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Biologia Molecular(1)

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  • NOTAS DE BIOLOGA MOLECULAR J. Ramos- Zapata y L. Gonzlez-Herrera

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    UNIDAD 1

    ADN COMO FUENTE DE INFORMACIN 1.1 DESCUBRIMIENTO DEL ADN El cido desoxiribunucleico fue identificado inicialmente en 1868 por Friedrich Miescher, en los ncleos de las clulas del pus y en esperma de salmn. La llamo nuclena, observ la presencia de fsforo. Robert Feulgen, en 1914, describi un mtodo para revelar por tincin el ADN, basado en el colorante fucsina. Se encontr la presencia de ADN en el ncleo de todas las clulas eucariotas, especficamente en los cromosomas. El bioquimico P.A. Levene en los 20s analiz los componentes del ADN y encontr que contena cuatro bases nitrogenadas: citosina y timina (pirimidinas), adenina y guanina (purinas); el azcar desoxirribosa; y un grupo fosfato. Fosfato. La virtud del material gentico es su habilidad para especificar una larga variedad de protenas. Un error inicial fue el pensar que la estructura del material gentico debera ser tan compleja como la variedad de protenas producidas, ya que, se pensaba, que nicamente las protenas posean la suficiente diversidad para especificar otras protenas, sin embargo, se aclar esta cuestin cuando se sugiri que el material gentico produca protenas siguiendo un cdigo basado en la diversidad de combinaciones que se podan obtener de los nucletidos, tomados de tres en tres. El descubrimiento del principio de transformacin en los ncleo celulares por Griffth (1928), dio la base para pensar que el cido nucleico era el material gentico. La bacteria del gnero Pneumococus provoca la muerte en ratones producindoles neumona, la virulencia de las bacterias estn determinadas por los polisacridos capsulares, componentes de la superficie de diferentes tipos de Pneumococos, estos pueden ser tres diferentes tipos (I, II y III) de polisacridos capsulares, todos con apariencia algodonosa (S) en la pared y por lo tanto en la colonias formadas. La bacteria S, con apariencia lisa, muerta puede transformar a las bacterias vivas R. A esta capacidad de transformacin se le aisl, como un principio de transformacin, en cultivo por Avery y colaboradores en 1944 y demostraron que era el cido desoxiribonucleico (ADN), que se encontraba en abundancia en los ncleos de las clulas (Figura 1).

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    Figura 1.1 Experimento de transformacin de Avery y colaboradores El papel del ADN luego fue confirmado con el descubrimiento de las enzimas ADNasas, pues al degradar los cidos la capacidad transformante se perda, lo que no suceda se empleaba la tripsina que degrada protenas lo cual no influa en la transformacin, se desech entonces la idea de que las protenas posean la capacidad de trasmitir la informacin gnica. 1.2 ADN MATERIAL GENETICO UNIVERSAL Despus de demostrar que el principio transformante consista de ADN, era necesario probar que este era el material gentico en todos los sistemas biolgicos. Procariotas: Cuando el fago T2 infecta a clulas de E. coli, cuando estas se aplican a la bacteria son absorbidos y 20 minutos mas tarde las bacterias son lisadas, liberando una gran cantidad de fagos. Hershey y Chase (1952), infectaron bacterias E. coli, con fagos T2 marcados radiactivamente ya sea con P32 en el ADN o bien con S35 en las protenas. Las bacterias infectadas fueron centrifugadas separndose en dos capas. La capa superficial consista de las envolturas de los fagos liberados de la superficie bacteriana y por lo tanto marcados con S35. La otra fraccin consista de las bacterias infectadas, la mayora de P32 se present en las bacterias infectadas. La progenie de fagos producidos por la infeccin contena un 30% del P32 marcado, y muy poco (1%) de S35 marcado. Este experimento demuestra que el ADN del fago interno entra a la bacteria y forma parte de la progenie de fagos, exactamente el patrn de herencia esperado

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    del material gentico. Aunque se demostr claramente que el ADN es el material gentico, el experimento de infeccin con fagos no es tan preciso como la transformacin bacteriana para excluir protenas contaminantes del ADN.

    Figura 1.2 Experimento de Hershey y Chase Eucariontes: La discusin de los resultados de transmisin de Avery, son aplicados a un amplio rango de organismos tanto procariontes como eucariontes. Cuando el ADN es aplicado a poblaciones de clulas eucariticas simples crecidos en cultivos, los cidos nucleicos entran a la clula y en algunas resulta en la produccin de protenas nuevas. Al inicio la extraccin se realizaba en masa, pero ahora el ADN se puede purificar para incorporar secuencias que producen una protena particular. Como en el caso de clulas mutantes (TK-) para la produccin de Timidina kinasa (TK) y que pueden obtener esta capacidad cuando se le aplica una secuencia de

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    ADN que poseea el gen que la sintetiza Los experimentos de transformacin en clulas eucariotas se denominan como transfeccin, sin embargo es similar a la transformacin bacteriana. El ADN introducido se convierte en parte del material gentico de la clula que ha sido transfectada. Al inicio la tcnica se realizaba nicamente en cultivos de clulas, pero ms recientemente el ADN puede ser introducido en huevos de mamferos por microinyecciones. Estos experimentos demuestran no solamente que el ADN es el material gentico, sino que, puede ser transferido entre especies diferentes y permanecer funcional. El materia gentico de todos los seres vivos y algunos virus es el ADN. Sin embargo algunos virus poseen ARN como material gentico, no obstante an siguen siendo los cidos nucleicos los encargados de dirigir los cambios y perpetuaciones gnicas. 1.3 COMPONENTES DEL ADN La observacin de que las bases estn presentes en diferentes cantidades en el ADN de las diferentes especies dio como conclusin el concepto de que las secuencias de bases debe ser la forma en que la informacin gentica es almacenada.

    Figura 1.3 Componentes del ADN.

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    Figura 1.4 Cada nucletido contiene un anillo heterocclico de carbono con tomos de nitrgeno (base nitrogenada), un azcar con cinco carbonos en forma de anillo de pentosa y un grupo fosfato. Figura 1.5 Las bases nitrogenadas pueden ser pirimidinas: con anillos de seis miembros. Purinas: con dos anillos formados de cinco y seis miembros cada uno.

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    Las bases purnicas son: adenina y guanina tanto en molculas de ADN como en las molculas de ARN. Por otro lado, se encuentran 2 pirimidinas en ADN, citosina

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    y timina, mientras que en el ARN se encuentran la citosina y el uracilo. La timina difiere del uracilo por la presencia de un sustituto del metilo en la posicin C5. Las pentosas tambin son diferentes entre las molculas de ADN y de ARN, de donde proviene su nombre: ADN = 2 desoxyribosa y ARN = ribosa.

    Figura 1.6 Esquemas de los azcares presentes en las molculas de ARN (iquierda) y ADN (derecha). Son diferentes por ausencia o presencia del grupo hidroxil en la posicin dos. Las bases nitrogenadas se unen a la posicin uno de pentosa por una unin glucosidica en la posicin N1 de la primidina y en la N9 de las purinas. Una base ligada a un azcar es llamado nucleosido y cuando se une a un grupo fosfato se llama nucletido. Los nucletidos proveen de bloques, los cuales se unen para construir los cidos nucleicos. Los nucletidos se unen en una cadena de polinucletidos por una columna que consiste de series alternadas de azcar y residuos de fosfato. Los nucletidos pueden existir en formas en las cuales ms de un grupo fosfato se une a la posicin 5. Son enlaces de alta energa, la cual es proveda para actividades celulares. NTP nuclecido trifosfato, NDP nuclecido difosfato (ver figura 1.4).

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    Figura 1.7 La posicin nmero 5 de una pentosa se conecta con la posicin 3 del siguiente anillo de pentosa, por un grupo fosfato. Por lo que la columna de fosfodiesterazcar se dice que consiste en uniones 53, las bases nitrogenadas se pegan en la periferia de la columna azcar fosfato. 5 izquierda y 3 derecha. 1.4 LA DOBLE HLICE DEL ADN Tres puntos claves sirvieron de base para que Watson y Crick propusieran el modelo de doble hlice del ADN en 1953: 1. Los datos de las fotografas de los rayos X, que mostraban que el ADN tena una forma de hlice regular, dando una vuelta completa cada 34 A (3.4 nm) con un dimetro de 20 A (2 nm) aproximadamente.

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    2. La distancia entre nucletidos adyacentes es 3.4 A, 10 nucletidos por vuelta. La densidad del ADN sugera que la hlice debera contener dos cadenas de polinucletidos. El dimetro constante se explica si las bases de cada cadena se unen de manera restringida por lo que las purinas siempre son opuestas a las pirimidinas.

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    Pirimidina con pirimidina, muy delgado

    Purina con purina, muy grueso

    20 A

    3. Independientemente de la cantidad de cada base, la proporcin G y C es siempre la misma en el ADN al igual que la proporcin A y T. la composicin de cualquier ADN se describe por la proporcin G + C que tiene un rango de entre 26 a 74 % para las diferentes especies. Watson y Crick propusieron que las dos cadenas estn unidas no por enlaces covalentes, sino por uniones de hidrogeno entre las bases nitrogenadas por lo que G pasa puentes de hidrogeno que la unen con C, y A con T de igual manera estas reaccion

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