1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Senyawa flavanoid merupakan senyawa fenol yang paling banyak

ditemukan di alam dan jenisnya sangat beragam. Senyawa ini termasuk dalam

metabolit sekunder, dan dikenal memiliki aktivitas biologis yang menarik, antara

lain sebagai antioksidan, antimakanan serangga (Yogesh S. Nalwar,2009:123),

antiinflamasi, antibakteri, anti jamur, dan anti kanker (NY Sreedhar,2010:480).

Kalkon (1,3-difenilpropen-1-on) merupakan senyawa yang termasuk

dalam famili flavonoid dan banyak di teliti sebagai therapeutic, khususnya

sebagai obat antitumor. Bahkan disebutkan oleh karena aktivitasnya sebagai ”high

therapeutic index”, kalkon di anggap sebagai ”the new era of medicines ” dalam

kapasitasnya sebagai antitumor, antibakterial, dan anti-inflamatory (Afzal S., et

al., 2008).

Penyebaran senyawa kalkon di alam sangat terbatas dan hanya

ditemukan pada beberapa golongan tumbuhan dalam jumlah yang sedikit. Hal ini

disebabkan kalkon memiliki peranan yang penting dalam pembuatan turunan

flavonoid karena berfungsi sebagai zat antara. Kalkon biasanya langsung berubah

menjadi flavanon maupun turunan flavonoid yang lain. Oleh karena aktivitas

biologi dan potensi senyawa ini sangat bermanfaat bagi pengembangan obat,

maka perlu adanya upaya pengembangan sintesis senyawa kalkon dan derivatnya.

Penelitian sintesis senyawa kalkon pada awalnya dipelopori oleh Perkin

dan Robinson (Diedrich, 1962:1054-1062). Perkembangan selanjutnya

membuktikan bahwa senyawa kalkon merupakan isomer dari senyawa flavanon,

dan isomeri dapat dilakukan dengan cara menambahkan asam atau basa (Mabry,

1975 : 561). Suasana asam atau basa berpengaruh terhadap terhadap kecepatan

reaksi dan rendemen senyawa hasil sintesis. Beberapa senyawa sebagai bahan

dasar sintesis senyawa kalkon menyebabkan reaksi sukar terjadi jika dilakukan

dalam suasana basa, tetapi reaksinya mudah berlangsung jika dalam suasana asam

(Sykes, 1989 : 196).

2

Indyah Sulistyo Arty, dkk. (2000), berhasil mensintesis beberapa

senyawa mono para-hidroksi kalkon yang mengandung substituen hidroksil,

metoksi, tersier butil, fluoro dan kloro. Sintesis tersebut dilakukan dalam suasana

asam atau menggunakan katalis asam. Berdasarkan uji aktivitas penghambatan

lipid peroksidasi non enzimatis, dan aktivitas penghambatan siklooksigenase,

senyawa-senyawa hasil sintesis tersebut menunjukkan sangat poten sebagai

antioksidan (Indyah Sulistyo Arty, 2007). Penelitian lebih lanjut berkaitan dengan

potensinya sebagai antikanker menunjukkan bahwa senyawa dengan substituen

hidroksil dan fluoro ini bersifat sitotoksik pada sel HeLa, sel Raji dan sel T47D,

dan efek sitotoksis tertinggi pada sel HeLa (Indyah Sulistyo Arty, 2010 dan Retno

Arianingrum, dkk., 2011). Pada sel T47D, senyawa mono para hidroksi kalkon

dengan substituen hidroksil bersifat antiproliferasi dengan menekan viabilitas sel

dan mempengaruhi siklus sel (Retno Arianingrum, dkk, 2012). Sejauh ini sintesis

senyawa derivat kalkon dengan substituent bromo belum dilakukan. Eksplorasi

senyawa derivat kalkon melalui sintesis ini diharapkan dapat memperoleh

senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on yang

berpotensi sebagai antioksidan dan antikanker.

B. Batasan dan Rumusan Masalah

Penelitian ini dibatasi untuk mensintesis derivat kalkon dengan

substituen bromo, yaitu senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-

2-propen-1-on dan menguji potensinya sebagai antioksidan dan antikanker.

Dengan demikian rumusan masalah dalam penelitian ini adalah :

1. Bagaimana karakteristik senyawa mono para hidroksi kalkon bersubstituen

bromo hasil sintesis dari bahan dasar 4-bromoasetofenon dan vanilin dengan

katalis asam analisis serapan sinar UV-Vis, IR dan 1H-NMR ?

2. Bagaimana aktivitas senyawa mono para hidroksi kalkon bersubstituen bromo

hasil sintesis sebagai antioksidan ?

3. Bagaimana aktivitas senyawa mono para hidroksi kalkon bersubstituen bromo

hasil sintesis sebagai antikanker pada cancer cell lines sel HeLa

3

C. Tujuan Penelitian

Secara garis besar penelitian ini bertujuan untuk mengeksplorasi

senyawa derivat kalkon yang berpotensi sebagai antioksidan dan antikanker

melalui reaksi aldol silang dalam suasana asam. Sedangkan tujuan khususnya

meliputi :

1. Mensintesis senyawa mono para hidroksi kalkon bersubstituen bromo dengan

bahan dasar 4-bromoasetofenon dan vanilin dengan katalis asam, dan

menentukan karakteristiknya dengan serapan sinar UV-Vis, IR dan 1H-NMR.

2. Mengkaji aktivitas senyawa mono para hidroksi kalkon bersubstituen bromo

hasil sintesis sebagai antioksidan

3. Mengkaji aktivitas senyawa aktivitas senyawa mono para hidroksi kalkon

bersubstituen bromo hasil sintesis sebagai antikanker pada cancer cell lines sel

HeLa

D. Rencana/Disain Pelaksanaan Penelitian

Ruang lingkup penelitian yang akan dilakukan meliputi sintesis senyawa

mono para hidroksi kalkon dengan substituen bromo dengan cara kondensasi aldol

silang, dilanjutkan dengan melakukan uji aktivitas antioksidan dengan

menggunakan DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) dan uji aktivitas sitotoksik

terhadap sel HeLa dengan metode MTT.

Kegiatan penelitian ini direncanakan akan selesai dalam waktu 6 (enam)

bulan, dengan kegiatan penelitian meliputi : (1) sintesis senyawa mono para

bersubstituen bromo dari 4-bromoasetofenon dan vanilin melalui reaksi

kondensasi aldol silang dalam suasana asam; (2) uji aktivitas antioksidan senyawa

hasil sintesis dengan menggunakan DPPH dengan metode Chow dan (3) uji

aktivitas sitotoksis senyawa hasil sintesis dengan metode MTT, sebagaimana

jadwal pada Tabel 1.

E. Hasil/Sasaran yang Direncanakan

Hasil yang diharapkan dari penelitian ini adalah diperoleh :

1. senyawa mono para hidroksi kalkon dengan substituen bromo, yaitu 1-(4’-

bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on

4

Tabel 1. Jadwal penelitian

No. Kegiatan Bulan ke -

1 2 3 4 5 6

1 Seminar proposal

2. Sintesis senyawa mono para

hidroksi kalkon

3. Karakterisasi senyawa

4. Uji aktivitas antioksidan

5. Uji sitotoksisitas terhadap sel

HeLa

6. Analisis data

7. Pembuatan laporan

8. Seminar Hasil

9. Penulisan artikel & publikasi

2. informasi tentang aktivitas antioksidan dan sifat toksisitas terhadap cancer cell

lines HeLa dari senyawa hasil sintesis.

3. manuskrip untuk dipublikasikan pada seminar nasional/internasional atau

jurnal terakreditasi nasional atau jurnal internasional.

Selanjutnya, senyawa hasil sintesis diharapkan dapat digunakan sebagai

lead compoud (model) pada industri farmasi dan dapat dikembangkan sebagai

obat antikanker baru yang poten dan aman. Target hasil/luaran yang diharapkan

disajikan pada gambar 1.

Gambar 1. Bagan tahapan penelitian dan hasil yang ditargetkan

Tahapan Hasil/Luaran

Sintesis senyawa mono para

hidroksi kalkon bersubstituen

Bromo Karakterisasi senyawa

Uji antioksidan Uji sitotoksisitas terhadap sel

HeLa

Pembuatan laporan

Penulisan artikel & publikasi

Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on

Data tentang titik leleh, kemurnian, data

spektra UV-Vis, IR dan 1H-NMR

Data aktivitas antioksidan Data sitotoksik

Laporan, seminar

Artikel penelitian (Publikasi)

5

BAB II

KAJIAN PUSTAKA

A. Reaksi Kondensasi Aldol

Kondensasi aldol merupakan reaksi organik antara dua molekul aldehida

atau satu molekul aldehida dengan satu molekul keton menghasilkan senyawa

aldol. Reaksi aldol dapat berjalan melalui dua mekanisme yaitu mekanisme enol

yang menggunakan katalis asam kuat dan mekanisme enolat yang menggunakan

katalis basa kuat (Wade, L.G,2006:1041-1063).

Reaksi kondensasi aldol silang yang melibatkan penggunaan senyawa

aldehida aromatis dan senyawa alkil keton atau aril keton sebagai reaktannya

menghasilkan senyawa α,β-keton tak jenuh dikenal sebagai reaksi Claisen-

Schmidt. Reaksi ini melibatkan ion enolat dari senyawa keton yang bertindak

sebagai nukleofil untuk menyerang karbon karbonil senyawa aldehida aromatis

menghasilkan senyawa -hidroksi keton, yang selanjutnya mengalami dehidrasi

menghasilkan senyawa ,-keton tak jenuh (Bruice, 2007). Pada reaksi

kondensasi antara 4-bromoasetofenon dan vanilin dengan katalis asam, senyawa

4-bromoasetofenon akan mengalami tautomerasi dari bentuk keto menjadi bentuk

enol yang bersifat nukleofilik pada karbon-α. Katalis asam juga menyebabkan

karbonil pada vanilin akan terprotonasi dan bersifat elektrofilik. Enol dari 4-

bromoasetofenon yang bersifat nukleofil akan menyerang vanilin yang

terprotonasi membentuk senyawa aldol yang selanjutnya mengalami dehidrasi

menghasilkan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-

1-on. Mekanisme reaksinya ditunjukkan seperti pada gambar 2.

B. Potensi Senyawa Derivat Kalkon Sebagai Antioksidan dan Antikanker

Kalkon merupakan senyawa keton aromatik yang menjadi pusat inti dari

berbagai senyawa biologi penting. Senyawa ini mengandung dua cincin aromatik

dengan rantai tak jenuh, dan menunjukkan aktivitas menarik sebagai antioksidan,

antibakteri, antijamur, kemopreventif, antivirus, antiprotozoal, sifat insektisida,

6

antikanker, dan anti-inflamasi (Isa, et al, 2012; Kiat, et.al., 2006; Dimmock JR,

et.al; 1999, dan Nerya, 2004).

Gambar 2. Mekanisme Reaksi Claisen-Schmidt antara 4-bromoasetofenon dan

Vanilin dengan Katalis Asam

Berdasarkan studi penelusuran literatur menunjukkan bahwa senyawa

kalkon banyak di teliti sebagai therapeutic, khususnya sebagai obat antitumor

(Afzal S., et al., 2008). Disebutkan pula bahwa sebagian besar target utama dari

senyawa-senyawa kalkon adalah mempengaruhi siklus sel (cell cycle)

(Boumendjel, A., Ronox X., and Boutonnat, J., 2009).

Upaya-upaya untuk melakukan eksplorasi senyawa kalkon sebagai

antikanker telah dilakukan, baik dengan isolasi senyawa dari bahan alam maupun

sintesis. Diantaranya empat senyawa flavon dan kalkon glikosida baru berhasil

7

diisolasi dari ekstrak metanol bunga Helichrysum arenarium, keempat senyawa

tersebut memiliki aktivitas menghambat tumor necrosis faktor- (TNF-)-

induced citotoxixity pada sel L929 (Gambar 3). TNF- sangat berperan dalam

pengaturan mekanisme apoptosis (Toshio M, et. Al., 2009).

Gambar 3. Senyawa-senyawa Flavon dan Kalkon Glikosida dari Helichrysum

arenarium, yang memiliki Aktivitas menghambat TNF- pada Sel

L929.

Beberapa senyawa kalkon hasil sintesis diantaranya : Trans-4-lodo,4-

boranyl-chalcone memiliki aktivitas antitumor terhadap malignant glioma cell

lines secara in vitro dan in vivo (Sasayama, T., et al., 2007); senyawa 4-dihydroxy-

6-methoxy-3, 5-dimethylchalcone bersifat antitumor terhadap enam cancer cell

lines secara invitro (Ye, C.L., et al., 2004); senyawa 2, 4-dihydroxy-6-methoxy-3,

5-dimethylchalcone memiliki aktivitas antitumor terhadap ”solid human

carcinoma xenograft model”. secara invivo (Ye, C.L., et al., 2005). Tidak kalah

menariknya adalah senyawa 2-hydroxy-4-methoxychalcone yang memiliki

aktivitas anti-angiogenic dan antitumor (Lee, Y.S, et. Al., 2006).

8

Indyah Sulistyo Arty, dkk. (2000), berhasil mensintesis beberapa

senyawa mono para-hidroksi kalkon yaitu : (a) 3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-1-

fenil-2-propen-1-on atau MPHK A ; (b) 3-(4’-hidroksi-3’-metoksifenil)-1-(4”-

metoksifenil)-2-propen-1-on atau MPHK B; (c) 1-(4”-fluorofenil)-3-(4’-hidroksi-

3’-metoksifenil)-2-propen-1-on atau MPHK C; (d) 3-(3’, 5’-ditersierbutil-4’-

hidroksifenil)-1-(4”-fluorofenil)-2-propen-1-on atau MPHK D, dan (e) 3-(3’,5’-

ditersierbutil-4’-hidroksifenil)-1-(4”-kloro-fenil)-2-propen-1-on atau MPHK E

(gambar 4). Berdasarkan uji aktivitas penghambatan lipid peroksidasi non

enzimatis, dan aktivitas penghambatan siklooksigenase, senyawa-senyawa ini

menunjukkan sangat poten sebagai antioksidan. Pada beberapa senyawa golongan

terpenoid, adanya aktivitas antiinflamasi, antimutagenik dan antioksidan yang

dimiliki dapat memacu apoptosis dan menekan karsinogenesis yang di picu oleh

bahan kimia (Xu et al., 2007).

Kode

Senyawa

Warna Rendemen Titik

Lebur

(oC)

R1 R2 R3 R4 R5 R6

MPHK A Kuning 37 85-90 CH3O OH H H H H

MPHK B Kuning 34 161 - 164 CH3O OH H CH3O H H

MPHK C Kuning 36 94 - 97 CH3O OH H F H H

MPHK D Kuning 69 125 - 127 t-Bu OH t-Bu F H H

MPHK E Kuning 30 123 - 124 t-Bu OH t-Bu Cl H H

Gambar 4. Senyawa-senyawa Mono Para-Hidroksi Kalkon Hasil Sintesis dari

Derivat Benzaldehida dan Asetofenon atau Derivatnya melalui Reaksi

Kondensasi Aldol Silang dalam Suasana Asam (Indyah Sulistyo Arty.

dkk., 2000).

9

Hasil uji sitotoksisitas dari senyawa tersebut terhadap sel HeLa dan sel

Raji menunjukkan bahwa senyawa MPHK A dan MPHK C memiliki aktivitas

sitotoksik dalam menghambat pertumbuhan sel HeLa dan sel Raji (Tabel 2)

(Indyah Sulistyo Arty, 2009). Penelitian lebih lanjut terhadap senyawa MPHK A

menunjukkan bahwa senyawa ini bersifat sitotoksik pada sel kanker payudara

T47D, serta tidak bersifat sitotoksik terhadap sel normal Vero (Retno

Arianingrum, dkk.,2010). Pada sel T47D, senyawa MPHK A bersifat

antiproliferasi dengan menekan viabilitas sel, dan mempengaruhi daur sel (Retno

Arianingrum, dkk, 2012).

Tabel 2. Nilai IC50 Senyawa –senyawa MPHK terhadap sel HeLa dan Sel Raji

Kode

Senyawa IC50 (g/mL)

Sel HeLa Sel Raji

MPHK A 16, 08 36,44

MPHK B 147,43 468, 92

MPHK C 13, 37 30, 46

MPHK D - 98,74

MPHK E 576,63 110,97

10

BAB III

METODE PENELITIAN

.

A. Alat dan Bahan

Penelitian di awali dengan mempersiapkan alat dan bahan yang

digunakan pada setiap tahap penelitian, yang meliputi sintesis dan pemurnian

senyawa, uji aktivitas antioksidan, dan uji aktivitas antikanker.

1. Sintesis dan Pemurnian Senyawa

Alat yang digunakan : spektrofotometer UV 2400PC, spektrofotometer

Infra Merah (Shimadzu FTIR Prestige 21), spektrofotometer 1H-NMR (1H-NMR,

Jeol JNM-MY 500), plat KLT silica Gel 60 GF254 (Merck), varian Cary 100

Conc untuk mengukur spektrum ultraviolet (UV), seperangkat alat refluk,

peralatan gelas untuk sintesis

Bahan yang digunakan: 4-bromoasetofenon, vanilin, NaOH, etanol,

akuades, n-Heksana, etilasetat, H2SO4 pekat, kristal NaCl, CaCl2 anhidrat, dan gas

nitrogen.

2. Uji Aktivitas Antioksidan

Alat yang digunakan adalah spektrofotometer UV-Vis, flakon,

mikropipet, vorteks, timbangan elektrik, eppendorft, dan tip.

Bahan yang digunakan meliputi 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH), metanol,

asam aspartat, dan BHT .

3. Uji Aktivitas Antikanker

Alat yang digunakan : tangki nitrogen cair, mikroskop fase kontras,

penangas air, sentrifuge, inkubator CO2 , incubator, ELISA (Enzyme Linked

Immunosorbent Assay) reader, hemocytometer (New Bauer), tabung conical

steril, scraper, tissue culture flask, ampul, plate, laminar airflow, pH meter,

mikroplate 96 sumuran, mikropipet, vorteks, timbangan elektrik, eppendorft,

pipet, dan tip.

11

Bahan yang digunakan : Cell line cancer Sel HeLa, Medium Rosewell

Park Memorial Institut (RPMI) 1640 (GIBCO BRL), medium penumbuh

mengandung growth factor 10% dan 20% FBS (Fetal Bovine Serum) (Sigma

Chem. CO. St. Louis. USA), DMSO (Dimetil Sulfoksida), natrium karbonat

(E.Merck), kertas saring 0,2 m, akuades, fungizon dan antibiotik penisilin dan

streptromisin (Sigma Chem. CO. St. Louis. USA), hepes dan tripsin (Sigma

Chem. CO. St. Louis. USA). PBS (Phospat Buffer Saline), MTT (3-(4,5-dimetil

tiazol-2-yl)-2,5-difenil tetrazolium bromida), dan SDS (Sodium duodecyl

sulphate)10% dalam HCl 0,01 N.

B. Prosedur Penelitian

1. Sintesis dan Pemurnian Senyawa

Alat refluk yang terdiri dari labu leher tiga, erlenmeyer dilengkapi

dengan magnetic stirrer dirangkai dan dihubungkan dengan gas nitrogen. Kristal

NaCl di masukkan ke dalam erlenmeyer dengan ketebalan 1 cm. Senyawa 4-

bromoasetofenon 0,012 mol (2,40 g) dan vanilin 0,01 mol (1,52 g) di masukkan

dalam labu leher tiga kemudian diaduk. Selanjutkan kran gas nitrogen dibuka dan

dialirkan ke dalam campuran. Sebanyak 15 ml larutan H2SO4 pekat ditetes-

teteskan pada kristal NaCl agar terbentuk gas HCl. Campuran diaduk dalam labu

leher tiga selama 7,5 jam dengan dialiri gas HCl dan gas nitrogen. Sisa gas HCl

yang keluar ditangkap dengan kristal CaCl2 anhidrat. Hasil pengadukan

didiamkan semalam, kemudian dituangkan ke dalam erlenmeyer yang berisi

akuades dingin sambil diaduk dengan magneticstirrer hingga terbentuk endapan.

Endapan dicuci dengan akuades hingga pH netral dan disaring dengan penyaring

Buchner lalu dikeringkan. Kristal yang terbentuk direkristalisasi dengan pelarut

etanol-akuades dengan perbandingan 1:1. Larutan selanjutnya disaring filtratnya

dan didinginkan sampai terbentuk kristal kembali. Endapan hasil rekristalisasi

disaring dan dicuci dengan akuades. Endapan tersebut kemudian dikeringkan, lalu

ditimbang dengan menggunakan timbangan analitik. Titik leburnya ditentukan

dengan menggunakan melting point apparatus. Uji kemurnian dilakukan dengan

menggunakan KLT dan KLT Scanner menggunakan eluen campuran dua pelarut

12

organik yang sesuai. Struktur senyawa hasil sintesis diidentifikasi dengan

menggunakan spektrofotometer UV-Vis, IR dan 1H-NMR.

2. Uji Aktivitas Antioksidan

Uji aktivitas antioksidan secara kuantitatif dilakukan menggunakan

DPPH menurut metode Chow. Sampel dilarutkan dalam metanol dan dibuat

dengan beberapa variasi konsentrasi, yaitu 1,25; 2,5; 5; 10; dan 20 g/mL. Ke

dalam masing-masing larutan ditambahkan 0,1 mL DPPH 1 mM dan diinkubasi

pada suhu 37°C selama 30 menit, selanjutnya diukur pada panjang gelombang 515

nm. Sebagai blanko digunakan metanol dan DPPH 1mM. Untuk pembanding

digunakan BHT (konsentrasi 1,25; 2,5; 5; 10; dan 20 g/mL ) dan asam aspartat

3,125; 6,25; 12,5; 25 dan 50 g/mL. Persentase hambatan (%I) dihitung

berdasarkan {(serapan blanko-serapan sampel)/serapan blanko} x 100%. Nilai

hambatan dan konsentrasi sampel diplot masing-masing pada sumbu x dan y, dan

persamaan garis yang diperoleh digunakan untuk menghitung Inhibition

Concentration 50% (IC50).

3. Uji Sitotoksisitas

Uji sitotoksisitas sebagai antikanker dalam penelitian ini menggunakan

cell lines HeLa yang dikembangkan di laboratorium Parasit Kedokteran UGM.

Uji sitotoksisitas terhadap cell lines dilakukan dengan tahapan sebagai berikut :

a. Menumbuhkan cell lines dari penyimpanan dalam nitrogen cair

Sel beku dari nitrogen cair dibiarkan pada suhu kamar sampai mencair

sebagian, kemudian dimasukkan dalam tabung konikal 15 ml, dan ditambah 10 ml

media pencuci lalu dikocok. Setelah itu disentrifus 750 g selama 7 menit. Pelet

diambil ditambahkan dengan media kultur, kemudian sel dimasukkan dalam flask.

Semua kegiatan tersebut dilakukan secara aseptis dalam laminar laminar airflow.

Sel kemudian diinkubasi pada suhu 37oC dengan aliran CO2 5%. Perkembangan

sel diamati tiap hari dan jika media mulai menguning diganti dengan media baru.

Jika sel sudah tumbuh memenuhi flask, media pada sel HeLa dicuci

dengan PBS secukupnya. Selanjutnya sel dilepas dari dinding flask (scapper)

menggunakan 0,5 ml tripsin 0,05%. Flask dikocok perlahan sampai sel terlepas

13

semua. Suspensi sel diinkubasi 2-5 menit di inkubator CO2 pada 37oC.

Selanjutnya suspensi sel tersebut dimasukkan dalam tabung conical 15 ml dan

ditambahkan dengan media kultur sebanyak 5 ml. Jumlah sel dihitung dengan

hemocytometer, disuspensikan dalam media kultur sampai diperoleh kepadatan sel

1 x 104 sebanyak 100 L pada setiap sumuran. Selanjutnya diinkubasi selama 12

– 24 jam pada suhu 37oC di inkubator CO2.

b. Uji sitotoksisitas dengan MTT assay

Setelah sel konfluen, media kultur di dalam sumuran dibuang, dan sel

dicuci menggunakan 100 l PBS. Setelah PBS dibuang, setiap sumuran

dimasukkan 100 μl sampel yang dilarutkan dalam media kultur yang mengandung

DMSO 0,05% dengan berbagai konsentrasi menggunakan 3 kali ulangan.

Sumuran yang tersisa digunakan untuk kontrol positif yang berisi sel tanpa

penambahan sampel, dan kontrol negatif hanya mengandung media kultur.

Sebagai pembanding digunakan doksorubisin yang dikenal sebagai obat leukimia

akut, limfoma, dan sejumlah timor akut. Selanjutnya diinkubasi 12- 24 jam pada

suhu 37oC di inkubator CO2. Media sel dibuang dan dicuci dengan PBS 1x, dan

kemudian masing-masing sumuran ditambahkan 100 l media kultur yang

mengandung MTT (0,5 mg/ml). Kultur diinkubasi 4 jam pada suhu 37oC di

inkubator CO2. Selanjutnya ditambahkan 100 l pelarut formazan (SDS 10%), di

gojog pelahan dengan shaker selama 5 menit, dan diinkubasi 12-24 jam pada suhu

kamar dalam ruang gelap. Prosentase kematian dihitung berdasarkan hasil

perbandingan sel kontrol yang diukur serapan menggunakan ELISA reader pada

panjang gelombang 595 nm.

Selanjutnya dengan dari prosentase sel hidup dapat dihitung nilai

sitotoksisitasnya sebagai Inhibition concentration (IC50). Nilai IC50 menunjukkan

nilai konsentrasi yang menghasilkan kematian sel 50% hal ini menunjukkan

potensi ketoksikan suatu senyawa terhadap masing-masing sel. Nilai IC50

ditentukan dengan analisis probit yang diperoleh dari konversi prosentase

% Sel Hidup = (Absorbansi perlakuan-Absorbansi kontrol media) X 100%

(Absorbansi kontrol sel-Absorbansi kontrol media)

14

kematian ke dalam nilai probit, sedangkan nilai konsentrasi diubah ke dalam nilai

Log konsentrasi. Nilai IC50 merupakan nilai antilog pada nilai probit 50. Dengan

demikian dapat dikaji aktivitas sitotoksisitas dari senyawa bioaktif berdasarkan

prosentase kematian dan IC50

15

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Sintesis dan Pemurnian Senyawa

Hasil sintesis antara senyawa 4-bromoasetofenon dan vanillin diperoleh

senyawa berbentuk kristal berwarna kuning dengan berat sebesar 2,32 g dengan

rendemen hasil 69,83%. Senyawa ini mempunyai titik lebur 103-106oC (gambar

5 ).

Gambar 5. Data Senyawa Hasil Sintesis antara Senyawa 4-bromoasetofenon dan

Vanilin

Kromatogram kromatogrfi lapis tipis (KLT) hasil identifikasi senyawa

hasil sintesis antara senyawa 4-bromoasetofenon dan vanilin menggunakan

pelarut n-heksana dan etil asetat 7:3 ; kloroform dan n-heksana 5:1 ; serta

kloroform dan etil asetat 8:2 menunjukkan satu bercak noda hasil dengan harga

Rf (Retardation factor) yang berbeda dengan bahan dasar senyawa tersebut. Hal

ini menunjukkan bahwa senyawa hasil sintesis merupakan senyawa baru yang

berbeda dengan senyawa asal.

Pada penelitian ini penggunaan beberapa eluen dimaksudkan untuk

memperoleh pemisahan yang baik. Penggunaan eluen n-heksana dan etilasetat

dengan perbandingan 7:3 menghasilkan bercak noda yang tunggal dan tidak

berekor dengan harga Rf mak sebesar 0,79. Pada penggunaan eluen kloroform

dan n-heksana dengan perbandingan 5:1 menghasilkan bercak noda yang tunggal

dan berekor dengan harga Rf max sebesar 0,47; dan penggunaan eluen kloroform

dan etilasetat dengan perbandingan 8:2 menghasilkan bercak noda yang tunggal

dan berekor dengan harga Rf max sebesar 0,82. Pemisahan yang baik untuk

16

menentukan kemurnian senyawa adalah bila dihasilkan bercak noda yang tunggal,

tidak berekor, dan mempunyai harga Rf berkisar antara 0,2-0,8. Oleh karena itu

untuk menentukan prosentase kemurnian digunakan eluen n-heksana dan etilasetat

dengan perbandingan 7:3.

Hasil KLT Scanner pada kromatogram menggunakan eluen campuran n-

heksana dan etilasetat dengan perbandingan 7:3 (gambar 6) menunjukkan bahwa

senyawa hasil sintesis mempunyai kemurnian yang cukup tinggi, yaitu sebesar

98,88%.

Gambar 6. Kromatogram Hasil KLT Scanner pada kromatogram

Data spektrum UV senyawa hasil sintesis menunjukkan adanya serapan

pada panjang gelombang 202,5 nm, 268,5 nm, dan 368 (Gambar 7). Pada umumnya

senyawa kalkon memiliki rentangan serapan spektrum UV pada pita I (unit sinamoil)

di daerah 340-390 nm dan pita II (unit benzoil) di daerah 230-270 nm. Dengan

demikian serapan yang muncul pada spektrum hasil sintesis berada pada rentang

serapan senyawa kalkon yaitu serapan dengan panjang gelombang 368 nm berada

pada rentang serapan yang berasal dari pita I, dan serapan dengan panjang gelombang

268,5 nm berasal dari serapan pita II senyawa kalkon.

17

Gambar 7. Spektra UV Senyawa Hasil Sintesis

Spektrum IR senyawa hasil sintesis (Gambar 8, Tabel 3, dan Lampiran)

menunjukkan adanya serapan dengan intensitas sedang pada daerah 1643,35 cm-1

dari gugus karbonil (C=O) keton. Frekuensi serapan karbonil keton normal

muncul pada 1715 cm-1

dengan intensitas kuat dan tajam. Perbedaan frekuensi

serapan ini terjadi karena terikatnya ikatan rangkap yang terkonjugasi dengan

gugus karbonil. Serapan pada daerah 1512,19 cm-1

dengan intensitas sedang

menunjukkan adanya C=C aromatik. Serapan dengan intensitas kuat pada daerah

1581,63 cm-1

menunjukkan adanya C=C vinil, yang diperkuat dengan munculnya

serapan C-H vinil/aromatik pada 3016,67 cm-1

. Serapan yang melebar pada

3387,00 cm-1 merupakan serapan serapan dari gugus –OH fenol, dan serapan

sedang pada daerah 1273,02 cm-1

menunjukkan adanya gugus C-O fenol.

18

Gambar 8. Spektra IR Senyawa Hasil Sintesis

Tabel 3. Data Spektrum IR Senyawa Hasil Sintesis

19

Spektrum 1H-NMR senyawa hasil sintesis (Gambar 9, Tabel 4 dan

Lampiran) muncul sinyal pada daerah 3,95 (3H, s) ppm merupakan sinyal proton

pada -OCH3, sinyal pada daerah 6,02 (1H, s) ppm menunjukkan proton pada –

OH. Sinyal pada daerah 7,31 (1H, d, 15,5 Hz) ppm dan 7,75 (1H, d, 15,5 Hz) ppm

merupakan sinyal dari proton pada C=C vinil pada posisi trans, yang ditunjukkan

dengan besarnya tetapan penggabungan J. sinyal pada daerah 6,95 (1H, d, 7,8 Hz)

ppm, 7,11 (1H, d, 2,0 Hz) ppm, dan 7,21 (1H, dd, 2,0;7,8 Hz) ppm merupakan

sinyal proton dari cincin aromatik pita I pada posisi 5, 2, dan 6. Proton pada cincin

aromatik muncul sebanyak tiga sinyal dikarenakan adanya substitusi gugus lain

pada posisi 3 dan 4, sehingga terjadi perubahan lingkungan elektronik. Proton

pada posisi 6 selain berinteraksi dengan proton pada posisi 5, juga berinteraksi

dengan proton pada posisi 2 sehingga muncul sebagai double doublet. Sinyal pada

daerah 7,63 (2H, d, 8,4 Hz) ppm merupakan sinyal proton dari cincin aromatik

pita II pada posisi 3’ dan 5’. Sedangkan sinyal pada daerah 7,87 (2H, d, 8,4 Hz)

merupakan sinyal proton dari cincin aromatik pita II pada posisi 2’ dan 6’.

Substitusi gugus lain pada posisi 4’ menyebabkan proton pada posisi 3’ dan 5’

muncul sebagai satu sinyal karena memiliki lingkungan elektronik yang sama,

demikian juga yang terjadi pada proton posisi 2’ dan 6’

Tabel 4. Data Spektrum 1HNMR

20

Gambar 9. Spektrum 1HNMR Senyawa Hasil Sintesis

21

Hasil analisis 13

C dan HMBC disajikan pada Tabel 5. Berdasarkan hasil

analisis dapat diperkirakan struktur senyawa hasil sintesis sebagaimana pada

gambar 10, yaitu merupakan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on.

Gambar 10. Struktur Senyawa Hasil Sintesis

Tabel 5. Hasil Analisis Senyawa Hasil Sintesis Berdasarkan data NMR : 13

C, 1H,

dan HMBC

No karbon δC δH (jumlah H, m,

J Hz)

HMBC (H→C)

1 189,6 -

2 119,2 7,31 (1H,d, 15,5) C1; C1’; C4

3 145,9 7,74 (1H,d, 15,5) C1; C4

4 127,4 -

5 123,7 7,21 (1H,dd,2,0;

7,8)

C9; C3; C7

6 115,1 6,95 (1H, d, 7,8) C4; C8

7 148,7

OH

-

6,02

-

C6; C7

8 147,0

56,2

(OCH3)

-

3,95 (3H,s)

9 110,2 7,11 (1H,d,2,0) C6; C5; C7; C3;

1’ 127,8 -

2’; 6’ 130,1 7,89 (2H, d, 8,4) C1; C1’

3’; 5’ 131,9 7,63 (2H,d, 8,4) C1’; C4’

4’ 137,3 - -

O

Br

OH

OCH3

H

H

H

H

H

H

H

H

H189,6

119,2

145,9

7,31

7,74

127,8

123,7

7,21

7,11

110,2

147

56,2

3,95

148,7

6,02115,1

6,95

127,4

130,1

7,89

7,63

131,9

137,3

131,9

7,63

7,89

130,11

2

3

4

56

7

1'

2'

4'

22

B. Uji Antioksidan

Pada penelitian ini uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode

DPPH menurut Chow et,al (2003). Kelebihan metode ini adalah memiliki

sensitifitas yang tinggi dan membutuhkan jumlah sampel yang sedikit.

Pengukuran aktivitas antioksidan sampel dilakukan pada panjang gelombang 515

nm yang merupakan panjang gelombang maksimum DPPH. Adanya aktivitas

antioksidan dari sampel mengakibatkan terjadinya perubahan warna pada larutan

DPPH dalam metanol yang semula berwarna ungu pekat menjadi kuning pucat.

Metode DPPH didasarkan pada kemampuan antioksidan untuk menghambat

radikal bebas dengan mendonorkan atom hidrogen. Prinsipnya adalah reaksi

penangkapan hidrogen oleh DPPH dari senyawa antioksidan yang mengubahnya

menjadi 1,1-difenil-2-pikrilhidrazin yang berwarna kuning (Gambar 11). Metode

ini menggunakan kontrol positif sebagai pembanding untuk mengetahui aktivitas

antioksidan sampel. Kontrol positif ini dapat berupa tokoferol, BHT, dan vitamin

C atau asam aspartat. Pada penelitian ini sebagai kontrol positif digunakan BHT

dan asam aspartat. Tingkat kekuatan antioksidan dengan metode DPPH

dikategorikan dalam beberapa tingkatan, yaitu sangat kuat, kuat, sedang, dan

lemah (Tabel 6)(Armala, 2009).

Gambar 11. Reaksi antara DPPH dengan Senyawa Antioksidan

23

Tabel 6. Tingkat Kekuatan Antioksidan dengan Metode DPPH

Intensitas Nilai IC50

Sangat kuat < 50 µg/mL

Kuat 50-100 µg/mL

Sedang 101-150 µg/mL

Lemah > 150 µg/mL

Pada penelitian ini diperoleh nilai IC50 dari BHT sebesar 6,29 μg/mL, dan

asam aspartat sebesar 2,43 μg/mL, sedangkan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-

hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on memiliki nilai IC50 sebesar 10,14 μg/mL

(Tabel 7 & Lampiran). BHT dan asam aspartat sebagai kontrol positif memiliki nilai IC50

yang lebih rendah dibanding senyawa hasil sintesis, namun senyawa ini merupakan

antioksidan yang sangat kuat, karena nilai IC50 kurang dari 50 μg/mL. Bila ditinjau dari

struktur senyawanya, aktivitas antioksidan ini kemungkinan besar berasal dari adanya

kontribusi gugus hidroksil dan bromide yang bersifat elektronegatif.

Tabel 7. Hasil Uji Antioksidan dari Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on terhadap DPPH dengan Kontrol Positif

BHT dan Asam Aspartat

No Sampel IC50 (μg/mL)

1 BHT 6,29

2 Asam Aspartat 2,43

3 Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on

10,14

C. Uji Sitotoksisitas

Berdasarkan perhitungan hasil uji sitotoksik menggunakan spss (Tabel 8

dan Lampiran) menunjukkan bahwa senyawa hasil sintesis, yaitu 1-(4’-

bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on berpotensi sebagai

antikanker, karena memiliki IC50 sebesar 9,6050 g/mL dan termasuk dalam

kategori sangat aktif. Semakin besar konsentrasi senyawa yang ditambahkan,

semakin menurun viabilitas sel HeLa.

24

Tabel 8. Data Absorbansi Hasil Uji Sitotoksik Senyawa Hasil Sintesis Terhadap

Sel HeLa

C Absorbansi Kontrol Blangko Viabilitas sel Rerata SD

(g/ml) 1 2 3 1 2 3

12 0.240 0.254 0.265 0.100 0.619 26.53 29.20 31.30 29.01 2.391215

10 0.399 0.397 0.380 0.101 0.599 56.87 56.49 53.24 55.53 1.992425

8 0.427 0.463 0.438 0.103 0.656 62.21 69.08 64.31 65.20 3.520635

6 0.429 0.447 0.443 0.101 0.625 62.60 66.03 65.27 64.63 1.803746

4 0.582 0.559 0.608 91.79 87.40 96.76 91.98 4.678493 2 0.608 0.585 0.586 96.76 92.37 92.56 93.89 2.480916

Gambar 12. Kurva Viabilitas Sel HeLa dengan Perlakuan Senyawa Hasil Sintesis 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on.

Pengamatan kematian sel dapat dilihat dari morfologi sel akibat

perlakuan senyawa. Sel yang mati akan kehilangan cairan sitoplasma karena

rusaknya membran sel, sehingga pada pengamatan mikroskop akan menunjukkan

warna hitam (gelap). Sebaliknya, pada sel hidup akan terlihat warna terang,

karena adanya cairan sitoplasma yang bersifat meneruskan cahaya dari

mikroskop. Pengamatan morfologi sel HeLa akibat pemberian senyawa 1-(4’-

bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on disajikan pada Gambar 11.

Nampak dari morfologinya, sel mengalami kematian dengan adanya perlakuan

penambahan senyawa hasil sintesis. Semakin banyak konsentrasi yang

ditambahkan, semakin banyak jumlah sel yang mengalami kematian.

IC50 = 9,6 g/mL

25

Gambar 13. Morfologi Sel HeLa: (A) tanpa perlakuan, dan dengan penambahan

senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on:

(B) 4 g/ml, (C) 6 g/ml, (D) 8 g/ml, (E) 10 g/ml, dan (F) 12 g/ml

F E D

S

C B A

26

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Reaksi antara 4-bromoasetofenon dan vanilin melalui kodensasi aldol silang

dengan katalis asam menghasilkan senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-

metoksifenil)-2-propen-1-on yang berbentuk kristal berwarna kuning dengan

rendemen 69,83% , titik lebur 103-106oC.

2. Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on meru-

pakan antioksidan yang sangat kuat dengan IC50 sebesar 10,14 g/mL

3. Senyawa 1-(4’-bromofenil)-3-(4-hidroksi-3-metoksifenil)-2-propen-1-on memi-

liki sifat sitotoksik yang sangat kuat terhadap cancer cell lines sel HeLa dengan

IC50 sebesar 9,6 g/mL sehingga berpotensi sebagai antikanker .

B. Saran

Perlu di lakukan lebih lanjut bagaimana mekanisme antikanker dari

senyawa senyawa mono para hidroksi kalkon bersubstituen bromo apakah dengan

mempengaruhi siklus sel atau dengan memacu apoptosis.

27

DAFTAR PUSTAKA

Afzal S., Asad M. K, Rumana Q. F, Ansari, Muhammad F. N, and Syed S. S.

2008. Redox Behavior of Anticancer Chalcone on a Glassy Carbon

Electrode and Evaluation of its Interaction Parameters with DNA, Int. J.

Mol. Sci. 2008, 9, 1424-1434

Armala, M. M. 2009. Daya Antioksidan Fraksi Air Ekstrak Herba Kenikir

(Cosmos caudatus H. B. K.) dan Profil KLT, Skripsi, 39, Fakultas Farmasi

Universitas Islam Indonesia, Yogyakarta.

Bruice, P.Y., 2007, Organic Chemistry, Fifth edition, New York

Boumendjel A, Ronot X, Boutonnat. 2009 . Chalcone derivatives acting as cell cycle

blockers : potensial anticancer drugs ? J Curr Drug Targets. Apr;10(4):363-71.

Chow ST, WW Chaw and YC Chung. 2003. Antioxidant Activity and Safety of

50 % Ethanolic Red Bean Extract (Phaseolus raditus L, Var Aurea).

Journal of Food Science. 2003; 68(1):21 – 5.

Diedrich, D. F. 1962. Some New Synthetic Flavanoid Glycosides Related in

Structure to Phlorizin. J. Med. Pharm. Chem, 1054-1062

Dimmock JR, Elias DW, Beazely MA, Kandepu NM. 1999. Bioactivities of

chalcones. Curr Med Chem ; 6: 1125-1149.

Indyah Sulistyo Arty, Henk T, Samhudi, Sastrohamidjojo, and Henk an der Goot.,

2000., Synthesis of benzylideneacetophenones and their inhibition of

lipidperoxidation., Eur. J., Med. Chem. 35, 449-457

Indyah Sulistyo Arty, A., 2007, Cyclooxygenase inhibitory activity of

benzilideneacetofenone analogue. Recent Development in Curcumin

Pharmacochemistry, Procedding of International Symposium on Recent

Progress in Curcumin Research, 11-12 September.

Indyah Sulistyo Arty, Synthesize and Citotoxicity Test of Several Compounds of

mono para hidroxy chalcone, 2010, Indo. J. Chem., 10 (1), 110-115

Isa NM, Abdelwahab SI, Mohan S, Abdul AB, Sukari MA, Taha MM, Syam S,

Narrima P, Cheah SC, Ahmad S, Mustafa MR.2012. In vitro anti-

inflammatory, cytotoxic and antioxidant activities of boesenbergin A, a

chalcone isolated from Boesenbergia rotunda (L.) (fingerroot), Braz J Med

Biol Res.

Kiat TS, Pippen R, Yusof R, Ibrahim H, Khalid N, Rahman NA. 2006. Inhibitory

activity of cyclohexenyl chalcone derivatives and flavonoids of fingerroot,

Boesenbergia rotunda (L.), towards dengue-2 virus NS3 protease. Bioorg

Med Chem Lett ; 16: 3337-3340.

Lee, Y.S.; Lim, S.S.; Shin, K.H.; Kim, Y.S.; Ohuchi, K.; Jung, S.H. 2006. Anti-

angiogenic and antitumoractivities of 2-hydroxy-4- methoxychalcone.

Biol. Pharm. Bull. 29, 1028-1031.

28

Mabry, T. J, K. R. Markham dan M. B. Thomas. 1975. The Systematic

Identification of Flavanoid. New York: Springer-Verlag New York Inc

Nerya O, Musa R, Khatib S, Tamir S, Vaya J. 2004. Chalcones as potent

tyrosinase inhibitors: the effect of hydroxyl positions and numbers.

Phytochemistry; 65: 1389-1395

NY Sreedhar. 2010. Synthesis and Characterization of 4-Hydroxy Chalcones

Using PEG-400 as a Recyclable Solvent. Research Journal of

Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 1 (4), 480-48

Retno Arianingrum, Indyah Sulityo Arty, dan Sri Atun, 2011, Uji Sitotoksisitas

Senyawa Mono Para Hidroksi Kalkon terhadap Cancer cell lines T47D,

Saintek Jurnal, UNY

Retno Arianingrum, Indyah Sulityo Arty, dan Sri Atun, 2012, Mono para hydroxy

chalcone inhibits the growth of breast cancer cell lines T47D and

influences its cell cycle arrest , International Conference on Biomedical

Science 27-28 Februari 2012, School of Life Sciences and Technology ,

Institut Teknologi Bandung

Sasayama, T.; Tanaka, K.; Mizukawa, K.; Kawamura, A.; Kondoh, T.; Hosoda,

K.; Kohmura, E. 2007. Trans-4-lodo,4-boranyl-chalcone induces antitumor

activity against malignant glioma cell lines in vitro and in vivo. J. Neu-

Onc. 85, 123-132

Sykes, Peter., 1989, Penuntun Mekasisme Reaksi Kimia Organik, Edisi Keenam,

Jakarta : Gramedia.

Toshio M. Li-Bo W. ,Seikou N. , Kiyofumi N., Eri Y., Hisashi M., Osamu .M.,

Li-Jun W., and Masayuki Y., 2009., Medicinal Flowers. XXVII.1) New

Flavanone and Chalcone Glycosides, Arenariumosides I, II, III, and IV,

and Tumor Necrosis Factor-a Inhibitors from Everlasting, Flowers of

Helichrysum arenarium, Chem. Pharm. Bull. 57(4) 361—367 (2009)

Wade, L. G. 1999. Organic Chemistry, Fourth Edition. USA: Prentice Hall

International, Inc

Xu, Z-X., Liang, J., Gaikwad, A., Connoly, F.P., Milss, G.B., and Guttermann,

J.U., 2007, A plant Triterpenoid, avicin D, Induces Autophagy by

Activation of AMP-activated Protein Kinase, Cell Death and

Differentitaion, 14:1948-1957.

Ye, C.L.; Liu, J.W.; Wei, D.Z.; Lu, Y.H.; Qian, F. 2004. In vitro anti-tumor

activity of 2, 4-dihydroxy-6-methoxy-3, 5-dimethylchalcone against six

established human cancer cell lines. Pharmacol. Res. 2004, 50, 505-510

Ye, C.L.; Liu, J.W.; Wei, D.Z.; Lu, Y.H.; Qian, F. 2005. In vivo antitumor activity

by 2, 4-dihydroxy-6-methoxy-3, 5-dimethylchalcone in a solid human

carcinoma xenograft model. Canc. Chemo.Pharm., 55, 447-452.

Yogesh S, Nalwar. 2009. Synthesis and Insect Antifeedant Activity of Some New

Chalcones Against Phenacoccus solanopsis. World Journal of Chemistry,

4 (2): 123-126

29

LAMPIRAN