Biochemistry of Bacterial Alcohol Dehydrogenases

1003KKU Res. J. 2013; 18(6)

ชีวเคมีของเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสในแบคทีเรียBiochemistry of Bacterial Alcohol Dehydrogenases

วรวัฒน พรหมเดน*

Worrawat Promden*

1 สาขาวิชาวิทยาศาสตรทั่วไป คณะครุศาสตร มหาวิทยาลัยราชภัฏบุรีรัมย* Correspondent author: [email protected]

บทคัดยอ

เอนไซมแอลกอฮอลดไีฮโดรจีเนสทําหนาทีเ่รงปฏิกริยิาออกซิเดชันหรือรดีกัชันทาํใหเกดิการเปล่ียนแปลง

ระหวางแอลกอฮอลและแอลดีไฮดหรือคีโตน สามารถจําแนกเอนไซมกลุมนี้ตามชนิดของตัวรับอิเล็กตรอนไดเปน

3 กลุม คือ แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสชนิดท่ีขึ้นกับ NAD(P)+ แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสชนิดที่ไมขึ้นกับ NAD(P)+

และแอลกอฮอลออกซิเดสชนิดที่ขึ้นกับ FAD มีการศึกษาพบวาเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสในแบคทีเรียมี

หลากหลายชนิดซึ่งมีความแตกตางกันหลายประการ เชน ลําดับนิวคลีโอไทด ลําดับกรดอะมิโน โครงสรางสามมิติ

ของโปรตีน คุณสมบัติทางจลนศาสตรการเรงปฏิกิริยาของเอนไซม ตําแหนงที่พบเอนไซมในเซลล ตลอดจนกลไก

การควบคุมการแสดงออกระดับยีน ในบทความนี้กลาวถึงองคความรูทางชีวเคมีพื้นฐานที่เกี่ยวของกับเอนไซม

แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสในแบคทีเรีย โดยเฉพาะอยางยิ่งในดานการออกซิเดชันของแอลกอฮอล

Abstract

Alcohol dehydrogenases (ADHs) catalyze the oxidative and reductive conversion of alcohols and

aldehydes or ketones. They can be divided into three major categories; The NAD(P)+- dependent

alcoholdehydrogenases, NAD(P)+ - independent alcohol dehydrogenases and FAD-dependent alcohol oxidases.

There are several varieties of alcohol dehydrogenases found in bacteria each of which may exist in several variants,

e.g., molecular properties, catalytic properties, localization as well as gene expression and regulation. This article

describes the basic knowledge of biochemistry that is related to bacterial alcohol dehydrogenases, especially in

oxidation of alcohols.

คําสําคัญ: แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนส ออกซิเดชันของแอลกอฮอล

Keywords: alcohol dehydrogenase, alcohol oxidation

KKU Res. J. 2013; 18(6): 1003-1020http : //resjournal.kku.ac.th

1004 KKU Res. J. 2013; 18(6)

1. บทนํา

แอลกอฮอลเปนสารประกอบอินทรียที่มีหมู

ไฮดรอกซลิ (hydroxyl group, -OH) ตออยูกบัอะตอมของ

คารบอน โดยท่ีเมทานอล (methanol) เปนแอลกอฮอลทีม่ี

จํานวนอะตอมคารบอนนอยท่ีสุดคือมีจํานวน 1 อะตอม

(C1) แอลกอฮอลโมเลกุลขนาดเล็กระหวาง C1-C3

สามารถละลายน้ําไดดแีละคุณสมบัตกิารละลายน้ําจะลด

ลงเม่ือจํานวนอะตอมคารบอนมากข้ึน ในปฏิกิริยาเคมี

ทั่วไปการออกซิเดชันของแอลกอฮอลปฐมภูมิ (primary

alcohol) จะไดผลิตภัณฑเปนแอลดีไฮด (aldehyde)

ซึ่งจะสามารถเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันตอไปเปนกรด

คารบอกซลิกิ (carboxylic acid) สวนการออกซเิดชนัของ

แอลกอฮอลทุตติยภูมิ (secondary alcohol) จะไดคีโตน

(ketone) ในขณะที่การออกซิเดชันของแอลกอฮอล

ตติยภูมิ (tertiary alcohol) จะเกิดข้ึนไดยาก

ในระบบชีวภาพกระบวนการเมแทบอลิซึม

ของแอลกอฮอลผานกระบวนการออกซิเดชันมีความ

สําคัญตอสิ่งมีชีวิตหลายชนิดโดยอาจมีวัตถุประสงค

แตกตางกันไป สําหรับในมนุษยแอลกอฮอลชนิด

เอทานอล (ethanol) ที่รับประทานเขาไปจะถูกทําลาย

ที่ตับโดยเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนส (alcohol

dehydrogenase, ADH) เกิด เปนอะซีทาลดีไฮด

(acetaldehyde) และเปลีย่นแปลงเปนกรดแอซติกิ (acetic

acid) โดยเอนไซมแอลดีไฮดดีไฮโดรจีเนส (aldehyde

dehydrogenase, ALDH) แมวาเมแทบอลซิมึของเอทานอล

ในทายท่ีสุดแลวจะใหพลังงานแกรางกายแตไมจัดเปน

การบริโภคสารอาหารเพราะถือวาเปนกลไกกําจัดสาร

พิษของร่างกาย (detoxification)(1,2) ในขณะท่ีระบบ

เมแทบอลิซึมของสิ่งมีชีวิตทุกชนิดมีความตองการ

นํ้าตาลกลูโคส ซึ่งทําหนาที่เปนสารประกอบหลักใน

กระบวนการเมแทบอลิซึมที่มีวิถีการสลายสารประกอบ

เพื่อใหไดพลังงาน แตสําหรับจุลินทรียบางชนิดพบวา

ในสภาวะที่ขาดแคลนอาหารจุลินทรียไดแสดงความ

สามารถในการใชแอลกอฮอลชนดิตางๆ เปนแหลงอาหาร

เพื่อการสัง เคราะหพลังงานและการเจริญเติบโต

ไดเปนอยางดีไดแก Methylobacterium extorquens(3),

Comamonas testo steroni (4), Pseudomonas aeruginosa(5)

และ Pseudomonas putida(6) เปนตน คุณสมบัติที่โดดเดน

ของจุลินทรีย เหลาน้ีทําใหสามารถนํามาศึกษาและ

ประยุกตใชใหเกิดประโยชนไดทั้งในเทคโนโลยีชีวภาพ

ดานตางๆ รวมถึงการบําบัดสารมลพิษที่ปนเปอนใน

สิ่งแวดลอมดวยจุลินทรีย เชน พอลิไวนิลแอลกอฮอล

(polyvinyl alcohol) และสารประกอบไฮโดรคารบอน

ตางๆ(7, 8)

สารประกอบแอลกอฮอลในระบบเมแทบอลิซมึ

ของจุลินทรียอาจไดมาจากกระบวนการหมักสารอาหาร

ประเภทคารโบไฮเดรตหรืออาจมาจากกระบวนการ

เมแทบอลิซึมของสารประกอบไฮโดรคารบอน ซึ่งเปน

ผลิตภัณฑจากอุตสาหกรรมปโตรเลียมท่ีปนเปอนใน

สิ่งแวดลอม ปจจัยสําคัญในการเกิดปฏิกิริยาการยอย

สลายสารอินทรียเหลานี้คือเอนไซมชนิดตางๆ ในแตละ

ขั้นตอนของลําดับปฏิกิริยา ดังนั้นเฉพาะจุลินทรียที่มี

รหัสพันธุกรรมสําหรับกําหนดรหัสใหเอนไซมอยาง

จําเพาะตอซับสเตรต (substrate) ชนิดหนึ่งๆ เทานั้น

จึงจะมีความสามารถในการยอยสลายสารประกอบ

เหลาน้ีได แมวาจะเปนเอนไซมทีเ่รงปฏิกริยิาชนิดเดียวกัน

ในสิ่งมีชีวิตตางชนิดกัน ก็ยังพบความแตกตางกันในเชิง

อณูชีววิทยาของเอนไซม เชน ตําแหนงที่พบในเซลล

โครงสรางสามมติ ิคณุสมบตัทิางจลนศาสตรของเอนไซม

ลําดับกรดอะมิโน ลําดับนิวคลีโอไทดและกลไกการ

ควบคุมการแสดงออกระดับยีนการศึกษาในเชิงลึกระดับ

อณูชวีวิทยาจะทําใหเกดิองคความรูในธรรมชาติของส่ิงมี

ชีวิตน้ันๆ อันจะเปนพื้นฐานสําคัญในการประยุกตสูการ

ใชประโยชนดานตางๆ ใหเกดิประสิทธภิาพสูงสดุ รวมถึง

เพื่อการดัดแปลงพันธุกรรมใหสอดคลองกับความ

ตองการใชเฉพาะดาน

บทความน้ีจะกลาวถึงความรูพื้นฐานและ

วิธีการศึกษาวิจัยเบื้องตนทางชีวเคมีที่ของเอนไซม

แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสในแบคทีเรียเพ่ือเปนแนวทาง

ในการศึกษาวิจัยทางชีวเคมีขั้นสูงตอไป

1. เอนไซมทีเ่กีย่วของในการออกซเิดชนัของ

แอลกอฮอลและการรีดักชันของแอลดีไฮดในแบคทีเรีย

แหลงที่มาของแอลกอฮอลในแบคทีเรียกอน

ที่จะเขาสูกระบวนการออกซิเดชันอาจมีสารตั้งตน

1005KKU Res. J. 2013; 18(6)

ชนิดอื่นที่ไมใชแอลกอฮอลแตถูกเปลี่ยนแปลงโดย

เอนไซมที่ จํ า เพาะตอซับสเตรตทําหนาที่ เติมหมู

ไฮดรอกซิลใหกลาย เปนแอลกอฮอลซึ่ ง เรี ยกว า

กระบวนการไฮดรอกซิเลชัน (hydroxylation) โดย

เอนไซมกลุมนี้มีชื่อเรียกทั่วไปคือเอนไซมไฮดรอกซิเลส

(hydroxylase) หรอืโมโนออกซิเจนเนส (monooxygenase)

ในปฏิกิริยาจะมีการรีดิวซโมเลกุลออกซิเจน (O2) ใหแก

หมูไฮดรอกซลิและโมเลกลุของนํา้อยางละ 1 อะตอม โดย

ปฏิกิริยาเกิดขึ้นรวมกับการออกซิเดชันของโคเอนไซม

(coenzyme) เชน NAD(P)H (nicotinamide adenine

dinucleotide (phosphate) เม่ือพิจารณาโครงสรางโมเลกลุ

ของแอลกอฮอลปฐมภมูจิะพบวาโครงสรางของโมเลกลุที่

เปนสารตั้งตน (precursor) กอนท่ีจะเกิดเปนแอลกอฮอล

คือสารประกอบแอลเคน (alkane) ดังนั้นเอนไซมที่ทํา

หนาที่เติมหมูไฮดรอกซิลใหแกโมเลกุลแอลเคนจึงเรียก

วาเอนไซมแอลเคนไฮดรอกซเิลสหรอืแอลเคนโมโนออก

ซเิจนเนส ดงัปฏิกริยิาในรปูที ่1 นอกจากน้ันยงัมกีารเรยีก

ชื่อเอนไซมเหลานี้ตามชนิดของซับสเตรตที่จําเพาะโดย

เรียกช่ือของซับสเตรต เชน มีเทน โพรเพนหรือ บิวเทน

แลวตอดวยคําวาโมโนออกซิเจนเนส ในกรณีที่เอนไซม

มีความจําเพาะตอซับสเตรตอยางกวางขวางเปนกลุม

ใหญ อาจมีการเรียกชื่อเอนไซมดวยกลุมของซับสเตรต

เชนแอลเคนโซสั้น (short chain alkane) แอลเคนโซยาว

ปานกลาง (medium chain alkane) และแอลเคนโซยาว

(long chain alkane) และตอดวยคําวาโมโนออกซิเจนเนส

รูปท่ี 1 กระบวนการเมแทบอลิซมึของสารประกอบแอลเคน (ตวัอยางคอืบวิเทน)ใน Pseudomonas spp. โดยเอนไซม

แอลเคนโมโนออกซิเจนเนสเกิดแอลกอฮอลเปนสารมัธยันตร (intermediate หรือ metabolite) แอลกอฮอล

เปล่ียนเปนแอลดีไฮดโดยเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนส และเกิดปฏิกิริยาออกซิเดชันตอเน่ืองจนได

พลังงานสําหรับเซลล (รูปดัดแปลงจาก Rojo F. (9)

เอนไซมในลําดับตอจากกระบวนการเติมหมู

ไฮดรอกซิลใหแกโมเลกุลแอลเคนคือเอนไซมแอลกอฮอล

ดไีฮโดรจเีนสซึง่มบีทบาทชดัเจนในกระบวนการออกซเิดชนั

ของแอลกอฮอลเอนไซมกลุมนีม้แีนวทางการเรยีกชือ่ใน

ทํานองเดียวกับเอนไซมแอลเคนโมโนออกซิเจนเนสคือ

ขึน้ตนดวยชือ่กลุมหรือชือ่เฉพาะของซับสเตรตแตลงทาย

ดวยคําวาดีไฮโดรจีเนส (dehydrogenase) ซึ่งมีความ

หมายถึงการออกซิไดซโมเลกุลซับสเตรตโดยปฏิกิริยา

รีดักชันซ่ึงถายทอดไอออนประจุลบของไฮโดรเจน

(hydride, H-) ไปยังตัวรับอิเล็กตรอนประเภทโคเอนไซม

เชน NAD+ หรอืไพโรโลควโินลนีควโินน (pyrroloquinoline

quinone, PQQ) เปนตน ตัวอยางของโมเลกุลแอลกอฮอล

ถกูออกซิไดซเปนแอลดีไฮดในแบคทีเรยี ไดแก เมทานอล

ถูกออกซิไดซเปนฟอรมาลดีไฮด (formaldehyde) โดย

เอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสที่เรียกวาเมทานอล

ดไีฮโดรจเีนส (methanol dehydrogenase, MDH) ในขณะที่

เอทานอลถูกออกซิไดซเปนอะซีทาลดีไฮด โดยเอนไซม

แอลกอฮอลดไีฮโดรจีเนสท่ีเรยีกวาเอทานอลดีไฮโดรจีเนส

(ethanol dehydrogenase, EDH) เปนตน

1006 KKU Res. J. 2013; 18(6)

เอนไซมที่สําคัญในลําดับตอจากนี้คือเอนไซม

แอลดีไฮดดี ไฮโดรจี เนสซ่ึงจะออกซิไดซโมเลกุล

แอลดีไฮดใหเปนกรดคารบอกซิลิกซึ่งมีคุณสมบัติเปน

กรดออน กรดคารบอกซิลิกท่ีเกิดข้ึนมีชื่อเรียกตาม

จํานวนคารบอนไดแก กรดแอซีติก (acetic acid, C2)

กรดโพรพิโอนิก (propionic acid, C3) เปนตน กรณีที่

โซคารบอนของโมเลกุลกรดคารบอกซิลกิมคีวามยาวมาก

ขึน้จะมคีณุสมบตักิารละลายน้ําลดลง ไดแก กรดบวิทริกิ

(butyric acid, C4) กรดออกทาโนอิก (octanoic acid, C8)

และเม่ือมคีวามยาวมากข้ึนกวานีจ้ะจดัเปนกรดไขมัน หมู

คารบอกซิลของกรดอินทรยีหรอืกรดไขมันจะถกูเชือ่มตอ

ดวยโมเลกลุ โคเอนไซมเอ (coenzyme A, CoA) ดวยพนัธะ

ไทโอเอสเทอร (thioester) โดยเอนไซมในกลุมไลเกส

(ligase) คือเอนไซมเอซิลโคเอซินเธเทส (acyl CoA

synthetase) ไดผลิตภัณฑเปนแฟตตีเอซิลโคเอนไซมเอ

(fatty acyl coenzyme A) ซึ่งพรอมจะเขาสูการสลายกรด

ไขมันดวยกระบวนการเบตาออกซิเดชัน (β-oxidation)

ซึง่จะมีการตัดคารบอนออกคร้ังละ 2 อะตอมจากโมเลกุล

ของแฟตตีเอซิลโคเอนไซมเอไดผลิตภัณฑเปนอะซิติล

โคเอนไซมเอ (acetyl coenzyme A) และเขาสูวัฏจักร

กรดซิตริก (citric acid cycle) ไดผลิตภัณฑสุดทายเปน

คารบอนไดออกไซดและ NADH ซึง่ NADH จะเขาสูหวง

โซการถายทอดอิเล็กตรอน (electron transport chain)

เพื่อผลิตสารประกอบพลังงานสูง คือ ATP (adenosine

triphosphate)

อยางไรก็ตามจุลินทรียบางชนิดที่มีความเปน

เอกลักษณเฉพาะตัวอาจจะมีกระบวนการเมแทบอลิซึม

ที่ตรงขามการยอยสลาย ซึ่งหมายถึงการสังเคราะห

แอลกอฮอลจากสารอาหารดังรูปที่ 2 แบคทีเรียที่พบ

วิถี เมแทบอลิซึมในลักษณะนี้ ไดแก Clostridium

acetobutylicum ที่สามารถผลิตบิวทานอลไดจากการ

ยอยสลายน้ําตาลกลูโคสในกระบวนการไกลโคไล

ซิส (glycolysis) ไดผลิตภัณฑเปนไพรูเวท (pyruvate)

และเกิดปฏิกิริยาตอไปเปนอะซิติลโคเอนไซมเอ จนกระทั้ง

เปนบิวทิรัลดีไฮด (butyraldehyde) และถูกเอนไซมบิว

ทานอลดีไฮโดรจีเนส (butanol dehydrogenase, BDH)

เปลี่ยนใหกลายเปนบิวทานอลในที่สุด ในกรณีนี้จะเห็น

วาปฏิกิริยาสุดทายที่เรงโดยเอนไซมบิวทานอลดีไฮโดร

จีเนสเปนการผันกลับจากสารประกอบแอลดีไฮดกลาย

เปนแอลกอฮอลซึ่งจัดเปนปฏิกิริยารีดักชัน

รูปท่ี 2 วถิเีมแทบอลซิมึใน Clostridium acetobutylicum ทีม่กีารสงัเคราะหแอลกอฮอลจากสารอาหาร โดยเอนไซม

แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนส (EDH และ BDH) ทําหนาที่เปลี่ยนแอลดีไฮดใหเปนแอลกอฮอล (รูปดัดแปลง

จาก Lutke-Eversloh T. และคณะ (10) และ Cooksley C. M. และคณะ (11)

1007KKU Res. J. 2013; 18(6)

2. การจํ า แนกประ เภทของ เ อนไซม

แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสในแบคทีเรีย

การศึกษา เกี่ ยวกับ เอนไซมแอลกอฮอล

ดไีฮโดรจีเนสมีรายงานคร้ังแรกในป ค.ศ. 1937 เริม่จากการ

คนพบและทําเอนไซมใหบรสิทุธ์ิจากยีสต Saccharomyces

cerevisiae และกลาวไดวานบัตัง้แตป ค.ศ. 1950 เปนตนมา

ไดมีการศึกษาเกี่ยวกับเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนส

อยางแพรหลายและเร่ิมมผีลงานวิจยัออกมาอยางตอเน่ือง

ในป ค.ศ. 1961 มีรายงานเก่ียวกับกลไลการเรงปฏิกิริยา

ของแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสที่สกัดจากตับมา (horse

liver alcohol dehydrogenase)(12) และในชวงเวลา

เดียวกันก็มีการศึกษาแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสในแมลง

สกุลแมลงหวี่ หรือ Drosophila(13) ซึ่งเอนไซม

แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสจากยีสต มา และแมลงหว่ี

นับไดวาเปนตนแบบการวิจัยและใชอางอิงเปรียบเทียบ

ของการศกึษาแอลกอฮอลดไีฮโดรจเีนสในยคุตอๆ มา(14)

จากการที่องคความรูดานชีวเคมีและขอมูล

ชีวภาพมีมากขึ้นในการประชุมวิชาการชีวเคมีนานาชาติ

(3rd International Congress of Biochemistry) ระหวาง

วนัท่ี 1-6 สงิหาคม ป ค.ศ. 1955 ณ เมอืงบรสัเซลล (Brussels)

ประเทศเบลเยียม มีการพิจารณาการจัดหมวดหมูของ

เอนไซมและกําหนดใหมีระบบเลขรหัสของเอนไซม

(Enzyme Commission number, EC number) โดยประกาศ

ใชคร้ังแรกในป ค.ศ. 1961 จนกระทัง่ในป ค.ศ. 1992 สมาคม

ชวีเคมแีละอณชูวีวทิยานานาชาต ิ(International Union of

Biochemistry and Molecular Biology) ไดมกีารปรับปรุง

EC number เปนคร้ังที่ 6 และใชจนถึงปจจุบัน ตัวเลข

ของ EC number จะมี 4 ชุด (EC x.x.x.x) ตัวเลขชุดแรก

ใชระบุชั้น (class) ของเอนไซมซึ่งมีเพียง 6 ชั้น ตัวเลขชุด

ที่ 2-4 ใชระบุ subclasssub-subclass และ serial number

ตามลําดับตัวอยางเอนไซมเรงปฏิกิริยาชีวเคมีชนิดที่มี

การเคลื่อนยายอิเล็กตรอนจากโมเลกุลหนึ่งซึ่งเรียกวาตัว

ใหอิเล็กตรอน (electron donor) ไปยังอีกโมเลกุลหนึ่ง

ซึ่งเปนตัวรับอิเล็กตรอน (electron acceptor) มีการจัด

หมวดหมูเอนไซมทีม่ปีฏกิริยิาลกัษณะน้ีอยูในชัน้ (class)

ออกซิโดรีดักเทส (oxidoreductase) กําหนดใหตัวเลข

class ของ EC number เปน EC 1 หากเอนไซมทาํปฏิกริยิา

บนหมูไฮดรอกซิลจะมีการกําหนดตัวเลข subclass ของ

EC number เปน EC 1.1 และหากเอนไซมแตละชนิดอาจ

มีตัวรับอิเล็กตรอนท่ีจําเพาะ เชน NAD(P)+ ไซโตโครม

(cytochrome) ควิโนน (quinone) หรือคอปเปอรโปรตีน

(copper protein) เปนตนจะกําหนดตัวเลข sub-subclass

ของ EC number เปน EC 1.1.1 EC 1.1.2 EC 1.1.5 หรือ

EC 1.1.9 ตามลําดับเปนตน และในกรณีของเอนไซม

แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสท่ีเรงปฏิกิริยาการเปล่ียนแปลง

แบบผันกลับไดระหวางแอลกอฮอลและแอลดีไฮดโดยมี

NAD+/NADH เปนตัวรบัสงอเิลก็ตรอน จะกาํหนดตวัเลข

serial number ของ EC number เปน EC 1.1.1.1

ในสิ่งมีชีวิตตางชนิดกันแมวาจะมีเอนไซม

แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสทําหนาที่เรงปฏิกิริยาชนิด

เดียวกันแตพบวามีความแตกตางกันตั้งแตลําดับของ

นิวคลีโอไทด (nucleotide sequence) ชนิดของตัวรับ

อิเล็กตรอน จนกระท้ังมีความแตกตางกันในดานความ

จําเพาะตอซับสเตรตแมวาจะมีการจัดหมวดหมูและ

ระบบเรียกช่ือเอนไซม เพือ่ใหสามารถศึกษาเขาใจในภาพ

รวมของเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสจึงจัดจําแนก

ตามชนิดของตัวรับอิเล็กตรอนไดเปน 3 กลุมดังนี้

2.1 แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสชนิดที่ขึ้น

กับ NAD(P)+ (NAD(P)+-dependent ADH)

แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสชนิดที่ขึ้นกับ

NAD+ หรือ NADP+ พบไดในส่ิงมีชีวิตหลากหลายชนิด

เชน สัตว พืช จุลินทรีย สามารถเขียนเปนสมการของ

ปฏิกิริยาไดดังนี้

ในแบคทีเรียจะพบวาเอนไซมกลุมนี้เปน

เอนไซมชนิดละลายนํ้า (soluble enzyme) พบในสวน

ไซโทพลาซึมของเซลล (15) โครงสรางปฐมภูมิของ

เอนไซมกลุมนี้พบวามีไทโรซีน (tyrosine residue) ใน

บริเวณเรง (active site) และลําดับกรดอะมิโนที่มีไกลซีน

มาก (glycine-rich sequence) ซึง่มลีาํดบัเปน GGXXGXG(16)

หรอื GXGXXG หรอื GXXGXXG(17) สาํหรับขึน้รปูเปน

โครงสราง 3 มิติของโปรตีนแบบ β sheet-turn- α helix

1008 KKU Res. J. 2013; 18(6)

เพ่ือใชเปนบริเวณยึดจบั (binding site) โมเลกุล NAD+หรอื

NADP+(18,19) นอกจากน้ียังสามารถจําแนก NAD(P) +-

dependent ADH ออกเปน 3 กลุมยอยไดดังนี้

2.1.1 แอลกอฮอลดไีฮโดรจีเนสชนิด

ขึ้นกับสังกะสี (zinc-dependent ADH) หรืออาจเรียก

วากลุมที่ 1 ซึ่งโมเลกุลของเอนไซมจะมีอะตอมสังกะสี

อยูในภายในทําหนาเปนโคแฟคเตอรในการเรงปฏิกิริยา

ดงันัน้จงึมลีาํดบักรดอะมิโนทีเ่ปนสวนอนรุกัษ (conserve

region) สาํหรบัจบัอะตอมสังกะสี (catalytic zinc binding

motif) คือ GHEXXGXVXXXGXXV(20) ดังรูปที่ 3 ซึ่ง

แสดงถึงการมีวิวัฒนาการรวมกันของส่ิงมีชีวิตตั้งแต

แบคทีเรียไปจนถึงสัตวเลี้ยงลูกดวยนม เอนไซมกลุมนี้มี

ความยาวของกรดอะมิโนโดยเฉล่ีย 350 อะมิโนตอหนวย

โปรตนีจงึมีชือ่เรยีกวาแอลกอฮอลดไีฮโดรจเีนสชนดิสาย

ยาว (long chain alcohol dehydrogenase) หรอือาจเรยีกวา

แอลกอฮอลดไีฮโดรจีเนสชนดิสายยาวปานกลาง (medium

chain alcohol dehydrogenase) เนื่องจากมีความยาวของ

กรดอะมิโนโดยเฉลี่ยยาวกวาแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนส

ชนดิไมขึน้กับสงักะสี แตสัน้กวาแอลกอฮอลดไีฮโดรจีเนส

ชนิดไอรอนแอคทิเวเท็ตเพียงเล็กนอย


ไมขึ้นกับสังกะสี (zinc-independent ADH) หรือกลุมที่

2 เมื่อพิจารณาตารางท่ี 1จะสังเกตไดวามีความยาวของ

กรดอะมิโนสั้นกวากลุมที่ 1 โดยมีกรดอะมิโนประมาณ

250 อะมิโนตอหนวยโปรตีนและไมมีอะตอมสังกะสี

ภายในโมเลกุลเอนไซม ซึ่งจะพบลําดับกรดอะมิโน

อนุรักษสําหรับยึดจับโมเลกุล NAD(P)+ แตไมพบลํา

ดับกรดอะมิโนอนุรักษสําหรับยึดจับกับอะตอมสังกะสี

ดงัน้ันจงึมชีือ่เรยีกอกีอยางหนึง่วาแอลกอฮอลดไีฮโดรจเีนส

ชนิดสายสั้นและไมมีโลหะ (metal-free short-chain

alcohol dehydrogenase) ในอดีตเอนไซมกลุมนี้มีการ

ศึกษากันครั้งแรกในแมลงสกุล Drosophila และนิยมใช

แอลกอฮอลดไีฮโดรจีเนสของ D. melanogaster (แมลงหว่ี)

เปนตัวแทนในการกลาวถึงเอนไซมกลุมนี้


ไอรอนแอคทิเวเท็ต (iron activated ADH) หรือกลุมที่ 3

เอนไซมกลุมน้ีพบมากในแบคทเีรยีและรา โมเลกลุเอนไซม

มีจํานวนกรดอะมิโนประมาณ 380 อะมิโนตอหนวย

โปรตีน และบางชนิดอาจพบวามีความยาวถึง 900 อะมิ

โนตอหนวยโปรตีน ภายในโมเลกุลของเอนไซมมีเหล็ก

เปนองคประกอบ ซึง่โครงสรางปฐมภูมขิองโปรตีนจะพบ

ลําดับกรดอะมิโนอนุรักษสําหรับใชยึดจับอะตอมเหล็ก

รูปท่ี 3 การจัดวางแนวลําดับกรดอะมิโน (amino acid alignment) ของเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสชนิดที่

ขึ้นกับ NAD(P)+ กลุมที่ 1 จากส่ิงมีชีวิตชนิดตางๆ เชน Saccharomyces cerevisiae (P00330), Acetobacter

pasteurianus (AEN03783), Bacillus cereus (ZP04296089), Pseudomonas putida (YP003617171), Equus

caballus (NP001075414) และ Clostridium beijerinckii (P25984) ในกรอบสี่เหลี่ยมคือลําดับกรดอะมิโน

สวนอนุรักษที่พบในส่ิงมีชีวิตตางชนิดกัน ขอมูลลําดับกรดอะมิโนและรหัส accession number สืบคนจาก

ฐานขอมูล GenBank

1009KKU Res. J. 2013; 18(6)

(iron-binding motif, GXXHXXAHXXGXXXXXPHG)

(21) มรีายงานการคนพบเอนไซมนีค้รัง้แรกในแบคทเีรีย

Zymomonas mobilis(22) ดังนั้นจึงนิยมใชเปนตัวแทน

อางถึงเอนไซมในกลุมนี้

ตารางที่ 1 แสดงลักษณะขอมูลทางโครงสรางของเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสชนิดที่ขึ้นกับ NAD(P)+

ทั้ง 3 กลุม ที่พบในส่ิงมีชีวิตชนิดตางๆ

กลุม สิ่งมีชีวิตชื่อเอนไซม (ตัวยอ)/

Accession No.

จํานวน subunit

(โครงสราง

จตุรภูมิ)

จํานวนกรด

อะมิโนตอ

subunit

อางอิง

Group I

Zinc-dependent

ADHs

Equus caballus

(มา)

Horse liver alcohol

dehydrogenase

(HLADH) /

NP001075414

2

(homodimer)374 (23, 24)

Saccharomyces

cerevisiae

(ยีสต)

alcohol dehydrogenase I

(SADH I) /

P00330

4

(homotetramer)348 (25, 26)

Clostridium

beijerinckii

alcohol dehydrogenase

(CBADH) /

P25984

4


Acetobacter

pasteurianus

SKU1108


(ADH I) /

AEN03783

3

(homotrimer)342 (29, 30)

Group II

Zinc-independent

ADHs

Drosophila

melanogaster

(แมลงหวี่)


(DmADH) / P00334

2

(homodimer)256 (14)

Geobacillus

thermoleovorans


(Bt-ADH) /

BAA94092

- 249 (16)

Thermus

thermophilus


(ADHTt

) / YP005594

4


Lactobacillus

brevis


(LB-RADH)/ YP794310

4


Group III

iron activated

ADHs

Zymomonas

mobilis


(ZADH-2)/ 3OWOA

4


Escherichia coli

L-lactaldehyde and L-1,2-

propanediol dehydrogense

(FucO) / P0A9S1

2

(homodimer)383 (36)

Bacillus

methanolicus

Methanol dehydrogenase

(MDH) / AAA22593

10

(homodecamer)381 (37)

Clostridium

acetobutylicum

Butanol dehydrogenase A

(BDH I) / AAK81232

2

(homodimer)389 (38-40)

1010 KKU Res. J. 2013; 18(6)

2.2 แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสชนิดที่ไม

ขึ้นกับ NAD(P)+ (NAD(P) +-independent ADH)

เปนเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนส

ชนิดท่ีไมขึ้นกับ NAD(P)+ พบไดในสิ่งมีชีวิตหลายชนิด

เชน สัตว พืช จุลินทรียสามารถเขียนเปนสมการของ

ปฏิกิริยาไดดังน้ี

เมื่อ 2X(ox)

และ 2X(red)

คือ รูปแบบท่ี

ถูกออกซิไดสและถูกรีดิวซของตัวรับอิเล็กตรอน (X)

ตามลําดับ เอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสชนิดน้ี

พบมากในแบคทีเรียแกรมลบ (Gram negative bacteria)

โดยโมเลกุลเอนไซมจะมีหมูพรอสเธติก (prosthetic group)

เปนสารประกอบไพโรโลควโินลนีควโินน (pyrroloquino-

line quinone, PQQ) หรอืเปนโคเอนไซม F420

(8-hydroxy-

5-deazafl avin) ซึ่งทําหนาท่ีเปนตัวรับอิเล็กตรอน

เอนไซมที่มี PQQเปนหมูพรอสเธติก

จะมีชื่อเรียกโดยรวมวา ควิโนโปรตีน (quinoprotein)

หรืออาจเรียกวาเอนไซมที่ขึ้นกับ PQQ (PQQ-dependent

enzyme)ซึ่ง PQQ ถูกคนพบครั้งแรกในป ค.ศ. 1964

โดย J.G. Hauge(41) โดยพบวาเปนหมูพรอสเธติกของ

เอนไซมกลูโคสดีไฮโดรจีเนส (glucose dehydrogenase)

ของแบคทีเรยีและตอมาในป ค.ศ.1967 มรีายงานวา PQQ

เปนหมูพรอสเธติกของเอนไซมเมทานอลดีไฮโดรจีเนส

ในแบคทีเรีย Pseudomonas sp. M27 โดยเรียก PQQ วา

methoxatin(42) ซึ่งนับวาเปนรายงานครั้งแรกของ

เอนไซมแอลกอฮอลดไีฮโดรจเีนสชนดิท่ีมหีมูพรอสเธตกิ

เปน PQQ และภายหลังมีการศึกษาอยางละเอียดถึง

โครงสรางระดับโมเลกุลในแบคทีเรียชนิดอ่ืนๆ ควิโน

โปรตีนแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนส (quinoprotein alcohol

dehydrogenase, QADH) สามารถจําแนกไดเปน 3

ประเภทตามคุณสมบัติทางอณูชีววิทยา การเรงปฏิกิริยา

และรวมไปถึงตําแหนงในเซลลที่พบเอนไซม (43) ไดแก

ADH-I ADH-II และ ADH-III ดังแสดงในตารางท่ี 2

2.2.1 ADH-I เปนเอนไซมชนิดท่ี

ละลายนํา้พบอยูในสวนของเพรพิลาซมึ (periplasm) ซึง่อยู

ระหวางเยื่อเซลลชั้นนอกและช้ันใน ลักษณะโครงสราง

ของเอนไซมประกอบดวยหนวยยอย 2 หนวย ทีเ่หมือนกัน

(homodimeric enzyme) แตละหนวยมีขนาดประมาณ

60-65 กิโลดาลตัน (kDa) และมี PQQ เปนหมูพรอสเธติก

เพียงอยางเดียว โดยมีรายงานวาพบใน P. aeruginosa

P. butanovora และ P. putida (6, 23) เปนตน ตวัอยาง ไดแก

เอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสชนิดที่มีความชอบ

(affinity) ต่อเอทานอลสูงกว่าแอลกอฮอล์ชนิดอื่นๆ

จะมีชื่อวาควิโนโปรตีนเอทานอลดีไฮโดรจีเนส (QEDH)

นักวิจัยบางกลุมไดรวมเอนไซมควิโนโปรตีนเมทานอล

ดีไฮโดรจีเนส (QMDH) ซึ่งมีความชอบตอเมทานอล

เทานั้นไวในกลุม ADH-I เนื่องจากโครงสรางทางอณู

ชีววิทยาของเอนไซมทั้งสองมีความคลายคลึงมาก(44)

อยางไรก็ตามมีนักวิจัยบางกลุมเห็นวา QMDH มีความ

จาํเพาะตอซบัสเตรตทีเ่ปนเมทานอลเทานัน้และสามารถ

เรงปฏิกิริยาที่มีเมทานอลเปนซับสเตรตไดดีกวา ADH-I

ชนิดอื่นๆถึง 104 เทาจึงควรจัดกลุมแยกออกจาก ADH-I

(43, 45, 46)

2.2.2 ADH-II เปนเอนไซมชนิดที่

ละลายนํา้พบอยูในสวนของเพรพิลาซมึของเซลล ลกัษณะ

โครงสรางของเอนไซมประกอบดวยหนวยยอย 1 หนวย

(monomeric enzyme) มขีนาดประมาณ 70-75 kDa มหีมู

พรอสเธติก 2 ชนิดคือ PQQ และ ฮีม (heme) จึงมีการ

เรียกช่ือโปรตีนชนิดนี้วาควิโนฮีโมโปรตีนแอลกอฮอล

ดีไฮโดรจีเนส (quinohemoprotein alcohol dehydrogenase,

qhADH) มีรายงานการคนพบไดแกควิโนฮีโมโปรตีน

เอทานอลดีไฮโดรจีเนสใน Comamonas testosteroni(47)

และควิโนฮีโมโปรตีนแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสชนิด B

และ G (ADH-IIB และ ADH-IIG) ใน P. putida HK5

โดยพบวา ADH-IIB มีความจําเพาะตอซับสเตรต ไดแก

แอลกอฮอลปฐมภูมิสายยาวปานกลาง และแอลกอฮอล

ทุติยภูมิ ในขณะท่ี ADH-IIG มีความจําเพาะตอ

ซับสเตรตประเภทไดออล (diol) เทานั้น(6)

2.2.3 ADH-III เปนเอนไซมชนิดที่

ตรงึอยูบนเยือ่เซลล (membrane bound enzyme) พบบนเยือ่

เซลลดานไซโทพลาซึม เอนไซม ADH-III จะเรงปฏิกริยิา

ออกซิเดชันแอลกอฮอลที่ไมสามารถผันกับได โดยมี

1011KKU Res. J. 2013; 18(6)

ความจําเพาะตอแอลกอฮฮลปฐมภูมิยกเวนเมทานอล

โมเลกุลของเอนไซมประกอบดวย 3 หนวยยอยสําคัญ คอื

หนวยยอยท่ี 1 มีขนาด 80 kDa จะมีบริเวณเรงปฏิกิริยา

(catalytic site) ที่เกี่ยวของกับ PQQ ซึ่งทําหนาที่เปน

โคแฟคเตอรหลกัและมีฮมี ซ ี(heme c) 1 โมเลกุล ทาํหนารบั

อิเล็กตรอนตอจาก PQQ หนวยยอยที่ 2 หรือ หนวย

ไทรฮีมไซโตโครม ซี (triheme cytochrome c subunit)

มีขนาด 50 kDa เกี่ยวของกับการเกิดปฏิกิริยารีดักชัน

ของยูบิควิโนน (ubiquinone) ซึ่ง อยูบนเยื่อหุมเซลลโดย

ยูบิควิโนนรับอิเล็กตรอนตอจากฮีมซี และหนวยยอยที่ 3

มขีนาด 20 kDa ซึง่ไมมโีคแฟคเตอรและยังไมทราบหนาที่

ชัดเจน มีรายงานวาพบเอนไซม ADH-III ในแบคทีเรีย

ชนิดที่ผลิตกรดแอซิติก เชน Gluconobacter suboxydans

และ Acetobacter pasteurianus(48-50)

ตารางที่ 2 แสดงตาํแหนงในเซลลทีพ่บเอนไซมแอลกอฮอลดไีฮโดรจเีนสชนดิทีข่ึน้กบั PQQ กลุมตางๆ ในแบคทเีรยี

เอนไซม ตําแหนงที่พบในเซลล* แบคทีเรียที่พบ

ควิโนโปรตีนท่ีสามารถออกซิไดซเมทานอล

(หมูพรอสเธติก PQQ)

Methanol dehydrogenase (MDH) S Methylotrophs

ควิโนโปรตีนแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนส-I

(ADH-I) (หมูพรอสเธติก PQQ)

Ethanol dehydrogenase (QEDH) S Pseudomonas aeruginosa

Alcohol dehydrogenase (ADH-I) S Pseudomomas putida

1-Butanol dehydrogenase (BOH) S Pseudomonas butanovora

ควิโนฮีโมโปรตีนแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนส– II

(ADH-II) (หมูพรอสเธติก PQQ และ heme c)

Ethanol dehydrogenase (qhEDH) S Comamonas testosteroni

Alcohol dehydrogenase (ADH IIB) S Pseudomonas putida

Alcohol dehydrogenase (ADH IIG) S Pseudomonas putida

1-Butanol dehydrogenase (BDH) S Pseudomonas butanovora

ควิโนฮีโมโปรตีนแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนส– III

(ADH-III) (หมูพรอสเธติก PQQ และ heme c)

Alcohol dehydrogenase M Acetobacter aceti

Alcohol dehydrogenase M Acetobacter pasteurianus

Alcohol dehydrogenase M Acidomonas methanolicus

Alcohol dehydrogenase M Gluconobacter suboxydans

* S, soluble enzyme พบใน periplasm

M, membrane bound enzyme พบบนเย่ือเซลลดานไซโทพลาซึม

;ตารางดัดแปลงจาก Toyama H. และคณะ(45)

1012 KKU Res. J. 2013; 18(6)

2.3 แอลกอฮอลออกซิเดสชนิดที่ขึ้นกับ

FAD (FAD-dependent alcohol oxidases, ALOD)

แอลกอฮอลออกซิเดสเปนเอนไซมที่จัด

อยูในระบบออกซิเดชันของแอลกอฮอลแตมีความแตก

ตางจากแอลกอฮอลดไีฮโดรจีเนสคือเปนการเรงปฏิกริยิา

ที่ไมสามารถผันกลับได ซึ่งเอนไซมจะทําหนาที่เปลี่ยน

แอลกอฮอลใหเปนแอลดีไฮดและไฮโดรเจนเปอรออกไซด

สามารถเขียนเปนสมการของปฏิกิริยาไดดังนี้

แอลกอฮอล ออก ซิ เ ดส ซ่ึ งมี F A D

(fl avin adenine dinucleotide) เปนโคแฟกเตอร มกีารคนพบ

ครั้งแรกในราเสนใย (fi lamentous fungi) และยีสตบางสาย

พนัธุทีม่รีะบบออกซเิดชนัของเมทานอล (methylotrophic

yeast) เชน Hansenula polymotpha, Pichia pastoris และ

Candida boidinii เปนตน ซึ่งพบวาเอนไซมกลุมนี้จะ

มีนํ้าหนักโมเลกุลระหวาง 72-83 kDa (51, 54) ตัวอยาง

เอนไซมแอลกอฮอลออกซิเดสที่พบใน H. polymotpha

จะมีลักษณะโครงสรางเปน 8 หนวยยอยท่ีเหมือนกัน

(homooctomeric enzyme) แตละหนวยมีขนาด 83 kDa

และมี FAD หนวยละ 1 โมเลกุล คุณสมบัติของเอนไซม

พบวามีความชอบตอเมทานอลสูง แตความชอบตอ

ซับสเตรตจะลดลงในกรณีที่คารบอนของแอลกอฮอล

ยาวมากขึ้น

3. การศกึษาคุณสมบตัขิองเอนไซมแอลกอฮอล

ดีไฮโดรจีเนสในแบคทีเรียดวยเทคนิคทางชีวเคมี

ในการศึกษาวิจัยทางดานเอนไซมในแบคทีเรีย

นอกจากจะตองใชทักษะการวิจัยทางชีวเคมีแลวยังตอง

ใชทักษะทางวิทยาศาสตรแขนงอื่นๆ ที่สัมพันธกันโดย

เฉพาะอยางย่ิงเทคนิคทางจุลชีววิทยา สําหรับกรณีการ

ศึกษาเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสในแบคทีเรียจะ

มขีัน้ตอนพืน้ฐานการเลีย้งเซลลแบคทเีรยีทีค่ลายคลงึกนั

ในขณะท่ีเปาหมายการศึกษาวิจัยท่ีแตกตางหลากหลาย

จะทําใหตองเลือกใชเทคนิควิธีวิ เคราะหที่แตกตาง

กันไป ตัวอยางขั้นตอนการศึกษาเอนไซมแอลกอฮอล

ดีไฮโดรจีเนสในแบคทีเรียมีดังนี้

3.1 การเตรียมแบคทีเรียเพ่ือสกัดแยก

เอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนส

ในการเพาะเลี้ยงแบคที เรีย เพื่อสกัด

เอนไซมนยิมใชอาหารเล้ียงเช้ือพืน้ฐาน (minimal medium

หรือ basal medium) ที่ประกอบดวยสารอาหารประเภท

แรธาตุอาหารหลัก เชน NaNO3, (NH

4)

2SO

4, K

2HPO

4,

KH2PO

4, MgSO

4, CaCl

2และสารสกัดจากยีสต อีกทั้ง

มีการเติมแรธาตุอาหารรอง (trace element) เชน H3BO

3,

ZnSO4, Ni

2SO

4, (NH

4)

6Mo

7O

24, CuSO

4, MnSO

4, CoCl

2

และ FeCl3ในขณะที่แหลงคารบอนที่จะเติมลงในอา

หารจะใชแอลกอฮอลที่สนใจศึกษาท่ีความเขมขนตา

งๆ เพื่อเปนการเหน่ียวนําใหเช้ือแบคทีเรียผลิตเอนไซม

แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนส ความเขมขนของแอลกอฮอล

ที่ เ ติมจะอยู ในชวง 0 .2-1 .0 % โดยปริมาตรตอ

ปริมาตร(6,55) ซึ่งจะทําการเล้ียงเซลลภายใตสภาวะที่

มีออกซิเจนโดยการเขยาที่ความเร็ว 250 รอบตอนาที

อุณหภูมิ 30-37◦C ตามแตชนิดของสายพันธุแบคทีเรีย

และจะทําการเก็บเชื้อเมื่อไดระยะเวลาที่เหมาะสมเชน

6-24 ชั่วโมงภายหลังการเติมแอลกอฮอลหรือเมื่อวัดคา

ความขุน (OD620

) ไดคาที่เหมาะสมโดยผูวิจัยตองทดลอง

เก็บเซลลที่ระยะตางๆ เพื่อหาระยะเวลาที่มีการผลิต

เอนไซมไดสูงสุด

ภายหลงัจากทีเ่ซลลแบคทเีรยีเจรญิเตบิโต

จนไดคาความขุนที่เหมาะสมจะทําการปนเก็บเซลลดวย

เทคนิคเซนทริฟวเกชัน (centrifugation) โดยใชแรงเหว่ียง

สมัพทัธ (relative centrifugal force, RCF) ที ่3,000 g-8,000 g

และอณุหภมูติํา่ (4 ◦C) ประมาณ 15 นาท ีแลวลางเซลลดวย

สารละลายบัพเฟอรทีม่คีวามเขมขนและคา pH เหมาะสม

สาํหรับเอนไซมแอลกอฮอลดไีฮโดรจีเนสนิยมใชบพัเฟอร

ที่ความเขมขน 10-50 mM เชนบัฟเฟอรฟอสเฟต

(phosphate buffer) สาํหรบัชวง pH 7.0-7.5 หรอื บฟัเฟอร

ทรสิไฮโดรคลอไรด (Tris-HCl buffer) สาํหรบัชวง pH 8.0-

9.0 และกระจายเซลลในสารละลายบัพเฟอรที่เหมาะสม

กบัการทํางานของเอนไซมและสามารถรักษาเสถียรภาพ

ของเอนไซมได ซึ่งอาจเติม phenylmethylsulfonyl

fluoride (PMSF) เพื่อทําหน้าที่เป็นตัวยับยั้งเอนไซม์

โปรตีเอส (protease inhibitor) และเติมสารรีดิวซ

1013KKU Res. J. 2013; 18(6)

(reducing agent) เชน dithiothreitol (DTT) เพื่อปองกัน

การเกิดพันธะไดซัลไฟด (disulfi de) ระหวางโมเลกุลของ

โปรตีนที่อาจเกิดขึ้นไดจากกรดอะมิ โนซีสเทอีน

(cysteine residue)

การทําใหเซลลแตก (cell disruption) เพื่อ

ศึกษาเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสมีวิธีการที่นิยม

ใชคือเทคนิคโฮโมจีไนเซชัน (homogenization) ซึ่งเปน

วธิกีารใชความดันสงูทําใหเซลลแตก (7,000-10,000 psi)

โดยใชอุปกรณที่เรียกวา French pressure cell press

(French press) การทําใหเซลลแตกวิธีนี้จะทําใหเยื่อหุม

เซลลของแบคทีเรียแตกออกเปนชิ้นเล็กๆ และเกิดเปน

ถุงเล็กๆ ที่กลับดาน (inside-out membrane vesicle) โดย

เอาเยือ่หุมเซลลดานทีเ่คยอยูตดิกบัไซโทพลาซมึหนัออกสู

สิง่แวดลอม ซึง่จะเปนลกัษณะทีเ่หมาะสมสําหรับการนํา

ไปวิเคราะหทางชีวเคมีในหลอดทดลอง (in vitro) ตอไป

ในกรณีเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสใน P. pitida

HK5 พบวาสามารถใชคลอโรฟอรม (chloroform) ใน

การทําใหเซลลแตกได โดยการเติม คลอโรฟอรมลงใน

สารละลายบัฟเฟอรที่มีเซลลแขวนลอยอยูและทําการ

เขยาอยางแรง (vortex) แลวจึงแยกเอาช้ันที่เปนบัฟเฟอร

ออกมา โดยที่แอกทิวิตีของเอนไซม ADH-I ยังไม

เปลี่ยนแปลง

3.2 การวิเคราะหแอกทิวิตีของเอนไซม

แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนส

ในการศึกษาดานเอนไซมสิง่สาํคญัอยางย่ิง

คือการวัดคาแอกทิวิตีของเอนไซม เพราะจะทําใหผูวิจัย

ทราบไดวาเอนไซมที่กําลังศึกษาอยูนี้มีหนาที่ตรงตาม

สมมติฐานท่ีตัง้ไวหรอืไม หรอืเพือ่พสิจูนวาการสกัดและ

การทําใหบริสทุธ์ินัน้ประสบผลสําเร็จหรือไม นอกจากน้ี

การวัดแอกทิวิตีของเอนไซมยังใชในการอธิบายคุณสมบัติ

ทางจลนศาสตรของเอนไซม (enzyme kinetics) เชน

ความเร็วของการเรงปฏกิริยิา (velocity) ความจาํเพาะตอ

ซับสเตรต (substrate specifi city) การอธิบายกลไกการ

เรงปฏิกิริยา (mechanism) และกลไกการยับยั้งเอนไซม

(inhibition mechanism) แบบตางๆ เปนตน หลักการวัด

คาแอกทิวิตีของเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสมีดังนี้

3.2.1 การวัดแอกทิวิตีของเอนไซม

แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสชนิดที่ขึ้นกับ NAD(P) +

การวัดแอกทิวิตีของเอนไซมชนิดนี้

สามารถใชไดกับเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสชนิด

ที่ขึ้นกับ NAD(P+) ทั้ง 3 กลุมคือ Zn-dependent ADH

Zn-independent ADH และ iron activated ADH ซึง่อาศัย

หลักการตรวจวัดปริมาณ β-NADH หรือ β-NADPH

(reduced form) ทีเ่พิม่ขึน้เมือ่ปฏกิริยิาดาํเนนิไป(56) ดงันี้

β-NAD(P)+ มีคาการดูดกลืนแสง

อัลตราไวโอเลตไดสูงสุดที่ความยาวคลื่น 260 nm และ

มีคา extinction coeffi cient (ε) เปน 16,900 M-1.cm-1 ใน

ขณะที ่β-NAD(P)H มคีาการดดูกลนืแสงอลัตราไวโอเลต

ไดสูงสุดที่ความยาวคล่ืน 340 nm และมีคา ε เปน

62,200 M-1.cm-1 ความแตกตางของการดูดกลืนแสงที่

ความยาวคลื่นแสงสูงสุดของโมเลกุลนี้ในรูปถูกออก

ซิไดสและรูปถูกรีดิวซสามารถนํามาใชตรวจวัดการ

ดาํเนินไปของปฏิกริยิาไดดวยเทคนิคสเปกโตรโฟโตเมตรี

(spectrophotometry)โดยการวัดคาการดูดกลืนแสง

ที่ความยาวคลื่น 340 nm ที่เพิ่มขึ้นตอหนวยเวลา ซึ่ง

สามารถนําคา ε ของ β-NAD(P)H มาใชในการคํานวณ

ปริมาณผลิตภัณฑที่เกิดขึ้นและใชคํานวณคาแอกทิวิตี

ของเอนไซมได


แอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสชนิดที่ไมขึ้นกับ NAD(P)+

การ วั ดแอกทิ วิ ตี ข อ ง เ อน ไซม

แอลกอฮอลดไีฮโดรจีเนสชนิดนีใ้ชหลกัการตรวจวัดทาง

ออม โดยการเติมสารตัวรบัอเิลก็ตรอน (artifi cial electron

acceptor) ลงไปในปฏิกิริยาแลวติดตามการเปลี่ยนแปลง

ของสารน้ันที่เกิดขึ้นในรูปถูกรีดิวซซึ่งเรียกวารีดักเทส

แอกทิวิตี (reductase activity)(57) ตัวอยางเชนเอนไซม

ADH-I ใน P. putida HK5 ซึ่งในโมเลกุลมี PQQ เปน

ตัวรับอิเล็กตรอน สําหรับในปฏิกิริยาการวัดแอกทิวิตี

ของเอนไซมจะเติมฟนาซีนเมโทรซัลเฟต (phenazine

1014 KKU Res. J. 2013; 18(6)

methosulfate, PMS) และ 2,6 dichlorophenol indophenol

(DCPIP) เปนตัวรับอิเล็กตรอนซ่ึงเม่ือเกิดปฏิกิริยาข้ึน

PMS จะรับอิเล็กตรอนจาก PQQ หลังจากนั้นมีการ

สงอิเล็กตรอนจาก PMS ไปยัง DCPIP ซึ่งมีสีนํ้าเงิน

เกดิเปน DCPIP ในรปูถูกรดีวิซซึง่ไมมสี ีดงันัน้จึงสามารถ

ตดิตามปฏกิริยิาโดยการวดัสีนํา้เงนิทีจ่างหายไปและอาน

คาการดดูกลนืแสงทีล่ดลงทีค่วามยาวคลืน่ 600 nm (คา ε ของ DCPIP คอื 21,000 M-1.cm-1 ที ่ pH 9.0) อยางไรกต็าม

พบวาวิธีการวิเคราะหดังกลาวไมเหมาะสมในการใช

สารละลายบัพเฟอรที่มีคา pH ตํ่ากวา 6.0 เน่ืองจากมีการ

เปลี่ยนแปลงของสีและคา ε ของ DCPIP ไปตามคา pH

ดังน้ันจึงตองระมัดระวังการเลือกใชระบบบัฟเฟอรที่

เหมาะสม

ในกรณีของเอนไซม ADH-II ใน

P. putida HK5 ซึ่งมีหมูพรอสเธติก 2 หมู คือ PQQ และ

ฮีม จะใชเทคนิคการวัดทางออมเรียกวาการวัดแอก

ทิวิตีของเฟอรริกไซยาไนดรีดักเทส (ferricyanide

reductase) ซึ่งในปฏิกิริยาจะมีการถายทอดอิเล็กตรอน

จาก PQQ ไปยังหมูฮีมและจากนั้นเฟอรริกไซยาไนด

จะทําหนาที่รับอิเล็กตรอนจากหมูฮีมเกิดเปนเฟอรริก

ไซยาไนดทีอ่ยูในรูปถูกรดีวิซ ซึง่จะมคีาการดดูกลนืแสงที่

ความยาวคล่ืน 420 nm ลดลง (คา ε ของเฟอรรกิไซยาไนดคอื 1,040 M-1.cm-1) การใชเฟอรรกิไซยาไนดในปฏิกริยิาน้ี

สามารถใชระบบบัฟเฟอรที่มีคา pH เปนชวงกวางตั้งแต

3-9 ไดและในกรณีของเอนไซม ADH-III สามารถใชวิธี

การตรวจวัดแอกทิวิตีเชนเดียวกับเอนไซม ADH-II แตมี

ความแตกตางกันในขั้นตอนการเตรียมตัวอยางเอนไซม

เนือ่งจากเอนไซม ADH-III เปนเอนไซมชนิดทีต่รงึอยูบน

เยือ่เซลล ดงันัน้ภายหลังจากการทําใหเซลลแตกดวยเทคนิค

โฮโมจไินเซชนัโดยใชเครือ่ง French press แลว จาํเปนตอง

ปนแยกเอาเศษเซลลออกดวยความเร็วตํ่า จากน้ันจึงปน

เหวี่ยงดวยความเร็วสูงดวยแรงเหวี่ยงสัมพัทธประมาณ

68,000 g เปนเวลา 1 ชั่วโมง จะไดสวนตะกอน (pellet)

ซึ่งเปนโปรตีนท่ีอยูบนเย่ือหุมเซลล (membrane-bound

protein fraction) ซึ่งสามารถทําการกระจายกลับคืน

(resuspended) ดวยบัพเฟอรที่เหมาะสมกอนนําไปวัดคา

แอกทิวิตีและวิเคราะหหาปริมาณโปรตีน


แอลกอฮอลออกซิเดสชนิดที่ขึ้นกับ FAD

การวัดแอกทิวิตีของเอนไซมชนิดนี้

อาศยัหลกัการเกดิปฏกิริยิาคูควบกบัเอนไซมเปอรออกซเิดส

(peroxidase-coupled assay system) ซึ่งในข้ันแรก

ปฏิกิริยาที่เรงโดยเอนไซมแอลกอฮอลออกซิเดสจะให

ผลิตภัณฑเปนแอลดีไฮดและไฮโดรเจนเปอรออกไซด

ไฮโดรเจนเปอรออกไซดที่เกิดขึ้นจะสามารถใชเปนสาร

ตัง้ตนสาํหรบัการทาํปฏกิริยิากบัเอนไซมเปอรออกซเิดส

และสารที่เกิดสี (chromogenic substrate) ทําใหสามารถ

ติดตามการเกิดปฏิกิริยาโดยออมผานการวัดสีที่เกิดขึ้น

ดวยเทคนิคสเปกโตรโฟโตเมตรี

ตัวอยางสารที่เกิดสีที่นิยมใชไดแก

ABTS (2,2’-Azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic

acid) เมือ่อยูในรปูถกูออกซไิดสจะกลายเปนสารละลายสี

เขยีวทีม่คีาการดดูกลนืแสงสงูสดูทีค่วามยาวคลืน่ 420 nm

(คา ε ของ ABTS คือ 36,000 M-1.cm-1)

การคํานวณคาแอกทิวติขีองเอนไซม

จะไดผลลัพธเปนตัวเลขท่ีเรียกวาหนวยของเอนไซม

หรือยูนิต (Unit) ซึ่งจะมีการใหคํานิยามของคายูนิต

ดังนี้ 1 ยูนิตของเอนไซมคือปริมาณเอนไซมที่สามารถ

เปลี่ยนแปลงซับสเตรต (ในกรณีนี้คือ DCPIP หรือ

เฟอรริกไซยาไนด หรือ ABTS) ใหเกิดเปนผลิตภัณฑ

(เชน อยูในรูปถูกรีดิวซ หรือรูปถูกออกซิไดส) ไดจํานวน

1 μmole ภายใน 1 หนวยเวลา (เชน 1 นาที) ภายใตสภาวะ

pH และอุณหภูมิที่กําหนด ดังนั้นยูนิตของเอนไซมจึงมี

หนวยเปนโมลตอเวลา เชน μmole.min-1 เอนไซมที่ผาน

กระบวนการทําใหบริสุทธิ์จะพบวามีปริมาณโปรตีน

ทัง้หมด (total protein) ลดลงทุกๆ ขัน้ตอน และเมือ่ตรวจ

วัดแอกทิวิตีของเอนไซมอาจพบวาไดคาแอกทิวิตีลดตํ่า

ลงเนื่องจากการเสียสภาพของเอนไซมและการสูญเสีย

โมเลกุลเอนไซมระหวางกระบวนการ อยางไรก็ตามเมื่อ

นําคาแอกทิวิตีของเอนไซมทั้งหมดหารดวยนํ้าหนักเปน

1015KKU Res. J. 2013; 18(6)

มิลลิกรัมของโปรตีนทั้งหมดจะไดคาแอกทิวิตีจําเพาะ

(specific activity) มีหน่วยเป็นไมโครโมลต่อนาทีต่อ

มิลลิกรัมโปรตีน (μmol.min-1.mg-1) ซึ่งจะเปนคาที่สูง

ขึ้นเม่ือเทียบกับคาแอกทิวิตีของเอนไซมสกัดหยาบและ

คาแอกทิวิตีจําเพาะนี้สามารถใชเปรียบเทียบความ

บริสุทธิ์ที่เพ่ิมขึ้นของกระบวนการสกัดแตละข้ันตอนได

และยงัสามารถใชเปรยีบเทยีบผลการทดลองในแตละครัง้

หรือแตละสภาวะการทดลองได

3.3 การใชเทคนิค Polyacrylamide Gel

Electrophoresis (PAGE) เพือ่ศกึษาเอนไซมแอลกอฮอล

ดีไฮโดรจีเนส

การใหโปรตีนเคลื่อนที่ผานตัวกลาง เชน

เจลพอลิอะคริลาไมด (polyacrylamide gel) ภายใตสนาม

ไฟฟาเรียกวาเทคนิคอิเล็กโตรโฟรีซิส (electrophoresis)

ซึ่งนิยมใชวิเคราะหหาน้ําหนักโมเลกุลของโปรตีนที่

กําลังศึกษา โดยจะทําใหโปรตีนเสียสภาพธรรมชาติ

(denaturation) ดวยการใหความรอนพรอมกับการเติม

สารลดแรงตึงผิวประจุลบ (anionic detergent) เชน

โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (sodium dodecyl sulfate, SDS)

และสารรีดิวซ (reducing agent) เชน บีตา-เมอแคปโต

เอทานอล (β–mercaptoethanol) เพื่อทําลายพันธะ

ไดซัลไฟด (disulfi de) ภายในสายโปรตีนโปรตีนที่ไดจะมี

ลกัษณะเปนสายยาวของพอลิเพปไทดทีต่ลอดโมเลกุลอิม่

ตวัไปดวยประจลุบและสามารถเคลือ่นทีผ่านตวักลางบน

สนามไฟฟาไดจากข้ัวลบไปยังขั้วบวกโดยอัตราเร็วการ

เคลือ่นท่ีจะขึน้กบันํา้หนกัโมเลกลุเทานัน้ เทคนคิดงักลาว

จงึเรยีกวา Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel

Electrophoresis หรือ SDS-PAGE และนิยมยอมสีโปรตีน

บนแผนเจลดวยส ีCoomassie brilliant blue R-250 ซึง่เปน

สีที่จับกับโปรตีนไดดี

นอกจากนี้ยังมีเทคนิคที่ใหโปรตีนคง

สภาพธรรมชาติ (native) เคล่ือนท่ีผานตัวกลางภายใต

สนามไฟฟาเรยีกวาเทคนคิ native-PAGE (รปูที ่4ก.) โดยที่

โปรตนีหรอืเอนไซมยงัมคีณุสมบตัทิางชวีภาพอยู ภายใน

ระบบอิเล็กโตรโฟรีซิสจะไมมีการเติม SDS และมีการ

ควบคมุอณุหภมูใิหตํา่ตลอดเวลา การเคลือ่นทีข่องโปรตนี

จะเคลือ่นทีด่วยอตัราเรว็ทีข่ึน้กบัสดัสวนประจุตอมวลของ

โปรตีนน้ันๆ การศึกษาเอนไซมแอลกอฮอลดไีฮโดรจีเนส

ดวยเทคนิคนีส้ามารถนําหลกัการวัดรดีกัเทสแอกทิวติมีา

ใชเพื่อระบุตําแหนงของเอนไซมบนแผนเจลไดเรียกวา

การยอมแอกทิวิตี (activity staining) โดยไดดัดแปลง

วิธีการมาจากการยอมแอกทิวิตีของเอนไซมกลุม

ออกซิโดรีดักเทสที่ใชสําหรับศึกษาหวงโซการถายทอด

อิเล็กตรอนในไมโทคอนเดรีย (mitochondrial electron

transport chain complexes) ซึ่งเมื่อโมเลกุลของเอนไซม

เคล่ือนท่ีแยกออกจากโปรตีนชนิดอื่นๆ บนแผนเจลจะ

เสมอืนวาเอนไซมถกูทาํใหบรสิทุธิอ์ยูในตาํแหนงหนึง่บน

แผนเจล หลงัจากน้ันจงึนาํแผนเจลมาทําปฏิกริยิาโดยการ

เตมิซบัสเตรต เชน แอลกอฮอล บฟัเฟอร โคแฟกเตอรและ

มกีารเตมิตัวรบัอเิลต็รอน เชน PMS และไนโตรบลเูตตระ

โซเลยีม (nitro blue tetrazolium, NBT) บนแผนเจลทีเ่ปน

ตาํแหนงของเอนไซมแอลกอฮอลดไีฮโดรจเีนสทีเ่คลือ่นที่

ไปถึงจะเกิดปฏิกิริยา จากนั้น PMS จะรับอิเล็กตรอนตอ

จากโคแฟกเตอรและเมือ่ NBT รบัอเิลก็ตรอนตอจาก PMS

แลวจะทาํให NBT อยูในรปูถูกรีดวิซซึง่เปนสารประกอบ

ทีต่กตะกอนมสีนีํา้เงนิ-มวงเรยีกวาฟอรมาซาน (formazan)

(รูปที่ 4ข.) ซึ่งเปนการยืนยันผลการศึกษาวาเอนไซม

ที่สกัดไดมาเปนเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสจริง

และอาจมีการยืนยันอีกครั้งดวยเทคนิคเวสเทิรนบลอท

(Western blotting หรือ Immunoblotting) ซึ่งใชหลักการ

ติดฉลากบนโมเลกุลแอนติบอดีที่จําเพาะตอโปรตีน

เปาหมายในการตรวจสอบ

1016 KKU Res. J. 2013; 18(6)

2. สรุป

จากความรูขั้นพ้ืนฐานตั้งแตเรื่องโครงสราง

และสมบัติของสารชีวโมเลกุล เมแทบอลิซึมของสาร

อินทรีย และพ้ืนฐานจุลชีววิทยาเปนสิ่งสําคัญที่ทําให

สามารถบูรณาการกับเทคนิควิธีการทางชีวเคมีเพื่อตอยอด

สูงานวิจัยเชิงลึกของเอนไซมได ตัวอยางของการใชความรู

และเทคนคิทางชวีเคมใีนการศกึษาแอลกอฮอลดไีฮโดรจเีนส

ในแบคทีเรียไดแก การศึกษาแบคทีเรีย P. putida HK5

โดยการเล้ียงเซลลภายใตสภาวะอาหารท่ีมีแอลกอฮอล

ตางชนิดกัน จากน้ันจึงสกัดเอนไซมและทําเอนไซมให

บริสุทธิ์บางสวนเอนไซมที่ไดถูกนําไปผานกระบวนการ

อิเล็กโตรโฟรีซิสและยอมแอกทิวิตี ผลลัพธที่ไดจะพบ

แถบตะกอนสีมวงของฟอรมาซานซ่ึงเปนตําแหนงของ

เอนไซมแอลกอฮอลดไีฮโดรจเีนสชนดิตางๆ ซึง่สามารถ

อธิบายไดดังน้ีคือ ในสภาวะอาหารท่ีมีกลูโคสเซลลจะ

ไมมีการผลิตเอนไซมสําหรับยอยสลายแอลกอฮอลจึงไม

พบแถบตะกอนบนแผนเจล ในขณะท่ีเม่ือใชเอทานอล

บิวทานอลและ1,2 โพรเพนไดออลเปนแหลงอาหาร

จะพบแถบตะกอนบนแผนเจลซึ่งแสดงถึงตําแหนงของ

เอนไซม ADH-I ADH-IIB และADH-IIG ตามลําดับ

เอนไซมทั้ง 3 ชนิดนี้ไดมีการศึกษาในระดับอณูชีววิทยา

แลวพบวามคีณุลกัษณะตางกนัทัง้ในดานของลาํดบัชนดิ

กรดอะมิโนและจํานวนกรดอะมิโน (58-60) จึงมีผลตอ

การเคลื่อนที่บนสนามไฟฟาไดไมเทากัน และจากผล

การศึกษาทางจลนศาสตรของเอนไซมกอนหนานี้โดย

ใชเอนไซมทั้ง 3 ชนิดนี้ที่ทําใหบริสุทธ์ิแลวจะพบวามี

ความแตกตางกันในสวนของความจําเพาะตอซับสเตรต

ที่เปนแอลกอฮอลชนิดตางๆ รวมทั้งคา Kmและ V

max ตอ

ซับสเตรตชนิดตางๆ (6) จากองคความรูนี้สามารถนํา

เทคนิคตางๆ ไปพัฒนาและประยุกตเขากับงานวิจัยเพ่ือ

ศึกษาลักษณะการแสดงออกของโปรตีนในแบคทีเรีย

ชนิดนี้ระหวางสายพันธุดั้งเดิม (wild type) และสาย

พันธุกลาย (mutant) (61,62) นอกจากน้ีสาเหตุที่ทําให

P. putida HK5 ผลิตเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนส

ไดตางชนิดกันเมื่อเลี้ยงในอาหารที่ตางกันนั้น สามารถ

อธิบายไดในระดับการควบคุมยีน (gene regulation)

และการแสดงออกของยีน (gene expression) ซึ่งเปน

ความรูทางชีวเคมีขั้นสูง โดยจะกลาวถึงในโอกาสตอไป

ในเร่ืองเก่ียวกับอณูชวีวิทยาของเอนไซมชนดินีโ้ดยเฉพาะ

รูปท่ี 4 (ก) การใชเทคนิค Native-PAGE และการยอมแอกทิวิตีของเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสที่สกัดจาก

Pseudomonas putida HK5 เมือ่เลีย้งดวยอาหาร basal medium และเติมแหลงคารบอนเปน กลโูคส เอทานอล

บิวทานอล หรือ 1,2 โพรเพนไดออล ตามลําดับ ความเขมขนของอะคริลาไมดใน separating gel คือ 8.5%

การยอมแอกตวิติขีองเอนไซมใชซบัสเตรตผสมในสารละลายบฟัเฟอร 50 mM Tris-HCl pH 8.0 ทีป่ระกอบ

ดวย 1 mM ethanol, 1 mM butanol, 1 mM 1,2-propanediol, 0.2 mM PMS, 50 mM ethylamine และใสผลึก

NBT 4-5 เกร็ด บมท่ีอุณหภูมิ 37 ◦C ในท่ีมืดเปนเวลา 30 นาที (รูปโดย วรวัฒน พรหมเดน) (ข) แสดงแผนผัง

การเกิดปฏิกิริยาของเอนไซมแอลกอฮอลดีไฮโดรจีเนสและการเกิดตะกอนนํ้าเงิน-สีมวงของฟอรมาซาน

1017KKU Res. J. 2013; 18(6)

3. เอกสารอางอิง

(1) Lieber CS. Alcohol, liver, and nutrition. J Am

Coll Nutr. 1991 Dec;10(6):602-32.

(2) Lieber CS. Relationships between nutrition,

alcohol use, and liver disease. Alcohol Res

Health. 2003;27(3):220-31.

(3) Chistoserdova L, Chen SW, Lapidus A, Lidstrom

ME. Methylotrophy in Methylobacterium

extorquens AM1 from a genomic point of view.J

Bacteriol. 2003 May;185(10):2980-7.

(4) Jongejan A, Jongejan JA, Duine JA. Homology

model of the quinohaemoprotein alcohol

dehydrogenase from Comamonas testosteroni.

Protein Eng. 1998 Mar;11(3):185-98.

(5) Groen B, Frank J, Jr., Duine JA. Quinoprotein

alcohol dehydrogenase from ethanol-grown

Pseudomonas aeruginosa. Biochem J. 1984 Nov

1;223(3):921-4.

(6) Toyama H, Fujii A, Matsushita K, Shinagawa E,

Ameyama M, Adachi O. Three distinct

quinoprotein alcohol dehydrogenases are

expressed when Pseudomonas putida is grown on

different alcohols. J Bacteriol. 1995 May;177(9):

2442-50.

(7) Kawai F, Hu X. Biochemistry of microbial

polyvinyl alcohol degradation. Appl Microbiol

Biotechnol. 2009 Aug;84(2):227-37.

(8) Lopes Ferreira N, Mathis H, Labbe D, Monot F,

Greer CW, Fayolle-Guichard F. n-Alkane

assimilation and tert-butyl alcohol (TBA) oxidation

capacity in Mycobacterium austroafricanum

strains. Appl Microbiol Biotechnol. 2007

Jun;75(4):909-19.

(9) Rojo F. Degradation of alkanes by bacteria.

Environ Microbiol. 2009 Oct;11(10):2477-90.

(10) Lutke-Eversloh T, Bahl H. Metabolic engineering

of Clostridium acetobutylicum: recent advances

to improve butanol production. Curr Opin

Biotechnol. 2011 Oct;22(5):634-47.

(11) Cooksley CM, Zhang Y, Wang H, Redl S, Winzer K,

Minton NP. Targeted mutagenesis of the

Clostridium acetobutylicum acetone-butanol-

ethanol fermentation pathway. Metab Eng. 2012

Nov;14(6):630-41.

(12) Theorell H, Mc KJ. Mechanism of action of

liver alcohol dehydrogenase.Nature. 1961 Oct

7;192:47-50.

(13) Sofer W, Martin PF. Analysis of alcohol

ehydrogenase gene expression in Drosophila.

Annu Rev Genet. 1987;21:203-25.

(14) Benyajati C, Place AR, Powers DA, Sofer W.

Alcohol dehydrogenase gene of Drosophila

melanogaster: relationship of intervening

sequences to functional domains in the protein. Proc

Natl Acad Sci U S A. 1981 May;78(5):2717-21.

(15) Anthony C. The structure of bacterial

quinoprotein dehydrogenases. Int J Biochem.

1992;24(1):29-39.

(16) Kato T, Miyanaga A, Haruki M, Imanaka T,

Morikawa M, Kanaya S. Gene Cloning of

an alcohol dehydrogenase from thermophilic

alkane-degrading Bacillus thermoleovorans B23.

J Biosci Bioeng. 2001;91(1):100-2.

(17) Jornvall H, Persson B, Jeffery J. Characteristics

of alcohol/polyol dehydrogenases. The zinc-

containing long-chain alcohol dehydrogenases.

Eur J Biochem. 1987 Sep 1;167(2):195-201.

(18) Scrutton NS, Berry A, Perham RN. Redesign

of the coenzyme specifi city of a dehydrogenase

by protein engineering. Nature. 1990 Jan

4;343(6253):38-43.

(19) Lawton MP, Gasser R, Tynes RE, Hodgson E,

Philpot RM. The fl avin-containing monooxygenase

enzymes expressed in rabbit liver and lung are

products of related but distinctly different genes.

1018 KKU Res. J. 2013; 18(6)

J Biol Chem. 1990 Apr 5;265(10):5855-61.

(20) Reid MF, Fewson CA. Molecular characterization

of microbial alcohol dehydrogenases. Crit Rev

Microbiol. 1994;20(1):13-56.

(21) Bairoch A. PROSITE: a dictionary of sites and

patterns in proteins. Nucleic Acids Res. 1991

Apr 25;19 Suppl:2241-5.

(22) Neale AD, Scopes RK, Kelly JM, Wettenhall RE.

The two alcohol dehydrogenases of Zymomonas

mobilis. Purifi cation by differential dye ligand

chromatography, molecular characterisation and

physiological roles. Eur J Biochem. 1986 Jan

2;154(1):119-24.

(23) Park DH, Plapp BV. Isoenzymes of horse liver

alcohol dehydrogenase active on ethanol and

steroids.cDNA cloning, expression, and comparison

of active sites. J Biol Chem. 1991 Jul 15;266(20):

13296-302.

(24) Ramaswamy S, Eklund H, Plapp BV. Structures

of horse liver alcohol dehydrogenase complexed

with NAD+ and substituted benzyl alcohols.

Biochemistry. 1994 May 3;33(17):5230-7.

(25) Bennetzen JL, Hall BD. The primary structure of

the Saccharomyces cerevisiae gene for alcohol

dehydrogenase. J Biol Chem. 1982 Mar 25;257(6):

3018-25.

(26) Ramaswamy S, Kratzer DA, Hershey AD, Rogers

PH, Arnone A, Eklund H, et al. Crystallization

and preliminary crystallographic studies of

Saccharomyces cerevisiae alcohol dehydrogenase

I. J Mol Biol. 1994 Jan 14;235(2):777-9.

(27) Peretz M, Bogin O, Tel-Or S, Cohen A, Li G,

Chen JS, et al. Molecular cloning, nucleotide

sequencing, and expression of genes encoding

alcohol dehydrogenases from the thermophile

Thermoanaerobacter brockii and the mesophile

Clostridium beijerinckii. Anaerobe. 1997

Aug;3(4):259-70.

(28) Ismaiel AA, Zhu CX, Colby GD, Chen JS.

Purifi cation and characterization of a primary-

secondary alcohol dehydrogenase from two

strains of Clostridium beijerinckii.J Bacteriol.

1993 Aug;175(16):5097-105.

(29) Chinnawirotpisan P, Matsushita K, Toyama H,

Adachi O, Limtong S, Theeragool G. Purifi cation

and characterization of two NAD-dependent

alcohol dehydrogenases (ADHs) induced in the

quinoprotein ADH-defi cient mutant of Acetobacter

pasteurianus SKU1108. Biosci Biotechnol

Biochem. 2003 May;67(5):958-65.

(30) Masud U, Matsushita K, Theeragool G. Molecular c

loning and characterization of two inducible

NAD(+)-adh genes encoding NAD(+)-dependent

alcohol dehydrogenases from Acetobacter

pasteurianus SKU1108. J Biosci Bioeng. 2011

Nov;112(5):422-31.

(31) Pennacchio A, Pucci B, Secundo F, La Cara F,

Rossi M, Raia CA. Purifi cation and characterization

of a novel recombinant highly enantioselec-

tive short-chain NAD(H)-dependent alcohol

dehydrogenase from Thermus thermophilus. Appl

Environ Microbiol. 2008 Jul;74(13):3949-58.

(32) Henne A, Bruggemann H, Raasch C, Wiezer

A, Hartsch T, Liesegang H, et al. The genome

sequence of the extreme thermophile Thermus

thermophilus. Nat Biotechnol. 2004 May;22(5):

547-53.

(33) Niefind K, Muller J, Riebel B, Hummel W,

Schomburg D. The crystal structure of R-specifi c

alcohol dehydrogenase from Lactobacillus brevis

suggests the structural basis of its metal dependency.

J Mol Biol. 2003 Mar 21;327(2):317-28.

(34) Makarova K, Slesarev A, Wolf Y, Sorokin A,

Mirkin B, Koonin E, et al. Comparative genomics

1019KKU Res. J. 2013; 18(6)

of the lactic acid bacteria. Proc Natl Acad Sci U

S A. 2006 Oct 17;103(42):15611-6.

(35) Moon JH, Lee HJ, Park SY, Song JM, Park MY,

Park HM, et al. Structures of iron-dependent

alcohol dehydrogenase 2 from Zymomonas

mobilis ZM4 with and without NAD+ cofactor.

J Mol Biol. 2011 Apr 1;407(3):413-24.

(36) Montella C, Bellsolell L, Perez-Luque R, Badia J,

Baldoma L, Coll M, et al. Crystal structure of

an iron-dependent group III dehydrogenase

that interconverts L-lactaldehyde and L-1,2-

propanediol in Escherichia coli. J Bacteriol. 2005

Jul;187(14):4957-66.

(37) de Vries GE, Arfman N, Terpstra P, Dijkhuizen

L. Cloning, expression, and sequence analysis

of the Bacillus methanolicus C1 methanol

dehydrogenasegene. J Bacteriol . 1992

Aug;174(16):5346-53.

(38) Nolling J, Breton G, Omelchenko MV, Makarova

KS, Zeng Q, Gibson R, et al. Genome sequence

and comparative analysis of the solvent-producing

bacterium Clostridium acetobutylicum. J Bacteriol.

2001 Aug;183(16):4823-38.

(39) Petersen DJ, Welch RW, Rudolph FB, Bennett

GN. Molecular cloning of an alcohol (butanol)

dehydrogenase gene cluster from Clostridium

acetobutylicum ATCC 824.J Bacteriol. 1991

Mar;173(5):1831-4.

(40) Walter KA, Bennett GN, Papoutsakis ET.

Molecular characterization of two Clostridium

acetobutylicum ATCC 824 butanol dehydrogenase

isozyme genes.J Bacteriol. 1992 Nov;174(22):

7149-58.

(41) Hauge JG. Glucose Dehydrogenase of Bacterium

Anitratum: an Enzyme with a Novel Prosthetic

Group. J Biol Chem. 1964 Nov;239:3630-9.

(42) Anthony C, Zatman LJ. The microbial oxidation

of methanol. The prosthetic group of the alcohol

dehydrogenase of Pseudomonas sp. M27: a new

oxidoreductase prosthetic group. Biochem J.

1967 Sep;104(3):960-9.

(43) Goodwin PM, Anthony C. The biochemistry,

physiology and genet ics of PQQ and

PQQ-containing enzymes. Adv Microb Physiol.

1998;40:1-80.

(44) Diehl A, von Wintzingerode F, Gorisch H.

Quinoprotein ethanol dehydrogenase of

Pseudomonas aeruginosa is a homodimer--

sequence of the gene and deduced structural

properties of the enzyme. Eur J Biochem. 1998

Oct 15;257(2):409-19.

(45) Kalyuzhnaya MG, Hristova KR, Lidstrom ME,

Chistoserdova L. Characterization of a novel

methanol dehydrogenase in representatives of

Burkholderiales: implications for environmental

detection of methylotrophy and evidence

for convergent evolution. J Bacteriol. 2008

Jun;190(11):3817-23.

(46) Toyama H, Mathews FS, Adachi O, Matsushita K.

Quinohemoprotein alcohol dehydrogenases:

structure, function, and physiology. Arch Biochem

Biophys. 2004 Aug 1;428(1):10-21.

(47) Keitel T, Diehl A, Knaute T, Stezowski JJ, Hohne W,

Gorisch H. X-ray structure of the quinoprotein

ethanol dehydrogenase from Pseudomonas

aeruginosa: basis of substrate specifi city. J Mol

Biol. 2000 Apr 7;297(4):961-74.

(48) de Jong GA, Caldeira J, Sun J, Jongejan JA, de

Vries S, Loehr TM, et al. Characterization of

the interaction between PQQ and heme c in the

quinohemoprotein ethanol dehydrogenase from

Comamonas testosteroni. Biochemistry. 1995 Jul

25;34(29):9451-8.

1020 KKU Res. J. 2013; 18(6)

(49) Yakushi T, Matsushita K. Alcohol dehydrogenase

of acetic acid bacteria: structure, mode of

action, and applications in biotechnology. Appl

Microbiol Biotechnol. 2010 May;86(5):1257-65.

(50) Matsushita K, Yakushi T, Toyama H, Adachi O,

Miyoshi H, Tagami E, et al. The quinohemoprotein

alcohol dehydrogenase of Gluconobacter

suboxydans has ubiquinol oxidation activity at a

site different from the ubiquinone reduction site.

Biochim Biophys Acta. 1999 Jan 5;1409(3):154-64.

(51) Chinnawirotpisan P, Theeragool G, Limtong S,

Toyama H, Adachi OO, Matsushita K. Quinoprotein

alcohol dehydrogenase is involved in catabolic

acetate production, while NAD-dependent

alcohol dehydrogenase in ethanol assimilation

in Acetobacter pasteurianus SKU1108. J Biosci

Bioeng. 2003;96(6):564-71.

(52) Hartner FS, Glieder A. Regulation of methanol

utilisation pathway genes in yeasts. Microb Cell

Fact. 2006;5:39.

(53) Sakai Y, Tani Y. Cloning and sequencing of the

alcohol oxidase-encoding gene (AOD1) from

the formaldehyde-producing asporogeneous

methylotrophic yeast, Candida boidinii S2. Gene.

1992 May 1;114(1):67-73.

(54) Cregg JM, Madden KR, Barringer KJ, Thill GP,

Stillman CA. Functional characterization of the

two alcohol oxidase genes from the yeast Pichia

pastoris. Mol Cell Biol. 1989 Mar;9(3):1316-23.

(55) Koutz P, Davis GR, Stillman C, Barringer K,

Cregg J, Thill G. Structural comparison of the

Pichia pastoris alcohol oxidase genes. Yeast.

1989 May-Jun;5(3):167-77.

(56) Fassel TA, Buchholz LA, Collins ML, Remsen

CC. Localization of methanol dehydrogenase in

two strains of methylotrophic bacteria detected by

immunogold labeling. Appl Environ Microbiol.

1992 Jul;58(7):2302-7.

(57) Kagi JH, Vallee BL. The role of zinc in alcohol

dehydrogenase. V. The effect of metal-binding

agents on thestructure of the yeast alcohol

dehydrogenase molecule. J Biol Chem. 1960

Nov;235:3188-92.

(58) Ameyama M, Nonobe M, Shinagawa E,

Matsushita K, Adachi O. Method of enzymatic

determination of pyrroloquinoline quinone.

Analytical Biochemistry. 1985;151(2):263-7.

(59) Toyama H, Fujii T, Aoki N, Matsushita K, Adachi O.

Molecular cloning of quinohemoprotein alcohol

dehydrogenase, ADH IIB, from Pseudomonas

putida HK5. Biosci Biotechnol Biochem. 2003

Jun;67(6):1397-400.

(60) Toyama H, Chen ZW, Fukumoto M, Adachi O,

Matsushita K, Mathews FS. Molecular cloning and

structural analysis of quinohemoprotein alcohol

dehydrogenase ADH-IIG from Pseudomonas

putida HK5. J Mol Biol. 2005 Sep 9;352(1):

91-104.

(61) Promden W, Vangnai AS, Pongsawasdi P,

Adachi O, Matsushita K, Toyama H. Disruption

of quinoprotein ethanol dehydrogenase gene and

adjacent genes in Pseudomonas putida HK5.

FEMS Microbiol Lett. 2008 Mar;280(2):203-9.

(62) Promden W, Vangnai AS, Toyama H, Matsushita K,

Pongsawasdi P. Analysis of the promoter activities

of the genes encoding three quinoprotein alcohol

dehydrogenases in Pseudomonas putida HK5.

Microbiology. 2009 Feb;155(Pt 2):594-603.

Documents

Biochemistry of Bacterial Alcohol Dehydrogenases