ các dữ liệu của phổ NMR và so sánh với phổ theo tài liệu [109] có thể xác định

CH2 là 3α,24-dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid. Hợp chất này lần đầu tiên được

phân lập từ dịch chiết chloroform của Verbena officinalis [109].

73

4.2.1.3. Hợp chất ursolic acid (CH3)

COOH

OH

H

1

3 57

9

11

12

1416

1718

1921

22

2324

2526

27

28

29

30

Chất CH3 được phân lập dưới dạng bột màu trắng. Phổ khối ESI-MS cho pic

ion phân tử ở m/z 479,2 [M+Na]+ và 455,2 [M-H]

-, kết hợp với phổ NMR cho phép

dự đoán công thức phân tử là C30H48O3.

Phổ 1H-NMR của chất CH3 xuất hiện tín hiệu của một proton olefin ở δH

5,11 (1H, m, H-12), một nhóm hydroxymethine ở δH 2,98 (1H, m), 7 nhóm methyl

bao gồm 5 nhóm methyl bậc ba ở δH 0,66; 0,73; 0,85; 0,88; 1,02 (mỗi tín hiệu 3H, s)

và hai nhóm methyl bậc hai ở δH 0,79 (3H, d, J = 6,4 Hz); 0,89 (3H, d, J = 8,7 Hz).

Phổ 13

C-NMR và DEPT cho thấy sự có mặt của 30 carbon trong phân tử gồm

một carbon của nhóm acid ở δC 178,27, một carbon hydroxymethine ở δC 76,85, hai

carbon olefin dạng >C=CH- ở δC 138,19 và 124,58, bảy carbon methyl, chín carbon

methylene, năm carbon methine và năm carbon bậc bốn. Từ các số liệu phổ phân

tích trên cho thấy chất CH3 là một triterpenoid khung ursane. Cấu trúc của CH3

được khẳng định là ursolic acid khi so sánh các dữ liệu phổ 1H-,

13C-NMR của nó

với tài liệu tham khảo [110]. Ursolic acid được tìm thấy trong nhiều loài thuộc chi

Chirita. Đây là một hợp chất phổ biến trong giới thực vật, thể hiện phổ hoạt tính đa

dạng như kháng khuẩn, kháng viêm, bảo vệ gan, chống ung thư ... [111, 112].

4.2.1.4. Hợp chất oleanolic acid (CH4)

COOH

OH

1

3 57

9

11

12

1416

1718

1921

22

2324

2526

27

28

29

30

74

Chất CH4 được phân lập dưới dạng bột màu trắng. Phổ khối ESI-MS cho pic

ion phân tử ở m/z 455,5 [M-H]-, ]

-, kết hợp với phổ NMR cho phép dự đoán công

thức phân tử là C30H48O3.

Dữ liệu phổ NMR của chất CH4 gần giống với CH3 có 30 nguyên tử carbon

trong phân tử với điểm khác biệt là xuất hiện thêm một nhóm methyl ở vị trí C-20

đồng thời mất đi nhóm methyl gắn với carbon C-19 so với CH3. Các tín hiệu trong

phổ 1H- và

13C-NMR của chất CH4 bao gồm một nối đôi thế 3 lần ở δH 5,27 (1H, t,

J = 3,5 Hz, H-12), δC 122,7 và 143,6; một nhóm hydroxymethine ở δH 3,20 (1H, dd,

J = 4,0; 11,0 Hz, H-3), δC 79,1; một nhóm carboxylic ở δC 181,6 và tín hiệu của 7

nhóm methyl. Sự khác nhau của hai chất là sự thay thế 2 tín hiệu doublet methyl

trong phổ 1H-NMR của chất CH3 bằng 2 tín hiệu singlet methyl ở CH4 Điều này

được khẳng định lại trong phổ 13

C-NMR, đó là sự xuất hiện nhóm methylen ở δC

45,9 và carbon bậc 4 ở δC 30,7 ở CH4 thay cho 2 carbon methine ở δC 38,4; 38,5

trong CH3. Từ các số liệu phổ phân tích trên kết hợp với so sánh tài liệu tham khảo

[113], cấu trúc của CH4 được khẳng định là oleanoic acid, một triterpenoid khung

olean. Oleanolic là một trong những hợp chất thể hiện nhiều hoạt tính sinh học và

tồn tại tương đối phổ biến trong thực vật. Các công bố cho thấy oleanoic acid thể

hiện hoạt tính chống ung thư, bảo vệ gan, kháng viêm, kháng vi sinh vật…[114, 115].

4.2.1.5. Hợp chất 2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl-β-D-glucopyranoside (CH5)

OOH

O

OH

OH

OHOH

OH

1'2'

3'

4'5'

6'

12

3

4

5

6

OOH

O

OH

OH

OHOH

OH

1'2'

3'

4'5'

6'

12

3

4

5

6

Hình 4.17 Cấu trúc và một số tương tác chính (HC) trên phổ HMBC của CH5

Chất CH5 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu vàng nhạt từ cao

chiết n-butanol. Phổ khối ESI-MS ion âm cho pic ion giả phân tử tại m/z 315,0 [M-

H]-. Công thức phân tử được rút ra từ số liệu phổ khối và NMR là C14H20O8.

75

Hình 4.18. Phổ 1H NMR của CH5 (CD3OD)

Hình 4.19 Phổ 13


Phổ NMR chỉ ra sự có mặt của phenylethyl alcohol và một β-glucopyranose

trong phân tử. Trên phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của 3 proton thơm thế ở vị trí 1,

3, 4 tại δH 6,71 (d, J = 1,5 Hz); 6,69 (d, J = 8,5 Hz) và 6,57 (dd, J = 1,5 & 8,5 Hz),

tín hiệu của một nhóm oxymethylene tại δH 4,05 (1H, m), (3,72 1H, m), và một

nhóm methylene tại δH (2,80 2H, m) chứng tỏ sự có mặt của nhóm 2-(3,4-

76

dihydroxyphenyl)ethyl. Mặt khác, sự xuất hiện của một đơn vị đường glucose được

nhận biết bằng tín hiệu doublet của một proton anomer tại δH 4,31(1H, d, J = 8,0

Hz, H-1’) cùng với giá trị hằng số tương tác JH-1’/H-2’ = 7,5 Hz, chứng tỏ cả hai

proton H-1’ và H-2’ đều ở vị trí axial tức là có mặt liên kết ether dạng β-glycoside

giữa phân tử đường với aglycone. Ngoài ra, trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện các tín

hiệu điển hình khác của một đơn vị đường glucose 3,20 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-2’);

3,28 – 3,39 (3H, m, H-3’; H-4’; H-5’); 3,88 (1H, dd, J = 1,5; 12,0 Hz, Ha-6’), 3,68

(1H, dd, J = 5,0; 12,0 Hz, Hb-6’) Như vậy, dựa trên việc phân tích các tín hiệu trên

phổ 1H-NMR có thế khẳng định CH5 thuộc loại hợp chất phenolic glucoside.

Phổ 13

C-NMR xuất hiện tín hiệu của 14 nguyên tử carbon, trong đó có 8

carbon thuộc hợp phần aglycon khung phenol, 6 carbon thuộc đơn vị đường

glucose. 2 nguyên tử carbon thơm gắn với 2 nhóm thế hydroxyl chuyển dịch ở vùng

trường thấp tại C 146,11 và 144,64; 4 nguyên tử carbon còn lại thuộc vòng benzene

tại C 131,6 (C-1), 117,1 (C-2), 116,3 (C-5), 121,3 (C-6), cùng với tín hiệu của một

nhóm methylene tại δC 36,6 (C-β), một nhóm oxymethylene tại δC 72,1 (C-α) 6

carbon thuộc đơn vị đường glucose với các tín hiệu tại δC 104,4 (C-1’); 75,1 (C-2’);

77,9 (C-3’); 71,6 (C-4’); 78,1 (C-5’); 62,7 (C-6’) Vị trí kết nối của đơn vị đường

glucose được xác định trên phổ HMBC bởi tương tác giữa proton H-1’ (δH 4,31) với

C-α (δC 72,1) cũng như tương tác của H-α (δH 4,05; 3,70-3,74) với C-1’ (δC 104,4).

So sánh các giá trị phổ NMR của hợp chất CH5 với các giá trị phổ tương ứng đã

công bố của 2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl-β-D-glucopyranoside cho thấy sự phù

hợp hoàn toàn ở tất cả các vị trí [116]. Hợp chất này đã được tìm thấy ở loài Prunus

grayana [116].

4.2.1.6. Hợp chất acteoside (CH6)

O

O

OH

O

OH

O

OH

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

O

1"'

1"

12

3

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

77

Chất CH6 được phân lập dưới dạng bột vô định hình màu trắng từ cao chiết

n-butanol.

Hình 4.20. Phổ 1H-NMR của CH6 (CD3OD)

Phổ NMR của CH6 bên cạnh những tín hiệu giống như phổ của CH5 còn

xuất hiện những tín hiệu đặc trưng của đường α-rhamnopyranose và nhóm caffeoyl.

Điều này được thể hiện ở các tín hiệu của 3 proton thơm trong vòng benzene thế ở

vị trí 1, 3, 4 tại δH 6,73 (d, J = 2,0 Hz); 6,71 (d, J = 8,0 Hz) và 6,58 (dd, J = 2,0 &

8,5 Hz), một nhóm oxymethylene tại δH 4,06 (1H, m), (3,75 1H, m), và một nhóm

methylene tại δH 2,81 (2H, m) trên phổ 1H-NMR. Sự xuất hiện tín hiệu doublet

proton anomer tại δH 4,40 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1”) chứng tỏ sự có mặt của đơn vị

đường β-glucose. Sự khác biệt so với CH5 là xuất hiện những tín hiệu đặc trưng của

đường α-rhamnopyranose: tín hiệu proton anomer tại H 5,22 brs, tín hiệu proton

nhóm methyl tại H 1,12 (d, J = 6,5 Hz) và các tín hiệu của nhóm trans-caffeoyl, bao

gồm 3 proton vòng thơm tương tác kiểu ABX tại H 7,09 (d, J = 1,5 Hz); 6,81 (d, J =

8,0 Hz); 6,98 (dd, J = 1,5 & 8,0 Hz) và 2 proton olefin cấu hình trans tại H 6,30 (d,

J = 16,0 Hz); 7,62 (d, J = 16,0 Hz) được quan sát thấy trên phổ 1H-NMR.

78

Hình 4.21 Phổ 13


Phổ 13

C-NMR xuất hiện tín hiệu của 29 nguyên tử carbon, trong đó có 8

carbon thuộc hợp phần aglycon khung phenol, 12 carbon thuộc đơn vị đường

glucose và rhamnose, 9 nguyên tử carbon thuộc nhóm caffeoyl. Các tín hiệu điển

hình của aglycon khung phenol gồm 2 carbon thơm gắn với 2 nhóm thế hydroxyl ở

vùng trường thấp tại C 146,0 và 144,6, tín hiệu đặc trưng của đường glucose tại δC

104,1 (C-1”); 76,1 (C-2”); 81,6 (C-3”); 70,4 (C-4”); 75,9 (C-5”); 62,3 (C-6”), tín

hiệu đặc trưng của đường α-rhamnopyranose gồm anomer methine tại δC 103,0 (C-

1”’) và nhóm methyl tại 18,4 (C-6’”) chứng tỏ chất CH6 một phenylethyl alcohol

diglycoside với C6-C3 acid ester. Vị trí kết nối gốc trans-caffeoyl được xác định là

ở C-4” của đơn vị β-glucopyranose, được thể hiện ở độ dịch chuyển về trường thấp

hơn của nhóm CH-4” tại 4,95 (1H, t, J = 9Hz, H-4”) so với chất CH5 với giá trị C

= 1,25. Trong phổ 13

C-NMR, độ chuyển dịch hóa học của C-3” (C 81,6) của đơn vị

đường glucose về phía trường thấp hơn so với CH5 với giá trị C = 3,7 chứng tỏ

phần rhamnose liên kết với C-3” của glucose. Từ dữ liệu phổ 1H-NMR và

13C-NMR

của CH6 (Bảng 4.3 và 4.4) và so sánh với dữ liệu phổ của [116, 117], có thể kết

luận CH6 là acteoside. Hợp chất này có tác dụng ngăn chặn di căn của tế bào u ác

tính B16 gây ung thư phổ [118] và có hoạt tính kháng viêm mạnh in vitro và in

vivo [119].

79

4.2.1.7. Hợp chất isoacteoside (CH7)

O

O

OH

O

O

O

OHOH

OH

OHOH

OH

OH

OH

O

1"'

1"

12

3

4

5

61'

2'3'

4'6'

5'

Phổ NMR của CH7 gần giống với phổ của CH6 với những tín hiệu đặc

trưng của một lớp chất phenylethanoid glycoside chỉ khác là nhóm caffeoyl liên kết

với nhóm hydroxy ở vị trí C-6 của glucose. Sự giống nhau của hai chất CH6 và

CH7 trong phổ NMR thể hiện ở tín hiệu của nhóm 2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl

gồm ba proton thơm trong vòng benzen bị thế ở trí 1,3,4 tại δH 6,70 (1H, d, J = 1,5

Hz), 6,67 (1H, d, J = 8,0 Hz) và 6,55 (1H, dd, J = 1,5; 8,0 Hz), một nhóm

methylene tại δH 2,80 (2H, m) và một nhóm oxymethylene tại δH 4,05 (1H, m); 3,73

(1H, m), nhóm trans- caffeoyl bao gồm cụm tín hiệu của hệ spin ABX ở H 7,06

(1H, d, J = 2,0 Hz), 6,79 (1H, d, J = 8,0 Hz), 6,90 (1H, dd, J = 2,0; 8,5 Hz); một nối

đôi có cấu hình trans ở H 6,390 (1H, d, J = 16,0 Hz), 7,58 (1H, d, J = 16,0 Hz) và

một nhóm carbonyl ở C 169,2 cùng với hai đơn vị đường: glucopyranose và

rhamnopyranose với tín hiệu đặc trưng lần lượt tại δH 4,33 (1H, d, J = 8,0 Hz); 5,21

(brs); δC 102,66 và nhóm methyl tại tại H 1,28 (d, J = 6,0); δC 17,9 chứng tỏ chất

CH7 là một phenylethyl alcohol diglycoside với C6-C3 acid ester. Khi so sánh số

liệu phổ 13

C-NMR của CH7 (Bảng 4.4) với CH6 cho thấy tín hiệu của nhóm 2-

(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl và đơn vị đường α-rhamnopyranose ở trung tâm là

trùng khớp nhau, chỉ có tín hiệu proton gắn với C-4” và C-6” của glucose trong phổ

1H-NMR là khác nhau, cụ thể là tín hiệu proton ở vị trí carbon C-4” và C-6” trong

phân tử CH6 lần lượt ở H 4,95 (t, 9,0; H-4”); 3,3 – 4,1 (m, H-6”), trong phân tử

CH7 ở 3,4-4,0 (m, H-4”); 4,39 (brt, 5,5; H-6”a); 4,52 (dd, 1,5; 11,5; H-6”b) Điều

này có nghĩa là gốc trans-caffeoyl của chất CH7 được gắn ở C-6” thay vì gắn vào

C-4” như ở chất CH6. Cấu trúc của chất CH7 được xác định là isoacteoside khi so

sánh với số liệu phổ của nó với tài liệu [114]. Hợp chất này được phân lập từ các

loài Cistanche tubulosa [120], Byblis liniflora [117]. Hợp chất này có hoạt tính

80

chống oxi hóa và kháng viêm [121, 122].

4.2.1.8. Hợp chất decaffeoylacteoside (CH8)

O

O

OH

O

OH

O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

1"'

1"

12

3

4

5

6

Chất CH8 được phân lập dưới dạng bột, màu trắng từ cao chiết n-butanol.

Phổ khối ESI-MS ion âm có pic ion giả phân tử ở m/z = 461 [M-H]-, kết hợp với

phổ 1H-,


Phổ NMR của CH8 giống với phổ của CH6 với những tín hiệu đặc trưng của

một phenylethyl glycoside nhưng khác là CH8 không có nhóm caffeoyl trong phân

tử so với CH6. Sự giống nhau của chúng trong phổ NMR thể hiện ở tín hiệu của 3

proton thơm tương tác kiểu ABX ở H 6,71 (1H, d, J = 1,5 Hz); 6,69 (1H, d, J = 8,0

Hz); 6,57 (1H, dd, J = 2,0; 8,0 Hz), tín hiệu của một nhóm oxymethylene tại δH 4,01

(1H, m), (3,72 1H, m), một nhóm methylene tại δH (2,80 2H, m) cùng với tín hiệu

của 2 nhóm methine anomer ở H 4,31 (1H, d, J = 8,0 Hz)/C 104,2 và H 5,17 (d, J

= 1,0 Hz)/C 102,8. Sự khác nhau của hai phân tử CH8 và CH6 thể hiện là trong

phân tử CH8 không còn nhóm caffeoyl Điều này được thể hiện rất rõ trong phổ

NMR không còn tín hiệu đặc trưng của nhóm caffeoyl đồng thời thay thế tín hiệu

proton H-4 của phân tử glucose ở H 3,95 (t, 9,0) trong chất CH6 bằng tín hiệu ở H

3,3-4,1 (m) trong chất CH8.

Vị trí của các nhóm thế trong phân tử CH8 được khẳng định bằng các tương

tác trong phổ HMBC gồm tương tác giữa H-1” (H 4,31) với C-1 (C 131,5); giữa

H-α (H 3,72; 4,01) với C-4 (C 146,1), C-5 (C 117,1) và C-3 (C 144,6) chứng tỏ

nhóm phenylethyl gắn kết với phần đường ở vị trí C-1”

Từ các dữ liệu phổ 1D-, 2D-NMR (Bảng 4.3 và 4.4) và so sánh với tài liệu

tham khảo [123] cho phép kết luận hợp chất CH8 là decaffeoyl acteoside. Chất này

cũng được phân lập từ một số loài như Euphrasia pectinata [124], Clerodendron

trichotomum [119].

81

4.2.1.9. Hợp chất β-hydroxyacteoside (CH9)

O

O

OH

O

OH

O

OH

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

O

OH

1"'

1"

12

3

4

5

6

1'2'

3'

4'

5'

6'

O

O

OH

O

OH

O

OH

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

O

OH

1"'

Hình 4.22 Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ HMBC của CH9

Phổ NMR của CH9 giống với phổ của CH6 chỉ trừ những tín hiệu methylen

của aglycon khung phenol được thay bằng tín hiệu hydroxy methine. Điều này được

thể hiện ở các tín hiệu của 3 proton thơm trong vòng benzene thế ở vị trí 1, 3, 4 tại

δH 6,73 (d, J = 2 Hz); 6,76 (d, J = 8,0 Hz) và 6,87 (dd, J = 2,0 & 8,0 Hz). Tín hiệu

proton của nhóm methine CH-β ở H 2,80 m; C 36,5 trong CH6 được thay bằng tín

hiệu hydroxyl methine ở H 4,77 m, C 74,2 C-β. Sự chuyển dịch về trường thấp của

tín hiệu CH2-α với C = 4,4 ppm cùng với sự tương tác giữa C-β (C 74,2) với H-2

[H 6,73 (d, J = 2,0 Hz)], H-6 [H 6,87 (dd, J = 2,0 & 8,0 Hz)] trong phổ HMBC

chứng tỏ nhóm hydroxyl liên kết với C-β Ngoài ra, còn xuất hiện tín hiệu của 2

nhóm methine anomer ở H 4,31 (1H, d, J = 8,0 Hz)/C 104,2 và H 5,17 (d, 1,0

Hz)/C 102,8 chứng minh hai đơn vị đường trong phân tử chất CH9 là β-glucose và

α-rhamnose dựa vào độ chuyển dịch hóa học và hằng số tương tác của proton

anomer cùng với sự có mặt của các tín hiệu nhóm oxymethylene (CH2-6”) ở H 3,84

(1H, brt, J = 8,5 Hz); 3,42 (1H, brt, J = 9,0 Hz)/C 68,0 của đường β-glucose và

nhóm methyl (CH3-6”) ở H 1,12 (3H, d, J = 6,0 Hz)/C 18,3 của đường α-

rhamnose. Tương tác giữa proton anomer H-1”’ của đường α-rhamnose (H 5,22)

với C-3” (C 81,3) và C-2”’ (C 72,1) chứng tỏ trong phổ HMBC chứng tỏ đơn vị α-

82

rhamnose kết nối với β-glucose ở C-3”. Vị trí kết nối của diglycoside và nhóm

ethenyl được xác định bằng các tương tác trong phổ HMBC, bao gồm tương tác

giữa H-1” (H 4,40) với C-α (C 76,5); giữa H-α (H 3,57) với C-1” (C 104,6).

Tương tác giữa proton H-4” (H 4,96) với C-α của nhóm caffeoyl (C 168,3) chứng

tỏ nhóm caffeoyl kết nối với β-glucose ở C-4” Độ dịch chuyển về phía trường thấp

của C-2 ở C 116,3 và C-5 ở C ở 117,1 chứng tỏ nhóm thế thứ 3,4 trong phân tử là

nhóm hydroxyl.

Từ dữ liệu phổ 1D-NMR và 2D-NMR (Bảng 4.3 và 4.4) và so sánh với tài

liệu tham khảo [122] cho phép kết luận CH9 là β-hydroxyacteoside. Hợp chất này

lần đầu tiên được phân lập từ Forsythia viridissima vào năm 1984 [125]. Hợp chất

này có hoạt tính kháng khuẩn đối với chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus với giá

trị MIC là 2,0 mM [126].

Bảng 4.3 Số liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) của CH6-CH9

C δH, J (Hz)

CH6 CH 7 CH 8 CH 9

1 - - - -

2 6,73 (d, 2,0) 6,70 (d, 1,5) 6,71 (d, 1,5) 6,73 (d, 2,0)

3 - - - -

4 - - - -

5 6,71 (d, 8,0) 6,67 (d, 8,0) 6,69 (d, 8,0) 6,76 (d, 8,0)

6 6,58 (dd, 2,0;

8,5)

6,55 (dd, 1,5; 8,0) 6,57 (dd, 2,0;

8,0)

6,87 (dd, 2,0; 8,0)

α 3,75 m

4,06 m

3,73 m

4,05 m

3,72 m

4,01 m

3,57 m

4,00 m

β 2,81 m 2,80 m 2,80 m 4,77 m

Caffeoyl

1’ - - - -

2’ 7,09 (d, 1,5) 7,06 (d, 2,0) - 7,07 (d, 2,0)

3’ - - - -

4’ - - - -

5’ 6,81 (d, 8,0) 6,79 (d, 8,0) - 6,80 (d, 8,0)

6’ 6,98 (dd,

1,5 & 8,0)

6,90 (dd, 2,0

& 8,5)

- 6,98 (dd, 2,0 &

8,0)

83

α - - -

β 6,30 (d, 16,0) 6,30 (d, 16,0) - 6,29 (d, 16,0)

7,62 (d, 16,0) 7,58 (d, 16,0) - 7,62 (d, 16,0)

Glc

1” 4,40 (d, 8,0) 4,33 (d, 8,0) 4,31 (d, 8,0) 4,40 (d, 8,0)

2” 3,3 – 4,1 m

3,4 – 4,0 m

3,3 – 4,1 m

3,5 – 4,0 m

3”

4” 4,95 (t, 9,0) 4,96 (t, 9,0)

5” 3,3 – 4,1 m 3,5 – 4,0 m

6” 4,39 (brt, 5,5)

4,52 (dd, 1,5; 11,5)

3,37 (brt, 9,5)

3,42 (brt, 9,5)

3,42 (brt, 8,5)

3,84 (brt, 9,0)

Rham

1”’ 5,22 brs 5,21 brs 5,17 (d, 1,0) 5,22 brs

2”’

3,3 – 4,1 m

3,4 – 4,0 m

3,3 – 4,1 m

3,5 – 4,0 m 3”’

4”’

5”’

6”’ 1,12 (d, 6,5) 1,28 (d, 6,0) 1,26 (d, 7,0) 1,12 (d, 6,0)

Bảng 4.4 Số liệu phổ 13

C-NMR (125 MHz, CD3OD) của CH6-CH9

C C

CH6 CH 7 CH 8 CH 9

1 131,5 131,4 131,5 133,7

2 116,5 117,1 116,3 114,6

3 144,6 146,0 144,6 146,3

4 146,0 144,6 146,1 146,1

5 117,1 116,4 117,1 116,5

6 121,3 121,3 121,2 119,0

α 72,3 72,4 72,1 76,7

β 36,5 36,6 36,5 74,2

Caffeoyl

1’ 127,6 127,7 - 127,7

84

2’ 114,7 115,1 - 115,3

3’ 149,7 146,7 - 146,9

4’ 146,7 149,5 - 149,8

5’ 116,3 116,6 - 116,2

6’ 123,2 123,2 - 123,2

α 168,3 169,2 - 168,3

β 115,3 114,8 - 114,7

148,0 147,2 - 148,0

Glc

1” 104,1 104,3 104,2 104,6

2” 76,1 75,3 75,6 76,4

3” 81,6 84,0 84,5 81,3

4” 70,4 70,0 70,1 70,5

5” 75,9 75,6 77,8 76,1

6” 62,3 64,6 62,7 62,3

Rham

1”’ 103,0 102,7 102,8 102,9

2”’ 72,0 72,2 72,2 72,1

3”’ 72,2 72,3 72,3 72,4

4”’ 73,8 74,0 74,0 73,8

5”’ 70,6 70,4 70,2 70,4

6”’ 18,4 17,9 17,9 18,4

4.2.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được

Bảng 4.5. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập được

Tên mẫu

IC50 (M) ± SD TLTK

KB HepG2 LU-1 MCF7

CH2 165,21±1,51 167,45±1,23 169,23±0,45 140,13±1,46 [31]

CH5 > 200 > 200 > 200 > 200 [31]

CH7 51,04±1,86 57,61±0,51 125,71±1,84 > 200

CH8 48,67±3,38 78,80±3,34 132,82±0,95 > 200

Ellipticine 0,93±0,06 1,26±0,05 1,75±0,05 2,07±0,08

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 4 hợp chất phân lập từ cây Cày ri ta

Hạ long cho thấy ba hợp chất CH2, CH7, CH8 thể hiện hoạt tính yếu trên cả 4

dòng tế bào biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (LU-1) và ung thư

vú (MCF7).

85

Kết luận: Đây là lần đầu tiên thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào

của cây Cày ri ta Hạ long được nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới

Kết quả đã phân lập và xác định được cấu trúc của 9 hợp chất gồm 1

anthraquinone, 3 triterpenoid và 5 phenylethanoid glycoside Trong đó, có 3 hợp chất:

oleanolic acid, decaffeoylacteoside và β-hydroxy acteoside lần đầu tiên được phân lập

từ chi Chirita. Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây về thành phần hóa

học của chi Chirita có chứa chủ yếu là các hợp chất phenylethanoid.

Kết quả thử nghiệm về hoạt tính gây độc tế bào trên bốn dòng tế bào: ung

thư biểu mô (KB), ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (LU-1) và ung thư vú

(MCF7) của ba hợp chất CH2, CH7, CH8 phân lập được từ cây Cày ri ta Hạ long

cho thấy 3 hợp chất này thể hiện hoạt tính yếu trên 4 dòng tế bào thử nghiệm.

4.3. Kết quả nghiên cứu về cây An điền lá thông (Oldenlandia pinifolia)

4.3.1. Các hợp chất phân lập từ cây An điền lá thông

Từ cây An điền lá thông phân lập được 14 hợp chất gồm 4 hợp chất từ cao n-

hexane, 3 hợp chất từ cao ethyl acetate, 7 hợp chất từ cao n-butanol. Sử dụng các

phương pháp phổ MS và NMR đã xác định được cấu trúc của 4 anthraquinone

(HP1-HP4), 1 carotenoid (HP5), 2 triterpen (HP6-HP7), 4 iridoid glycoside (HP8-

HP11), 3 flavonoid glycoside (HP12-HP14) (Hình 4.23).

86

O

O

R1

R2

R4

R3

12

4

3

5

7

8 9

10

6

9a

4a

8a

10a

OH

COOH1

3 5

6

7

2

4

8

9

10

1112

13

14

15

16

23 24

25 17

18

1920 21

2226

27

28

29

30

OH

OH

1

2

3

4

5

67

8

9

10

11

12

13

14

15

1'

2'

3'

4'5'

6'

7'

8'9'

10'

11'

12'13'

14'

15'

HP1 R1 = R3 = R4 = OH, R2 = Me

HP2 R1 = OMe, R2 = OH, R3 = R4 =H

HP3 R1 = R4 = OH, R2 = Me, R3 = H

HP4 R1 = OH, R2 = CH2OH, R3 = R4 = H

OH

COOH1

3 5

6

7

2

4

8

9

10

1112

13

14

15

16

23 24

25 17

18

1920 21

2226

27

28

29 30O

O CO

O O

OH

OH

OH

OH

R

H

H1

3

4

579

10

11

1'

2'

3'

4'

5'6'

6

8

HP6 HP7

HP8 R = OAc

HP9 R = OH

HP5

O

R1

OH

R2

O O

OH

OH

OH

OH

H

H1

3

4

56

7

89

10 1'

2'

3' 4'

5'

6'

HP10 R1 = COOH, R2 = OAc

HP11 R1 = COOMe, R2 = OH

O

O

OH

OH

OH

OO

OH

OH

OH

3'

1'

4'

6'2

34

9

10

7

5

1''

5''

2'

5'

2''

3''4''

6

8

OOH

OH O

OH

OH

OOH

O

O

OH

OH

O

OH

OH

OH

1"'

2"'

3"'

5"'

4"'

6"'

2

3

410

5

6

7

89

1'

3'

4'

1"

2''

3"4"

6" 5"

HP12HP13 R = OH

HP14 R = OMe

Hình 4.23. Cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ cây An điền lá thông

4.3.1.1. Hợp chất 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone (HP1)

O

O

OH

CH3

OH

OH HMBC

O

O

OH

OH

OH

12

4

3

5

7

8 9

10

6

9a

4a

8a

10a

Hình 4.24. Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ HMBC (HC) của HP1

Chất HP1 được phân lập dưới dạng bột màu cam từ cao chiết n-hexane. Phổ

khối phân giải cao HR-ESI-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z = 269,0464 [M-H]-

(tính theo lý thuyết là 269,0450) phù hợp với công thức phân tử C15H10O5.

87

Hình 4.25 Phổ HR-ESI-MS của HP1

Hình 4.26 Phổ 1H-NMR của HP1 (CDCl3 + CD3OD)

Phổ 1H-NMR của HP1 xuất hiện tín hiệu singlet của 1 proton thơm tại δH

7,12; các tín hiệu của proton thơm điển hình của vòng được thế ở vị trí 1, 3, 4 tại δH

8,22 (d, J = 8,5Hz); 7,21 (dd, J = 2,5; 8,5Hz) và 7,64 (d, J = 2,5 Hz) và tín hiệu

singlet của proton nhóm methyl gắn vào carbon vòng thơm tại δH 2,37.

88

Hình 4.27 Phổ 13

C-NMR của HP1 (CDCl3 + CD3OD)

Phổ 13

C-NMR cho thấy hợp chất HP1 có 15 nguyên tử carbon bao gồm 2

carbon carbonyl, 8 carbon thơm bậc bốn, 4 carbon thơm bậc ba và 1 nhóm methyl.

Trong số 8 carbon thơm bậc bốn có 3 nguyên tử carbon gắn với nhóm hydroxyl

cộng hưởng tại δC 156,7 (C-1); 157,4 (C-4) và 163,6 (C-6); 1 nguyên tử carbon gắn

với nhóm methyl cộng hưởng tại C 141,2 (C-2) và bốn nguyên tử carbon khác cộng

hưởng tại δC 111,7; 111,9; 125,9 và 136,1. Trên phổ 13

C-NMR còn xuất hiện tín

hiệu của 4 carbon bậc ba trong vùng 112,6-130,1 ppm, tín hiệu của nhóm methyl tại

δC 16,6 ppm cùng với hai tín hiệu đặc trưng của 2 nhóm carbonyl tại C 186,7 và

187,0 cho phép dự đoán chất HP1 có khung anthraquinone. Liên kết của 2 nhóm

hydroxy ở C-1 và C-4 được chứng minh dựa vào tín hiệu proton hydroxy có liên kết

hydro nội phân tử trên phổ 1H NMR (đo trong DMSO-d6) ở H 13,51 và 12,73 cùng

với sự chuyển dịch về phía trường thấp của hai carbon carbonyl.

89

Hình 4.28 Phổ 1H-NMR của HP1 (DMSO-d6)

Hình 4.29 Phổ HMBC của HP1

Phổ HMBC cho thấy các tương tác giữa H-8 (H 8,22) với C-9 (C 186,7) và

C-6 (C 163,6); H-5 (H 7,64) với C-10 (C 187,0) và C-7 (C 121,9); H-7 (H 7,21)

với C-5 (C 112,6) và C-8a (C 125,9) chứng tỏ nhóm hydroxy gắn với C-6. Ngoài

ra còn có tương tác giữa proton của nhóm methyl ở H 2,37 với C-3 (C 128,0) và

C-1 (C 156,7) chứng minh nhóm methyl gắn với C-2.

Từ các dữ liệu phổ 1H-,

13C- NMR (Bảng 4.6) và HMBC cho phép xác định

90

chất HP1 là 2-methyl-1,4,6-trihydroxy-anthraquinone, một hợp chất mới. Islandicin

(1,4,5-trihydroxy-2-methylanthraquinone) được phân lập từ Cassia occidentalis

[127], Asahinea chrysantha [128] và digitopurpone (1,4,8-trihydroxy-2-

methylanthraquinone) được phân lập từ Barleria eranthemoides [129], tương tự

hợp chất HP1, chỉ khác ở vị trí nhóm hydroxyl thứ 3.


13C-NMR (500/125 MHz) của hợp chất HP1

C CDCl3 + CD3OD DMSO-d6

1H

13C

1H

13C

1 - 156,7 - 155,9

2 - 141,2 - 140,6

3 7,12 (s) 128,0 7,29 (s) 127,8

4 - 157,4 - 156,6

4a - 111,7 - 111,1

5 7,64 (d, 2,5) 112,6 7,51 (d, 2,5) 112,4

6 - 163,6 - 164,5

7 7,21 (dd, 2,5; 8,5) 121,9 7,23 (dd; 2,5; 8,5) 122,1

8 8,22 (d, 8,5) 130,1 8,14 (d, 8,5) 130,4

8a - 125,9 - 124,1

9 - 186,7 - 185,8

9a - 111,9 - 111,4

10 - 187,0 - 186,3

10a - 136,1 - 135,4

2-CH3 2,37 (s) 16,6 2,3 (s) 16,3

1-OH - - 13,51 (s) -

4-OH - - 12,73 (s) -

4.3.1.2. Hợp chất 2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone (HP2)

O

O

O

OH

CH3

HMBC

O

O

OMe

OH12

4

3

5

7

8 9

10

6

9a

4a

8a

10a

Hình 4.30. Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ HMBC (HC) của HP2

91

Chất HP2 được phân lập dưới dạng bột, màu cam từ cao chiết n-hexane. Phổ

1H-NMR của HP2 xuất hiện tín hiệu proton singlet của nhóm hydroxy tại δH 6,69

(1H, s), tín hiệu đặc trưng của 6 proton thơm trong đó có 4 proton thơm tương tác

kiểu AA’BB’ tại δH 8,27 (2H, m, H-5, H-8); 7,74 (2H, m, H-6, H-7) và 2 proton

thơm tương tác ortho tại δH 7,36 (d, J = 9,0 Hz, H-3); 8,14 (d, J = 9,0 Hz, H-4); và

tín hiệu proton của nhóm methoxy gắn vào carbon vòng thơm tại δH 4,04 (3H, s).

Hình 4.31 Phổ 1H-NMR của HP2 (CDCl3)

Hình 4.32 Phổ 13

C-NMR của HP2 (CDCl3)

92

Phổ 13

C-NMR cho thấy hợp chất HP2 xuất hiện 15 nguyên tử carbon bao

gồm 2 carbon carbonyl, 6 carbon thơm có gắn với nhóm thế bao gồm 1 nguyên tử

carbon gắn với nhóm hydroxy cộng hưởng tại δC 155,6; 1 nguyên tử carbon gắn với

nhóm methoxy cộng hưởng tại C 144,6 và bốn nguyên tử carbon khác cộng hưởng

tại δC 125,7; 127,6; 133,0 và 134,5, 6 carbon thơm và 1 nhóm methoxy Trên phổ

13C NMR còn xuất hiện tín hiệu của 6 carbon bậc ba trong vùng 120,3-133,9 ppm,

nhóm methoxy tại δC 62,3 cùng với hai tín hiệu đặc trưng của nhóm carbonyl tại C

182,1 và 182,7. Số liệu phổ đã phân tích cho phép dự đoán chất HP2 có khung

anthraquinone.

Hình 4.33 Phổ HMBC của HP2

Phổ HMBC cho thấy các tương tác xa giữa proton của nhóm hydroxy ở H

6,69 với C-3 (C 120,3); C-2 (C 155,6) và C-1 (C 146,6), H-3 (H 7,36) tương tác

với C-1 (C 146,6), C-2 (C 155,6) và C-4a (C 127,6) chứng minh nhóm hydroxy

gắn với carbon C-2.


13C-NMR (Bảng 4.7), HMBC và so sánh với số liệu

phổ trong tài liệu [130, 131] cho phép kết luận HP2 là 2-hydroxy-1-methoxy-

anthraquinone hay alizarin-1-methyl ether. Hợp chất này được phân lập trước đây từ

O. diffusa [63], O. corymbosa [64], thể hiện hoạt tính ức chế protein tyrosine kinasa

v-src và pp60src và ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư SPC-1-A, Bcap 37

93

và HepG2 với giá trị IC50 tương ứng là 51 µM và 62 µM [40], ngoài ra, còn thúc

đẩy quá trình tăng sinh tế bào tạo xương [124].


13C-NMR (500/125 MHz, CDCl3) của hợp chất HP2

Vị trí

H (J, Hz) C H (J, Hz) C

HP2 2-hydroxy-1-methoxy-

anthraquinone [122, CDCl3]

1 - 146,6 - 146,6

2 - 155,6 - 155,6

3 7,36 (d, 9,0) 120,3 7,34 (d, 8,5) 120,3

4 8,14 (d, 9,0) 125,8 8,13 (d, 8,5) 125,8

4a - 127,6 - 127,5

5 8,27 (m) 127,1 8,22-8,28 (m) 127,1

6 7,74 (m) 133,9 7,72-7,74 (m) 133,9

7 7,74 (m) 133,9 7,72-7,74 (m) 133,9

8 8,27 (m) 126,9 8,22-8,28 (m) 126,9

8a - 134,5 - 134,5

9 - 182,7 - 182,7

9a - 125,7 - 125,7

10 - 182,1 - 182,1

10a - 133,0 - 132,96

1-OCH3 4,04 (s) 62,3 4,02 ( s) 62,3

2-OH 6,69 (s) - 6,65 ( br s) -

4.3.1.3. Hợp chất 1,6-dihydroxy-2-methylanthraquinone (HP3)

O

O

OH

OH

12

4

3

5

7

8 9

10

6

9a

4a

8a

10a

Chất HP3 được phân lập dưới dạng bột, màu cam từ cao chiết n-hexane. Phổ

khối ESI-MS có pic ion giả phân tử ở m/z = 253 [M-H]-, kết hợp với phổ NMR dự

đoán công thức phân tử là C15H10O4 (M = 254).

Phổ NMR của HP3 gần giống với phổ của HP1 với những tín hiệu đặc trưng

của một anthraquinone với điểm khác biệt duy nhất là mất đi một nhóm hydroxy so

với chất HP1. Sự giống nhau của hai chất trong phổ 1H-NMR thể hiện ở tín hiệu

94

của 3 proton thơm tương tác kiểu ABX tại H 7,44 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-5); 7,21

(1H, dd, J = 2,5; 8,5 Hz, H-7); 8,08 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-8), tín hiệu singlet của

nhóm methyl gắn với carbon vòng thơm tại δH 2,27. Sự khác nhau của chúng thể

hiện là trong phân tử chất HP3 chỉ xuất hiện một nhóm hydroxy có liên kết cầu

hydro nội phân tử ở H 13,08 và xuất hiện thêm một proton thơm doublet ở δH 7,55

có tương tác ortho J = 7,5 với H-3 ở H 7,61. Phổ 13

C-NMR của HP3 phù hợp với

công thức cấu tạo, đó là sự thay thế tín hiệu carbon có gắn với nhóm hydroxy ở δC

157,4 trong chất HP1 bằng tín hiệu carbon methine ở δC 125,8 trong chất HP3.

Vị trí của các nhóm thế trong phân tử HP3 được khẳng định thêm bằng các

tương tác trên phổ HMBC, bao gồm các tương tác giữa H-8 (H 8,08) với C-9 (C

187,6) và C-6 (C 163,9), H-5 (H 7,44) với C-10 (C 181,7) và C-7 (C 121,4), H-7

(H 7,21) với C-5 (C 112,5) và C-8a (C 124,4) chứng tỏ nhóm hydroxy gắn với C-

6 Ngoài ra còn có tương tác giữa proton H-3 (H 7,61) với C-1 (C 159,9) và C-4a

(C 131,1), H-4 (H 7,55) với C-2 (C 114,6); C-10 (C 181,7) và C-9a (C 134,2)

chứng minh nhóm methyl gắn với C-2. Liên kết của nhóm hydroxy ở C-1 được

chứng minh dựa vào tín hiệu proton của nhóm hydroxy có liên kết cầu hydro nội

phân tử trên phổ 1H NMR (đo trong DMSO-d6) ở H 13,08 và tín hiệu carbon của

nhóm carbonyl chuyển dịch ở trường thấp (C 187,6) cùng với sự tương tác xa giữa

proton của nhóm hydroxy ở H 13,08 với C-2 (C 114,6) và C-9a (C 134,2) trong

phổ HMBC.

Từ các dữ liệu phổ 1D- và 2D-NMR và so sánh với tài liệu tham khảo [61]

cho phép khẳng định HP3 là 1,6-dihydroxy-2-methylanthraquinone. Hợp chất này

lần đầu tiên được phân lập từ loài Cinchona pubescens vào năm 1986 [132] và cũng

được phân lập từ loài này bởi tác giả Lê Hoàng Duy [61].

4.3.1.4. Hợp chất digiferruginol (HP4)

O

O

OH

OH

1

2

3

45

6

7

8 9

10

9a

10a

8a

5a

2'

O

O

OH

OH

Hình 4.34. Cấu trúc và một số tương tác xa trên phổ HMBC (HC) của HP4

95

Hợp chất HP4 được phân lập dưới dạng bột, màu vàng sẫm từ cao chiết

ethylacetate. Phổ khối ion âm ESI-MS có pic ion giả phân tử ở m/z = 253 [M-H]-,

kết hợp với phổ 1H- và

13C-NMR dự đoán công thức phân tử là C15H10O4 (M =

254).

Phổ NMR của HP4 xuất hiện tín hiệu đặc trưng của một anthraquinone,

giống với hợp chất HP2, thể hiện hai carbon carbonyl ở C 188,7 và 181,8 cùng với

2 vòng thơm gồm 2 proton thơm có tương tác ortho ở δH 7,77 (d, J = 8,0 Hz, H-3);

7,92 (d, J = 8,0 Hz, H-4) và 4 proton thơm của vòng thế A2B2 ở δH 8,20 (m, H-5);

7,95 (m, H-6, H-7); 8,25 (m, H-8). Bên cạnh đó, phổ NMR còn cho thấy tín hiệu

của 1 nhóm hydroxy ở H 12,77 (1H, s, OH) có liên kết cầu hydro nội phân tử với

nhóm carbonyl và 1 nhóm hydroxymethylen ở H 4,66 (d, J = 5,0 Hz); 5,46 (t, J =

5,5 Hz; δC 57,4. Các tương tác trong phổ HMBC giữa hydroxy proton (δH 12,77)

với C-1 (δC 158,4); proton H-4 (δH 7,92) với C-2 (δC 138,2), C-9a (δC 114,9), C-10

(δC 181,9); methylen proton (δH 4,66) với C-1 (δC 158,4), C-2 (δC 138,2) chứng tỏ

nhóm hydroxyl gắn với carbon C-1 và nhóm hydroxymethylen gắn với carbon C-2.

Các số liệu phổ 1D-NMR và 2D-NMR của HP4 hoàn toàn phù hợp với số

liệu trong tài liệu tham khảo [133]. Hợp chất này còn được gọi là digiferruginol, nó

đã được phân lập trước đây từ loài Oldenlandia capitellata [60], Morinda parvifolia

và thể hiện hoạt tính gây độc tế bào rất mạnh trên dòng tế bào ung thư KB với giá

trị ED50 là 0,09 µg/mL [133].

4.3.1.4. Hợp chất lutein (HP5)

OH

OH

1

2

3

4

5

67

8

9

10

11

12

13

14

15

1'

2'

3'

4'5'

6'

7'

8'9'

10'

11'

12'13'

14'

15'

CH3 CH3

CH3CH3

CH3 CH3

OH CH3

CH3

CH3 CH3

OH

Hình 4.35. Cấu trúc và một số tương tác xa trên phổ HMBC (HC) của HP5

Chất HP5 được phân lập dưới dạng bột màu đỏ cam từ cao chiết n-hexane.

96

Phổ khối ion dương ESI-MS có pic ion giả phân tử ở m/z = 569,3 [M+H]+, kết hợp

với phổ 1H- và

13C-NMR dự đoán công thức phân tử là C40H56O2 (M = 568).

Hình 4.36. Phổ (+) ESI-MS của HP5

Hình 4.37. Phổ 1H-NMR của HP5 (CDCl3)

97

Hình 4.38. Phổ 1H-NMR giãn của HP5

Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu đặc trưng của một carotenoid gồm 14 proton

olefin liên hợp ở vùng 5,43 đến 6,67 ppm cùng với 4 nhóm methylen tại 1,48 (2H, t,

12,0 Hz, H2-2), 2,04 (1H, dd, 17,0, 10,0 Hz, H-4ax), 2,33 – 2,42 (1H, m, H-4eq), 1,37

(1H, dd, 13,0; 7,0 Hz, H-2’ax), 1,84 (1H, dd, 13,0; 6,0 Hz, H-2’eq), 4,25 (1H, m, H-

3’), 5,54 (1H, brs, H-4’) Bên cạnh đó, tín hiệu của 2 nhóm oxy-methine ở H 4,00

(1H, m, H-3); 4,25 (1H, m, H-3’) và 10 nhóm methyl cũng được quan sát thấy.


C-NMR của HP5 (CDCl3)

Phổ 13

C-NMR xuất hiện tín hiệu của 40 nguyên tử carbon gồm 22 carbon

olefin, 10 carbon methyl, 4 carbon methylen, 2 carbon oxy-methine và 2 carbon bậc

98

4. Trong số 22 carbon olefin liên hợp có 4 nguyên tử carbon nối đôi ở hai vòng

cyclohexen tại C 126,2 (C-5), 137,6 (C-6), 137,8 (C-5’), 55,0 (C-6’). Phổ 13

C-

NMR cho thấy tín hiệu cộng hưởng của 2 carbon oxy-methine tại C 65,1 (C-3),

65,9 (C-3’), 4 carbon methylen tại C 48,5 (C-2), 42,6 (C-4), 44,6 (C-2’), 125,6 (C-

4’), 10 carbon methyl tại C 28,7 (1-Me), 30,3 (1-Me), 21,6 (5 –Me), 12,8 (9-Me,

13-Me), 24,3 (1’-Me), 29,5 (1’-Me), 22,9 (5’-Me), 14,1 (9’-Me), 13,1 (13’-Me) và 2

carbon bậc 4 tại C 37,1 (C-1), 34,0 (C-1’) Từ các dữ liệu phổ NMR gợi ý HP5 là

một carotenoid.

Hình 4.40. Phổ HMBC của HP5

Vị trí của hai nhóm hydroxy được xác định dựa vào tín hiệu cộng hưởng của

carbon C-3, C-3’ ở trường thấp. Vị trí của phần allen gắn với phần alicyclic tại vị trí

carbon C-6 được khẳng định bằng tương tác proton H-7 (H 6,12) với C-5 (C

126,2) và C-6 (C 137,6) trên phổ HMBC. Mặt khác trên phổ HMBC còn xuất hiện

tương tác giữa proton của nhóm methyl tại C-1 (C 37,1) và H 0,85; 1,00 với C-1’

(C 34,0) chứng tỏ 2 nhóm methyl tương ứng gắn vào C-1’, tương tác giữa H-14 với

C-12; C-15’ và carbon nhóm methyl gắn với C-13; tương tác giữa H-14’ với C-12’;

C-15 và carbon nhóm methyl gắn với C-13’ chứng tỏ có chuỗi nối đôi liên hợp

trong phân tử HP5.

99

Các dữ liệu phổ 1H-,

13C-NMR hoàn toàn trùng khớp với số liệu phổ của

lutein trong tài liệu tham khảo [134] (Bảng 4.8) Lutein được tìm thấy trong các loại

rau xanh và trái cây có màu đậm, cung cấp hàm lượng dinh dưỡng lớn cho mắt, da

của con người và các cơ quan của cơ thể tiếp xúc trực tiếp với môi trường bên

ngoài, ngoài ra nó còn tác dụng chống ung thư vú, ung thư ruột kết [135].


13C-NMR (500/125 MHz, CDCl3) của HP5 và lutein

C H (J, Hz) C H (J, Hz) C

HP5 Lutein [15, CDCl3]

1 - 37,1 - 37,1

2 1,48 (t, 12,0) 48,5 1,48 (t, 12,0) 48,4

3 4,00 (m) 65,1 4,00 (m) 65,1

4 ax

4 eq

2,04 (dd, 17,0; 10,0)

2,33 – 2,42 (m)

42,6 2,04 (dd, 17,0; 10,0)

2,33 – 2,45 (m)

42,5

5 - 126,2 - 126,2

6 - 137,6 - 137,6

7 6,12 (s) 125,6 6,12 (s) 125,6

8 6,12 (s) 138,5 6,12 (s) 138,5

9 - 135,7 - 135,6

10 6,15 (m) 131,3 6,15 (m) 131,3

11 6,58-6,67 (m) 124,8 6,55 – 6,71 (m) 124,9

12 6,36 (d, 15,0) 137,7 6,36 (d, 15,0) 137,6

13 - 136,5 - 136,5

14 6,25 (brd, 9,0) 132,6 6,26 (m) 132,6

15 6,58-6,67 (m) 130,1 6,55 – 6,71 (m) 130,0

1-Me 1,07 (s) 28,7 1,07 (s) 28,7

1-gem Me 1,07 (s) 30,3 - 30,2

5 -Me - 21,6 1,74 (s) 21,6

9 -Me 1,97 (s) 12,8 1,97 (s) 12,7

13 -Me 1,97 (s) 12,8 1,97 s 12,7

1’ - 34,0 - 34,0

2’ ax

2’ eq

1,37 (dd, 13,0; 7,0)

1,84 (dd, 13,0; 6,0)

44,6 1,37 (dd, 13,0; 7,0)

1,84 (dd, 13,0; 6,0)

44,7

100

3’ 4,25 (m) 65,9 4,25 (m) 65,9

4’ 5,54 (brs) 125,6 5,55 (s) 125,6

5’ - 137,8 - 137,8

6’ 2,33 – 2,42 m 55,0 2,33 – 2,45 (m) 55,0

7’ 5,43 (dd, 10,0; 15,5) 128,7 5,43 (dd, 15,5; 10,0) 128,6

8’ 6,15 (m) 138,0 6,15 (m) 137,8

9’ - 135,1 - 135,0

10’ 6,15 (m) 130,8 6,15 m 130,8

11’ 6,58-6,67 (m) 124,5 6,55 – 6,71 m 124,5

12’ 6,36 (d, 15,0) 137,6 6,36 (d, 15,0) 137,6

13’ - 136,4 - 136,5

14’ 6,25 (brd, 9,0) 132,6 6,26 (m) 132,6

15’ 6,58-6,67 (m) 130,0 6,55 – 6,71 (m) 130,0

1’-Me 0,85 (s) 24,3 0,85 (s) 24,3

1’-Me 1,00 (s) 29,5 1,00 (s) 29,5

5’-Me 1,63 (s) 22,9 1,63 (s) 22,8

9’-Me 1,91 (s) 14,1 1,91 (s) 13,2

13’-Me 1,97 (s) 13,1 1,97 s 12,7

4.3.1.6. Hợp chất ursolic acid (HP6)

OH

COOH1

3 5

6

7

2

4

8

9

10

1112

13

14

15

16

23 24

25 17

18

1920 21

2226

27

28

29

30

Hợp chất HP6 được phân lập dưới dạng bột, màu trắng, có Rf = 0,5 với hệ

dung môi CH2Cl2:MeOH (94/6, v/v) được xác định là ursolic acid, khi so sánh với

chất chuẩn trên sắc ký lớp mỏng. Ursolic acid được tìm thấy trong nhiều loài thuộc

chi Oldenlandia.

101

4.3.1.7. Hợp chất oleanolic acid (HP7)

OH

COOH1

3 5

6

7

2

4

8

9

10

1112

13

14

15

16

23 24

25 17

18

19 20 21

2226

27

28

29 30

Hợp chất HP7 được phân lập dưới dạng bột, màu trắng, có Rf = 0,48 với hệ

dung môi CH2Cl2:MeOH (94/6, v/v) được xác định là oleanolic acid, khi so sánh

với chất chuẩn trên sắc ký lớp mỏng. Oleanolic cũng được tìm thấy trong nhiều loài

thuộc chi Oldenlandia.

4.3.1.8. Hợp chất asperuloside (HP8)

O

O CO

O O

OH

OH

OH

OH

H3CCOO

H

H

COSY HMBC

O

O CO

O O

OH

OH

OH

OH

MeCOO

H

H1

3

4

579

10

11

1'

2'

3'

4'

5'6'

6

8

Hình 4.41. Cấu trúc và một số tương tác chính trên phổ COSY và HMBC của HP8

Hình 4.42 Phổ (-)-ESI-MS của HP8

102

Hợp chất HP8 được phân lập dưới dạng bột màu trắng từ cao chiết n-

butanol Phổ khối ESI-MS có pic ion giả phân tử ở m/z = 437 [M+Na]+, 413,1 [M-

H]-, kết hợp với phổ

1H-,

13C-NMR cho phép dự đoán công thức phân tử là

C18H22O11 (M = 414).

Hình 4.43 Phổ 1H-NMR của HP8 (CD3OD)

Phổ 1H NMR cho thấy tín hiệu 2 proton olefin đặc trưng của hợp chất iridoid

(Bảng 4.9) ở δH 7,32 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-3) và một proton singlet ở δH 5,75 (1H,

brs, H-7), tín hiệu proton của nhóm oxy-methine ở δH 5,97 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-1);

5,59 (1H, brd, J = 6,5 Hz, H-6) cùng với tín hiệu proton của hai nhóm methine ở δH

3,70 (1H, m); 3,32 (1H, m). Ngoài ra, còn có tín hiệu của một nhóm methylen ở δH

4,69 (1H, dd, J = 14,0; 1,0 Hz); 4,80 (1H, dd, J = 14,0; 1,0 Hz) và tín hiệu proton

của nhóm acetyl tại H 2,10 (3H, s, CH3CO). Trên phổ 1H- NMR xuất hiện tín hiệu

điển hình của proton anomeric tại δH 4,71 (d, J = 8,0 Hz, H-1’) chứng tỏ HP8 có

một đơn vị đường glucose Các tín hiệu proton khác của glucose (H-2’, H-3’, H-4’,

H-5’) cộng hưởng ở khoảng 3,31–3,94 ppm.

Phổ 13

C-NMR và phổ DEPT của HP8 cho thấy tín hiệu của 18 nguyên tử

carbon bao gồm 12 carbon thuộc phần aglycone và 6 carbon thuộc đơn vị đường.

Trong số 12 nguyên tử carbon thuộc phần aglycone có bốn carbon olefin tại δC 150,3

(C-3); 106,1 (C-4); 128,9 (C-7); 144,2 (C-8), hai carbon oxy-methine tại δC 93,3 (C-

103

1); 86,3 (C-6), hai carbon carbonyl ester ở 172,30 (C-11); 172,6 (CH3CO), một tín

hiệu carbon oxy-methylene tại δC 61,9 (C-10), cùng với hai tín hiệu carbon methine

tại δC 37,4 (C-5); 45,2 (C-9) và một tín hiệu carbon methyl tại C 20,6 (CH3CO).

Những tín hiệu này đã gợi ý cấu trúc của HP8 là hợp chất iridoid. Phổ 13

C-NMR ghi

nhận tín hiệu của carbon anomer đặc trưng cho một đơn vị đường tại C 100,0 (C-

1’) cùng các tín hiệu khác tại C 74,6 (C-2’); 78,3 (C-3’); 71,6 (C-4’); 77,8 (C-5’);

62,8 (C-6’)

Hình 4.44 Phổ 13

C-NMR của HP8 (CD3OD)

Hình 4.45 Phổ DEPT của HP8

104

Vị trí của các proton và carbon tương ứng trong phân tử được khẳng định bằng

việc phân tích phổ HSQC, COSY và HMBC. Vị trí đơn vị đường β-glucose gắn vào

carbon C-1 được khẳng định thông qua phổ HMBC bằng tương tác giữa proton H-1

(δH 5,97) với C-1’ (δC 100,0) và H-1’(δH 4,71) với C-1 (δC 93,3). Phổ HMBC còn cho

thấy tương tác giữa proton H-10 (δH 4,69; 4,80) với C-8 (δC 144,24); C-7 (δC 128,9)

chứng tỏ nhóm oxymethylen được gắn vào C-8 của khung iridoid, tương tác giữa

proton H-3 (δH 3,72) với C-11 (δC 172,3), H-6 (δH 5,59) với C-11 (δC 172,3) chứng

minh tồn tại vòng lactone trong phân tử, tương tác giữa proton H-7 (H 5,75) với C-5

(C 37,4), C-8 (C 144,2), C-10 (C 61,9) chứng tỏ C-7 liên kết với C-6, C-5, C-7 liên

kết với C-8. Phổ COSY của HP8 cho thấy các tương tác proton H-5 (δH 3,70) với H-

6 (δH 5,59) và H-9 (δH 3,32); H-6 (δH 5,59) tương tác với H-7 (δH 5,75).


105

Hình 4.47. Phổ COSY của HP8

Từ các dữ liệu phổ 1D-NMR, 2D-NMR và so sánh với tài liệu tham khảo

[77] có thể kết luận HP8 là asperuloside. Hợp chất này được phân lập từ nhiều loài

của chi Oldenlandia, nó thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đáng kể với các dòng tế

bào ung thư HL-60, A459, HepG2, BGC-823, CNE-2 và HCT15 [136].

4.3.1.9. Deacetyl asperuloside (HP9)

O

O CO

O O

OH

OH

OH

OH

OH

H

H1

3

4

579

10

11

1'

2'

3'

4'

5'6'

6

8

Hợp chất HP9 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng từ cao chiết n-

butanol. Phổ khối âm ESI-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z = 370,9 [M-H]

-, 394,9

[M+Na]+, kết hợp với phổ

1H-,


C16H20O10 (M = 372).

Phổ NMR (Bảng 4.9) của HP9 gần giống với phổ của HP8 với các tín hiệu

đặc trưng của một iridoid gắn một đơn vị đường glucose. Khác biệt duy nhất là mất

đi nhóm acetyl và xuất hiện thêm một nhóm hydroxy so với chất HP8. Sự giống

nhau của hai chất HP9 và HP8 trong phổ 1H-NMR thể hiện ở tín hiệu đặc trưng của

106

khung iridoid gồm một proton olefin tại δH 7,31 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-3) và hai

proton nhóm oxymethine tại δH 5,97 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-1); tín hiệu doublet của

một proton anomer tại δH 4,70 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1’). Sự khác nhau thể hiện là

trong phân tử chất HP9 chỉ xuất hiện một nhóm carbonyl ở δC 172,8 đồng thời

không còn tín hiệu của carbon methyl trên phổ 13

C-NMR. Kết luận này cũng thể

hiện rõ trong phổ 1H-NMR của HP9 không có tín hiệu đặc trưng của nhóm acetyl.

Trên cơ sở phân tích số liệu phổ NMR của HP9 và so sánh với tài liệu tham

khảo [77] cấu trúc của HP9 được xác định là deacetyl asperuloside. Hợp chất này

tồn tại rất phổ biến trong nhiều loài Oldenlandia như O. diffusa, O. corymbosa, O.

tenelliflora và O. hedyotidea.


13C-NMR (500/125 MHz, CD3OD) của HP8 và HP9

C H (J, Hz) C

HP8 HP9 HP8 HP9

1 5,97 (d, 1,0) 5,97 (d, 1,5) 93,3 93,3

3 7,32 (d, 2,0) 7,31 (d, 2,0) 150,3 150,2

4 - - 106,1 106,5

5 3,7 (m) 3,7 (m) 37,4 37,5

6 5,59 (brd, 6,5) 5,58 (dd, 1,5; 6,5) 86,3 86,6

7 5,75 (brs) 5,66 (brs) 128,9 125,7

8 - - 144,2 149,8

9 3,32 (m) 3,32 (m) 45,2 45,0

10 4,69 (dd, 14,0; 1,0)

4,80 (dd, 14,0; 1,0)

4,21 (brs) 61,9 60,1

11 - - 172,3 172,8

CH3CO - - 172,6 -

CH3CO 2,1 (s) - 20,6 -

Glc

1’ 4,71 (d, 8,0) 4,70 (d, 8,0) 100,0 99,9

2’ 3,22 (dd, 9,0; 8,0) 3,21 (dd, 9,0; 8,0) 74,6 74,7

3’

3,31-3,40 (m)

3,30-3,60 (m) 78,3 78,4

4’ 71,6 71,6

5’ 77,8 77,9

6’ 3,94 (dd, 12,0; 2,0) 3,94 (dd, 12,0; 2,0) 62,8 62,8

107

3,70 (dd, 12,0; 6,0) 3,84 (dd, 12,0; 6,0)

4.3.1.10. Hợp chất asperulosidic acid (HP10)

O

COOHOH

H3CCOOO O

OH

OH

OH

OH

H

H1

3

4

56

7

89

10

11

1'

2'

3' 4'

5'

6'

HMBC

O

COOHOH

H3CCOOO O

OH

OH

OH

OH

Hình 4.48 Cấu trúc và một số tương tác chính (HC) trên phổ HMBC của HP10

Hình 4.49. Phổ 1H-NMR của HP10 (CD3OD)

Hợp chất HP10 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng từ dịch chiết n-

butanol. Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu proton singlet đặc trưng của iridoid ở δH

7,63 (1H, brs, H-3) và 6,04 (1H, brs, H-7); tín hiệu 2 nhóm oxy-methine tại H 5,07

(1H, d, J = 9,0 Hz, H-1); 4,85 (1H, m, H-6), 2 nhóm methine tại δH 3,05 (1H, m, H-

5), 2,65 (1H, t, J = 8,0 Hz, H-9), 1 nhóm oxy-methylene tại δH 4,97 (1H, brd, J =

14,5 Hz, H-10a), 4,83 (1H, brd, J = 14,5 Hz, H-10b). Ngoài ra, phổ 1H-NMR của

HP10 còn xuất hiện tín hiệu proton singlet của nhóm methyl gắn với carbonyl ester

tại 2,03 (3H, s). Sự có mặt của đơn vị đường glucose trong phân tử được chứng minh

qua các tín hiệu: doublet của proton anomer tại δH 4,75 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1’) cùng

các tín hiệu khác trong vùng 3,25-3,87 ppm.

108



Phổ 13

C-NMR cho thấy HP10 có 18 nguyên tử carbon trong đó có 12 nguyên

tử carbon thuộc hợp phần aglycon khung iridoid, 6 carbon thuộc đơn vị đường

glucose. 12 carbon thuộc hợp phần aglycon khung iridoid gồm 4 carbon olefin ở C

154,6 (C-3); 109,0 (C-4); 131.9 (C-7); 145,9 (C-8); 2 carbon nhóm oxymethine tại

C 101,2 (C-1); 75,5 (C-6), 2 carbon nhóm methine ở C 42,7 (C-5), 46,4 (C-9) cùng

với 2 carbon nhóm acetyl ở C 172,5 và 20,8; một carbon nhóm oxymethylen ở C

63,8 (C-10) và một carbon nhóm carboxylic ở 173,0 (C-11). Tín hiệu của 6 carbon

thuộc đơn vị đường glucose tại δC 100,6 (C-1’); 74,9 (C-2’); 78,5 (C-3’); 71,6 (C-

4’); 77,9 (C-5’) và 63,0 (C-6’)


109

Vị trí của các nhóm thế trong phân tử HP10 được khẳng định bằng các tương

tác trên phổ HMBC. Tương tác giữa H-3 (H 7,63) với C-1 (C 101,2); C-5 (C

42,7); C-11 (C 170,0) chứng tỏ nhóm carboxyl gắn với C-4, H-10 (H 4,83 và 4,97)

với carbon nhóm acetyl (C 172,5) và proton của nhóm methyl (H 2,03) tương tác

với carbon carbonyl ester (C 172,5) chứng tỏ nhóm acetyl liên kết với C-10. Tương

tác của H-1’(H 4,75) với C-1 (C 101,2) chứng tỏ vị trí của đơn vị đường glucose

gắn vào carbon C-1. Ngoài ra, tương tác giữa H-5 với C-3, C-4, C-6, C-9 và H-6 với

C- 7, C-8, C-11 và C-4 chứng tỏ nhóm hydroxy liên kết với C-6.

Từ các dữ liệu phổ NMR (Bảng 4.7) và HMBC kết hợp so sánh với số liệu

của tài liệu [137] chứng tỏ rằng HP10 là asperulosidic acid, một iridoid glucoside

được acetyl hóa. Hợp chất này có hoạt tính gây độc tế bào với các dòng tế bào gây

ung thư HL-60 và HCT15 [136].

4.3.1.11. Hợp chất scandoside methyl ester (HP11)

O

COOMeOH

OHO O

OH

OH

OH

OH

H

H1

3

4

56

7

89

10

11

1'

2'

3' 4'

5'

6'

Hợp chất HP11 được phân lập dưới dạng bột màu trắng từ cao chiết n-

butanol Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z = 427,0 [M+Na]+ và 403,0

[M-H]-, kết hợp với phổ

1H-,


C17H24O11 (M = 404).

Phổ NMR của HP11 tương tự với phổ HP10 với những tín hiệu đặc trưng

của một iridoid glycoside nhưng khác nhau là nhóm chứa acid được ester hóa với

methyl và mất đi nhóm acetyl so với chất HP10. Bên cạnh các tín hiệu đặc trưng

của một iridoid glucoside như singlet tù của H-3 ở δH 7,53 (1H, brs), một tín hiệu

doublet của proton anomer được thể hiện rõ ở δH 4,69 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1’)

trong phổ 1H NMR. Sự khác nhau của chúng thể hiện là trong phân tử HP11 chỉ

xuất hiện một carbon carbonyl ở C 170,3 và xuất hiện thêm một nhóm methoxy ở

110

H 3,77 (3H, s), C 52,03 trên phổ 1H- và

13C-NMR.

Từ các dữ liệu phổ NMR (Bảng 4.10) của HP11 kết hợp so sánh với so sánh

các giá trị phổ trong tài liệu [77] có thể kết luận HP11 là scandoside methyl ester.

Hợp chất này đã được tìm thấy ở các loài O. diffusa, O. corymbosa [136, 62].



C H (J, Hz) C

HP10 HP11 HP10 HP11

1 5,07 (d, 9,0) 5,21 (t, 6,0) 101,2 98,3

3 7,63 (s) 7,53 (brs) 154,6 153,9

4 - - 109,0 110,8

5 3,05 (m) 3,04 (m) 42,7 45,6

6 4,85 (m) 4,57 (brs) 75,5 82,6

7 6,04 (brs) 5,83 (brs) 131,9 130,1

8 - - 145,9 147,5

9 2,65 (t, 8,0) 3,23 (brt, 8,0) 46,4 47,1

10 4,97 (brd, 14,5)

4,83 (brd, 14,5)

4,21 (brd, 15,0)

4,36 (brd, 15,0)

63,8 61,0

11 - - 173,0 170,3

CH3CO - - 172,5

-

CH3CO 2,03 (s) - 20,8 -

OCH3 - 3,77 (s) - 52,0

Glc

1’ 4,75 (d, 8,0) 4,69 (d, 8,0) 100,6 100,3

2’ 3,41 (brt, 8,5) 3,20- 3,34 (m) 74,9 74,8

3’

3,25-3,33 (m)

78,5 78,4

4’ 71,6 71,5

5’ 3,20- 3,34 (m) 77,9 77,9

6’ 3,87 (brd, 10,0)

3,64 (dd, 12,0; 5,0)

3,88 (brd, 11,5)

3,66 (brd, 11,5)

63,0 62,7

111

4.3.1.12. Hợp chất afzelin (HP12)

O

O

OH

OH

OH

OO

OH

OH

OH

3'

1'

4'

6'2

34

9

10

7

5

1''

5''

2'

5'

2''

3''4''

6

8

Chất HP12 là được phân lập dưới dạng bột màu vàng từ cao chiết n-butanol.

Phổ khối ESI-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z = 430,9 [M-H]-, kết hợp với phổ

1H,


C21H20O10 (M = 432).

Hình 4.52. Phổ ESI-MS của HP12

Hình 4.53 Phổ

1H-NMR của HP12 (CD3OD)

112

Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu của proton vòng thơm thế meta tại H 6,22

(1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,40 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), tín hiệu của proton thơm

điển hình của vòng thơm thế para tại H 7,79 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-2’, 6’); 6,96

(2H, d, J = 9,0 Hz, H-3’, 5’) Ngoài ra, các tín hiệu của một đơn vị đường rhamnose

cũng được xác định trên phổ bao gồm tín hiệu của 1 proton anomer tại H 5,40 (1H,

d, J = 1,5 Hz), một nhóm methyl gắn với gốc đường tại H 0,94 (3H, d, J = 6,0 Hz)

và tín hiệu của các nhóm methine gắn với nhóm hydroxyl ở H 3,73 (1H, dd, J =

3,0; 9,0 Hz, H-2”); 3,36 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-3”); 3,35 (1H, d, J = 5,0 Hz, H-4”)

Hình 4.54 Phổ 13


Phổ 13

C-NMR của HP12 cho thấy tín hiệu của 21 nguyên tử carbon trong đó

có 15 nguyên tử carbon khung flavonoid và 6 nguyên tử carbon của phần đường.

Trong số 15 nguyên tử carbon khung flavonoid có 1 carbon carbonyl cộng hưởng

tại C 179,6; 8 carbon thơm bậc bốn gồm 3 nguyên tử carbon gắn với nhóm hydroxy

tại C 163,2 (C-5); 166,6 (C-7); 161,1 (C-4’) và 5 nguyên tử carbon khác tại C

159,3 (C-2); 136,2 (C-3); 158,6 (C-9); 105,9 (C-10); 122,7 (C-1’) cùng với 6 carbon

nhóm methine ở vùng 94,8 đến 131,9 ppm. Ngoài ra, trên phổ còn có tín hiệu điển

hình của carbon anomer tại C 103,5 (C-1”), 1 nhóm methyl tại C 17,6 (C-6”) cùng

với các tín hiệu khác của carbon gắn với nhóm hydroxy và methyl ở vùng 71,9-73,2

ppm. Những tín hiệu trên gợi ý cho sự có mặt của một khung flavon gắn phần tử

đường rhamnose. Vị trí của proton và carbon trong phân tử được khẳng định qua

113

phân tích phổ HSQC.


13C-NMR, HSQC có thể khẳng định HP12 là một

flavon có gắn đường rhamnose bị thế hai vị trí ở vòng A và thế para ở vòng B và

so sánh với tài liệu tham khảo [138] cho phép kết luận chất HP12 là 3-O-α-L-

rhamnopyranoside kaempferol hay afzelin. Chất này lần đầu tiên được phân lập từ

cây Afzelia doussie [139]. Afzelin ức chế sự phát triển của tế bào ung thư vú bằng

cách kích thích apoptosis [140], có khả năng loại bỏ gốc anion superoxide trong tế

bào RAW264.7 [141] và thể hiện hoạt tính chống ung thư tiền liệt tuyến đáng kể đối

với 2 dòng ung thư PC-3 và LNCaP [142].

4.3.1.13. Hợp chất isorhamnetin-3-O-β-rutinoside (HP13)

OOH

OH O

OH

OMe

OOH

O

O

OH

OH

O

OH

OH

OH

1"'

2"'

3"'

5"'

4"'

6"'

2

3

410

5

6

7

89

1'

3'

4'

1"

2''3"

4"6"

5"

OOH

OH O

OH

OCH3

OOH

O

O

OH

OH

O

OH

OH

OH

HMBC

Hình 4.55 Cấu trúc và một số tương tác chính (HC) trên phổ HMBC của HP13

Hình 4.56 Phổ ESI-MS của HP13

114

Chất HP13 thu được dưới dạng chất bột màu vàng. Phổ khối phân ESI-MS

cho pic ion giả phân tử ở m/z = 647,1 [M+Na]+ và 623,2 [M-H]

-, kết hợp với phổ

1H-,


Hình 4.57 Phổ 1H-NMR của HP13 (CD3OD)

Phổ 1H-NMR xuất hiện tín hiệu 5 proton của vòng thơm, trong đó có 3

proton thơm tương tác kiểu ABX ở H 7,95 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2’); 6,93 (1H, d, J

= 8,5 Hz, H-5’); 7,64 (1H, dd, J = 2,0 Hz, 8,5 Hz, H-6’) và 2 proton thơm của vòng

thế meta ở H 6,22 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-6); 6,41 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-8) cùng với

tín hiệu singlet của 1 nhóm methoxy ở H 3,96 (3H, s, OCH3). Phổ 1H-NMR còn có

tín hiệu đặc trưng của phần đường gồm 2 tín hiệu doublet của 2 proton anomeric ở

H 5,24 (1H, d, 7,5 Hz, H-1”); 4,55 (1H, d, 1,0 Hz, H-1”’) tương ứng với H-1” của

proton β-glucosyl và H-1”’ của proton α-rhamnosyl tương ứng, 1 tín hiệu methyl tại

1,12 (3H, d, J = 7,5 Hz) ở vùng trường cao đặc trưng của rhamnose.

115

Hình 4.58 Phổ DEPT của HP13

Hình 4.59 Phổ 13


Phổ 13

C-NMR và DEPT của HP13 cho thấy phân tử có 28 nguyên tử carbon

gồm 16 nguyên tử carbon phần aglycone có khung flavonoid và 12 nguyên tử

carbon của hai đơn vị đường. Trong số 16 nguyên tử carbon phần aglycone có 15

nguyên tử carbon thuộc khung flavonoid như HP13 và một carbon nhóm methoxy

cộng hưởng ở C 56,8. Phổ 13

C-NMR cũng ghi nhận các tín hiệu đặc trưng của

đường glucose và rhamnose, đó là tín hiệu điển hình của carbon anomer tại C

104,4(C-1”), 102,5 (C-1”’) và một carbon nhóm methyl tại C 17,9 (C-6”’).

116


Vị trí của các nhóm thế trong phân tử HP13 được khẳng định bằng tương tác

trên phổ HMBC. Tương tác giữa proton nhóm methoxy ở H 3,96 với carbon C-3’

(C 148,3) chứng tỏ nhóm methoxy gắn với C-3’ của khung flavonoid Tương tác

giữa H-1” (δH 5,24) với carbon C-3 (δC 135,5) chỉ ra rằng phần đường glucose gắn

với C-3 phần aglycone, H-1”’ (δH 4,55) với carbon C-6” (δC 68,5), cùng với sự

chuyển dịch về phía trường thấp của carbon C-6” chứng tỏ hai phân tử đường -

glucose và - rhamnose kết nối với nhau qua liên kết disaccharide 6”1”’, đó là

đường rutinoside.

Như vậy, kết hợp các dữ liệu phổ 1D-, 2D-NMR (Bảng 4.11) và so sánh với

tài liệu tham khảo [143] cho phép xác đinh hợp chất HP13 là isorhamnetin-3-O-β-

rutinoside hay narcissi, chất này lần đầu tiên được phân lập từ hoa của cây

Narcissus tazetta L. [144].

4.3.1.14. Hợp chất rutin (HP14)

OOH

OH O

OH

OH

OOH

O

O

OH

OH

O

OH

OH

OH

1"'

2"'

3"'

5"'

4"'

6"'

2

3

410

5

6

7

89

1'

3'

4'

1"

2''3"

4"6"

5"

117

Chất HP14 thu được dưới dạng chất bột màu vàng. Phổ khối ESI-MS cho pic

ion giả phân tử ở m/z = 633,1[M+Na]+ và 609,2 [M-H]

-, kết hợp với phổ

1H-,

13C-

NMR cho phép dự đoán công thức phân tử là C27H30O16 (M = 610).

Phổ NMR của HP14 giống với phổ của HP13 với những tín hiệu đặc trưng

của một flavonoid diglycoside. Tuy nhiên điểm khác biệt là mất đi nhóm methoxy

và thay vào đó là nhóm hydroxy so với chất HP13. Sự giống nhau của hai chất

HP13 và HP14 trong phổ 1H-NMR thể hiện ở tín hiệu của 5 proton thơm trong đó

có 3 proton tương tác kiểu ABX tại H 7,71 (1H, brs, H-2’); 6,91 (1H, d, J = 8,0 Hz,

H-5’); 7,64 (1H, brd, J = 8,5 Hz, H-6’) và 2 proton ở H 6,22 (1H, brs, H-6); 6,42

(1H, brs, H-8) và tín hiệu của 2 proton anomer của 2 phân tử đường tại H 5,07 và

4,54 Điểm khác nhau của chúng thể hiện là trong phân tử HP14 không xuất hiện

tín hiệu nhóm methoxy trong phổ NMR.

Kết hợp các dữ liệu phổ NMR (Bảng 4.11) và so sánh với tài liệu tham khảo

[145] cho phép kết luận chất HP14 chính là rutin hay quercetin-3-O-rutinoside. Hợp

chất này rất phổ biến trong giới thực vật, có phổ hoạt tính rộng như hoạt tính chống

oxi hóa, kháng viêm, gây độc tế bào [146].

Bảng 4.11. Phổ 1H-,


C H (J, Hz) C

HP13 HP14 HP13 HP14

Aglycone

2 - - 158,5 158,4

3 - - 135,5 135,6

4 - - 179,3 179,3

5 - 162,9 162,7

6 6,22 (d, 1,5) 6,22 (brs) 100,0 100,0

7 - - 166,0 166,0

8 6,41 (d, 1,5) 6,42 (brs) 94,9 95,0

9 - - 158,9 159,4

10 - - 105,7 105,6

1’ - - 123,0 123,1

2’ 7,95 (d, 2,0) 7,71 (brs) 114,6 117,7

3’ - - 148,3 145,6

118

4’ - - 150,8 149,7

5’ 6,93 (d, 8,5) 6,91 (d, 8,0) 116,1 116,1

6’ 7,64 (dd, 2,0; 8,5) 7,64 (brd, 8,5) 124,0 123,6

Glc

1” 5,24 (d, 7,5) 5,07 (d, 7,5) 104,4 104,8

2” - 3,53 (t, 9,0) 75,9 75,5

3” - - 78,1 78,0

4” - - 71,6 71,3

5” - - 77,3 77,1

6” - 3,81 (brd, 9,5) 68,5 68,6

Rha

1”’ 4,55 (d, 1,0) 4,54 (brs) 102,5 102,3

2”’ - 3,69 (brs) 72,0 72,0

3”’ - 3,58 (dd, 3,5; 9,5) 72,3 72,1

4”’ - 3,31 (m) 73,8 73,9

5”’ - 3,44 (m) 69,8 69,6

6”’ 1,12 (d, 7,5) 1,14 (d, 6,5) 17,9 17,8

OMe 3,96 (s) - 56,8 -

4.3.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết và các hợp chất

4.3.2.1. Kết quả thử hoạt tính cảm ứng apoptosis của cao chiết n-butanol (HPB

)trên tế bào bạch cầu OCI-AML

Kết quả đếm số tế bào bạch cầu OCI-AML sống sót khi dùng cao chiết n-

butanol (Hình 4.47).

Hình 4.61. Số tế bào sống sót sau 24 giờ nuôi cấy ở 5 nồng độ khác nhau của cao

chiết n-butanol so với EtOH/H2O

119

Kết quả cho thấy, ở hai nồng độ cao hơn (300 và 150 μg/mL), cao chiết n-

butanol làm giảm đáng kể số tế bào bạch cầu OCI-AML có ý nghĩa thống kê tương

ứng với P < 0,01 và P < 0,05.

Kết quả khả năng gây apoptosis của cao chiết n-butanol trên dòng tế bào

bạch cầu OCI-AML thông qua phương pháp nhuộm nhân bằng propidium iodide và

phân tích tế bào theo dòng chảy được thể hiện ở hình 4.48.

Hình 4.62. Phần trăm tế bào có hiện tượng apoptosis sau 24 giờ nuôi cấy với các

nồng 300, 150, 75, 37,5, 18,75 μg/mL của cao chiết n-butanol so với EtOH/H2O

Kết quả cho thấy ở tất cả các nồng độ thử nghiệm, cao chiết n-butanol thể

hiện khả năng gây apoptosis có ý nghĩa thống kê (P < 0,001). Nồng độ cao chiết

càng cao, tỉ lệ chết tế bào càng lớn.

Kết quả phân tích chu kỳ của tế bào OCI-AML sau 24 giờ xử lý với các nồng

độ khác nhau của cao chiết n-butanol thông qua phương pháp nhuộm nhân bằng

propidium iodide và phân tích tế bào theo dòng chảy (Hình 4.63, 4.64, 4.65).

120

Hình 4.63: Số tế bào trong pha G0/G1 của chu kỳ tế bào

Hình 4.64: Số tế bào trong pha S của chu kỳ tế bào

Hình 4.65. Số tế bào trong pha G2/M của chu kỳ tế bào

Kết quả cho thấy không có sự khác biệt đáng kể ở mọi nồng độ thử của cao

chiết n-butanol. Vì vậy, cao chiết n-butanol gây apoptosis nhưng chưa làm ảnh

121

hưởng đến chu kỳ của tế bào sau 24 giờ nuôi cấy.

Như vậy, các kết quả thu được rất đáng quan tâm bởi vì cao chiết n-butanol

có khả năng gây apoptosis nhưng chưa làm ảnh hưởng đến chu kỳ của tế bào. Vì

vậy, chúng tôi tiếp tục thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính cảm ứng apoptosis

của cao chiết n-butanol và các hợp chất phân lập từ cao chiết này trên dòng tế bào

ung thư máu K562 nhằm mục đích tìm ra những hợp chất từ cao chiết này có khả

năng ức chế tăng sinh tế bào, gây apoptosis.

4.3.2.2. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết n-butanol và một số hợp

chất phân lập từ cao chiết này trên dòng tế bào ung thư máu K562

Hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết n-butanol và các hợp chất HP9,

HP11, HP13, HP14, phân lập từ cao chiết này được xác định thông qua mô hình

MTT (Hình 4.66 và Bảng 4.12).

compound 8: HP9

compound 10: HP11

compound12: HP13

compound 13: HP14

Hình 4.66. Cao chiết n-butanol và các hợp chất HP9, HP11, HP13, HP14 ức chế

tăng sinh tế bào K562 trong thời gian 72 giờ. Tế bào nuôi cấy (5×104

tế bào/giếng)

được xử lý 37,5 µg/mL, 75 µg/mL, 150 µg/mL and 300 µg/mL cao chiết hoặc hợp

chất HP9; HP11; HP13; HP14 .*P<0,05, **P<0,01 so với đối chứng âm (DMSO).

Kết quả cho thấy cao chiết n-butanol và các hợp chất HP9, HP11, HP13,

HP14 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu K562 phụ thuộc vào liều. Tất

cả các hợp chất và cao chiết thể hiện hoạt tính đáng kể ở nồng độ 300 và

150 μg/mL Sau 72 giờ, ở nồng độ 300 μg/mL cao chiết n-butanol, 806,45, 742,57,

480,77 μM lần lượt với hợp chất HP9, HP11, HP13 gây chết hơn 60% tế bào trong

khi hợp chất HP14 chỉ gây chết 34% tế bào ở nồng độ 480,77 μM

122

Bảng 4.12 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết n-butanol và các hợp

chất phân lập trên dòng tế bào K562

Mẫu IC50

Cao chiết n -butanol 188,08 ± 19,22 (g/mL)

HP9 754,46 ± 31,96 (M)

HP11 607,05 ± 42,84 (M)

HP13 394,68 ± 25,12 (M)

HP14 -

Ellipticine 1,13 ± 0,12 (M)

(-): Kết quả âm tính

Kết quả cho thấy, cao chiết n-butanol thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh

hơn các hợp chất phân lập từ cao này (HP9, HP11, HP13, HP14) trên dòng tế bào

K562 với giá trị IC50 là 188,08 ± 19,22 µg/mL. Điều này có thể lý giải do nhóm hợp

chất khác trong cao chiết n-butanol thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn các

hợp chất iridoid và flavonoid được thử nghiệm. Hợp chất isorhamnetin-3-O--

rutinoside (HP13) có hoạt tính gây độc tế bào mạnh hơn các hợp chất khác với giá

trị IC50 là 394,68±25,12 µM. Hợp chất HP13 cũng gây độc tế bào mạnh trên dòng

tế bào ung thư vú (MCF-7 ) và ung thư tuyến tiền liệt phụ thuộc hormone với giá trị

IC50 lần lượt là 25,2 và 20,5 µg/mL [147].

4.3.2.3. Kết quả thử hoạt tính cảm ứng apoptosis của cao chiết n-butanol và một số

hợp chất phân lập từ cao chiết này trên dòng tế bào ung thư máu K562

Hoạt tính apoptosis của cao chiết n-butanol và 4 hợp chất (HP9, HP11, HP13,

HP14) phân lập từ cao chiết này trên dòng tế bào ung thư máu K562 được xác định

thông qua phương pháp nhuộm Hoechst 33342 và xác định hoạt tính caspase 3

Kết quả về khả năng gây apoptosis của cao chiết n-butanol và một số hợp

chất thông qua phương pháp nhuộm Hoechst 33342 (Hình 4.52)

123

Hình 4.67. Phần trăm tế bào K562 apoptosis gây ra bởi cao chiết n-butanol và các

hợp chất HP9, HP11, HP13, HP14 sau 24 giờ. Tế bào nuôi cấy (5×104

tế

bào/giếng) được xử lý bằng 300 µg/mL cao chiết hoặc hợp chất HP9, HP11,

HP13, HP14. *P<0,05, **P<0,01 so với đối chứng âm.

Kết quả cho thấy cao chiết n-butanol và các hợp chất này gây apoptosis đáng

kể theo thứ tự là: HP13> cao chiết n-butanol> HP14> HP9> HP11.

Đối chứng Camptothecin (0,5 µg/ml) HP13 (300 µg/ml)

HP9 (300 µg/mL) HP11 (300 µg/mL) HP14 (300 µg/mL)

Cao chiết n-butanol (300 µg/mL)

Hình 4.68 Hình ảnh tế bào nhuộm Hoechst 33342 dưới tác động của cao chiết n-

butanol và các hợp chất HP9, HP11, HP13, HP14

124

Kết quả xác định hoạt tính caspase 3 thông qua độ biến đổi về tỉ lệ (fold

change)

Hình 4.69. Hoạt tính caspase 3 của cao chiết n-butanol và các hợp chất HP9, HP11,

HP13, HP14 trên tế bào K562 trong thời gian 24 giờ. Tế bào nuôi cấy (5×104

tế

bào/giếng) được xử lý bằng 300 µg/mL cao chiết hoặc hợp chất HP9; HP11;

HP13; HP14 (tương ứng với 806,45 µM của HP9; 742,57 µM của HP11; 480,77

µM của HP13 và 491,80 µM của HP14). Camptothecin (1,44 µM) là chất đối

chứng tham khảo. *P<0,05, **P<0,01 so với chất đối chứng âm (DMSO 0,5%).

Kết quả cho thấy hợp chất HP13 và HP9 làm tăng đáng kể hoạt tính caspase

3, (p< 0,05) trong khi, cao chiết n-butanol và hợp chất HP11, HP14 hoạt hóa

caspase 3 giống nhau nhưng thấp hơn so với hợp chất HP9 và HP13.

Kết luận:

- Kết quả phân lập và xác định cấu trúc hóa học các hợp chất được phân lập

cho thấy cây An điền lá thông chứa chủ yếu các hợp chất anthraquinone, iridoid,

triterpenoid và flavonoid, ngoài ra còn có hợp chất carotenoid. Trong số, 14 hợp chất

được phân lập có 1 anthraquinone mới 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone

(HP1) và 13 hợp chất đã biết gồm 3 anthraquinone: 2-hydroxy-1-methoxy-

anthraquinone (HP2), 1,6-dihydroxy-2-methylanthraquinone (HP3), digiferruginol

(HP4), 1carotenoid: lutein (HP5), 2 triterpene: ursolic acid (HP6), oleanolic acid

(HP7), 4 iridoid glycoside: asperuloside (HP8), deacetyl asperuloside (HP9),

asperulosidic acid (HP10), scandoside methyl ester (HP11) và 3 flavonoid glycoside:

afzelin (HP12), isorhamnetin-3-O--rutinoside (HP13), rutin (HP14) trong đó hợp

125

chất HP5, HP12 lần đầu tiên được phân lập trong chi Oldenlandia.

- Đây là lần đầu tiên hoạt tính gây độc tế bào của cây An điền lá thông được

nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới. Cao chiết n-butanol và 4 hợp chất phân lập

từ cao chiết này ức chế tăng sinh tế bào ung thư máu K562, gây apoptosis và có khả

năng kích hoạt caspase 3 (p<0,05). Ngoài ra, cao chiết n-butanol gây apoptosis

nhưng chưa ảnh hưởng đến chu kỳ của tế bào.

Nhƣ vậy, từ 3 cây nghiên cứu đã phân lập và xác định cấu trúc tổng cộng 26

hợp chất và xác định được hoạt tính gây độc tế bào của một số hợp chất phân lập

(Bảng 4.13, Hình 4.70).

Bảng 4.13 Tổng kết 26 hợp chất phân lập được từ ba loài nghiên cứu

Ký hiệu Tên hợp chất Cấu trúc Các steroid

AL3 Stigmasterol

OH

1

3

4 5

6

7

8

9

10

11

12

13

1415

16

17

18

1920

2122

2324

25 26

2728

29

AL4 -sitosterol

RO

1

3

4 5

6

7

8

9

10

11

12

13

1415

16

17

18

1920

2122

2324

25 26

2728

29

AL4: R = H

AL5: R = Glc

AL5 -sitosterol glucoside

Các anthraquinone

CH1 7-hydroxytectoquinone O

O

R1

R2

R4

R3

R5 1

2

4

3

5

78 9

10

6

9a

4a

8a

10a

CH1 R1 = R3 = R4 = H, R2 = Me, R5 = OH

HP1 R1 = R3 = R4 = OH, R2 = Me, R5 = H

HP2 R1 = OMe, R2 = OH, R3 = R4 = R5 = H

HP3 R1 = R4 = OH, R2 = Me, R3 = R5 = H

HP4 R1 = OH, R2 = CH2OH, R3 = R4 = R5 = H

HP1 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-

anthraquinone (chất mới)

HP2 2-hydroxy-1-methoxy-

anthraquinone

HP3 1,6-dihydroxy-2-

methylanthraquinone

HP4 digiferruginol

126

Carotenoid

HP5 Lutein

(lần đầu tiên được phân lập từ

chi Oldenlandia) OH

OH

1

2

3

4

5

67

8

9

10

11

12

13

14

15

1'

2'

3'

4'5'

6'

7'

8'9'

10'

11'

12'13'

14'

15'

Các triterpenoid

AL1 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol


chi Allophylus)

OH

13

6101215

16171819

20

CH2 3α, 24-Dihydroxy-urs-12-

ene-28-oic acid

HP6 = CH3 R1

= -OH, R2

= R3 = R5 = CH3, R4

= H

HP7 = CH4 R1

= -OH, R3

= H, R2 = R4

= R5 = CH3

CH2 R1 = -OH, R2 = R3 = CH3, R4

= H, R5

= CH2OH

COOH

R5

R2

R3

R1

R4

1

3

57

9

11

12

14 16

1718

1921

22

2324

25 26

27

28

29

30

CH3

HP6

Ursolic acid

CH4

HP7

Oleanolic acid


chi Chirita)

Các iridoid glycoside

HP8 Asperuloside

O

O CO

O O

OH

OH

OH

OH

R 1

3

45

7

9

10

11

1'

2'

3'

4'

5'6'

6

8

HP8 R = OAc

HP9 R = OH

HP9 Deacetyl asperuloside

HP10 Asperulosidic acid

O

R1

OH

R2

O O

OH

OH

OH

OH

1

3

456

7

8 9

10 1'

2'

3' 4'

5'

6'

HP10 R1 = COOH, R2 = OAc

HP11 R1 = COOMe, R2 = OH

HP11 Scandoside methyl ester

127

Các flavonoid

AL2 Catechin


chi Allophylus) O

OH

OH

OH

OH

OH

2

3

45

7 9

10

1' 3'

4'6'

HP12 Afzelin


chi Oldenlandia) O

O

OH

OH

OH

OO

OH

OH

OH

3'

1'

4'

6'2

34

9

10

7

5

1''

5''

2'

5'

2''

3''4''

6

8

HP13 Isorhamnetin-3-O--

rutinoside

OOH

OH O

OH

R

OOH

O

O

OH

OH

O

OH

OH

OH

1"'

2"'

3"'

5"'

4"'

6"'

2

3

410

5

6

7

89

1'

3'

4'

1"

2''

3"4"

6" 5"

HP13 R = OH

HP14 R = OMe

HP14 Rutin

Các phenylethanoid glycoside

CH5 2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl

-β-D-glucopyranoside

OOH

OH

OH

O

OH

OH

OH

1

3

4

CH6

Acteoside

O

OH

OH

OR1

O

OH

O

OR2

O

OH

OH

OH

R3

1"'

1"

1

3

4



CH8 R1

= R2 = R3

= H

CH6 R1 = Caffeoyl, R2 = H, R3 = OH

CH7 Isoacteoside

CH8 Decaffeoylacteoside


chi Chirita)

CH9 β-hydroxy acteoside


chi Chirita)

128

O

O

OH

O

O

O

OHOH

OH

OHOH

OH

OH

OH

O

1"'

1"

12

3

4

5

61'

2'3'

4'6'

5'

CH7

Thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên 3

dòng tế bào KB, HepG2 và LU-1 với giá trị

IC50 lần lượt là:51,04±1,86; 57,61±0,51;

125,71±1,84 (μM)

O

O

OH

O

OH

O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

1"'

1"

12

3

4

5

6

CH8

Thể hiện hoạt tính gây độc tế bào (μM)

trên 3 dòng tế bào KB, HepG2 và LU- với

giá trị IC50 lần lượt là: 48,67±3,38;

78,80±3,34; 132,82±0,95

O

O CO

O O

OH

OH

OH

OH

OH 1

3

45

7

9

10

11

1'

2'

3'

4'

5'6'

6

8

HP9

O

COOMeOH

OHO O

OH

OH

OH

OH

1

3

456

7

8 9

10 1'

2'

3' 4'

5'

6'

HP11

OOH

OH O

OH

R

OOH

O

O

OH

OH

O

OH

OH

OH

1"'

2"'

3"'

5"'

4"'

6"'

2

3

410

5

6

7

89

1'

3'

4'

1"

2''

3"4"

6" 5"

HP13 R = OH

HP14 R = OMe

Cao chiết n-butanol và 4 hợp chất HP9, HP11, HP13, HP14 ức chế tăng sinh tế bào ung

thư máu K562, gây apoptosis và có khả năng kích hoạt caspase 3 (p<0,05). Ngoài ra, cao

chiết n-butanol gây apoptosis nhưng chưa ảnh hưởng đến chu kỳ của tế bào

Hình 4.70 Tổng kết hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết và các hợp chất phân lập

được từ ba loài nghiên cứu

129

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

1. Kết luận

Đây là công bố đầu tiên ở Việt Nam cũng như trên thế giới về thành phần

hóa học và hoạt tính gây độc tế bào của loài Ngoại mộc tái và Cày ri ta Hạ long, hai

loài thực vật đặc hữu của vùng Vịnh Hạ Long.

Đây là công bố đầu tiên ở Việt Nam cũng như trên thế giới về hoạt tính gây

độc tế bào của cây An điền lá thông.

Từ 3 cây nghiên cứu đã phân lập và xác định cấu trúc tổng cộng 26 hợp chất

và đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của cao chiết và một số hợp chất chọn lọc, cụ

thể là:

1.1. Thành phần hóa học

Cấu trúc của 26 hợp chất phân lập từ 3 cây nghiên cứu (Ngoại mộc tái, Cày

ri ta Hạ long, An điền lá thông) là:

- 3 Steroid: stigmasterol (AL3), β-sitosterol (AL4) và β-sitosterol glucoside

(AL5)

- 4 Terpenoid: 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1), 3α, 24-dihydroxy-urs-12-

ene-28-oic acid (CH2), ursolic acid (CH3, HP6), oleanolic acid (CH4, HP7).

- 5 Anthraquinone: 7-hydroxytectoquinone (CH1), 1,4,6-trihydroxy-2-methyl

anthraquinone (HP1), 2-hydroxy-1-methoxy-anthraquinone (HP2), 1,6-dihydroxy-

2-methyl-anthaquinone (HP3) và digiferruginol (HP4).

- 5 Phenylethanoid glycoside: 2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethyl-β-D-

glucopyranoside (CH5), acteoside (CH6), isoacteoside (CH7), decaffeoylacteoside

(CH8), β-hydroxyacteoside (CH9).

- 1 Carotenoid: lutein (HP5)

- 4 Flavonoid: catechin (AL2), afzelin (HP12), isorhamnetin-3-O--rutinoside

(HP13), rutin (HP14).

- 4 Iridoid glycoside: asperuloside (HP8), deacetyl asperuloside (HP9),

asperulosidic acid (HP10), scandoside methyl ester (HP11).

Trong đó, có 1 hợp chất mới là 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-anthraquinone

(HP1), và 7 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi nghiên cứu, cụ thể là:

1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1) và catechin (AL2) từ chi Allophylus, oleanolic

130

acid (CH4), decaffeoylacteoside (CH8) và β-hydroxy acteoside (CH9) từ chi

Chirita, và lutein (HP5), afzelin (HP12) từ chi Oldenlandia.

1.2. Hoạt tính gây độc tế bào

Hợp chất 1,6,10,14-phytatetraen-3-ol (AL1) phân lập từ cây Ngoại mộc tái

thể hiện kết quả âm tính khi thử hoạt tính gây độc tế bào trên 5 dòng tế bào ung thư

ở người (KB, HepG2, LU-1, MCF-7, SK-Mel-1).

Ba hợp chất 3α, 24-dihydroxy-urs-12-ene-28-oic acid (CH2), isoacteoside

(CH7), decaffeoylacteoside (CH8) được phân lập từ cây Cày ri ta Hạ long thể hiện

hoạt tính gây độc tế bào yếu trên 4 dòng tế bào ung thư ở người (KB, HepG2, LU-1,

MCF-7).

Cao chiết n-butanol cây An điền lá thông (HPB) và các hợp chất phân lập từ

cao này HP9, HP11, HP13, HP14 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư máu

K562 phụ thuộc vào liều, trong đó cao chiết n-butanol thể hiện hoạt tính mạnh nhất.

Cao chiết n-butanol (HPB) có khả năng gây apoptosis trên dòng tế bào bạch cầu

OCI-AML nhưng chưa làm ảnh hưởng đến chu kỳ của tế bào. Cao chiết n-butanol

(HPB) và các hợp chất HP9, HP11, HP13, HP14 gây apoptosis đáng kể theo thứ

tự: HP13> cao chiết n-butanol> HP14> HP9> HP11. Hợp chất HP13 và HP9 làm

tăng đáng kể hoạt tính caspase 3, (p< 0,05) trong khi, cao chiết n-butanol và hợp

chất HP11, HP14 hoạt hóa caspase 3 giống nhau nhưng thấp hơn so với hợp chất

HP9 và HP13.

2. Kiến nghị

Tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính sinh học một số hợp chất có hoạt

tính sinh học từ ba loài nghiên cứu từ đó tìm ra mối tương quan giữa cấu trúc hóa

học và hoạt tính sinh học.

131

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

1. Đây là lần đầu tiên loài Ngoại mộc tái và Cày ri ta Hạ long được nghiên cứu về

thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ở Việt Nam cũng như trên thế

giới. Trong số các hợp chất được phân lập và xác định cấu trúc hóa học có 2

hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Allophylus là 1,6,10,14-phytatetraen-

3-ol và catechin; 3 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi Chirita là

oleanolic acid, decaffeoylacetoside và β-hydroxy acteoside.

2. Đây là lần đầu tiên cây An điền lá thông được nghiên cứu về hoạt tính gây độc

tế bào ở Việt Nam và trên thế giới. Trong số 14 hợp chất được phân lập và xác

định cấu trúc hóa học trong đó có 1 hợp chất mới là 1,4,6-trihydroxy-2-methyl-

anthraquinone và 2 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ chi này là lutein và

afzelin. Cao chiết n-butanol và 4 hợp chất phân lập từ cao chiết này ức chế tăng

sinh tế bào ung thư máu K562, gây apoptosis và có khả năng kích hoạt caspase

3 (p<0,05).

132

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ

LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Khiếu Thị Tâm, Đào Đức Thiện, Nguyễn Thị Hoàng Anh, Trịnh Thị Thủy,

Trần Văn Lộc, Trần Văn Sung, Chemical constituents and biological activity of

Allophylus livescens Gagnep. collected in Halong bay, Vietnam Journal of

Chemistry - Vol 53, No 6 (2015).

2. Nguyen Thi Hoang Anh, Khieu Thi Tam, Nguyen Van Tuan, Dao Duc

Thien, Tran Duc Quan, Nguyen Thanh Tam, Nguyen Chi Bao, Thi Thao

Do, Nguyen Thi Nga, Trinh Thi Thuy, Tran Van Sung & Domenico V. Delfino,

Chemical constituents of Oldenlandia pinifolia and their antiproliferative

activities, Natural Product Research, Pages 1-7 | Received 27 Sep 2017,

Accepted 26 Nov 2017, Published online: 06 Dec 2017,

doi.org/10.1080/14786419.2017.1410806.

3. Khieu Thi Tam, Nguyen Thi Hoang Anh, Nguyen Van Tuan, Đao Đuc Thien,

Nguyen Thanh Tam, Tran Duc Quan, Le Quoc Thang, Trinh Thi Thuy, Tran

Van Sung, Chemical constituents of Chirita halongensis Kiew & T.H.Nguyen

collected in Halong bay, Quang Ninh province, Viet Nam, đã nhận đăng ở Tạp

chí Hóa học.

4. Khieu Thi Tam, Nguyen Thi Hoang Anh, Nguyen Van Tuan, Dao Duc Thien,

Tran Duc Quan, Nguyen Thanh Tam, Nguyen Chi Bao, Trinh Thi Thuy, Tran

Van Sung, chemical constutuents of Oldenlandai pinifolia Wall. collected in

Thua Thien Hue, đã nhận đăng ở Tạp chí Khoa học và Công nghệ.

133

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. The Plant List. Retrieved 27 October 2017.

2. 2a. Phạm Hoàng Hộ. Cây cỏ Việt Nam, tập II, NXB. Trẻ, 312-318, 2003.

2b. Phạm Hoàng Hộ. Cây cỏ Việt Nam, tập III, NXB. Trẻ, 19-24, 2003.

2c. Phạm Hoàng Hộ. Cây cỏ Việt Nam, tập III, NXB. Trẻ, 106-123, 2003.

3. Võ Văn Chi Từ điển cây thuốc Việt nam. Nhà xuất bản Y học 1996.

4. Adem Yesuf, Kaleab Asres. Wound healing and antiinflammatory properties

of Allophylus abyssinicus. Phytopharmacology, 2013, 4(2), 442 - 453.

5. Gupta A. K., Tandon N., Reviews on Indian Medicinal Plants. Indian Council

of Medical Research, New Delhi, 2004, vol. 2, pp. 90–92.

6. Ulubelen A., Cetin ET, Guran A. Flavonoid compounds of Genista tinctoria

[J]. Lloydia, 1971, 34: 258-259.

7. Kumar, M., P. Rawat, P. Dixit, D. Mishra and A.K. Gautam et al. Anti-

osteoporotic constituents from Indian medicinal plants, Phytomedicine, 2010,

17: 993-999.

8. Arisawa M, Morinaga Y, Nishi Y, Ueno H, Suzuki S, Hayashi T, Shimizu M,

Yoshizaki M, Morita N, Berganza LH. Chemical and pharmaceutical studies

on medicinal plants in Paraguay constitueints of angiotensin converting

enzyme inhibitory fraction from cocu, Allophylus edulis Radlk. Nat Med

(Tokyo) 1989, 43(1), 78-90.

9. Hoffmann-Bohm, K., Lotter, H., Seligmann, O. and Wagner, H.

Antihepatotoxic C-Glycosylflavones from the Leaves of Allophyllus edulis var.

edulis and gracilis. Planta Medica, 1992, 58, 544-548.

10. Juceni P. David, Ihanmarck D. dos Santos, Jorge M. David, A new

sesquiterpene from the fruits of Allophylus laevigatus, Fitoterapia. 2004, 75,

795–798

11. Manmeet Kumara, Preeti Rawat, Preeti Dixit, Devendra Mishraa, Abnish K.

Gautam, Rashmi Pandey, Divya Singh, Naibedya Chattopadhyay, Rakesh

Maurya, Anti-osteoporotic constituents from Indian medicinal plants,

Phytomedicine, 2010, 17, 993–999.

12. Zhang XY, Cai XH, Luo XD. Chemical constituents of Allophylus longipes

[J]. Chin J Nat Med, 2012, 10(1), 36-39.

134

13. Hegnauer, R., Distribution of hydrocyanic acid in cormophytes. IV.

Distribution of cyanogenesis, Pharma Week blad, 1961, 96, 577.

14. Martina Díazl, Lucía Castillo, Carmen E. Díaz, Ricardo Guillermo Álvarez,

Azucena González-Coloma, Carmen Rossini, Differential deterrent activity of

natural products isolated from Allophylus edulis (Sapindaceae), Advances in

Biological Chemistry, 2014, 4, 168-179.

15. Ciepichal E, Wojcik J, Bienkowski T, et al. Alloprenols: novel α-trans-

polyprenols of Allophylus caudatus [J]. Chem Phy Lip, 2007, 147 (2), 103-

112.

16. Oladosu I. A, Balogun S. O, LIU Zhi-Qiang, Chemical constituents of

Allophylus africanus, Chinese Journal of Natural Medicines, 2015, 13(2), 133-

141.

17. Braekman, J.C., Daloze, D. and Pasteels, J.M. Cyanogenic and Other

Glucosides in a Neo-Guinean Bug Lepto-coris isolata. Possible Precursors in

its Host Plant. Biochemical Systematics and Ecology, 1982, 10, 355-357.

18. Martina Díaza, Andrés González, Ian Castro-Gamboa, David Gonzalez,

Carmen Rossini, First record of L-quebrachitol in Allophylus edulis

(Sapindaceae), Carbohydrate Research, 2008, 343, 2699–2700.

19. P. Avato, I. Rosito, P. Papadia, F. P. Fanizzi. Cyanolipid-rich seed oils from

Allophylus natalensis and A. dregenus. Lipids 2005, 40 (10), 1051-1056.

20. Nguyen Tien Hiep, Kiew R. New and interesting plants from Ha Long Bay,

Vietnam, Gardens’ Bulletin (Singapore), 2000, 52, 185-202.

21. Hồ Đình Hải, Rau rừng Việt Nam, 2014

22. Chen Yueyuan, Chen Wenjuan, Li Dianpeng, et al., Preparative isolation and

purification of five phenylethanoid glycosides from Chirita eburnea,

Chemistry of Natural Compounds, 2011, 47 (4), 615-618.

23. Xiang Hai Cai, Xiao Dong Luo, Jun Zhou and Xiao Jieng Hao, Quinones from

Chirita eburnea, Journal of Natural Products, 2005, 68 (5), 797-799.

24. Xiang Hai Cai, Xiao Dong Luo, Jun Zhou and Xiao Jieng Hao, A new

naphthaquinone derivative from Chirita eburnea, Journal of Asian Natural

Products Research, 2006, 8 (4), 351-353.

25. Zhou Li Dong, Y. J. Guang, G. Jia, Y. S. Lin, Compounds from roots of

135

Chirita fimbrisepala Hand.-Mazz, Zhongguo Zhongyao Zazhi, 2001, 26 (2),

114 – 117.

26. Verdan MH and Stefanello ME’, Secondary metabolites and biological

properties of Gesneriaceae species, Chemistry and Biodiversidey, 2012, 9,

2701-2731.

27. Marina Gálvez, Carmen Martín-Cordero, María Jesús, Pharmacological

activities of phenylpropanoids glycosides, Studies in Natural Products

Chemistry, 2006, 33, 675-718.

28. Haichong Wu, Gan Zhao, Kangfeng Jiang, X. Chen, et al., Plantamajoside

ameliorates lipopolysaccharise-induced acute lung injury via suppressing NF-

κB and MAPK activation, International Immunopharmacology, 2016, 35, 315-

322.

29. Man Yuan Wang, Lan Yang, Y. Y. Tu, Phenylethanoid glycosides from stems

of Chirita longgangensis var.hongyao, China journal of Chinese Material

Medica, 2005, 30 (24), 1921-1923.

30. S. Damtoft and S. R. Jensen, Three phenylethanoid glucosides of unusual

structure from Chirita sinensis (Gesneriaceae), Phytochemistry, 1994, 37 (2),

441-443.

31. Nguyen Thi Hoang Anh, Nguyen Van Tuan, Dao Duc Thien, Tran Duc Quan,

Nguyen Thanh Tam, Giang Thi Kim Lien, Katrin Franke, Trinh Thi Thuy,

Tran Van Sung, Chemical constituents of Chirita drakei Burtt, Natural Product

Communications, 2017, 12 (4), 563-566.

32. Man Yuan Wang, Lan Yang, Y. Y. Tu, Studies on the chemical constituents

from stems of Chirita longgangensis var. hongyao, China journal of Chinese

Material Medica, 2006, 31 (4), 307-308.

33. Shao Yao, B. J. Long, W. Y. Hu, et al., Chemical constituents from Chirita

longgangensis var. hongyao with inhibitory activity against porcine

respiratory and reproductive syndrome virus, J.Braz.Chem.Soc, 2012, 23 (10),

1925-1932.

34. Wenzhen Liao, Luying Chen, Xiang Ma, Rui Hua Jiao, Xiaofeng Li, Yong

Wang, Protective effects of kaempferol against reactive oxygen species-

induced hemolysis and its antiproliferative activity on human cancer cells,

136

European Journal of Medicinal Chemistry, 2016, 114, 24-32.

35. Kasi Pandima Devi, Dicson Sheeja Malar, Seyed Fazel Nabavi, et al.,

Kaempferol and inflammation: From chemistry to medicine, Pharmacological

Research, 2015, 99, 1-10.

36. Man Yuan Wang, Mu Xin Gong, Z. Dong, Y. Lan, A new β-

naphthalenecarboxylic acid biglycoside from from Chirita longgangensis var.

hongyao, Acta Pharmaceutica Sinica, 2011, 46 (2), 179-182.

37. Nalini K., K. S. Karanth, A. Rao, A. R. Aroor, Effects of Celastrus

paniculatus on passive avoidance performance and biogenic amine turnover

in albio rats, Journal of Ethnopharmacology, 1995, 47, 101-108.

38. Safayhi H., E. R. Sailer, Anti-inflammatory action of pentacyclic

triterpenoides, Planta Medica, 1997, 63, 487.

39. Nguyen Thi Hoang Anh, Nguyen Van Tuan, Tran Đuc Quan, Đao Đuc Thien,

Nguyen Thanh Tam, Giang Thi Kim Lien, Trinh Thi Thuy, Tran Van Sung,

Chemical constituents of Chirita drakei Burtt collected in Ha Long Bay,

Quang Ninh province, Viet Nam, I. Compounds isolated from the n-hexane

and ethyl acetate extracts, Vietnam Journal of Chemistry, 2017, 55 (2), 203-

207.

40. Nguyen Thi Hoang Anh, Nguyen Van Tuan, Tran Đuc Quan, Đao Đuc Thien,

Nguyen Thanh Tam, Giang Thi Kim Lien, Trinh Thi Thuy, Tran Van Sung,

Chemical constituents of Chirita drakei Burtt collected in Ha Long Bay,

Quang Ninh province, Viet Nam, II. Compounds isolated from the n-butanol

extract, Vietnam Journal of Chemistry, 2017, 55 (4), 504 -508.

41. Chen T., and C.M. Taylor, Flora of China, Science Press, Beijing, and

Missouri Botanical Garden Press, St. Louis, 2011, 19, 147-174.

42. Edward E. Terrell, Revision of Houstonia (Rubiaceae-Hedyotideae),

Systematic Botany Monographs, 1996, 48: 1–118.

43. Trung tâm nghiên cứu tài nguyên và môi trường- Đại học Quốc gia Hà Nội,

Danh lục các loài thực vật Việt Nam, nhà xuất bản Nông nghiệp, tập 3, trang

98-109.

44. Sridevi Sangeetha Kothandaraman Sivapraksam , Kavitha Karunakaran,

Umamaheswari Subburaya, et al., A Review on Phytochemical and

137

Pharmacological Profile of Hedyotis corymbosa Linn, Int. J. Pharm. Sci. Rev.

Res., 2014, 26 (1), 320-324.

45. Gupta Salin, et al. Anticancer activities of Oldenlandia diffusa. Journal of

Herbal Pharmacotherapy, 2004, 4(1), 21-33.

46. Bhakuni, D.S; Gupta, N.C; Satish, S; Sharma, C; Shukla, Y.N; Tandon, J.S.

Chemical constituents of Actino daphneaugustifolia, Crotonsparsiflorus,

Duabangasonneratiodes, Glycosmismauritiana, Hedyotis auricularia, Lyoniao

valifolia, Micromel umpubescens, Pyruspashia and Rhododen dronniveum.

Phytochemistry, 1971, 10(9), 2, 247-2249.

47. Ming Li, Ren Wang Jiang, Po-Ming Hon, et al., Authentication of the anti-

tumor herb Baihuasheshecao with bioactive marker compounds and molecular

sequences. Food Chem. 2010, 119, 1239–1245.

48. Kozhiparambil Purushothaman, Ayyapath Sarada, Structure of auricularine, a

bis-indole alkaloid from Hedyotis auricularia, Phytochemistry 1981, 20 (2),

351–356.

49. Jiang-Nan Peng, Xiao-Zhang Feng, Qi-Tai Zheng and Xiao-Tian Liang, -

carboline alkaloid from Hedyotis chrysotricha, Phytochernistry 1997, 46 (6),

1119-1122.

50. Nguyen Minh Phuong, Tran Van Sung, Andrea Porzel, Juergen Schmidt, Kurt

Merzweiler, Guenter Adam, -Carboline alkaloids from Hedyotis capitellata,

Phytochemistry, 1999, 52, 1725-1729.

51. Nguyen Minh Phuong, Tran, Van Sung, Porzel, A., Schmidt, J., and Adam, G.

Two new beta-carboline alkaloids from Hedyotis capitellata var. mollis,

Planta Med., 1999, 65(8), 761-762.

52. Tong-Ing Ho, Gen-Phon Chen, Yuan-Chuan Lin, Yuh-Meei Lin, Fa-Ching

Chen, An anthraquinone from Hedyotis diffusa, Phytochemistry, 1986, 25 (8),

1988–1989.

53. Lại Kim Dung, Trần Văn Sung, Phạm Gia Điền, Hai antraquinon từ Hedyotis

corymbosa và Hedyotis diffusa, Tạp chí Hóa Học, 2002, 40(3), 66-68.

54. Xing-Dong Kang, Xian Li, Chun-Chao Zhao & Yu Mao, Two new

anthraquinones from Hedyotis diffusa W., Journal of Asian Natural Products

Research, 2008, 10 (2), 193-197.

138

55. Wei-Hua Huang, Shun-Hui Yu; You-Bin Li, Jian-Qin Jiang, Two new

anthraquinones from Hedyotis diffusa, Journal of Asian Natural Products

Research, 2008, 10 (5), 467-471.

56. Wei-Hua Huang, Shun-Hui Yu, You-Bin Li, & Jian-Qin Jiang, Four

anthraquinones from Hedyotis diffusa, Journal of Asian Natural Products

Research, 2008, 10 (9), 887-889.

57. Senthi Mahibalan, Poorna Chandra Rao, Rukaiyya Khan, Ameer Basha,

Ramakrishna Siddareddy, Hironori Masubuti, Yoshinori Fujimoto, Ahil Sajeli

Begum, Cytotoxic constituents of Oldenlandia umbellata and isolation of a

new symmetrical coumarin dimer, Med Chem Res, 2016, DOI

10.1007/s00044-015-1500-z

58. Ahmad Hamzah, H. Jasmani, R. Ahmad, and A. R. Baba, New Anthraquinones

from the Roots of Hedyotis dichotoma, J. Nat. Prod., 1997, 60 (1), 36-37.

59. Dharma Permana, Nordin Hj. Lajis, A. Ghafar Othman, Abdul M. Ali, Norio

Aimi, Mariko Kitajima, and Hiromitsu Takayama, Anthraquinones from

Hedyotis herbacea, J. Nat. Prod., 1999, 62(10), 1430-1431.

60. Ahmad Rohaya, Shaari Khrirah, Lajis N. H., Hamzah A. S., Ismail N.H. and

Kitajima, M. Anthraquinones from Hedyotis capitellata, Phytochemistry,

2005, 66 (10), 1141-1147.

61. Lê Hoàng Duy, Nguyễn Kim Phi Phụng, các anthraquinon từ hedyyotis

pinifolia, Tạp chí hóa học, 2009, 47 (3), 380 – 384.

62. Hong quan Li, Chun Li, Bohou Xia, Yamin Zhou, Limei Lin, Duanfang Liao,

A chemotaxonomic study of phytochemicals in Hedyotis Corymbosa,

Biochemical Systematics and Ecology, 2015, 62, 173 -177.

63. Ying Shi, Chen Hui Wang, Gong X.G. Apoptosis-inducing effects of two

anthraquinones from Hedyotis diffusa Wild. Biol. Pharm. Bull. 2008, 31,

1075–1078.

64. Zheng Liu, Ming Liu, Miao Liu, Jianchun Li, Methyl anthraquinone from

Hedyotis diffusa WILLD induces Ca2+

-mediated apoptosis in human breast

cancer cells, Toxicology in Vitro, 2010, 4, 142–147.

65. Ahmad Hamzah, Norio Aimit and Nordin H. J. Lajis, Constituents of

Hedyotis herbacea (Rubiaceae), Biochemical Systematics and Ecology,

139

1996, 24 (3), 273.

66. Nguyen Hoang Hang, Do Trong Khoi Tuong, Nguyen Kim Tuyen, Nguyen

Kim Phi Phung et al., Further study on the chemical constituents of Hedyotis

vestita (Rubiaceae). Vietnam J. Chem. 2014, 51, 648–652.

67. Chai Ming Lu, Yang J., Wang P., and Lin C., A new acylated flavonol

glycoside and antioxidant effects of Hedyotis diffusa, Planta Med., 2000, 66,

374-377.

68. Youngleem Kim, Eun Jung Park, Jinwoong Kim, Yang-Bae Kim, So Ra Kim,

and Young Choong Kim, Neuroprotective Constituents from Hedyotis diffusa,

J. Nat. Prod. 2001, 64 (1), 75-78.

69. Duxin Li, Schmitz O.J., Comprehensive two-dimensional liquid

chromatography tandem diode array detector (DAD) and accurate mass

QTOF-MS for the analysis of flavonoids and iridoid glycosides in Hedyotis

diffusa. Anal. Bioanal. Chem. 2015, 407, 231–240.

70. Ahmad Hamzah, Laijis N.H., and Sargent M.V., Kaempferitrin from the

leaves of Hedyotis verticullata and it biological activity, Planta Medica., 1994,

60, 388-389.

71. Ahmad Hamzad, A.S., Jasmani, H., Baba, A.R., Laijis, N.H., and Konishi, M.,

Coumarins from Hedyotis dichotoma, Pertanika J. Sci & Technol., 2001, 9

(2), 143-147.

72. Lại Thị Kim Dung, Một số hợp chất flavonoid phân lập từ cây An điền sát

Hedyotis pressa-Rubiaceae, Tạp chí hóa học, 2009, 47 (4A), 304-306.

73. Lin Zhang, Jing Zhang, Bing Qi, Guoqiang Jiang, Jia Liu, Pei Zhang, Yuan,

Weiling, The anti-tumor effect and bioactive phytochemicals of Hedyotis

diffusa Willd on ovarian cancer cells, Journal of Ethnopharmacology, 2016,

192, 132-139.

74. Caiqin Wua , Huanan Luoa , Weijun Maa , Xiaoyong Rena , Chuangxin Lub ,

Ni Lic , Zhenghui Wanga, Polysaccharides isolated from Hedyotis diffusa

inhibits the aggressive phenotypes of laryngeal squamous carcinoma cells via

inhibition of Bcl-2, MMP-2, and μPA, Gene 2017, 637, 124–129.

75. Jiang-Nan Peng, Xiao-Zhang Feng, Xiao-Tian Liang. Iridoids from Hedyotis

hedyotidea, Phytochemistry 1998, 47 (8), 1657-1659.

140

76. Jiang-Nan Peng, Xiao-Zhang Feng, Li GY, Liang XT, Chemical

investigation of genus Hedyotis. II. Isolation and identification of iridoids

from Hedyotis chrysotricha, Yao Xue Xue Bao. 1997, 32(12), 908-913.

77. Otsuka, H., Yoshimura, K., Yamasaki, K., and Cantoria, M.C., Isolation of 10-

O-acyl iridoid glucosides from a Phillippine medicinal plant, Oldenlandia

corymbosa L. (Rubiaceae), Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1991, 39 (8),

2049-2052.

78. Zhao, J.F., Yang, X.D., and Li, G.P., Two new iridoid glycosides from

Hedyotis tenelliflora, Helvetica Chimica Acta, 2005, 88 (9), 2532–2536.

79. Jiang-Nan Peng, Xiao-Zhang Feng and Xiao-Tian Liang, Two New Iridoids

from Hedyotis chrysotricha, J. Nat. Prod. 1999, 62, 611-612.

80. Miao Ye, Jing-Jing Su, Shu-Ting Liu, Lei Cao, Juan Xiong, Yun Zhao, Hui

Fana, Guo-Xun Yang, Gang Xia and Jin-Feng Hu, (24S)-Ergostane-3β,5α,6β-

triol from Hedyotis chrysotricha with inhibitory activity on migration of SK-

HEP-1 human hepatocarcinoma cells, Natural Product Research, 2013, 27

(12), 1136–1140.

81. Luu H Van Long, Vo Thi Nga, Nguyen Phuc Dam, Mai Anh Hung, Tu Duc

Dung, Ton That Quang, Nguyen K Phi Phung, Three new iridoid glucoside

salts from Hedyotis tenelliflora growing in Vietnam, Nat. Prod.Commun.,

2013, 8 (11), 1507-1508.

82. Nguyen Thi Hoa, Ho Viet Duc, Nguyen Dinh Quynh Phu, Takeshi Kodama,

Takuya and Hiroyuki Morita. A new iridoid from the aerial parts of Hedyotis

pilulifera, Natural Product Communications, 2016, 11 (3), 365-367.

83. Houming Wu, Xieliang Tao, Qi Chen and Xiafei Lao, iridoids from Hedyotis

diffusa, Journal of Natural product, 1991, 54 (1), 254-256.

84. Yongyong Zhang, Yan Chen, Chunlin Fan, Wencai Ye, Jiabo Luo, Two new

iridoid glucosides from Hedyotis diffusa, Fitoterapia, 2010, 8, 515–517.

85. Bo Ding, Wei Wei Ma, Yi Dai, Gao H., Yu Y., Tao, Y., Zhong, Y., Yao,

X.S.: Biologically active iridoids from Hedyotis diffusa. Helv. Chim. Acta,

2010, 93(12), 2488–2494.

86. Wei Jiang, Li-Sha Kuang, Ai-Jun Hou, Min Qian and Ji-Zong Li, Iridoid

Glycosides from Hedyotis corymbosa, Helvetica Chimica Acta, 2007, 90

141

(7), 1296–1301.

87. Dong Hyun Kim, Hyo Jung Lee, Young Jun Oh, Min Jung Kim, Sung Hoon

Kim, Tae Sook Jeong, Nam In Baek, Iridoid Glycosides isolated from

Oldenlandia diffusa inhibit LDL oxidation, Arch Pharm Res. 2005, 28 (10),

1156-1160.

88. Nina Artanti1 , Muhammad Hanafi, Rina Andriyani, Vienna Saraswati,

Zalinar Udin, Puspa D. Lotulung, Ken Ichi Fujita, Yoshinosuke Usuki,

Isolation of an Anti-Cancer Asperuloside from Hedyotis corymbosa L., The

journal of tropical life science, 2015, 5(2), 88-91.

89. Ahmad Nhlar. Phytochemical studies and pharmacological activities of plants

in genus Hedyotis/Oldenlandia. Natural Products Chemistry, 2006, 33(13),

1057-1090.

90. Tohru Kikuchi, Satoko Matsuda, Kadota.S, Sakai.Y, Namba.T, Watanabe.K,

Dissanayake.M, Studies on the constituents of medicinal and related plants in

Sri Lanka. New triterpenes from Hedyotis lawsoniae, Chem. Pharm. Bull.,

1984, 32 (10), 3906-3911.

91. Qui-xia Meng, Roubin, H.R.; Hanranhan, R.J. Ethnopharmacological and

bioactivity guided investigation of five TCM anticancer herbs. J.

Ethnopharmacol. 2013, 148, 229–238.

92. Pui Kei Wu William, Chi Shing Tai, Zhi-Tao Liang, Zhong-Zhen Zhao, Wen

Luan Wendy Hsiao, Oleanolic acid isolated from Oldenlandia diffusa exhibits

a unique growth inhibitory effect against ras-transformed fibroblasts, Life

Sciences, 2009, 85 (3-4), 113-121.

93. Emilio Ghisalberti, Biological and pharmacological activity of naturally

occurring iridoids and secoiridoids. Phytomedicine. 1998, 5 (2), 147-163

94. Oluwasesan Bello, Ahmed Zaki, A. Sinmisola, P.S. Fasinu, M.B. Oluwatoyin,

U.L. Ajao, O.S. Olubunmi, The genus Vitex: An Overview of Iridoids as

Chemotaxonomic Marker, Beni-Suef University Journal of Basic and Applied

Sciences 2017, doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.bjbas.2017.07.004.

95. Le Minh Quan, Kim Man Sub, S. Y. Seok, R. H. Won, et al., 6-O-Veratroyl

catalpol suppresses pro-inflammatory cytokines via regulation of extracellular

signal-regulated kinase and nuclear factor- κB in human monocytic cells,

142

Biochimie, 2015, 119, 52-59.

96. Irena Kruk, Hassan Aboul-Enein, Teresa Michalska, Alex Kladna, scavenging

of reactive oxygen species by the plant phenols genistein and oleuropein. A.

Luminescence, 2005, 20(2), 81-89.

97. Dharmender Rathee, T. Madhavi, B. Satish, A. Sheetal, et al., Iridoid

glycosides-Kutkin, Picroside I, and Kutkoside from Picrorrhiza kurroa Benth

inhibits the invasion and migration of MCF-7 breast cancer cells through the

down regulation of matrix metalloproteinases, Arabian Journal of Chemistry,

2013, 6, 49-58.

98. So Ra Kim, Kyung Ah Koo, Sang Hyung Sung, et al.,

Iridoids from Scrophularia buergeriana attenuate glutamate-induced

neurotoxicity in rat cortical cultures. J. Neurosci. Res., 2003, 15, 948.

99. Simeon Fogue Kouam, Alain Wembe Ngouompe, Anke Bullach, Marc

Lamshöft, Guy Merlin Kuigoua, Michael Spiteller, Monoterpenes with

antibacterial activities (Rubiaceae), Fitoterapia, 2013, 199-204.

100. Wei Peng, Xiao-Qian Qiu, Zhi-Heng Shu , Qing-Chun Liu, Mei-Bian Hu,

Ting Han, Khalid Rahman, Lu-Ping Qin, Cheng-Jian Zheng, Hepatoprotective

Activity of Total Iridoid Glycosides Isolated from Paederia scandens (Lour.)

Merr. var. Tomentosa, Journal of Ethnopharmacology, 2015, 174, 317-321.

101. Anne Monks, Diego Scudiero, P. Skehan, R. Shoemake, K. Paull, D. Vistica,

C. Hose, J. Langley, P. Cronise, H. Camplell, L. Mayo, M. Boyd, Feasibility

of a high-flux anticancer drug screen use a diverse panel of cultured human

tumor cell lines, J. Nalt. Cancer Inst., 1991, 83 (11), 757 – 766.

102. Ales Svatos, Klára Urbanová, Irena Valterová. The First Synthesis of

Geranyllinalool enantiomers. Collect. Czech. Chem. Commun., 2002, 67, 83 –

90.

103. Alexandre Quintana, Judith Reinhard, Robert Faure, Paolo Uva, Anne-Genevi

Eve Bagn Eres, Georges Massiot, Jean-Luc Clement. Interspecific variation in

terpenoid composition of defensive secretions of European Reticulitermes

termites. Journal of Chemical Ecology, 2003, 29 (3), 639 – 652.

104. Teresita Martin, Hiroe Kikuzaki, M. Hisamoto and Nakatani,

Constituents of Amomum tsao-ko and their radical scavenging and

143

antioxidant activities, J. Am. Oil Chem. Soc., 2000, 77 (6), 667–673.

105. Venkata Sai Prakash Chaturvedula, Indra Prakash. Isolation of Stigmasterol

and β-Sitosterol from the dichloromethane extract of Rubus suavissimus

International Curent Pharmaceutical Journal, 2012, 1 (9), 239 – 242.

106. Kittisak Likhitwitayawuid, Cindy Angerhofer, Geoffrey Cordell, Nijsiri R.,

Pezzuto J.M. Cytotoxic antimalarial bisbenzylisoquinoline aklaloids from

Stephania erecta. Journal of Natural Products, 1993, 56, 30–38.

107. Philip Skehan, Ritsa Storeng, Dominic Scudiero, Anne Monks, Jame Mc

Mahon, David Vistica, Jonathan Warren, New colorimetric cytotoxicity assay

for anticancer-drug screening. Journal of the National Cancer Institute, 1990,

82, 1107–1112.

108. Kawasaki, Yukihiro Goda, Hiroshi Noguchi, et al., A new anthraquinone

from rubia tinctorum, Shoyakugaku Zasshi, 1990, 44, 95-97.

109. Deepak M., Handa Sukhdev S., 3α,24-Dihydroxy-urs-12-en-28-oic acid from

Verbena officinalis, Phytochemistry, 1998, 49, 269.

110. Maria Goretti Silva., Variation of ursolic acid content in eight Ocimum

species from Northeastern Brazil, Molecules, 2008, 13, 2482-2487.

111. Shashi Mahato, Ashoke Nandy, Gita Roy, Triterpenoids, Phytochemistry,

1992, 31, 2199-2249.

112. Jie Liu, Pharmacology of oleanolic acid and ursolic acid, Journal of

ethnopharmacology, 1995, 49, 57-68.

113. Chi-Ren Liao, Yueh-Hsiung Kuo, Yu-Ling Ho, Ching-Ying Wang, Chang -

Syun Yang, Cheng-Wen Lin and Yuan-Shiun Chang. Studies on Cytotoxic

Constituents from the Leaves of Elaeagnus oldhamii Maxim. in Non-Small

Cell Lung Cancer A549 Cells. Molecules, 2014, 19, 9515-9534.

114. Helen Alvarado, Guadalupe Abrego, Eliana Souto, et al., Nanoemulsions for

Dermal Controlled Release of Oleanolic and Ursolic Ac-ids: In Vitro, Ex Vivo

and In Vivo Characterization. Colloids Surf. B Biointerfaces, 2015, 130, 40–

47.

115. Juliane Liese, Behnaz Ahangarian Abhari, Simone Fulda, Smac Mimetic and

Oleanolic Acid Synergize Toinduce Cell Death in Human Hepatocellular

Carcinoma Cells. Cancer Letters, 2015, 365, 47–56.

144

116. Hiroko Shimomura, Yutaka Sashida, Tokuo Adachi, Phenolic glucosides

from Prunus grayana. Phytochemistry, 26, 249 – 251 (1987).

117. Jan Schlauer, Jaromir Budzianowski, Krystyna Kukułczanka, Lidia Ratajczak,

Acteoside and related phenylethanoid glycosides in Byblis liniflora. Plants

propagated in vitro and its systematic significance. Acta Societatis

Botanicorum Poloniae, 2004, 73, 9-15.

118. Takamasa Ohno, Makoto Inoue, Yukio Ogihara, Iclal Saracoglu,

Antimetastatic activity of acteoside, a phenylethanoid glycoside. Biol Pharm

Bull. 2002, 25(5), 666-668.

119. Kyoung Hee Kim, Sungun Kim, Mn Young Jung, In Hye Ham, Wan Kyunn

Whang, Anti-inflammatory phenylpropanoid glycosides from Clerodendron

trichotomum leaves.Arch Pharm Res. 2009, 32(1):7-13.

120. Hirimi Kobayashi, Hiroko Oguchi, Nobuo Takizawa, Miyase T., Ueno A.,

Usmanghani K., Ahmad M., New phenylethanoid glycosides from Cistanche

tubulosa (Schrenk) Hook. f. I. Chem. Pharm. Bull., 1987, 35, 3309-3314.

121. Chae S, Kim JS, Kang KA, Bu HD, Lee Y, Seo YR, Hyun JW, Kang SS,

Antioxidant activity of isoacteoside from Clerodendron trichotomum, J

Toxicol Environ Health A. 2005, 68(5):389-400.

122. Hongwei Gao, Yankun Cui, et al.,, Isoacteoside, a dihydroxyphenylethyl

glycoside, exhibits anti-inflammatory effects through blocking toll-like

receptor 4 dimerization, Br J Pharmacol. 2017, 174(17), 2880-2896.

123. Hiroaki Nishimura, Hirosho Sasaki, Takashi Morota, Chin M., Mitsuhashi H.,

Six glycosides from Rehmannia glutinosa var. purpurea., Phytochemistry,

1990, 29, 3303-3306.

124. Tayfun Ersöz, Berkman MZ, Deniz Tasdemir, Ireland CM, Calis I. An iridoid

glucoside from Euphrasia pectinata. J Nat Prod., 2002, 26, 179–88.

125. Shizuka Kitagana, Hiroki Tsukamoto, Hisada S., Nishibe S., Studies on the

Chinese Crude Drug “Forsythiae Fructus”. VII A new cafeoyl glycosides from

Forsythia viridissima., Chem. Pharm. Bull., 1984, 32, 1209 – 1213.

126. Takeshi Deyama, Kobayashi(Late), Sansei Nishibe, P. Tu, Isolation, Structure

Elucidation and Bioactivities of Phenylethanoid Glycosides from Cistanche,

Forsythia and Plantago Plants, Studies in Natural Products Chemistry, 2006,

145

33, 645-674.

127. Yadav JP, Vedpriya Arya, Yadav S, Panghal M, Kumar S, Dhankhar S, Cassia

occidentalis L.: A review on its ethnobotany, phytochemical and

pharmacological profile. Fitoterapia, 2010, 81, 223-230.

128. Natalia Mishchenko, Stepanenko LS, Krivoshchekova OE, and Maksimov

OB, Anthraquinones of the Lichen Asahinea chrysantha. Translated from

Khimiya Prirodnykh Soedinenii, 1980, 2, 160-165.

129. Luc Pieters, Sheila Maregesi, Sandra Apers, Arnold Vlietinck, Isolation and

Structure Elucidation of Anthraquinones from Barleria eranthemoides

(Acanthaceae). Planta Med., 2006, 72, 5.

130. Yan Bin Wu, Chengjeng Zheng, Qin LP, Sun LN, Han T, Jiao L, Zhang QY,

Wu JZ Antiosteoporotic Activity of Anthraquinones from Morinda officinalis

on Osteoblasts and Osteoclasts. Molecules, 2009, 14 (1), 573-583.

131. Derek V. Banthorpe, John J. White, Novel anthraquinones from

undifferentiated cell cultures of gallium verum, Phytochemistry, 1995, 38 (1),

107 – 111

132. R.Wijnsma, J.T.K.A.Go, P.A.A.Harkes, R.Verpoorte, A.Baerheim, Svendsen,

Anthraquinones in callus cultures of Cinchona pubescens, Phytochemistry,

1986, 25 (5), 1123-1126.

133. Zhang Hai-Long, Zhang Qing-Wen, Zhang Xiao-Qi, Ye Wen-Cai, Wang Yi-

Tao, Chemical Constituents from the Roots of Morinda officinalis, Chinese

Journal of Natural Medicines, 2010, 8 (3), 1−4

134. Mohamed A. El-Raey, Gamil E. Ibrahim, Omayma A. Eldahshan. Lycophene

and Lutein. A review for their Chemistry and Medicinal Uses. Journal of

Pharmacognosy and Phytochemistry, 2013, 2, 245-254.

135. Rothermel and Kutuzov, Andrew and Mikhail. "Benefits of Lutein and

Zeaxanthin intake in patients with Age-Related Macular Degeneration,

Retinitis Pigmentosa and Cataracts". Journal of Physiology and

Pharmacology Advances, 2015, 3, 12-17.

136. Changfu Wang, Ping Xin, Youzhi Wang, Xuegang Zhou, Donghua Wei,

Chengjie Deng, Shiqin Sun, Iridoids and sfingolipids from Hedyotis diffusa,

Fitoterapia, in press, corrected proof, Available online 6 November 2017,

146

doi.org/10.1016/j.fitote.2017.11.004

137. Olga Tzakoua, Philippos Mylonas, Constantinos Vagias and Panos V.

Petrakis, Iridoid Glucosides with Insecticidal Activity from Galium

melanantherum. Z. Naturforsch. 2007, 62 c, 597-602.

138. Trinh Thi Thuy, Tran Van Sung, Nguyen Thi Hao, Chemical constituents of

Fissistigma pallens. Vietnam Journal of Chemistry, 2006, 44, 412-417.

139. King, F. W. and Acheson, Jouranl of chemistry society, 1950, 168.

140. Ajeng Diantini, Anas Subarnas, Keri Lestari, et al, Kaempferol-3-O-

rhamnoside isolated from the leaves of Schima wallichii Korth inhibits MCF-7

breast cancer cell proliferation through activation of the caspase cascade

pathway. Oncol Lett., 2012, 3, 1069–1072.

141. Yi-Wen Mao, Hsiang-WenTseng, Wen-Li Liang et al, Anti-inflammatory and

free radial scavenging activities of the constituents isolated from Machilus

zuihoensis. Molecules, 2011, 16, 9451–9466.

142. Kai-Chang Zhu, Jian-Mei Sun, Jian-Guo Shen, Ji-Zhong Jin, Feng Liu,

Xiao-Lin Xu, Lin Chen, Lin-Tao Liu, Afzelin exhibits anti-cancer activity

against androgen-sensitive LNCaP and androgen-independent PC-3 prostate

cancer cells through the inhibition of LIM domain kinase 1, Letters, 345,

2359-2365.

143. Derek Gutzeit, Victor Wray, Peter Winterhalter, Gerold Jerz, Preparative

Isolation and Purification of Flavonoids and Protocatechuic Acid from Sea

Buckthorn Juice Concentrate (Hippophaë rhamnoides L. ssp. rhamnoides) by

High-Speed Counter-Current Chromatography. Chromatographia, 2007, 65:

1-7.

144. Tasaki Kubota, T. Hase, J. Inst. Polytech., Osaka City Univ. Ser. C., 1956, 5,

49.

145. P. K. Agrawal, Carbon-13 NMR of Flavonoids. Elsevier publisher, 1989, 25-

28.

146. Naif Abdullah Al-Dhabi, Mariadhas Valan Arasu, Chang Ha Park, and Sang

Un Park, An up-to-date review of rutin and its biological and pharmacological

activities, Excli Journal. 2015; 14: 59–63.

147. Rosa Tundis, Monica Loizzo, Bonesi M, Menichini F, Statti GA, Menichini F,

147

In vitro cytotoxic activity of Salsola oppositifolia Desf. (Amaranthaceae) in a

panel of tumour cell lines, Z Naturforsch C. 2008, 63(5-6):347-54.

Documents

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA …gust.edu.vn/media/26/uftai-ve-tai-day26217.pdfLỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của