Bai Giang Thuc Hanh Enzyme -2014

8/18/2019 Bai Giang Thuc Hanh Enzyme -2014

1/45

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CNSH- KTMT

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BÀI GIẢNG THỰC HÀNH

CÔNG NGHỆ ENZYME

Hệ đại học

TP. Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2014

Lưu hành nội bộ


2/45

Bộ môn Công nghệ sinh học 1

MỤC LỤC

BÀI MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 3

1. MỤC ĐÍCH MÔN HỌC ...................................................................................................... 3

2. CÁC QUI ĐỊNH CHUNG .................................................................................................... 3

3. CÁCH PHA VÀ SỬ DỤNG DUNG DỊCH ĐỆM .................................................................. 4

4. MỘT SỐ BƢỚC CƠ BẢN TRONG THU NHẬN VÀ TÁCH CHIẾT ENZYME ................. 8

BÀI 1. ĐỘNG HỌC VÀ BỂ PHẢN ỨNG CỦA ENZYME ........................................................... 11

XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ ĐỘNG HỌC ENZYME SAVINASE ....................................................... 11

1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 11

2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- HA CHẤT- MẪU VẬT ............................................................ 11

3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 12

4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 14

5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ ................................................................................................ 14

BÀI 2. TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH BROMELINE ................................................. 15

1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 15


3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 17

4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 21


BÀI 3. TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PEPSIN ........................................................... 22

BẰNG PHƯƠNG PHÁP ANSSON ....................................................................................... 22

1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 22


3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 23

4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 26


BÀI 4. NHÂN SINH KHỐI SACCHAROMYCES CEREVISIAE .................................................... 27

ĐỂ THU NHẬN ENZYME INVERTASE .................................................................................. 27

1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 27

2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - HA CHẤT- MẪU VẬT ............................................................ 27

3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 28

4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 30


BÀI 5. TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME INVERTASE TÁCH TỪ

SACCHAROMYCES CEREVISIAE ......................................................................................... 31

1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 31


3/45



3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 32

4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 35


BÀI 6. SO SÁNH ĐỘNG HỌC ENZYME CỐ ĐỊNH VÀ ENZYME TỰ DO ................................... 36

1. MỤC ĐÍCH ....................................................................................................................... 36


3. NỘI DUNG ........................................................................................................................ 37

4. BÁO CÁO ......................................................................................................................... 41


TÀI LIỆU MÔN HỌC .......................................................................................................... 43

PHỤ LỤC PHÂN CÔNG CHUẨN BỊ THỰC HÀNH .................................................................. 44


4/45


BÀI MỞ ĐẦU

1. MỤC ĐÍCH MÔN HỌC

Sau khi học xong môn học sinh viên có khả năng:

- Chứng minh, củng cố lý thuyết, áp dụng kiến thức vào thực tế.

-

Có kỹ năng thao tác, sử dụng các thiết bị, dụng cụ thí nghiệm.

- Thực hiện nghiêm túc nội quy phòng thí nghiệm.

- Hoàn thành bài thực hành theo thời gian quy định.

2. CÁC QUI ĐỊNH CHUNG

1. Sinh viên đọc và tóm tắt bài trước khi đến lớp. Tự soạn bài để tham khảo

trong lúc làm thí nghiệm. Không được đem bài giảng vào ( PTN.

2. Có phiếu điểm danh theo buổi quên, không mang bị trừ điểm và phải viết đơn để

giáo viên xác nhận có đi buổi học đó.

3. Nghỉ phải có đơn xin phép GV dạy và xác nhận của GV dạy học bù. Phải viết bài

báo cáo riêng buổi bù nộp cho GV mà sinh viên đó đăng ký môn học.

4. Viết báo cáo theo tổ, nộp file word cho nhóm trưởng. GV nhận được bài báo cáo

sau 1 tuần của buổi học từ nhóm trưởng qua mail trước 0h của buổi kế tiếp.

5. Kết thúc môn học 1 tuần các nhóm gộp 6 bài lại thành 1 file gửi lại cho giáo viên.

Sau đó in toàn bộ bài trên giấy A4 nộp lại. (SV có thể cập nhật lại bài nếu phát hiện

ra lỗi so với bài đã gửi cho GV) 6. Địa chỉ mail: [email protected], [email protected], [email protected].

7. SV phải xem k ỹ bài thực hành tr ướ c khi vào PTN. Đầu buổi có kiểm tra bài trắc

nghiệm, điền khuyết, câu hỏi nhỏ....(Lớp bỏ quỹ trả tiền photo đề trong các buổi

kiểm tra). Nếu kiểm tra đầu giờ không đạt sẽ phải ra về ngay. Sau đó xin giấy vào

lớp của phòng Công tác học sinh – Sinh viên với lý do không chuẩn bị bài. Rồi bố

trí đi bù buổi thực hành khác. Phải có đơn đồng ý của GV dạy chính và GV dạy bù.

8. SV phải chịu trách nhiệm về: tr ật tự, an toàn, dụng cụ, hóa chất và k ết quả thí

nghiệm cho bài thực tậ p của mình.9. SV phải có mặt ở phòng thí nghiệm (PTN) đúng giờ qui định: Sáng 7h, chiều 12h30

và phải có mặt tại PTN suốt thờ i gian thực hành. Đến tr ễ 10 phút không đượ c vào

lớp. Mặc áo blouse khi vào phòng thí nghiệm.

10. Mỗi nhóm cử một đại diện ký nhận mượ n dụng cụ: kiểm tra tình hình dụng cụ

(thiếu, hỏng, bể) báo cáo ngay cho GVHD. SV phải r ử a d ụng c ụ s ạch s ẽ tr ướ c và

sau khi t hí nghiệm. K ết thúc buổi thực tậ p mỗi nhóm phải lau dọn, làm sạch chỗ

nhóm làm thí nghiệm, nếu dụng cụ bị mất mát, hư hỏng phải báo ngay GVHD và

mua đền vào buổi học tuần kế tiếp.

mailto:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]:[email protected]


5/45


11. Mỗi buổi thực hành, các nhóm làm theo phân công trong bảng. Nhóm trực nhật có

nhiệm vụ: dọn vệ sinh, kiểm tra điện, nướ c và cửa tr ướ c khi ra về. Không hoàn

thành nhiệm vụ kết quả bài thực hành đó đạt điểm 0

Công việc Buổi 1 Buổi 2 Buổi 3 Buổi 4 Buổi 4 Buổi 6

Dụng cụ 1 5 9 3 7 1,2Hóa chất 2 6 10 4 8 3,4

Thiết bị 3 7 1 5 9 5,6

Vệ sinh 4 8 2 6 10 7,8,9,10

12. Nhóm sinh viên làm phúc trình theo yêu cầu của từng bài, nộp cho giáo viên vào buổi

thực hành kế tiếp. Kết thúc môn có thi kiểm tra theo yêu cầu giáo viên.

13. Tiêu chuẩn đánh giá bài tập – thí nghiệm thực hành

- Điểm môn học là điểm trung bình cộng của 6 bài - Nhóm trưởng sẽ được cộng 0,3 điểm thưởng/ điểm tổng kết môn học.

STT Tiêu chí đánh giá Điểm tối đa

1 Nội dung

Nguyên tắc 0.5 điểm

Tiến trình thí nghiệm 2 điểm

Giải thích thí nghiệm 2 điểm

Kết quả 1 điểm

Kết luận - Kiến nghị 0.5 điểm Trả lời câu hỏi cuối bài 1 điểm

2 An toàn, tổ chức 1 điểm

3 Thời gian 1 điểm

4 Kỹ năng thao tác 1 điểm

3. CÁCH PHA VÀ SỬ DỤNG DUNG DỊCH ĐỆM

Enzyme là một phân tử sinh học rất nhạy với sự thay đổi pH của môi trường,

nên vấn đề pha và sử dụng dung dịch đệm trong chiết tách Enzyme là rất quantrọng. Vì giới hạn chương trình, nên chỉ trình bày cách pha và sử dụng những dung

dịch đệm cần thiết.

3.1 Định nghĩa pH

Giá trị của pH của một dung dịch được tính theo công thức:

pH = - log aH+

Trong đó:

- a H+ biểu thị hoạt động của ion có trong dung dịch và được tính theo biểu thức:

aH = f. CH+

- Với:


6/45


CH+ là nồng độ H+ trong dung dịch được tính theo đơn vị ion gam /l.

f là hoạt độ H+, f ≥ 1.

Khi nồng độ H+ trong dung dịch tăng thì f giảm và ngược lại khi nồng độ của H+ rất

nhỏ (dung dịch loãng) thì f = 1, lúc đó ta sẽ có:

CH+

= aH+

Vì thế, trong các dung dịch loãng có thể tính pH gần đúng theo công thức:

pH = -log CH+

Sự phát triển, diễn tiến của nhiều quá trình hóa học, sinh học, sinh hóa…. đòi

hỏi phải ở những giá trị pH nhất định không đổi hoặc có thay đổi chỉ là trong mức độ

rất nhỏ không đáng kể. Vì thế cần phải có các dung dịch đệm cho pH.

3.2. Định nghĩa dung dịch đệm

Dung dịch đệm pH là dung dịch chứa các chất có tác dụng giữ giá trị pH trong

giới hạn nhất định khi thêm acid mạnh hay kiềm mạnh vào dung dịch đó.Các dung dịch có tính chất này thường là dung dịch hỗn hợp của một cặp acid

và base liên hợp, ví dụ: CH3COOH và CH3COONa, NH4+ và NH3, H2PO4

- và

HPO42-…. Nhưng phổ biến là các dung dịch hỗn hợp của acid yếu và base liên hợp với

nó hay ngược lại.

Vì thế tác dụng đệm chỉ có hiệu lực lớn hơn trong một phạm vi nhất định tùy

thuộc vào bản chất của từng acid yếu và vùng đệm hiệu lực.

Tính theo công thức: pH = pK a 1.

Trong đó: pK a = - logK a với K a là hằng số phân ly H+ của acid trong nước.

Vì thế mỗi một hỗn hợp đệm chỉ có tác dụng trên từng thang đo pH. Do đó

muốn đệm cho vùng pH rộng phải có dung dịch đệm của hỗn hợp nhiều hệ acid và

base liên hợp. Ví dụ, dung dịch đệm gồm CH3COOH và CH3COONa có tác dụng tốt

trong khoảng pH = 3,7 5,7. Trong khi đó dung dịch đệm gồm NH4+ và NH3 lại có tác

dụng đệm tốt trong vùng pH = 8 11. Với hỗn hợp đệm gồm acid H3PO4 và muối của

nó thường có tác dụng đệm tốt trong hai vùng pH, tương ứng với hai hằng số phân ly

acid Ka1 và Ka2 vùng I có pH = 1 3,6 và vùng II pH = 6 8,3.3.3. Hiệu ứng pha loãng dung dịch đệm

Theo công thức pH của dung dịch đệm :

pH = pK a – log (Ca/C b)

Ca: là nồng độ acid

C b: là nồng độ của base liên hợp

Khi pha loãng, số lần pha loãng nồng độ Ca và C b là như nhau nên tỷ số Ca/C b

không thay đổi, nhưng hằng số điện ly ra H+ của acid và hoạt độ của các ion trong

dung dịch thay đổi. Vì thế khi pha loãng sẽ làm thay đổi một ít pH của dung dịch đệm.


7/45


8/45


Để pha chế dung dịch đệm này ta cần dung dịch K 2HPO4 0,1 M (20,42 g/l)và

dung dịch HCl 0,1 M (9 ml HCl đặc 36%). Hỗn hợp đệm này chứa 50 ml dd K 2HPO4

0,1 M và X ml HCl 0,1 M theo bảng sau:

pH ở 25

o

C X ml HCl 0.1 M pH1/2 2,20

2,30

2,40

2,50

2,60

2,70

2,80

2,903,00

3,10

3,20

3,30

3,40

3,50

3,60

3,70

3,80

3,90

4,00

49,50

45,80

42,20

38,80

35,40

32,10

28,90

25,7022,30

18,80

15,70

12,90

10,40

8,20

6,30

4,50

2,90

1,40

1,10

+0,14

+0,08

+0,09

+0,04

3.4.3. Hỗn hợp đệm K 2HPO4- NaOH

Để pha chế dung dịch đệm này ta cần dung dịch K 2HPO4 0,1 M (20,42 g/l) và

dung dịch NaOH 0,1M (4 gam NaOH/lít). Hỗn hợp đệm này chứa 50 ml dd K 2HPO4 0,1 M và X ml NaOH 0,1 M theo bảng sau:

pH ở 25oC X ml NaOH 0,1 M pH1/2

4.10

4.20

4.30

4.40

4.50

4.60

1.30

3.00

4.70

6.60

8.70

11.10

+ 0.05


9/45


4.70

4.80

4.90

5.00

5.105.20

5.30

5.40

5.50

5.60

5.70

5.80

5.90

13.60

16.50

19.40

22.60

25.5028.80

31.60

34.10

36.60

38.80

40.60

42.30

43.70

+ 0.06

+ 0.06

+ 0.14

3.4.4. Hỗn hợp đệm KH2PO4 – NaOH

Để pha chế dung dịch đệm này ta cần dung dịch KH2PO4 0,1 M (12,61 g/l) và

dung dịch NaOH 0,1 M (4.00 g/ lít). Hỗn hợp đệm này chứa 50 ml dd KH2PO4 0,1 M

và X ml NaOH 0,1 M theo bảng sau:

4. MỘT SỐ BƢỚC CƠ BẢN TRONG THU NHẬN VÀ TÁCH CHIẾT ENZYME

Tùy theo những đặc tính riêng biệt của từng loại enzyme mà lựa chọn phương

pháp làm sạch cho thích hợp. Trong quá trình tinh chế enzyme, mặc dù trình tự và cácthủ thuật ở các bước có thể thay đổi, song vẫn có những nguyên tắc chung.

pH ở 25oC X ml NaOH

0.1 M

pH1/2 pH ở 25oC X ml NaOH

0.1 M

pH1/2

5,80

5,90

6,00

6,10

6,20

6,30

6,40

6,506,60

6,70

6,80

6,90

3,60

4,60

5,60

6,80

8,10

9,70

11,60

13,9016,40

19,30

22,40

25,90

+0,07

+0,05

7,00

7,10

7,20

7,30

7,40

7,50

7,60

7,707,80

7,90

8,00

29,10

32,10

34,70

37,00

39,10

40,90

42,40

43,5044,50

45,30

46,10

+0,08

+0,06


10/45


Phá vỡ tế bào

Enzyme có trong tế bào chất của sinh vật và các cấu tử (nhân, lạp thể, ty thể,

lysosome...) của tế bào. Nhưng các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng

của tế bào và màng của các cấu tử. Do đó để có thể chiết rút các enzyme nội bào, bước

đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúng vàodung dịch.

Tác nhân cơ học

Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học như nghiền với

bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa (homogenizator). Để

việc phá vỡ có hiệu quả ở mô thực vật, trước khi nghiền người ta thường thái nhỏ mẫu

để vào ngăn đá hoặc cho trương nước (ví dụ như đối với mẫu hạt khô). Còn ở các mô

của động vật như gan hoặc thận, khi chiết enzyme người ta cần cắt bỏ các mô liên kết.

Tác nhân vật lý, hóa học Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phải dùng

các yếu tố vật lý và hóa học khác nhau như sóng siêu âm, dung môi hữu cơ (butanol,

aceton, glycerin, ethyl acetate..) và chất detergent (chất tẩy). Các hóa chất có tác dụng

tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa mỡ.

Chiết

Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất,

bằng các dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính.

Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết rút:

- Nhiệt độ: Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút và tiến

hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (30C ÷ 50C). Các thao tác phải nhanh.

- Một số chất điện ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl2,

CaCl2. Tác dụng của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút.

- Khử màu: Trong quá trình chiết rút enzyme ở các đối tượng động, thực vật, có

trường hợp còn có mặt chất màu làm ảnh hưởng đến việc làm sạch hoặc xác định hoạt

độ enzyme. Trong trường hợp này người ta còn cho thêm vào chất khử để loại màu. Ởcác mẫu từ động vật có sắc tố melanin màu nâu. Người ta thường loại màu trên cột

nhựa trao đổi ion bằng cách cho dịch enzyme qua cột hoặc lắc. Khi qua cột, chất màu

bị giữ lại và enzyme không bị giữ. Trong quá trình này phải chú ý kiểm tra pH. Sau

khi loại màu cần kiểm tra lại hoạt độ của enzyme.

Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn có các protein cấu trúc, các chất cao phân tử

khác nhau như polysaccharid, nucleic acid, các chất có phân tử nhỏ như đường

monose, các chất lipid, muối khoáng...Để loại chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện

pháp khác nhau.

Kết tủa


11/45


Cồn nồng độ cao (960 – 980 ) với tỉ lệ về thể tích 1 E : 3 cồn hay 1 E : 4 cồn.

Các dung môi như isopropanol, aceton với tỉ lệ dung dịch Enzyme : dung môi

là 1:1,5 hay 1: 2. Chú ý khi tủa E bằng các dung môi trên tốt nhất là nên ở nhiệt độ

thấp từ 30C ÷ 50C, khuấy đều khi cho dung môi từ từ vào.

Các dung dịch muối trung tính như NaCl, (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4…là tác nhân tủa tích cực. Thông thường hay dùng dung dịch (NH4)2SO4 vì độ hòa tan muối

này cao (chiếm từ 50 – 60 % so với dịch enzyme) không phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ,

không làm biến tính enzyme. Với pepsin người ta hay dùng NaCl (20 – 25%) vì muối

này rẻ, dễ tìm, không ảnh hưởng đến hoạt tính của E….

Tinh sạch

Sau khi kết tủa E, ly tâm, phần E tủa lúc này còn chứa nhiều tạp chất như protein,

muối, các chất có trọng lượng phân tử thấp khác, chất màu…. Nên ta cần tiến hành

tinh sạch theo các biện pháp sau: - Tách chất có trọng lượng phân tử thấp (như muối..) bằng phương pháp thẩm tích

qua màng bán thấm.

- Tách một phần các chất tạp bằng nồng độ rượu thấp (40 – 45%) khi đó E chủ yếu

nằm trong dung dịch.

- Có thể hòa tan E bằng lượng nước tối thiểu, lọc bỏ chất không tan, rồi kết tủa lại

bằng rượu cao độ.

- Hiện nay việc chiết tách, tinh sạch E đã được tiến hành với hiệu suất tương đối cao

bằng các kỹ thuật hiện đại như lọc gel, hấp phụ chọn lọc, sắc ký trao đổi ion….


12/45


13/45


10 Phễu Ф 60 cái 3

11 Bình định mức 250 Cái 1

C.THIẾT BỊ:

STT TÊN THIẾT BỊ QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

1 Máy đo quang phổ Cái 2

Cả lớp 2 Cân 2 số Cái 2

3 Máy ổn nhiệt Cái 1

4 Máy khuấy từ Cái 1

5 Máy Votex Cái 2

Tổ 1: Pha dung dịch casein 12 mM: Cân 2g casein vào cốc pha, thêm vào khoảng

20-30 ml dung dịch NaOH 0,5N, đặt lên máy khuấy từ ở 50-600C khuấy cho casein

tan hết, vẫn để dung dịch trên máy khuấy từ, tiếp tục khuấy nhưng không gia nhiệtnữa; dùng HCl có nồng độ tương ứng nhỏ vào từ từ đến khi pH đạt từ 7,5 -8 (nhớ

nhỏ HCl vào từ từ để tránh casein bị tủa và pH tăng quá nhanh), dùng đệm

phosphate pH = 8 định mức đến 200 ml.

Tổ 2: Pha dung dịch đệm phosphate:

- Dung dịch Na2HPO4 1/15M: hòa tan 23,9 g Na2HPO4.12H2O trong nước vừa đủ

1000 ml.

-

Dung dịch KH2PO4 1/15M : hòa tan 9,07 g KH2PO4 trong nước vừa đủ 1000ml.

Trộn 969 ml Na2HPO4 1/15M với 31 ml KH2PO4 1/15M thu được 1000 ml dung

dịch đệm phosphate pH = 8

Tổ 3: Pha dung dịch chuẩn Tyrosine (1mM): 181,19 mg Tyrosine hòa tan trong

HCl 0,2N đủ 1 lít.

Tổ 4: Pha dung dịch savinase 2%: Hút 8 ml enzyme Savinase thương mại hòa tan

trong 392 ml nước cất.

3. NỘI DUNG

Thông số động học của enzyme là tốc độ phản ứng Vmax và hằng số Michaelis

Km. Tốc độ của phản ứng trong một giới hạn nào đó phụ thuộc vào nồng độ cơ chất có

trong môi trường. Khi enzyme chưa bị bão hòa bởi cơ chất thì tốc độ phản ứng vẫn tỷ

lệ thuận với nồng độ cơ chất.

Do đó chúng tôi khảo sát biến thiên vận tốc phản ứng thuỷ phân casein của

savinase bằng cách thay đổi nồng độ casein từ 2.4 – 12 mM để tìm khoảng nồng độ

casein mà trong đó enzym chưa bị bão hoà bởi cơ chất.


14/45


Xây dựng đường thẳng tương quan giữa vận tốc thuỷ phân của enzym và nồng

độ cơ chất theo phương trình Lineweaver – Burk

Enzyme Savinase được sản xuất bởi quá trình lên men của các vi sinh vật biếnđổi gen ( Bacillus amyloliquefaciens). Sau khi kết thúc quá trình lên men, savinase

được tách chiết và tinh sạch từ các sản phẩm lên men. Enzyme này được ứng dụng

trong việc sản xuất bột giặt, nước rửa chén vì chúng giúp tẩy sạch các vết bẩn trên

quần áo có nguồn gốc từ thức ăn: trứng, thịt...hoặc vết máu, bùn...Savinase có tác

dụng thủy phân protein thành các peptide ngắn, tan trong nước.

Enzyme Savinase hoạt động trong môi trường kiềm cao, pH dao động từ 8 – 12

(tối ưu pH = 10), nhiệt độ hoạt động của nó từ 20 -600C (tối ưu ở 550C), được bảo

quản ở nhiệt độ từ 3 – 50C.

3.1. Lập đƣờng chuẩn Tyrosine

Nhóm cử 1 tổ chẵn, 1 tổ lẻ làm đường chuẩn

Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5

Dd tyrosine chuẩn (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Tyrosine tương ứng (µmol) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

HCl 0.2N (ml) 5 4.8 4.6 4.4 4.2 4

NaOH 0.5N 10Folin pha loãng 3 lần 1

Lắc mạnh, để yên trong 10 phút

Đo OD (Abs) tại λ =660 nm 0 ? ? ? ? ?

Dựng đường chuẩn tyrosine biểu diễn sự tương quan giữa lượng tyrosine và OD.

Ống 0 là ống mẫu, các ống khác là ống thí nghiệm.

3.2. Xác định thông số động học của enzyme savinase Tiến hành thí nghiệm


Casein 12 mM (ml) 0 1 2 3 4 5

Đệm phosphate (ml) 5 4 3 2 1 0

Nồng độ Casein (mM) 0 2.4 4.8 7.2 9.6 12

Savinase 2% (ml) 5

Để yên ở 50-55 C trong 2 phút

TCA 5% (ml) 5 Để yên 15 phút, lọc lấy dịch bên dưới

S

1.

v

K

v

1

v

1

max

M

max


15/45



Dịch lọc 5

NaOH 0.5N (ml) 10

Folin pha loãng 3 lần

(ml)

1

Lắc mạnh, sau đó để yên trong 10 phút

Đo OD (Abs)

tại λ =660 nm 0 ? ? ? ? ?

Dựa vào đồ thị chuẩn ta suy ra lượng Tyrosine tương ứng.

Ống nghiệm 1 2 3 4 5

OD (y)Lượng tyrosine (x)

Tính vận tốc phản ứng (V) ở các nồng độ cơ chất tương ứng:

V = d(P)/dt = Lượng tyrosine/thời gian.

Lập đồ thị thể hiện mối tương quan giữa 1/S và 1/V dựa vào bản sau:

Ống nghiệm 1 2 3 4 5

Lƣợng casein (S)

1/S

V

1/V

Sử dụng phần mềm Excel hoặc áp dụng phương pháp bình phương cực tiểu để

xây dựng đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nồng độ cơ chất tới tốc độ phản ứng.

Tham khảo bài 10 trang 66 sách Thí nghiệm hóa sinh thực phẩm Trần Bích

Lam NXB ĐHQG TP HCM

4. BÁO CÁO

1. Vẽ đồ thị tương quan giữa 1/S và 1/V dựa trên kết quả thực nghiệm.

2. Xác định thông số động học Km và Vmax.

5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ

Theo yêu cầu chung môn học.


16/45


BÀI 2. TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH BROMELINE

1. MỤC ĐÍCH

Sau khi học xong bài sinh viên có khả năng:

-

Viết quy trình tách chiết, thu nhận dung dịch enzyme bromeline thô. - Xác định hoạt tính enzyme bromeline.

- Viết quy trình thu nhận enzyme bromeline ở dạng paste .

2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ- HA CHẤT- MẪU VẬT

ảng 2.1. Các hóa chất dụng cụ thiết bị sử dụng trong bài thực hành

(cho nhóm gm sinh viên

A. HÓA CHẤT

STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ1 (NH4)2SO4 gam 100 PTN

2 Cồn 90o lit 3

3 Thơm (dứa) xanh trái 5 HS mua

4 Vải lọc m 1

5 DD NaOH 0.5 N ml 250

6 DD NaOH 1.0 N ml 100

7 DD HCl 0.2 N ml 300

8 DD HCl 2 N ml 100

9 Folin Ciocaltue ml 80

10

Acid tricloacetic TCA

(Cl3COOH) 5% ml 200

11 KH2PO4 1M ml 100

12 Hemoglobin gam 5,0

13 Tyrosine gam 3

14 Urê gam 80

15

Túi colodion hoặc

cellophane túi 10

16

Đệm phosphate có pH = 7,

nồng độ 0,01M lit 3

17 Nước cất 2 lần lit 3

18 Giấy lọc Hộp 1

B. DỤNG CỤ

STT TÊN DỤNG CỤ QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ


17/45


1 Ống đong 50ml Cái 1

1 tổ

2 Ống nghiệm phi 18 Cái 10

3 Giá ống nghiệm Cái 1

4 Pipep man 100 -1000µl Cái 1

5 Pipep 1ml Cái 16 Pipep 2ml Cái 1

7 Pipep 5ml Cái 1

8 Phễu thủy tinh Cái 1

9 Bình tia nước cất Cái 1

10 Dao inox Cái 1

11 Quả bóp Cái 1


13 Cốc 100 cái 3

14 Bình tam giác nút mài 100 cái 1

15 Đũa thủy tinh cái 10

cả lớp 16 Cốc thủy tinh 500ml Cái 2

17 Cồn kế 50-100 Cái 1

18 Cốc thủy tinh 1000ml Cái 10

C.THIẾT BỊ

STT TÊN THIẾT BỊ QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ1 Máy đo quang phổ Cái 2

cả lớp

2 Cân 2 số Cái 1

3 Máy ly tâm 6000v/p Cái 1

4 Máy xay sinh tố Cái 1

5 Máy khấy từ Cái 2

Chuẩn bị hóa chất:

Tổ 5: Pha dung dịch acid Trichloroacetic 5%: Cân 5 g pha với nước cất thành 100ml.

Tổ 6: Pha Dung dịch đệm KH2PO4 1M: Cân 13.6 g pha với nước cất thành

100ml.

Tổ 7: Pha dung dịch Tyrosine 1/400N mẫu: Cân 45 mg Tyrosine pha trong

100ml HCl 0.2N.

Tổ 8: Pha dung dịch Hemoglobin 2%: Cân 2g Hb + 36g Ure + 8 ml dung dịch

NaOH 1N hòa trong 40 ml nước cất. Để ở 25o

C trong 60 phút. Thêm 10 ml dung dịch


18/45


đệm KH2PO4 1M, điều chỉnh lại pH =6 với dung dịch HCl 2N. Thêm nước đầy tới

vạch mức 100ml. Bảo quản trong tủ lạnh.

3. NỘI DUNG

3.1. Nguyên tắc

Bromeline là một enzyme thuộc nhóm protease có nhiều trong trái thơm. Chúng tatiến hành khảo sát bromeline qua khả năng thủy phân các cơ chất protein

(Hemoglobin, Casein, Albumin….) tạo ra các sản phẩm tan trong dung dịch TCA là

các peptide có chứa Tyrosine. Việc định lượng Tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc

thử Folin – Ciocalteu cho biết hoạt động thủy phân của enzyme.

3.2. Chiết dịch thơm có chứa Enzyme

Nguyên liệu: ngọn (đỉnh sinh trưởng), vỏ quả, thịt và lõi thơm.

Tổ 3: Dứa gọt vỏ, bỏ lõi, cân khối lượng m (g), xay nhỏ bằng máy xay sinh tố lọc qua vải màn 2 lớp 1 lần, qua bông 1 lần, bỏ cặn, thu dịch ly tâm 4500 vòng /10

phút thu V ml dịch lọc thô có chứa bromeline. Chia về các tổ, mỗi tổ 50 ml thực

hiện thí nghiệm: 10ml dành cho thử hoạt tính, 20ml dành cho tủa bằng Ethanol, 20ml

dành cho tủa bằng muối (NH4)2SO4.

Quy trình trích ly và thu nhận bromeline dạng thô

3.3. Phƣơng pháp tủa bromelinea. Phƣơng pháp tủa bằng dung môi hữu cơ (Ethanol 80%, Aceton)

Làm sạch

Nghiền ép, xay nhuyễn

Lọc

Ly tâm 4500 v/ 10ph

Bã

Bã

Dứa

Dịch enzyme thô


19/45


Cơ sở: độ hòa tan của protein phụ thuộc vào sự tương tác của các nhóm tích

điện trong phân tử protein với các phân tử nước. Sự tương tác đó (còn gọi là sự

hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịch enzyme các dung môi hữu cơ

(ethanol, isopropanol, acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu). Tiến hành ở nhiệt độ thấp

(≤ 5

0

C), có tác dụng tốt đến độ ổn định của enzyme. Khi kết tủa, chú ý lấy nhanh kếttủa ra khỏi dung môi bằng cách dùng máy li tâm. Phương pháp này lợi thế là không

cần loại muối, nhưng nhược điểm là hay có màu.

Độ hòa tan của protein trong dung dịch phụ thuộc vào nhiều yếu tố, một trong

số đó là hằng số điện môi của dung dịch. Nhìn chung, những phân tử dung môi có

hằng số điện môi lớn (như nước, dimethylsulphoxid) có thể ổn định tương tác giữa

chúng với các phân tử protein và tạo điều kiện thuận lợi cho sự hòa tan của protein

trong dung dịch. Ngược lại, các dung môi với hằng số điện môi nhỏ (aceton, ethanol)

ngăn cản sự phân tán của các phân tử protein trong môi trường. Do đó, độ hòa tan củanhững phân tử protein giảm và xảy ra kết tủa do sự làm giảm hằng số điện môi hiện

hữu của môi trường. Điều này có được bằng cách thêm một dung môi hòa tan trong

nước như aceton vào dung dịch chứa protein. Sự tủa bằng aceton hoặc ethanol 80% có

nhiều thuận lợi hơn vì nó tương đối rẻ, có sẵn ở dạng tinh khiết với ít chất tạp nhiễm

gây độc hay ức chế đối với enzym, do nhiệt độ bay hơi của dung môi thấp nên dễ tách

bỏ dung môi khỏi chế phẩm enzym bằng phương pháp sấy nhẹ bằng quạt gió.

Quy trình kết tủa enzym Bromeline bằng cồn 80%

Tủa cồn 4oC / 1 giờ

Ly tâm 4500 v/p10 hút

Thu tủa

Sấy khô

Bỏ dịchtrong

Cồn 80%, 40C Dịch enzyme thô


20/45


Lưu ý: Phối trộn cồn với dịch dứa theo tỉ lệ 4:1 (1 dứa : 4 cồn).

Phƣơng pháp tủa bằng muối:

Người ta có thể dùng muối (NH4)2SO4, NaCl… để tủa protein vì các muối này

vừa làm trung hòa điện (do các ion tác động tương hỗ với các nhóm tích điện trái dấu),vừa loại bỏ lớp vỏ hydrat của phân tử protein. Các protein khác nhau có thể bị kết tủa

với nồng độ muối khác nhau, vì vậy có thể dùng muối để tách riêng các protein ra khỏi

hỗn hợp của chúng.

Quy trình thu nhận enzym Bromeline bằng muối (NH4)2SO4

Lưu ý : Để có muối (NH4)2SO4 bão hòa 70%, ta phối trộn với tỷ lệ 47,2g muối

trong 100ml nước thơm.

Kết quả: Hãy tính hàm lượng protein có trong 100g nguyên liệu ban đầu.

Phƣơng pháp thẩm tích

Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường... là các tạp chất có phân tử lượng

thấp, người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các

dung dịch đệm loãng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex.

Cách làm thẩm tích như sau: cho dung dịch enzyme vào túi colodion hoặccellophane (thông thường người ta dùng cellophane tốt hơn), sau đó đặt cả túi vào

Để yên, ở nhiệt độ

phòng 30 phút

Ly tâm 4500 v/p, trong10 hút

Thu tủa Bỏ dịchtrong

Thẩm tích

Bromeline

Sấy khô

Dịch enzyme thô Ammonium sulfate70% bão hòa


21/45


nước cất hoặc dung dịch đệm pha loãng (như đệm phosphate có pH = 7, nồng độ

0,01M chẳng hạn). Màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ cho các chất

có phân tử nhỏ xuyên và đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch

tán. Còn lại trong màng là các chất protein có phân tử lớn.

Có thể tăng tốc độ thẩm tích khi khuấy dung dịch rửa bằng máy trộn cơ học haymáy trộn từ hoặc là quay chậm túi nhờ động cơ không lớn. Khi thẩm tích các p rotein

thường người ta tiến hành tất cả các thao tác ở môi trường lạnh.

Hình 1. Thẩm tích để loại muối (NH 4 )2SO4 trong kết tủa protein

3.3. Khảo sát hoạt tính enzyme Thực hiện 3 ống nghiệm theo như bảng sau:

Dung dịch Ống Tyrosin

(ml)

Ống mẫu

(ml)

Ống không

(ml)

Dung dịch Hb 2% trong đệm

phosphate

2.5 2.5 2.5

Để yên ở 35,5

0

C trong 5 phútAcid Trichlororacetic 5% 5 0 5

Dung dịch HCl 0.2N 0 0.5 0.5

Dung dịch Tyrosine 1/400N 0.5 0 0

Dịch thơm có chứa enzyme

Bromeline

0 0.5 0

Lắc đều. Để yên ở 35o5C trong 10 phút

Dd Acid Trichlororacetic 5% 0 5 0

Dịch thơm có chứa Enzyme 0.5 0 0.5


22/45


Bromeline

Lắc đều, để yên 10 phút ở 250C,

Lọc

Dịch lọc (ml) 2.5 2.5 2.5

NaOH 0.5N (ml) 5Folin (ml) 1

Lắc đều, để yên 15 phút

Đo OD (λ=578 hoặc 660nm) ODT =? ODM=? ODC=?

3.3 Kết quả

Hoạt tính enzyme Bromeline được biểu thị là số g Tyrosine sinh ra do sự thủy

phân Hb của enzym có trong 1 ml dung dịch hay 1 mg hỗn hợp chứa Bromeline trong

1 phút.Hoạt tính này đựơc tính theo công thức :

X = 450 ODM 1 X1 (UI/ ml).

OD T 10 X2Với : X1: ml dung dịch Tyrosine chuẩn

X2: ml dung dịch chứa enzyme

OD T = OD T - ODC

OD M = ODM - ODC

(Tham khảo trang 63 Thực tập lớn sinh hóa – Lâm Thị Kim Châu)

4. BÁO CÁO

1. Nêu nguyên tắc khảo sát hoạt tính Bromeline dựa vào mật độ quang?

2. Giải thích các bước tiến hành thí nghiệm trong bài ?

3. Xây dựng công thức tính và giải thích ý nghĩa của các đơn vị ?


Theo yêu cầu chung môn học


23/45


BÀI 3. TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ PEPSIN

BẰNG PHƢƠNG PHÁP ANSSON

1. MỤC ĐÍCH

- Tách enzyme pepsin từ dạ dày heo.

- Xác định hoạt độ enzyme thô.




A. HÓA CHẤT

STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

1 HCl 0,5% Lít 1

2 Acetone Lít 1

3 NaCl 25% Lít 1

4 Thuốc thử Folin ml 100

5 TCA 5% ml 200

6

Hemoglobin 2% trong HCl

0.06N

ml 200

7 Dung dịch chuẩn tyrosine ml 50

8 Dd NaOH 0,5 N ml 5009 HCl 0,2N ml 500

10 Vải lọc m 1

HS mua11 Dạ dày heo (bò) Kg 1

12 Sữa đặc ông thọ vỉ Vỉ 1

13 Nước cất 2 lần Lít 4

Cả lớp

14 Giấy lọc Hộp 1

15 Giấy nhôm Quận 1

16 CaCl2 0,01M ml 150

B. DỤNG CỤ


1 Dao inox + thớt Cái 1 Mượn trước 24h

2 Kéo Cái 1

3 Tam giác 250 nút mài cái 1

4 Ống đong 25ml Cái 1 1 tổ

5 Cốc thủy tinh 100ml Cái 26 Ống nghiệm Ф18 Cái 12


24/45



8 Pipet 1ml Cái 1

9 Pipet 2ml Cái 1

10 Pipet 5ml Cái 1

11 Pipet 10ml Cái 112 Giá ống nghiệm Cái 1

13 Quả bóp cao su Cái 1

14 Kẹp ống nghiệm Cái 1

15 Bình tia Cái 1

16 Đũa thuỷ tinh Cái 1



Cả lớp 19 Bình định mức 100ml Cái 1

20 Chậu thủy tinh Cái 1 Mượn trước 2 ngày

C.THIẾT BỊ


1 Máy đo quang phổ cái 2

2 Cân 2 số cái 1 Mượn trước 2 ngày

3 Tủ ấm cái 1

4 Máy xay sinh tố có cối xaythịt cái 1

Tổ 9: Pha thuốc thử Folin: pha loãng 3 lần bằng nước.

Tổ 10: Dung dịch chuẩn Tyrosine 1mM: 181,19mg Tyrosine hòa tan / HCl 0,2N đủ

1 lít.

3. NỘI DUNG

3.1. Nguyên tắc:Pepsin được giải phóng từ màng nhầy dạ dày động vật do sự tự phân trong môi

trường acid loãng. Dung dịch sau tự phân có chứa pepsin dạng hòa tan và các thành

phần protein khác. Sự tinh sạch enzyme có thể thực hiện sau khi đã thu nhận đựơc chế

phẩm enzyme thô nhờ vào các tác nhân gây tủa.

Trong môi trường acid, pepsin (pepsin A, EC 3.4.23.1) phân giải được

Hemoglobin thành Tyrosine và Tryptophane hòa tan trong TCA. Xác định hàm lượng

tryosine và triptophane nhờ vào thuốc thử Folin – Ciocalteu.

3.2. Thu nhận dung dịch enzyme + Chuẩn bị nguyên liệu:


25/45


Dạ dày bò (hoặc heo) mới giết mổ, xử lý thô sau đó được bảo quản trong điều kiện

nhiệt độ thấp với sự có mặt chloroform 5%. Thời gian tối đa cho quá trình bảo quản là

48 giờ. Cân khối lượng niêm mạc m1 (g).

+ Tự phân enzyme:

Tách lớp niêm mạc thô từ dạ dày, xay nhỏ với máy xay sinh tố trong dung dịchHCl 0.5% (tỉ lệ 1:2 theo khối lượng). Sau đó cho vào chậu thuỷ tinh lớn, đậy kín, để

yên ở nhiệt độ 40 – 420C trong bể ổn nhiệt với thời gian 24 - 28 giờ.

Tiến hành lọc dung dịch qua vải lọc (từ 2- 4 lần), loại bỏ tạp chất bằng cách lọc

qua bông. Thu được dung dịch có enzyme thô được dùng tiến hành thử hoạt tính.

+ Thu chế phẩm pepsin thô:

Tiến hành thu kết tủa pepsin bằng dung dịch muối NaCl 25% (hoặc dung môi

aceton lạnh) với tỷ lệ 1:4, cho từ từ dung dịch muối vào kết hợp với khuấy đảo liên tục

để tránh sinh nhiệt trong hỗn hợp. Thời gian từ 5 – 10 phút, nhiệt độ khoảng 50C.Tiến hành ly tâm với tốc độ 6000/phút trong 15 phút.

Với tác nhân tủa là muối trung tính cần qua thẩm tích để giải phóng bớt lượng

muối trong hỗn hợp. Sau đó tiến hành sấy khô bằng máy sấy không khí, nhiệt độ 30 –

400C khoảng 1 –2 giờ. Đối với tác nhân tủa là aceton thì để khô tự nhiên dưới quạt gió

từ 3-4 giờ. Cân khối lượng chế phẩm m2 (g).

Chế phẩm tự nhiên có dạng bột màu trắng hay hơi vàng, vô định hình và có mùi

nước thịt, vị hơi chua. Người ta có thể thêm vào chế phẩm chất nền như tinh bột hay

dextrin để bảo quản. Điều kiện giữ chế phẩm cần khô, kín (trong lọ màu) và ở nhiệt độ

50C.

+ Hiệu suất chiết tách đựơc tính bằng công thức:

Khối lượng chế phẩm (m2) . 100%

K hối lượng niêm mạc thu nhận (m1)

3.3. Lập đƣờng chuẩn Tyrosine

Lập 6 ống nghiệm theo tuần tự sau:

(1mol =103mmol = 106 mol)

Ống 0 1 2 3 4 5

Tyrosine chuẩn 1mM (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

HCl 0,2 N (ml) 5 4,8 4,6 4,4 4,2 4

NaOH 0,5 N (ml) 10

Folin pha loãng 3 lần (ml) 3

Lượng tyrosine (mol ) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Lắc mạnh sau 5-10 phút

OD660nm 0 ? ? ? ? ?

H

=


26/45


Dựng đường chuẩn Tyrosine biểu diễn sự tương quan giữa lượng Tyrosine và OD

(Ống 0 là ống kiểm chứng (KC) . Các ống khác là ống thí nghiệm (TN) ).

3.4. Xác định hoạt tính Pepsin (hoạt tính chung) trong mẫu chế phẩm

Enzyme.

Lấy 2 ống nghiệm dán nhãn và làm theo thứ tự như bảng sau:Chất dùng Ống 1 (mẫu thí nghiệm) Ống 2 (mẫu kiểm chứng)

Hb 2% ở 25oC (ml) 5

TCA 5% (ml) 0 10

Enzyme pepsin (ml) 0,1

Nước (ml) 0,9

Thời gian Giữ 10 phút ở 35,5oC Không cần giữ 10 phút

TCA 5% (ml) 10 0Sau 30 phút đem lọc lấy dung dịch

Hút 5ml dung dịch lọc từ hai ống nghiệm

chuyển sang ống nghiệm mới

Ống nghiệm 1 2

NaOH 0,5 N (ml) 10

Lắc mạnh

Folin pha loãng 3lần (ml)

3

Lắc đều, để yên sau 5-10phút

OD ở = 660 nm ODTN = ? ODKC = ?

Tính OD = ODTN – ODKC. Dựa vào đồ thị chuẩn ta suy ra lượng Tyrosine .

4.4. Tính toán

a. Định nghĩa đơn vị Ansson (trang 116 Mục 6, TN CNSH tập 1- Nguyễn

Đức Lượng chủ biên).Lượng Enzyme tối thiểu trong điều kiện chuẩn (6 ml dịch ủ, 100mg

hemoglobin, nhiệt độ 35.5oC) thuỷ phân hemoglobin trong một phút tạo thành sản

phẩm hòa tan trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin tạo dung dịch màu có OD

tương ứng 1 mol Tyrosin.

b. Công thức tính

Hoạt tính pepsin được tính theo phương pháp Ansson biểu thị bằng số đơn vị Ansson.

mol Tyrosin *3,2 * 1,82

Số đơn vị hoạt độ Ansson =t*v


27/45


a: Tỉ lệ thể tích mẫu thí nghiệm (16/5)

v: Thể tích dung dịch đem xác định (0,1ml)

t : Thời gian thuỷ phân 10 phút

1,82: hằng số giá trị cường độ màu ở 25OC.

3.5. Xác định hoạt độ đông tụ sữa a. Nguyên tắc:

Xác định hoạt độ đông tụ sữa của pepsin dựa vào thời gian cần thiết để làm

đông tụ dung dịch sữa đã loại béo có nồng độ xác định. Công thức tính:

F = 1/(E.t)

Trong đó, F là hoạt độ đông tụ sữa; E là lượng enzyme tham gia (mg); t là thời

gian (phút hoặc giây).

b.Tiến hành:

Cân 5g sữa đặc hòa tan trong 100 ml dung dịch CaCl2 0,01N. Hút 5 ml dungdịch cho vào một ống nghiệm, thêm 0,5 ml dung dịch enzyme pepsin, lắc nhẹ, để ở

nhiệt độ phòng. Ghi nhận thời gian từ khi cho enzyme vào đến khi sự kết tủa protein

của sữa xuất hiện.

4. BÁO CÁO

1. Giải thích tại sao phải chiết pepsin trong môi trường acid ?

2. Tính hiệu suất thu nhận chế phẩm?

3. Mô tả chế phẩm thu được. 4. Xác định hoạt tính pepsin theo Ansson?

5. Xây dựng đường chuẩn tyrosine?

6. Xác định hoạt độ đông tụ sữa F?




28/45


BÀI 4. NHÂN SINH KHỐI SACCHAROMYCES CEREVI SIAE

ĐỂ THU NHẬN ENZYME INVERTASE

1. MỤC ĐÍCH

- Pha môi trường Han sen nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae.

- Thực hiện giữ giống Saccharomyces cerevisiae.

- Nhân giống cấp 1 - cấp 2 Saccharomyces cerevisiae.

- Thu nhận sinh khối Saccharomyces cerevisiae.

- Quan sát hình thái của tế bào Saccharomyces cerevisiae.

2. THIẾT BỊ - DỤNG CỤ - HA CHẤT- MẪU VẬT



A. HÓA CHẤT

STT TÊN HA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

1 Nước cất 2 lần Lít 3 Pha MT

2 NaOH 10% Ml 10Chỉnh pH

3 HCl 10% Ml 10

4 Cồn 700 Lít 1 Khử trùng

5 Cồn 900

Lít 16 Agar Gam 30

7 Bông thấm Gam 500

8 Bông không thấm Gam 500

9 Giấy pH Thếp 4

10 Glucose Gam 75

11 Tripton Gam 15

12 KH2PO4 Gam 5

13 MgSO4.7H2O Gam 3

14 NaCl Gam 20

15

Thuốc nhuộm xanh

methylen 0,1% Ml 20

Giấy báo 1kg, tick dán 100 cái, khăn tay 2 cái, kéo 1 cái sinh viên chuẩn bị

B. DỤNG CỤ STT TÊN DỤNG CỤ QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

1 Ống nghiệm Ф 18 nút vặn Cái 4/ tổ Lưu lại 1 tuần


29/45


2 Tam giác 250 Cái 1/tổ

3 Tam giác 500 Cái 8 cả lớp


1 tổ

Sau 48h mượnque cấy và đèn

cồn


6 Ông đong 25ml Cái 17 Phễu thủy tinh Cái 1

8 Pipet 10ml Cái 1

9 Pipet 1ml Cái 1

10 Pipet 5ml Cái 1

11 Bình tia Cái 1

12 Đũa thủy tinh Cái 1

13 Que cấy Cái 2

14 Đèn cồn Cái 2


16 Lam-lamen Cái 1

17 Cốc 1000ml Cái 3 Cả lớp

C . THIẾT BỊ


1 Tủ cấy Cái 1 Cả lớp

Tủ ấm, máy lắcsử dụng lưu

trong 1 tuần

2 Nồi hấp Cái 13 Cân phân tích Cái 1

4 Tủ ấm Cái 1

5 Lò vi ba Cái 1

6 Máy lắc Cái 1

7 Kính hiển vi Cái 1 1 tổ

Dung dịch xanh methylen (methylene blue) 0,1%

- Xanh methylen: 1g

- Nước cất: 1000ml

(Có thể pha thành dung dịch 1% sau đó lọc rồi pha loãng thêm 10 lần bằng nước cất).

3. NỘI DUNG

Sinh khối nấm men Saccharomyces cerevisiae là những tế bào sống được ứng dụng

trong: sản xuất đồ uống lên men, sản xuất bánh mì, sữa chua...và trong y học như sản

xuất thuốc hỗ trợ tiêu hóa biolactovin... Ngoài ra Saccharomyces cerevisiae còn được


30/45


quan tâm nhiều trong lĩnh vực thu nhận enzyme invertase để thủy phân đường

sacchrose thành đường nghịch đảo.

3.1 Chuẩn bị pha môi trƣờng

Thành phần môi trƣờng Hansen (g/l): Glucose 50 Tryptone 10 g

MgSO4.7H2O 2 g Nước 1000 ml

KH2PO4 3 g Agar 20 g

pH 5-6

Môi trường lỏng Hansen không cho agar trong thành phần môi trường. Phân phối môi

trường vào dụng cụ chứa, dán nhãn, ghi ngày giờ tên người pha chế. Hấp khử trùng

môi trường ở nhiệt độ 1210 C, 15 phút.

C huẩn bị:

Tổ 1: Pha môi trƣờng giữ giống nấm men: cân pha 200 ml môi trường Hansen đặc

(pha vào cốc 250 ml, đun sôi để tan hết agar ), sau đó phân phối cho mỗi tổ 20 ml chứa

trong 2 ống nghiệm (10 ml/ống).

Tổ 2: Pha môi trƣờng nhân giống cấp 1 Hansen lỏng: cân pha 200 ml môi trường

Hansen lỏng (cân các thành phần hóa chất trừ Agar vào cốc 250 ml, bổ sung nước cho

đủ 200 ml, khuấy tan, không đun), sau đó phân phối cho mỗi tổ 20 ml chứa trong 2

ống nghiệm (10 ml/ống).

Tổ 3: Pha môi trƣờng nhân sinh khối - Hansen lỏng: cân pha 1000 ml môi trường

Hansen lỏng (cân các thành phần hóa chất trừ Agar vào cốc 1000 ml, bổ sung nước

cho đủ 1000 ml, khuấy tan, không đun), sau đó phân phối cho mỗi tổ 100 ml chứa

trong bình tam giác 250 ml.

Tổ 4: chuẩn bị 4 bình tam giác 500 ml có chứa 400 ml nước cất, đậy nút bông, bao

gói.

Tổ 5: chuẩn bị 4 bình tam giác 500 ml có chứa 400 ml nước muối NaCl 0,85% (0,85 g

trong 100 ml), đậy nút bông, bao gói.Tổ 6: Đem toàn bộ phần chuẩn bị hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210 C, 15 phút.

Sau khi hấp xong lấy môi trường ra khỏi nồi hấp, tổ 6 đem môi trường nhân

sinh khối, NaCl 0,85% và nước cất để nguội, bảo quản trong nhiệt độ phòng, để sử

dụng sau 48h.

Các tổ chỉ sử dụng môi trường giữ giống làm 2 ống thạch nghiêng và 2 ống môi

trường nhân giống cấp 1 để cấy trong buổi thực hành này.

3.2. Cấy truyền giữ giống

-

Vệ sinh khu vực tổ bằng cồn 70%, chuẩn bị cấy truyền.


31/45


- Tất cả các tổ sử dụng ống giống nấm men Saccharomyces cerevisiae giáo viên

cung cấp cấy truyền vào 2 ống thạch nghiêng đã chuẩn bị.

- Lấy một vòng que cấy sinh khối nấm men, cấy zic zac trên ống thạch nghiêng.

- Ghi tên tổ/nhóm lớn/ngày cấy vào 2 ống nghiệm, sau đó đem cất lưu ở nhiệt độ

phòng trong 24 giờ.

Tiêu chí đánh giá kết quả của tổ (chụp hình báo cáo):

Số ống nhiễm trên tổng số ống. Đường cấy đẹp.

3.3. Nhân giống cấp 1

Các tổ sử dụng ống giống nấm men Saccharomyces cerevisiae (GV cung cấ p),

lấy 2 vòng que cấy cho vào mỗi ống nghiệm chứa 10 ml môi trường Hansen lỏng (môi

trường nhân giống cấp 1), khuấy nhẹ. Sau đó nuôi cấy 48 giờ ở điều kiện phòng.

3.4. Nhân sinh khối

Các nhóm đi theo lịch phân công ở phần phụ lục Lấy giống cấp 1 đưa toàn bộ sinh khối sang bình tam giác 250 chứa 100 ml môi

trường Hansen lỏng. Sau đó nuôi cấy lắc 150 vòng/1 phút ở 300C trong 72 giờ.

3.5 Quan sát hình thái nấm men

Quan sát vật kính 40:

- Lấy một phiến kính sạch nhỏ lên đó một giọt thuốc nhuộm (xanh methylen).

Giọt thuốc nhuộm không nên to quá (về sau sẽ tràn khỏi lamelle), cũng không nên

nhỏ quá (tạo thành nhiều bọt khí khi đậy lamelle).

-

Lấy một vòng sinh khối nấm men (từ ống giống GV cung cấp) hòa vào giọt

thuốc nhuộm. Đặt một cạnh của lamelle sát vào phía ngoài giọt mẫu rồi hạ từ từ

lamelle xuống cho giọt mẫu tràn đều khắp lamelle. Nếu tràn ra ngoài thì dùng giấy lọc

thấm bớt.

- Quan sát ở vật kính 40 và ghi nhận kết quả. Có thể căn cứ vào mức độ bắt màu

đậm nhạt để phân biệt được tế bào sống và tế bào chết.

Quan sát vật kính 100:

-

Dùng que cấy, phết dịch nấm men thành một lớp mỏng trên phiến kính.- Làm khô, cố định và nhuộm đơn bằng xanh methylen như khi nhuộm vi khuẩn.

- Quan sát ở vật kính 100 và ghi nhận kết quả.

4. BÁO CÁO

1. Giữ, nhân giống cấp 1, nhân sinh khối có bị nhiễm hay không? (ảnh chụp)

2. Hình thái tế bào nấm men quan sát trên vật kính 40, 100? (ảnh chụp)

3. Tìm hiểu quy trình rửa tế bào nấm men?




32/45


BÀI 5. TÁCH CHIẾT VÀ XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME

INVERTASE TÁCH TỪ SACCHAROMYCES CEREVI SIAE

1. MỤC ĐÍCH

- Tách chiết và thu nhận invertase từ sinh khối Saccharomyces cerevisiae.

- Xác định hoạt tính của invertase thô bằng phương pháp đường khử DNS.




A. HÓA CHẤT

STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

1 Saccharose 20g/lit Ml 100 PTN

2 HCl 0,1N Ml 100

3 Phenolphtalein 1% Ml 10

4 Glucose chuẩn 10mg/ml Ml 40

5 Thuốc thử DNS Ml 300

6 Nước cất 2 lần lit 4

7 Giấy nhôm cuộn Cuộn 1

8 Đệm acetate 0.1M

pH=4.5

ml 600 Lấy trước 48h

9 Sinh khối nấm men g 10 SV chuẩn bị

B. DỤNG CỤ


1 Cốc thủy tinh 1000ml Cái 1 cả lớp


3 Ống nghiệm phi 18 Cái 131 tổ

4 Giá ống nghiệm Cái 1


6 Pipet 5ml Cái 1

7 Pipet 10ml Cái 2

8 Pipet 1ml Cái 1


10 Bình tia Cái 1

11 Đũa thuỷ tinh Cái 1



33/45


13 Tam giác 100 Cái 1

14 Bình tam giác 100ml nút

mài

Cái 1 Mượn trước 48h

C. THIẾT BỊ STT TÊN THIẾT BỊ QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ

1 Máy Votex Cái 2 Cả lớp

2 Bếp điện Cái 10

3 Máy phá tế bào bằng

sóng siêu âm

Cái 1

4 Máy đo OD Cái 2

5 Xoong nhôm Cái 5

6 Kính hiển vi Cái 1 1 tổ 7 Tủ ấm đức Cái 1 Mượn trước 48h

8 Máy ly tâm Cái 2

9 Cân phân tích 2 số Cái 1

Phòng thí nghiệm chuẩn bị: Cân 5g DNS vào 300 ml nước cất vào cốc, hòa

tan ở 500C, sau đó thêm 5ml dung dịch NaOH 4M. Cuối cùng cho thêm 150g muối

tartrat kép hòa tan hoàn toàn rồi cho vào bình định mức bằng nước cất cho đủ 500ml,chứa trong bình thủy tinh sẫm màu.

Chuẩn 3 ml thuốc thử DNS bằng HCl 0.1N với thuốc thử là phenolphtalein, nếu

hết 5 - 6 ml HCl là được.

3. NỘI DUNG

Invertase tên khoa học là β-D-fructofuranoside fructohydrolase (EC 3.2.1.26) là

một loại enzym thủy phân saccharose thành glucose và fructose (tỉ lệ mol 1:1) còn

được gọi là đường nghịch đảo. Đường nghịch đảo được sử dụng khá phổ biến trong

công nghiệp nước giải khát và bánh ngọt.

Invertase có trong động thực vật, vi sinh vật (đặc biệt là nấm men có khả năng tổng

hợp invertase cao). Saccharomyces hiện là vi sinh vật được quan tâm nhiều nhất trong

lĩnh vực lên men tạo invertase.

Invertase của Saccharomyces gồm hai loại như sau: invertase nội bào có trọng

lượng phân tử vào khoảng 135000Da và invertase ngoại bào có trọng lượng phân tử

vào khoảng 270000Da.

Phản ứng thủy phân saccharose do invertase xúc tác như sau:


34/45


Invertase

Saccharose (đường không khử) Glucose + Fructose (đường khử)

O

H

OH

OH

H

OH

H

C HOH

O

O

HOH C

C HOH

OHHOH

HOH

O

H

OH

OH

H

OH

H

C HOH

OH

H

++

OC HOH

OHHO

H

HOH

HO

HOH C

Lượng glucose tạo thành sẽ phụ thuộc vào khả năng phân cắt của enzyme. Người ta

tiến hành định lượng glucose sinh ra sau thủy phân theo nhiều phương pháp khác nhau

như phương pháp Willsteate Schudel để biết được hoạt độ của enzyme (Trang 49-

T hực tập sinh hóa lớn - Lâm Thị Kim Châu, Trang 30- T hực tập sinh hóa cơ sở - Trần

Mỹ Quan).

3.1. Thu sinh khối nấm men (Tổ 1: Làm trước 48 giờ theo phân công ở phụ lục) - Dịch nấm men nhân sinh khối đem đi ly tâm lần 1 (4500 vòng/phút) trong 10

phút, loại dịch trong, thu hồi sinh khối nấm men.

- Tiếp tục phối trộn sinh khối nấm men với dung dịch nước muối NaCl (0,85%)

theo tỉ lệ 1/3 (w/w). Sau đó, tiến hành ly tâm (4500 vòng/phút) trong 10 phút để thu

nhận sinh khối nấm men Rửa bằng nước cất vô trùng theo tỉ lệ 1/3 (w/w) và giữ lại

sinh khối nấm men.

Bảo quản sinh khối nấm men ở 16-200C (ngăn mát của tủ lạnh).

3.2. Phá tế bào thu dịch enzyme thô

3.2.1. Phƣơng pháp tự phân (Tổ 1: Làm trước 48 giờ theo phân công ở phụ lục)

Trong quá trình tự phân nấm men, hệ enzyme tự phân có sẵn trong tế bào nấm

men được hoạt hóa. Chúng xúc tác phản ứng phân giải các chất có trong thành tế bào

nấm men và giải phóng enzyme invertase ra ngoài tế bào.

Cân 1g sinh k hối nấm men cho vào dung dịch đệm acetate pH = 5.5 theo tỷ lệ

1/6 (w/w) để thực hiện quá trình tự phân. Để trong tủ ấm 450C trong 50 giờ. Sau quá

trình tự phân, mẫu được ly tâm (5000 vòng/phút) trong 10 phút để tách bỏ phần khôngtan, phần dịch lỏng thu được là chế phẩm invertase thô. Sử dụng dịch enzyme này để

xác định hoạt tính.

3.2.2. Phƣơng pháp phá bằng sóng siêu âm

Tổ 2: Cân 1g sinh khối nấm men cho vào cốc 100 có chứa nước cất vô trùng theo tỷ lệ

1/6 (w/w). Dùng sóng siêu âm (tần số ?, thời gian ?) phá vỡ tế bào. Sau quá trình phá

tế bào, mẫu được ly tâm (5000 vòng/phút) trong 10 phút để tách bỏ phần không tan,

phần dịch lỏng thu được là chế phẩm invertase thô. Sử dụng dịch enzyme này để xác

định hoạt tính.


35/45


3.3. Xác định hoạt tính enzyme invertase

Nhóm chẵn xác định hoạt tính dịch enzyme tự phân

Nhóm lẻ xác định hoạt tính dịch enzyme phá sóng

- Hút 4ml dung dịch đệm acetate pH = 4,5; 4,6 ml nước cất và 0,4ml dịch chứa

enzyme cho vào bình tam giác 100ml.- Thêm vào 1ml dung dịch đường Sacchar ose nồng độ 2%.

- Lắc đều, để yên cho phản ứng xảy ra ở điều kiện phòng trong 15 phút.

- Đun cách thủy trong 2 phút và làm lạnh dưới vòi nước → mẫu thủy phân

dùng để xác định hàm lƣợng đƣờng glucose bằng phương pháp DNS, từ đó suy ra

số mol Saccharose đã bị thủy phân.

3.3.1. Định lƣợng đƣờng khử bằng phƣơng pháp acid dinitrosalicylic (DNS)

a. Nguyên tắc: Đường khử là các đường chứa nhóm aldehyde (-CHO) hoặc

ketone (-CO) như glucose, fructose, arabinose, maltose, lactose; trong khi đósaccharose, trehalose không phải đường khử.

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc

thử acid dinitrosalicylic (DNS). Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với

nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định. So màu tiến hành ở bước sóng

540nm. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính

được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu.

Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS acid:

b. Dựng đƣờng chuẩn và xác định hàm lƣợng đƣờng

- Cho vào 6 ống nghiệm sạch với các chất có thể tích như bảng sau:

Hóa chất Ống 1 Ống 2 Ống 3 Ống 4 Ống 5 Ống 6 Ống mẫu

Glucose 1% 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 0

Nước cất 10 9,8 9,6 9,4 9,2 9 0

Mẫu thủy phân 0 1

Nồng độ (%) ? ? ? ? ? ?

Hút 1ml từ ống 1 đến ống 6 vào 6 ống nghiệm tương ứng khác,

ống mẫu giữ nguyênThuốc thử DNS (ml) 3


36/45


Dùng giấy nhôm bịt kín đầu các ống nghiệm

Đặt vào nồi nước đang sôi trong 5 phút

Làm lạnh đến nhiệt độ phòng

OD ( = 540 nm) ? ? ? ? ? ? ?

Đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm với ống 1 để chỉnh OD = 0.

Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang (OD540nm), trục hoành là

nồng độ glucose.

Tìm phương trình biểu diễn đường chuẩn dạng y = ax + b với y = OD540nm; x =

[glucose] (%) và hệ số tương quan R 2 nhờ phần mềm Excel.

Chú ý: tiến hành các mẫu dựng đường chuẩn và mẫu thí nghiệm đồng thời.

c. Tính kết quả

- Từ phương trình đồ thị đường chuẩn tính được X (mg/ml) đường khử trongdung dịch đường pha lõang.

- Nhân với hệ số pha lõang n để được lượng đường trong 1 ml dung dịch gốc.

Chọn hệ số pha lõang n sao cho OD nằm trong giới hạn đường chuẩn.

- Tính hàm lượng đường trong nguyên liệu (mg/g) = X *n* V/m

V = thể tích dịch đường gốc (ml)

m = khối lượng mẫu cân (g)

Một đơn vị hoạt tính invertase là lượng enzyme cần thiết để thủy phân

micromol đường Saccharose trong phút ở điều kiện pH 45 và nhiệt độ 0oC.

Tính hoạt tính enzyme invertase.

4. BÁO CÁO

1. Nêu các bước thu nhận dung dịch invertase ?

2. Vẽ đường chuẩn glucose.

3. Tính hoạt tính của Invertase?

5. CÁCH THỨC ĐÁNH GIÁ Theo yêu cầu chung môn học


37/45


BÀI 6. SO SÁNH ĐỘNG HỌC ENZYME CỐ ĐỊNH VÀ ENZYME TỰ DO

1. MỤC ĐÍCH

Sau khi học xong bài sinh viên có khả năng:

- Xác định thông số động học của enzyme GOD tự do, cố định.

-

So sánh giá trị Vmax, Km của E tự do và cố định.- Nêu ưu, nhược điểm phương pháp sử dụng enzyme cố định và tự do.


Dụng cụ, hóa chất, thiết bị sử dụng cho bài thực hành được kê theo bảng 6.1.



A. HÓA CHẤT

STT TÊN HÓA CHẤT QUY CÁCH SL/ĐVT GHI CHÚ1 Nước cất 2 lần lit 3

2

Đệm acetate

pH =5.6

Ml 200

3 β-D-Glucose G 50

4 DNS Ml 650

5 NaOH 0,1N Ml 600

6 HCl 0,1N Ml 4007 Alginate G 100

8 CaCl2 2% Ml 3000

9 Bông thấm G 500

10 Bông không thấm G 500

11 Giấy pH Thếp 2

12 (NH4)2HPO4 g 0,4

Môi trường nuôi cấy

13 MgSO4.7H2O g 0,2

14 Peptone g 1015 Saccharose g 80

16 KH2PO4 g 0,2

17 NaOH rắn g 40

B. DỤNG CỤ



1 tổ 2 Pipet 5ml Cái 1

3 Cốc 100 Cái 2


38/45


4 Bình tia Cái 1

5 Quả bóp Cái 1

6 Đũa thủy tinh Cái 1

7 Bơm kim tiêm 1 cc Cái 2

8 Muỗn thủy tinh xúc hóachất

Cái 1

9 Panh kẹp Cái 1

10 Ống nghiệm cái 14

11 Ống đong 100 Cái 3 Cả nhóm

12 Pipet 5 Cái 12

13 Bình tam giác 100ml Cái 30

C.THIẾT BỊ


1 Máy quang phổ Cái 2

2 Cân 2 số Cái 1

3 Máy ổn nhiệt Cái 1

4 Máy khuấy từ Cái 4

5 Máy siêu âm Cái 1

6 Máy ly tâm Cái 1

7 Nồi hấp Cái 18 Máy lắc Cái 2

Cách pha dung dịch đệm acetate pH 5.6 Pha dung dịch A: Acetatic 0,2M: 11,55 ml CH3COOH đặc định mức tới 1000ml

Pha dung dịch B: Natri acetate 0,2M: 16,4g CH3COONa (27,2g CH3COONa.3H2O)

hòa tan định mức tới 1000ml

Trộn 4,8ml dung dịch A và 45,2 ml dung dịch B được 50ml đệm acetate pH =5,6

3. NỘI DUNG

Glucose oxidase (GOD, β-D-glucose: oxygen, 1-oxidoreductase, EC 1.1.3.4) là

enzym xúc tác quá trình oxi hóa β-D-glucose thành acid gluconic với oxi là chất nhận

điện tử và tạo ra hydro peroxide (H2O2). Là enzym đã được biết đến từ lâu, tuy nhiên

gần đây GOD đã thu hút được nhiều quan tâm và nghiên cứu trên thế giới bởi những

ứng dụng quan trọng trong thực phẩm và các lĩnh vực khác như y dược, hóa học lâm

sàng, công nghệ sinh học và trong công nghiệp dệt. Enzym được sử dụng trong sản

xuất chất tạo chua trong thực phẩm, làm trắng bột lòng trắng trứng, bảo quản thực phẩm, làm cảm biến sinh học để xác định hàm lượng đường glucose. Enzym được thu


39/45


40/45


41/45


Dựa vào đồ thị đường chuẩn với glucose tinh khiết, ta tính được hàm lượng glucose có

trong mẫu phân tích. Cường độ màu đo trên máy quang phổ tại bước sóng 540 nm.

Tiến hành

Ống nghiệm Đối chứng Enzyme tự do Enzyme/ nƣớc rửa

Glucose 1% (ml) 1 1 1

Đệm acetate pH= 5.6 (ml) 4 4 4

[glucose] (%) 0.2 0.2 0.2

GOD (ml) 0 1 1

Nước cất (ml) 1 0 0

Để yên trong 30 phút ở 30oC

Dừng phản ứng bằng cách đun cách thủy trong 3 phút

Chuyển sang các ống nghiệm tương ứng

Ống nghiệm Đối chứng Enzyme tự do Enzyme/ nước rửa

Dung dịch (ml) 1 1 1

DNS (ml) 3 3 3

Đun sôi trong 5 phút

Làm lạnh đến nhiệt độ phòng

OD 540nm ? ? ?

∆OD=ODM-ODKC

Lượng glucose (y)

Xác định hoạt tính

Một đơn vị hoạt độ của glucose oxidase là lượng enzyme dùng để chuyển hóa 1

µmol của glucose trong thời gian 1 phút ở điều kiện 30 oC và pH là 5.6.

3.7. Xác định thông số động học

3.7.1. Xác định thông số động học của enzyme tự doTiến hành thí nghiệm


Glucose 1% (ml) 0 1 2 3 4 5

Đệm acetate pH= 5.6 5 4 3 2 1 0

[glucose] (%) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

GOD 1%(ml) 1ml

Để yên trong 5 phút/37 C

Dừng phản ứng Đun cách thủy trong 3 phút


42/45




Dung dịch (ml) 1

DNS (ml) 3

Đun sôi 5 phút

Làm lạnh Nhiệt độ phòng

OD 540nm ? ? ? ? ? ?

∆OD=ODM-ODKC


Tính vận tốc phản ứng

Qua đó tính được 1/S và 1/V.

Tính Vmax và Km của enzyme tự do 3.7.1. Xác định thông số động học của enzyme cố định

Tiến hành thí nghiệm


Glucose 1% (ml) 0 1 2 3 4 5

Đệm acetate pH= 5.6 5 4 3 2 1 0

[glucose] (%) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

GOD cố định (g) 1

Để yên trong 5 phút/37 C

Dừng phản ứng Đun cách thủy trong 3 phút



Dung dịch (ml) 1

DNS (ml) 3

Đun sôi 5 phút

Làm lạnh Nhiệt độ phòng OD 540nm ? ? ? ? ? ?

∆OD=ODM-ODKC


4. BÁO CÁO

1. Tính giá trị Vmax, Km của GOD tự do và cố định2. So sánh, kết luận về thông số động học của enzyme tự do và cố định

3. Sinh viên tự xây dựng phương pháp xác định hoạt độ của GOD


43/45




Đổi đơn vị: 1mg = 3UI, 1ml=103 µg =106 ng

Bố trí thí nghiệm bài 6

STT Công việc Thời gian Nhiệm vụ 1 Hoạt hóa nấm mốc Chuẩn bị trước

buổi thực hành

Tổ 10

2 Nuôi cấy sinh tổng hợp GOD Tổ 9

3 Siêu âm trích ly e nội bào Làm trong buổi

thực hành

Tổ 8

4 Lập đường chuẩn Glucose Tổ 1, tổ 2

5 Xác định hoạt độ dịch e thô và nước rửa Các tổ làm

6 Tạo thể gel alginate Tổ 7

7 Cố định e Các tổ làm

8 XĐ thông số động học E cố định Các tổ chẵn

9 XĐ thông số động học E tự do Các tổ lẻ

Các nhóm lấy số liệu chéo của nhau để có đủ 9 phần việc của bài 6 để báo cáo.


44/45


TÀI LIỆU MÔN HỌC

Sách, giáo trình chính

[1] Bộ môn CNSH, Bài giảng thực hành công nghệ enzyme, Trường ĐH CNTP TP

HCM, 2014.

[2] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên), Công nghệ enyme, Nhà xuất bản Đại học quốc gia

TP.HCM, 2003.

Tài liệu tham khảo

[3] Lâm Thị Kim Châu, Nguyễn Thượng Lệnh, Văn Đức Chính, Thực tập lớn sinh

hóa, Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM, 1997 .

[4] Phạm Thị Ánh Hồng, 2006, Kỹ thuật hóa sinh, NXB ĐHQGTP HCM.

[5] Nguyễn Văn Mùi, 1999, Thí nghiệm hóa sinh NXB ĐHQGTP HCM.

[6] Trần Bích Lam, 2004, Thí nghiệm hóa sinh thực phẩm NXB ĐHQG TP HCM.[7] Nguyễn Đức Lượng, 2003, Thí nghiệm CNSH tập , NXB ĐHQGTP HCM.

[8] Trần Mỹ Quan, 2003, Thực tập hóa sinh cơ sở , NXB ĐHQGTP HCM.


45/45

PHỤ LỤC PHÂN CÔNG CHUẨN BỊ THỰC HÀNH NHÓM CÔ LINH

Documents

Bai Giang Thuc Hanh Enzyme -2014