BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN

CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG

(Avicenni alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN

RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khóa: 2003 – 2007

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN PHƢỚC DOANH

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 8 / 2007

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

*******************

BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN

CỨU SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG

(Avicenni alba) TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN

RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ

BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS. BÙI MINH TRÍ NGUYỄN PHƢỚC DOANH

Niên khóa: 2003 - 2007

Thành phố Hồ Chí Minh

Tháng 8 / 2007

iii

LỜI CẢM TẠ

Con muốn hôn lên đôi vầng trán đã nhiều nếp nhăn của Cha Mẹ để bày tỏ

lòng yêu thƣơng của con với ngƣời. Suốt cuộc đời này con xin mãi khắc ghi công

ơn sinh thành, dƣỡng dục của Cha Mẹ đã nuôi dƣỡng con khôn lớn và cho con ăn

học nên ngƣời. Con rất muốn Cha Mẹ biết rằng con yêu Cha Mẹ nhiều lắm, con

luôn tự hào vì là con của Cha Mẹ.

Con xin chân thành biết ơn những ngƣời thân yêu trong gia đình đã luôn

động viên và tạo điều kiện cho con ăn học đến ngày hôm nay.

Em xin gởi lòng biết ơn đến:

Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.

Ban giám đốc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm trƣờng Đại Học Nông

Lâm TP Hồ Chí Minh.

Ban Chủ nhiệm và các Thầy, Cô ở Bộ môn Công nghệ sinh học.

Ban quản lý Rừng phòng hộ Cần Giờ, anh Bình, anh Kiệt thuộc phòng

kỹ thuật.

đã tạo nhiều điều kiện thuận lợi cho phép em thực hiện đề tài này.

Em xin đặc biệt gởi lòng biết ơn và tri ân sâu sắc đến Thầy - Tiến sỹ Bùi

Minh Trí – giáo viên hƣớng dẫn, đã nhiệt tình chỉ dẫn, giúp đỡ và truyền đạt nhiều

kinh nghiệm quý giá trong nghiên cứu cũng nhƣ trong cuộc sống, giúp em hoàn

thành đề tài này và ứng dụng nhiều trong thời gian tới.

Và rất cảm ơn đến các anh chị đang công tác tại Trung tâm phân tích Thí

nghiệm Trƣờng Đại học Nông Lâm: chị Hƣng, chị Dung, chị Liên, anh Khoa, anh

Phƣơng, anh Vũ…cùng các bạn sinh viên Công nghệ sinh học K29 thƣơng yêu, đã

cùng tôi chia sẽ nhiều buồn vui, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài này.

Xin chân thành cảm ơn !

NGUYỄN PHƢỚC DOANH

iv

TÓM TẮT KHÓA LUẬN

NGUYỄN PHƢỚC DOANH, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh. Đề tài

“BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA

DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ

SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG PHƢƠNG PHÁP RAPD”

đƣợc tiến hành tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm và Hóa sinh trƣờng Đại học

Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, thời gian từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007.

Mắm trắng là loài cây ngập mặn thực sự, giữ nhiều vai trò quan trọng và có

sự phân bố rộng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. Tuy nhiên, trải qua những hoạt

động khai thác của con ngƣời, quần thể mắm trắng tại đây ngày càng thoái hóa và

suy giảm về diện tích nghiêm trọng. Vì vậy, những nghiên cứu về đa dạng di truyền

trở nên cần thiết để cung cấp những thông tin cơ bản cho việc thiết lập các chiến

lƣợc tái tạo và phục hồi sự đa dạng sinh học của hệ sinh thái.

Những kết quả đạt đƣợc:

Thu đƣợc 50 mẫu lá mắm trắng có tính chất đại diện cao cho quần thể.

Tối ƣu quy trình ly trích DNA, thu nhận DNA chất lƣợng cao đáp ứng

các yêu cầu nghiên cứu Sinh học phân tử.

Bƣớc đầu xây dựng quy trình RAPD phù hợp cho cây mắm trắng, sử

dụng primer OPAC10. Với 14 mẫu DNA phân tích thu đƣợc tổng cộng 49 băng,

trung bình là 3,5 băng cho mỗi mẫu. Có 6 băng đa hình ở các kích thƣớc 450 bp,

390 bp, 330 bp, 300 bp,100 bp, 50 bp và chỉ 1 băng đồng hình ở kích thƣớc 200bp.

Kết quả thực hiện phản ứng RAPD đƣợc xử lý trên mần mềm NTSYS

thu đƣợc cây phân loài của những cây đem phân tích. Cây phân loài cho thấy chỉ số

đồng dạng di truyền khá cao từ 0,55 – 1. Điều này cũng có nghĩa sự đa dạng di

truyền của quần thể mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ ở mức thấp do đó

cần đặc biệt chú ý đến công tác bảo tồn, phục hồi đa dạng di truyền trên cây mắm

trắng và đa dạng sinh học rừng Cần Giờ, đáp ứng mục tiêu phát triển bền vững rừng

trong thời gian tới.

v

SUMMARY

NGUYEN PHUOC DOANH, Nong Lam university. “PREMILINARY RESEACH

ON METHOD DEVELOPMENT AND GENETIC DIVERSITY EVALUATION

OF Avicennia alba IN CAN GIO MANGROVE BIOSPHERE RESERVE AREA

USING RAPD”.

This thesis was carried out at Chemical & Biological Analysis And Experiment

Center, Nong Lam university from April to August 2007.

Avicennia alba is an important true mangrove species because of it’s large

distribution, especially in Can Gio Mangrove Biosphere Reserve Area. However,

over – exploitation by human activities has induced to a steady decline and

degraduation. Studies on population genetics are necessary to provide basic

information for establishing the strategies for conserving and recovering

biodeversity of the ecosystem.

The obtained results were:

Fifty of Avicennia alba leaf samples were collected.

The genome DNA isolation protocol was improved to get high quality DNA.

The RAPD – PCR procedure was developed and optimized suitable for

Avicennia alba using primer OPAC10. Totally 49 amplicons were

generated with an average of 3,5 applicons per individual. There were only

one isomorphic băng (200 bps) and six polymorphic băngs (50 bps, 100 bps,

300 bps, 330 bps, 390 bps, and 450 bps).

A phylogenic tree was drawn by using NTSYS sofware based on RAPD

results. This phylogenic shown a high coefficient similarity from 0.55 to 1 in

14 analized samples. It suggested that the genetic diversity of Avicennia alba

population is relatively poor. So, strategies for conserving and recovering

their genetic diversity in Can Gio biodiversity is urgently needed.

vi

MỤC LỤC

ĐỀ MỤC TRANG

LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ iii

TÓM TẮT KHÓA LUẬN ......................................................................................... iv

SUMMARY ................................................................................................................ v

MỤC LỤC .................................................................................................................. vi

DANH SÁCH CÁC BẢNG ....................................................................................... ix

DANH SÁCH CÁC HÌNH ......................................................................................... x

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................... xi

Phần 1. GIỚI THIỆU .................................................................................................. 1

1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1

1.2. Mục đích ............................................................................................................... 2

1.3. Yêu cầu ................................................................................................................. 2

1.4. Giới hạn của đề tài ............................................................................................... 2

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3

2.1. Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ ...................................................... 3

2.1.1. Đặc điểm tự nhiên ............................................................................................ 3

2.1.2. Cấu trúc ............................................................................................................ 6

2.1.3. Các tiềm năng của rừng ngập mặn Cần Giờ .................................................... 7

2.1.4. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển .................................................................... 9

2.1.5. Các nguy cơ đe dọa đối với rừng ngập mặn Cần Giờ ...................................... 9

2.2. Giới thiệu về cây mắm trắng (Avicennia alba) ................................................. 10

2.2.1. Vùng phân bố ................................................................................................. 10

2.2.2. Hình thái học cây mắm trắng ......................................................................... 11

2.2.3. Giá trị kinh tế của cây mắm trắng .................................................................. 13

2.2.4. Những hiện trạng cây mắm trắng tại rừng ngập mặn Cần Giờ ....................... 13

2.2.5. Những nghiên cứu khoa học về cây mắm trắng .............................................. 14

vii

2.3. Khái niệm về đa dạng di truyền ......................................................................... 14

2.3.1. Đa dạng sinh học ............................................................................................ 14

2.3.2. Ý nghĩa và tầm quan trọng của đa dạng sinh học .......................................... 14

2.3.3. Các phân mức về đa dạng sinh học ................................................................ 15

2.3.3.1. Đa dạng hệ sinh thái ..................................................................................... 15

2.3.3.2. Đa dạng loài ................................................................................................. 15

2.3.3.3. Đa dạng di truyền ......................................................................................... 16

2.3.4 Hiện trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam ........................................................ 17

2.4. Phƣơng pháp chiết tách DNA thực vật ............................................................. 18

2.5. Polymerase Chain Reaction (PCR) .................................................................... 19

2.5.1 Khái niệm ........................................................................................................ 19

2.5.2. Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR .............................. 19

2.5.3. Nguyên tắc của phản ứng PCR ...................................................................... 20

2.5.4. Ứng dụng của kỹ thuật PCR .......................................................................... 21

2.5.5. Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR ............................................................. 21

2.6. Các chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền .................... 22

2.6.1. Nhóm không dựa trên PCR

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) .............................................. 22

2.6.2. Nhóm dựa trên PCR ........................................................................................ 23

2.6.2.1. SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism) ............................... 23

2.6.2.2. Microsatellite (SSR: Simple Sequence Repeat) .......................................... 24

2.6.2.3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ................................. 25

2.6.2.4. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ........................................ 30

Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ....................................... 33

3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ......................................................................... 33

3.1.1. Thời gian tiến hành ......................................................................................... 33

3.1.2. Địa điểm .......................................................................................................... 33

3.2. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................ 33

3.2.1. Mẫu thực vật.................................................................................................... 33

viii

3.2.2. Hóa chất thí nghiệm ........................................................................................ 34

3.2.2.1. Hóa chất dùng trong ly trích DNA ............................................................... 34

3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra DNA ............................................................. 35

3.2.2.3. Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD .............................................. 36

3.2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm ........................................................................ 36

3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................... 37

3.3.1. Phƣơng pháp ly trích DNA ............................................................................. 37

3.3.2. Kiểm tra DNA ly trích ........................................................................ 39

3.3.2.1. Kiểm tra định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel ...................... 39

3.3.2.2. Kiểm tra định lƣợng DNA bằng quang phổ kế ............................................ 39

3.3.3. Thực hiện kỹ thuật RAPD ............................................................................... 40

3.3.4. Phân tích số liệu trên phần mềm NTSYSpc2.1 ..................................... 42

Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 43

4.1. Kết quả thu thập mẫu mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ ............... 43

4.2. Kết quả quá trình bảo quản mẫu ........................................................................ 44

4.3. Kết quả quá trình ly trích DNA tổng số ............................................................. 44

4.4. Kết quả quá trình thực hiện phản ứng RAPD .................................................... 47

4.4.1. Kết quả thí nghiệm 1 ....................................................................................... 47

4.4.2. Kết quả thí nghiệm 2 ....................................................................................... 50

4.5. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh

quyển Cần Giờ .......................................................................................................... 50

Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 54

5.1. Kết luận .............................................................................................................. 54

5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 56

PHỤ LỤC

ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG

Bảng 3.1. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 ................... 40

Bảng 3.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 ............................... 40

Bảng 3.3. Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 ................ 41

Bảng 3.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 ............................... 41

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 4.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích 4 ............................................................ 47

x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG

Hình 2.1. Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ ............................. 5

Hình 2.2. Cây mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ. ................................. 11

Hình 2.3. Lá và hoa cây mắm trắng. ......................................................................... 12

Hình 2.4. Trái mắm trắng. ......................................................................................... 12

Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt nguyên lý kỹ thuật PCR. ..................................................... 20

Hình 2.6. Cơ chế cắt của enzyme MseI và EcoRI .................................................... 26

Hình 2.7. Cơ chế gắn của adapter MseI và adapter EcoRI. ...................................... 26

Hình 2.8. Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc trong phản ứng AFLP. .......................... 27

Hình 2.9. Cơ chế khuếch đại chọn lọc trong phản ứng AFLP. ................................. 28

Hình 2.10. Cơ chế phản ứng trong kỹ thuật AFLP ................................................... 29

Hình 2.11. Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD – PCR ........................ 30

Hình 4.1. Sơ đồ vị trí lấy mẫu tại Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ ......................... 43

Hình 4.2. Kết quả ly trích theo quy trình 1 và quy trình 2 ........................................ 45

Hình 4.3. Kết quả ly trích theo quy trình 3. .............................................................. 45

Hình 4.4. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích tối ƣu ....................................................... 46

Hình 4.5. Kết quả ly trích theo quy trình 4 ............................................................... 46

Hình 4.6. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1 ............................... 48

Hình 4.7. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2 ............................... 48

Hình 4.8. Sản phẩm RAPD với primer 1 trên cây mắm đen

(Avicennia officinalis) .............................................................................................. 49

Hình 4.9. Sản phẩm RAPD ở thí nghiệm 2 trên cây mắm trắng ............................... 50

Hình 4.10. Kết quả thực hiện RAPD trên cây mắm trắng ....................................... 51

Hình 4.11. Cây phân nhóm di truyền 14 mẫu mắm trắng phân tích ......................... 52

xi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

µl: microlite

µM: micromol/lite

bp: base pair

cm: centimét

CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide

DNA: Deoxyribonucleic acid

dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate

Kb: kilobases

mM: milimol/lite

m: mét

nm: nanomét

OD: Optical density.

PCR: Polymerase chain reaction

pmol: picomol

RNA: Ribonucleic acid

Rnase: Ribonuclease

SSR: Single sequence repeat

Ta : Annealing temperature (nhiệt độ bắt cặp)

TAE: Tris-glacial acetic acid- ethylenne diamine tetra acetic acid

TE: Tris-EDTA (ethylenne diamine tetra acetic acid)

Tm: Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy)

U: Đơn vị hoạt tính của enzyme

1

Phần 1

GIỚI THIỆU

1.1. Đặt vấn đề

Rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh, đƣợc xem là khu rừng phục hồi

đẹp nhất Đông Nam Á và vinh dự đƣợc UNESCO công nhận là khu dự trữ sinh

quyển đầu tiên của Việt Nam, nằm trong mạng lƣới 459 khu dự trữ sinh quyển trên

Thế giới. Đây đƣợc xem là hệ sinh thái quan trọng, điển hình ở vùng ven biển nhiệt

đới, không chỉ phong phú, đa dạng với các quần thể thực vật, động vật có giá trị mà

còn đƣợc xem là lá phổi xanh của TP Hồ Chí Minh và có nhiều tiềm năng về kinh

tế, du lịch sinh thái – văn hóa, nghiên cứu và giao lƣu quốc tế.

Cây mắm trắng (Avicennia alba) là một trong những loài thực vật ngập mặn

thực sự, rất phổ biến tại rừng Cần Giờ. Đây là quần thể tiên phong và giữ một vai

trò quan trọng trong hệ sinh thái rừng. Nguồn lợi chính của mắm không nằm trong

việc khai thác gỗ mà nằm trong việc bảo vệ đất bồi và gây môi trƣờng sống cho sinh

vật ven biển. Quần thể mắm trắng đi kèm với quần thể đƣớc là thành phần chính

của rừng ngập mặn Cần Giờ, có vai trò chắn sóng gió, bảo vệ vùng ven biển, là nơi

nuôi dƣỡng và cung cấp thức ăn cho các loài hải sản có giá trị cao. Diện tích đất bồi

sẽ giảm đi nếu thiếu mắm để bảo vệ.

Quần thể mắm trắng tại đây chủ yếu là phát triển tự nhiên. Tuy nhiên, qua

thời gian cùng với sự phát triển của rừng, diện tích mắm trắng đang ngày càng thu

hẹp trƣớc sự khai thác, sử dụng không hợp lý và lâm vào tình trạng báo động bởi

những dịch sâu bệnh tấn công trên vùng rộng. Việc đánh giá tổng quát về quỹ gien

và mức độ đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần

Giờ là cần thiết để cung cấp những thông tin cơ bản cho các kế hoạch bảo vệ và sử

dụng hợp lý tiềm năng cây mắm trắng. Đáp ứng yêu cầu đó, đƣợc sự phân công của

Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh, và

dƣới sự hƣớng dẫn của Tiến sĩ Bùi Minh Trí, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

2

“BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA

DẠNG DI TRUYỀN CÂY MẮM TRẮNG (Avicennia alba) TẠI KHU DỰ TRỮ

SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ THUẬT RAPD”.

1.2. Mục đích

Tối ƣu hóa quy trình ly trích DNA và bƣớc đầu hoàn thiện quy trình thực

hiện phản ứng RAPD thích hợp cho cây mắm trắng.

Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng

(Avicennia alba) tại khu dự trữ sinh quyển Rừng ngập mặn Cần Giờ.

1.3. Yêu cầu

Thu thập đƣợc nhiều mẫu đặc trƣng, mang tính đại diện cao cho quần thể

mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, chú ý đến những mẫu

đặc biệt, cá biệt trong quần thể, ghi nhận tọa độ chính xác của mỗi cá thể.

Ly trích thành công DNA từ các mẫu đã thu đủ tiêu chuẩn về độ tinh sạch

và số lƣợng cho các phân tích tiếp theo.

Thiết lập quy trình RAPD - PCR trên cây mắm trắng cho độ tin cậy cao.

1.4. Giới hạn của đề tài

Số lƣợng các primer đƣợc sử dụng còn bị hạn chế.

Chƣa có điều kiện khảo sát quần thể mắm trắng với số lƣợng mẫu lớn.

Việc tìm kiếm những cá thể đặc biệt bị giới hạn do điều kiện đi lại trong

rừng gặp nhiều khó khăn.

Đề tài đƣợc thực hiện trong thời gian ngắn, từ tháng 4/2007 đến tháng

8/2007, do đó chƣa phản ánh đúng đắn và chính xác với tất cả các giống hiện có.

3

Phần 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ

2.1.1. Đặc điểm tự nhiên

Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ nằm trên địa bàn huyện Cần Giờ, một huyện

ngoại thành của TP Hồ Chí Minh, nằm ở vùng ven biển vịnh Gềnh Rái và cửa sông

Đồng Nai, là cửa ngõ Đông Nam của thành phố Hồ Chí Minh, cách trung tâm thành

phố khoảng 30 km. Đây là khu dự trữ sinh quyển mang đặc điểm của hệ sinh thái

cửa sông ven biển, hệ động thực vật đặc trƣng cho hệ sinh thái rừng ngập mặn.

Vùng rừng ngập mặn bị chia cắt bởi hệ thống sông rạch dày đặc gồm sông lớn nhƣ

Lòng Tàu nằm giữa khu rừng (đƣờng thủy ra vào cảng Sài Gòn), sông Đồng Tranh,

sông Nhà Bè, sông Thị Vải, sông Gò Gia, và nhiều rạch khác [19].

Trƣớc năm 1960, rừng ngập mặn Cần Giờ (có tên gọi thông thƣờng là Rừng

Sác) có tới hơn 40.000 ha cây rừng, đƣợc xếp hạng rừng giàu. Rừng có cấu trúc dày

đặc với tán rừng dày, cao trên 25 m, đƣờng kính 25 – 40 cm, là sinh cảnh của nhiều

động vật hoang dã. Trong rừng, đƣớc (Rhizophora apiculata) là loài chiếm ƣu thế,

bên cạnh các quần thể khác nhƣ bần đắng (Sonneratia alba), mắm trắng (Avicennia

alba), đƣng (R. mucronata), vẹt (Bruguiera spp.), xu (Xylocarpus spp), cóc

(Lumnitzera spp.), chà là (Phoenix paludosa), giá (Excoecaria agallocha) [5], [19].

Trong suốt thời gian chiến tranh chống Mỹ, rừng ngập mặn Cần Giờ là đối

tƣợng tàn phá của nhiều phƣơng tiện chiến tranh, đặc biệt bị hủy diệt gần nhƣ hoàn

toàn do chất độc hóa học, liên tục từ năm 1961 đến năm 1971, hầu hết các loại cây

rụng lá và chết. Các loài cây nhƣ đƣớc, đƣng gần nhƣ biến mất. Một số ít cây dà

(Ceriops spp), giá (Excoecaria agallocha) ven bờ kênh rạch tái sinh theo từng cụm

nhỏ, nơi đất ngập triều có mắm, trên đất cao có chà là nƣớc (Phoenix paludosa) và

các loài ráng đại (Acrostichum aureum), dây mủ (Gymnanthera mitida), cóc kèn

4

(Derris trifoliata), chùm lé (Azima sarmentosa), lức (Pluchea indica), chùm gọng

(Clerodendrum inerme) [5].

Sau giải phóng, một chƣơng trình lớn đƣợc thực hiện: khôi phục rừng ngập

mặn Cần Giờ vì yêu cầu cấp bách khắc phục hậu quả nghiêm trọng đối với môi

trƣờng TP Hồ Chí Minh do chiến tranh hóa học gây ra. Từ năm 1967 đến nay, công

việc tái tạo rừng đƣợc thực hiện mạnh mẽ. Đến nay diện tích rừng ngập mặn Cần

Giờ vào khoảng 38.000 ha. Sau hơn 30 năm bảo tồn và phát triển, rừng ngập mặn

Cần Giờ vinh hạnh đƣợc UNESCO công nhận là Khu dự trữ sinh quyển với tên

chính thức: Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh và tên

ngắn gọn: Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ [19], [21].

Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ có tọa độ địa lý và các đặc điểm nhƣ sau:

Vĩ độ Bắc: 10o22’14” – 10

o37’39”

Kinh độ Đông: 106o46’12” – 107

o00’59”

Ngày đƣợc UNESCO công nhận: 21/01/2000.

Tổng diện tích: 71.370 ha, chiếm tới 1/3 diện tích đất đai toàn TP Hồ

Chí Minh. Trong đó diện tích rừng và đất liền là 38.664 ha (chiếm khoảng

54,2%).

Dân số: 57.650 ngƣời (nguồn thống kê tháng 7/1999 của huyện Cần

Giờ), với 40% số hộ thuộc diện xóa đói giảm nghèo, sống chủ yếu dựa vào

khai thác tài nguyên rừng [5], [8], [19].

5

Hình 2.1. Bản đồ Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.

Ghi chú:

Vùng lõi

Vùng đệm

Vùng chuyển tiếp

6

2.1.2. Cấu trúc

Khu dự trữ sinh quyển Rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc chia làm 3 vùng

chính: vùng lõi, vùng đệm, vùng chuyển tiếp [5].

Vùng lõi (4.721 ha): đặc trƣng cho các hệ sinh thái rừng trồng và đặc biệt

là rừng ngập mặn tái sinh tự nhiên dọc theo các kênh rạch và bìa rừng với đa dạng

sinh học cao về thành phần các loài động vật, thực vật, vi sinh vật với cảnh quan

rừng ngập mặn đa dạng và hấp dẫn, gồm các tiểu khu rừng số 4b, 6, 11, 12 và 13.

Mục tiêu quản lý vùng lõi là bảo tồn đa dạng sinh học, hạn chế các hoạt động

của con ngƣời và có các chức năng chính nhƣ sau:

Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn bao gồm rừng trồng và rừng

tự nhiên.

Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn với các môi trƣờng sống của

động vật hoang dã, đặc biệt là chim nƣớc.

Bảo tồn hệ thống thuỷ vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển

nơi kiếm ăn và sinh đẻ của các loài động vật vùng triều.

Tiến hành một số công trình nghiên cứu khoa học về sức bền hệ

sinh thái và du lịch sinh thái có giới hạn [5].

Vùng đệm (37.339 ha): tiếp giáp với vùng lõi, là nơi có thể tiến hành các

hoạt động kinh tế, nghiên cứu, giáo dục và giải trí nhƣng không ảnh hƣởng đến mục

đích bảo tồn trong vùng lõi, bao gồm các tiểu khu rừng số 1, 2, 3, 4a, 5, 7, 8, 9, 10,

14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. 23 và 24.

Với chức năng phục hồi các hệ sinh thái, vùng đệm có vai trò quan trọng

trong bảo tồn vùng lõi. Các hoạt động du lịch sinh thái, tham quan và nghiên cứu có

thể triển khai ở Khu căn cứ địa kháng chiến, đặc khu Rừng Sác, thăm vƣờn chim,

vƣờn cò, vƣờn dơi sẽ góp phần nâng cao thu nhập cho ngƣời dân, nâng cao ý thức

và hiểu biết giá trị của công tác bảo tồn góp phần làm giảm sức ép lên vùng lõi của

khu dự trữ sinh quyển. Mặt khác, vùng đệm còn tạo không gian cho thú hoang dã

nhƣ khỉ, rái cá, kỳ đà kiếm ăn. Khi các khu vực này trở nên ổn định, có thể bổ sung

7

vào vùng lõi nếu cần thiết, đồng thời tạo cảnh quan tự nhiên và hoạt động văn hoá

phục vụ cho du lịch sinh thái. Ngoài ra, các mô hình lâm ngƣ kết hợp thân thiện với

môi trƣờng cũng đƣợc ứng dụng, trình diễn cho nhân dân địa phƣơng đến tham

quan, học tập và trao đổi kinh nghiệm [5].

Vùng chuyển tiếp (29.310 ha): gồm các khu vực còn lại của huyện Cần

Giờ, bao gồm các vùng bãi bồi, giồng, bãi cát, các khu vực sản xuất nông nghiệp,

thuỷ sản của dân cƣ dọc theo ven biển Cần Giờ.

Vùng chuyển tiếp còn đƣợc gọi là vùng phát triển bền vững, nơi cộng tác của

các nhà khoa học, nhà quản lý và ngƣời dân địa phƣơng, tạo điều kiện thuận lợi và

đẩy mạnh các hoạt động phát triển kinh tế, du lịch, dịch vụ đi đôi với tuyên truyền

giáo dục nâng cao nhận thức cộng đồng [5].

2.1.3. Các tiềm năng của rừng ngập mặn Cần Giờ

Rừng ngập mặn Cần Giờ là Khu dự trữ sinh quyển thế giới đầu tiện tại Việt

Nam, và là thành viên thứ 368 của mạng dự trữ sinh quyển quốc tế thuộc 97 quốc

gia. Đến tháng 7/2002, Rừng ngập mặn Cần Giờ tiếp tục đƣợc Tổ chức Du lịch thế

giới (World Tourism Organization) công nhận là Khu du lịch Sinh thái bền vững

nhất (là 1 trong 65 khu đƣợc thế giới công nhận). Theo Ủy ban Quốc gia Con ngƣời

và Sinh quyển Việt Nam (MAB), rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc xem là khu rừng

phục hồi đẹp nhất Đông Nam Á, đặc biệt là còn rất ít trên thế giới [5], [19].

Rừng ngập mặn đƣợc xem là hệ sinh thái quan trọng, điển hình ở vùng ven

biển nhiệt đới không chỉ cung cấp lâm sản có giá trị mà còn là nơi cƣ trú của nhiều

loài hải sản, chim nƣớc, chim di cƣ và một số loài động vật lƣỡng cƣ, trên cạn [19].

Rừng ngập mặn Cần Giờ mang tính chất rừng nhiệt đới cổ và phong phú về

số loài thực vật di cƣ. Theo số liệu điều tra, Rừng ngập mặn Cần Giờ có khoảng 35

loài thực vật, phổ biến là đƣớc đôi (Rhizophora apiculata), đƣng (Rhizophora

mucronata), mắm trắng (Avicennia alba), bần (Sonneratia evata), chà là (Phoenix

paludosa), dừa nƣớc (Nipa fruticans) [19].

8

Cùng với sự phục hồi về thảm thực vật rừng, nhiều loài động vật tƣởng

chừng đã biến mất cùng với sự tàn phá của chiến tranh đã hồi sinh và phát triển lại

nhanh chóng ở nơi đây nhƣ khỉ, lợn rừng, chồn, trăn, rái cá, trong đó có nhiều loài

đƣợc ghi trong Sách Đỏ Việt Nam nhƣ Cá sấu hoa cà, Rắn hổ mang chúa. Đặc biệt,

nhờ có sinh cảnh thuận lợi, các sân chim tự nhiên đã và đang hình thành trở lại với

số loài đã chiếm tới 34% tổng số loài chim nƣớc ở Việt Nam, trong đó có tới 9 loài

quí hiếm đƣợc ghi trong Sách Đỏ Thế giới. Động vật không xƣơng sống thủy sinh ở

rừng ngập mặn Cần Giờ có hơn 700 loài, đặc biệt những loài giáp xác, nhuyễn thể

có giá trị kinh tế cao. Trong rừng Cần Giờ có 137 loài cá, 40 loài lƣỡng thể và bò

sát, 130 loài chim, 19 loài thú. Rừng ngập mặn thực sự là cầu nối giữa hệ sinh thái

thủy vực và hệ sinh thái trên cạn, giữa hệ sinh thái ngập triều và hệ sinh thái ngập

nƣớc lợ và lũ sông nƣớc ngọt [19].

Bên cạnh những giá trị về đa dạng sinh học, Cần Giờ còn là nơi lần đầu tiên

ở Việt Nam và khu vực Đông Nam Á phát hiện khu mộ cổ chum (trên 300 ngôi), di

chỉ có giá trị về nền văn hoá Óc Eo [19].

Ngoài ra, lịch sử phát triển Cần Giờ còn gắn liền với tên tuổi Nguyễn Huệ

(chiến thắng trên sông Soài Rạp), Nguyễn Lữ, Trƣơng Định và những chiến công

của quân dân trong thời kỳ kháng chiến chống ngoại xâm trong chiến khu Rừng Sác

[19].

Những giá trị văn hoá bản địa của cộng đồng ngƣời dân nơi đây cũng rất

phong phú và mang đậm bản sắc, gắn liền với các lễ hội theo ngành nghề cổ truyền:

làng chài thờ Thần Nam Hải (Cá voi); làng rừng, làng nông thờ Hà Bá, Thủy Quan

sông rạch [ 19].

Rừng ngập mặn ở đây có những tổ hợp gien đặc biệt có thể sống và phát

triển tốt trong điều kiện nƣớc mặn, ngập nƣớc triều mà các loại cây khác không thể

sống đƣợc. Tuy là rừng trồng nhƣng rừng ngập mặn Cần Giờ đạt đƣợc hệ sinh thái

giống nhƣ rừng tự nhiên. Một ƣu thế nữa là rừng ngập mặn Cần Giờ nằm trong một

thành phố công nghiệp đông dân cƣ, rất thuận lợi để phát triển du lịch, giáo dục,

hợp tác quốc tế vô cùng thuận lợi [5].

9

2.1.4. Vai trò của khu dự trữ sinh quyển

Các khu dự trữ sinh quyển là đại diện mẫu của các hệ sinh thái trên Trái đất,

là phòng thí nghiệm sống cho việc nghiên cứu và giám sát các hệ sinh thái, đem lại

lợi ích cho ngƣời dân địa phƣơng và Quốc tế [5].

Hiện nay trên thế giới có 459 khu dự trữ sinh quyển thuộc 97 nƣớc [5]. Khu

dự trữ sinh quyển có các chức năng sau:

Bảo tồn: đóng góp vào việc bảo tồn địa dạng cảnh quan, hệ sinh thái

loài và vốn gien di truyền.

Phát triển: thúc đẩy phát triển kinh tế dựa trên cơ sở bền vững môi

trƣờng và văn hóa.

Trợ giúp: nghiên cứu, giám sát, đào tạo và giáo dục về bảo tồn và phát

triển bền vững địa phƣơng, Quốc gia, khu vực và Quốc tế.

2.1.5. Các nguy cơ đe dọa đối với rừng ngập mặn Cần Giờ

Trong chiến tranh, rừng ngập mặn Cần Giờ bị hủy diệt gần nhƣ hoàn toàn do

chất độc hóa học của Mỹ. Hầu hết các loại cây rụng lá và chết. Các loài cây chính

của rừng nhƣ đƣớc, đƣng gần nhƣ bị biến mất [19].

Sau chiến tranh, rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc tái sinh theo kế hoạch trồng

và phát triển rừng của thành phố Hồ Chí Minh, nhanh chóng trở thành Khu rừng

phòng hộ (1991) và Khu dự trữ sinh quyển thế giới (2000). Tuy nhiên hiện nay rừng

ngập mặn Cần Giờ đang đứng trƣớc những nguy cơ đe dọa đáng báo động [21].

Việc nghiêm cấm tỉa thƣa rừng của Ủy ban Nhân dân thành phố Hồ Chí

Minh ban hành (6/1999) làm chất lƣợng rừng có xu hƣớng xấu đi, do cạnh tranh

không gian, dinh dƣỡng và tạo điều kiện cho sâu bệnh phát triển. Chiều cao của cây

quá cao (với tuổi đời 19 – 27 chiếm đa số), cộng với thiếu ánh sáng nên đƣờng kính

thân không cân đối, làm thiệt hại đáng kể đến thu nhập từ nguồn gỗ. Mặc khác, việc

lƣu thông tàu bè đã làm xói lở ven bờ, khói thải, dầu làm ảnh hƣởng đến môi sinh.

Nhiều hộ dân cƣ vẫn còn sinh sống và sản xuất trong rừng làm ảnh hƣởng đến dòng

chảy, nguồn nƣớc, tạo các dịch bệnh cho cây rừng. Hiện nay đã xuất hiện nhiều sâu

10

bệnh hại cây rừng, nhƣ sâu ăn lá, nấm trắng, sâu đục thân đe dọa nghiêm trọng đến

sự sinh trƣởng của cây rừng. Thêm vào đó, việc mở con đƣờng Rừng Sác băng qua

rừng ngập mặn Cần Giờ hiện nay càng làm tăng thêm mối đe dọa đến môi sinh và

sinh thái rừng nghiêm trọng [21]. Do đó, việc nghiên cứu đa dạng di truyền của các

loài cây rừng có giá trị để làm tiền đề cho công tác chọn giống, khôi phục rừng đang

trở thành một vấn đề cấp bách hiện nay.

2.2. Giới thiệu về cây mắm trắng (Avicennia alba)

Tên Việt Nam: mắm trắng

Tên Latinh: Avicennia alba

Vị trí phân loại cây mắm trắng [17]:

2.2.1. Vùng phân bố

Mắm trắng là một nhóm các loài cây rừng ngập mặn phân bổ rộng khắp trên

thế giới, trong các vùng bờ biển nằm trong khoảng giữa lúc triều lên và triều xuống,

về phía nam của Bắc chí tuyến, phổ biến ở Rừng Sác Việt Nam (Cà Mau, Cần Giờ)

Pakistan, Ấn Ðộ, Myanma, Philippin, Malaixia, Inđônexia, Nouvelle Guinee,

Saloman, Caroline [15].

(Superrgnum): Eukarya

Giới (regnum): Plantae

Ngành (divisio): Magnoliophyta

Lớp (class): Magnoliopsida

Bộ (ordo): Lamiales

Họ (familia): Acanthaceae hay Avicenniaceae

Chi (genus): Avicennia

Loài (species): Avicennia alba

11

2.2.2. Hình thái học cây mắm trắng

Hình dạng: Thân gỗ, có thể cao đến 20 m, đƣờng kính 0,5 m, thân ít khi

thẳng, với nhiều cành nhánh cong queo, chỉ khá thẳng khi mọc lẫn với rừng đƣớc

(Rhizophora apiculata), vỏ nâu dợt đến xám đen, tròn, nhiều nốt bần [17].

Hình 2.2. Cây mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ.

Lá: Lá đơn, mọc đối, phiến hình mác, thuôn, bầu dục, dài 5 – 7 cm, rộng từ

2,5 – 3 cm, đầu nhọn có khi tù, chân nêm, mặt dƣới phủ lông màu trắng bạc, gân

bên nổi rõ cả hai mặt, có tuyến tiết muối thƣa ở cả mặt dƣới và mặt trên, lá khô có

màu đen ở mặt trên [17].

12

Hoa: nhỏ 5 – 8 mm, vàng cam, tạo thành tán - gié ở ngọn, hoa từng cặp, lá

bắc nhỏ, không cọng, đài ngắn, không rụng, 5 tai đài hình bầu dục, có 2 lõm, đài

bằng nhau, vành đứng hình ống thẳng có 4 thùy bằng nhau, 4 tiểu nhị (2 dài, 2

ngắn), tua nhị ngắn và trơn, bao phấn có buồng song song, hình bầu dục, bầu nhụy

hình bầu dục, hơi mịn ở đầu, có nhựa thơm, 4 tiểu noãn tròn dài gắn ở đầu 1 trục,

vòi nhụy rất ngắn 1 mm, trơn đầu chẻ đôi [17].

Hình 2.3. Lá và hoa cây mắm trắng.

Trái: Trái là manh nang hình tim, phồng

lên ở một bên làm mũi trái cong qua 1 bên, dài 2

cm, vỏ dày lông mịn, xanh lục, 1 hột, không phôi

nhũ, chồi mầm mọc bên trong vỏ trƣớc khi trái

rụng với 2 lá mầm xanh, dày, trục rễ mầm có

nhiều lông trắng [17].

Hình 2.4. Trái mắm trắng.

13

Nơi sống: Mắm trắng là loại cây ƣa sáng, sinh trƣởng nhanh, thích nghi với

nhiều loại đất (bùn, cát, sét) và các độ mặn của nƣớc (mặn, lợ, ngọt). Mắm trắng là

loài cây cho chồi gốc, thƣờng trổ hoa vào đầu mùa mƣa (tháng 4 – 6 dƣơng lịch),

cho trái vào cuối mùa mƣa (tháng 9 – 11 dƣơng lịch). Chỉ vài giờ sau khi trái rụng,

cây mầm bên trong hút nƣớc lớn ra, làm vỡ lớp vỏ trái bao ngoài và phát triển thành

cây mới. Mắm trắng thƣờng chiếm những diện tích mới bồi ven biển, nơi có mực

thủy triều lên xuống hàng ngày. Nói chung "Ðất bùn có nƣớc triều lên xuống hàng

ngày" là đất sinh trƣởng, phát triển thích hợp của loài cây gỗ này [15].

2.2.3. Giá trị kinh tế của cây mắm trắng

Đặc điểm của cây mắm là có rễ đất và rễ phổi. Rễ phổi có nhiệm vụ hấp thụ

dƣỡng khí, là biện pháp sinh tồn khi nền đất ngập mặn. Rễ phổi cũng là "kiến trúc"

của thiên nhiên thích ứng để bảo vệ đất bồi [15].

Gỗ cây mắm trắng trƣớc đây dùng làm ghe, thuyền, cất nhà và làm củi. Ngày

nay mắm cũng cung cấp nguyên phẩm cho việc biến chế dƣợc liệu và cung cấp sắc

tố cho công nghiệp thuộc da. Vì thiếu nguồn cây giống để trồng bảo vệ ven biển và

đất bồi, một số nƣớc đã có lệnh cấm xuất khẩu gỗ và cây con các loại cây mắm,

đƣớc và vẹt [17].

Nguồn lợi chính của mắm không nằm trong việc khai thác gỗ mà nằm ở lợi

ích trong việc bảo vệ đất bồi và gây môi trƣờng sống cho sinh vật ven biển. Quần

thể mắm trắng đi kèm với quần thể đƣớc là thành phần chính của rừng ngập mặn có

vai trò chắn sóng gió, bảo vệ vùng ven là nơi nuôi dƣỡng và cung cấp thức ăn cho

các loài hải sản có giá trị cao. Diện tích đất bồi sẽ giảm đi nếu thiếu mắm để bảo vệ

(riêng Cà Mau vài km²/năm) [15].

2.2.4. Những hiện trạng cây mắm trắng tại rừng ngập mặn Cần Giờ

Trong tƣơng lai gần quần thể mắm trắng tại Cần Giờ sẽ lâm vào tình trạng

nguy cấp do khai thác bừa bãi quá mức, không có kế hoạch, chặt cây phá rừng lấy

đất làm đầm nuôi tôm và sản xuất nông nghiệp khác [16].

14

Bên cạnh đó việc phá rừng, phóng đƣờng đã và đang gây nhiều ảnh hƣởng

đến diện tích và môi sinh của cây mắm trắng. Do đó mặc dù diện tích rừng và trữ

lƣợng cây rất lớn nhƣng lại bị giảm sút nhanh chóng và ngày càng nghiêm trọng,

mức độ đe dọa: bậc V [16]. Do đó các nghiên cứu về đa dạng di truyền trên các cây

rừng ngập mặn nói chung và cây mắm trắng nói riêng rất đƣợc chú trọng đầu tƣ và

khuyến khích thực hiện.

2.2.5. Những nghiên cứu khoa học về cây mắm trắng

Những nghiên cứu trên cây mắm trắng chủ yếu đƣợc thực hiện ở trong nƣớc

ta, nguyên nhân có thể là do mắm trắng không phải là quần thể thực vật tiên phong

chính tại các rừng ngập mặn khác trên thế giới (mà thay vào đó là quần thể mắm

biển). Tuy vậy những nghiên cứu đã thực hiện chủ yếu là điều tra, khảo sát các đặc

điểm sinh lý, tình hình sâu bệnh, ít có những nghiên cứu thực sự ở mức độ phân tử.

Một số đề tài nghiên cứu đã thực hiện: Phân bố rễ Mắm trắng trên các vùng

có mức độ ngập triều khác nhau ở Cần Giờ TP Hồ Chí Minh (Viên Ngọc Nam,

2006)

2.3. Khái niệm về đa dạng di truyền

2.3.1. Đa dạng sinh học

Đa dạng sinh học là sự giàu có, phong phú và đa dạng về nguyên liệu di

truyền, về loài và các hệ sinh thái (Lê Trọng Cúc, 2002).

Định nghĩa do Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – WWF (1989) đề xuất nhƣ

sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là hàng triệu loài

thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gien chứa đựng trong các loài và là

những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trƣờng” [8].

2.3.2. Ý nghĩa và tầm quan trọng của đa dạng sinh học

Đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái quan trọng, cung cấp cơ

sở cho sức khoẻ con ngƣời, là nguồn tạo ra năng suất và tính bền vững trong nông

nghiệp tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội và làm giàu chất

lƣợng cuộc sống của chúng ta [9].

15

Đa dạng sinh học là một trong những nguồn tài nguyên không thể thay thế

đƣợc, là cơ sở của sự sống còn, sự thịnh vƣợng và bền vững của loài ngƣời [22].

2.3.3. Các phân mức về đa dạng sinh học

2.3.3.1. Đa dạng hệ sinh thái

Đây là sự đa dạng bao trùm nhất của đa dạng sinh học.

Hệ sinh thái là một cộng đồng gồm các loài sinh vật sống trong một điều

kiện nhất định và có mối quan hệ tƣơng hỗ giữa các sinh vật đó với các nhân tố môi

trƣờng.

Hệ sinh thái bao gồm các nhân tố vô sinh và hữu sinh. Các nhân tố hữu sinh

gồm có nhóm sinh vật tự dƣỡng – vật sản xuất sơ cấp (thực vật quang hợp), những

sinh vật tiêu thụ sơ cấp (động vật ăn cỏ), những vật tiêu thụ thứ cấp (các động vật

ăn thịt), và sinh vật phân hủy các chất hữu cơ giải phóng các chất vô cơ cung cấp

trở lại cho thực vật.

Sự đa dạng hệ sinh thái thể hiện bằng sự khác nhau của các kiểu quần xã sinh

vật. Quần xã này đƣợc tạo nên do các cơ thể sống và mối liên hệ giữa chúng với

nhau và với các điều kiện sống (đất, nƣớc, khí hậu, địa hình).

Tóm lại, hệ sinh thái càng khác nhau thì tính đa dạng sinh học càng cao.

Điều kiện môi trƣờng càng khác nhau thì hệ sinh thái nơi đó càng đa dạng [9].

2.3.3.2. Đa dạng loài

Sự đa dạng loài bao gồm số loài có trên Trái đất. Sự đa dạng này đƣợc thể

hiện bằng số lƣợng loài khác nhau cùng sống trong một vùng nhất định. Loài đƣợc

xác định bởi một trong hai cách:

Phân loại theo cấu tạo hình thái của loài: xác định theo nhóm cá thể

có những hình thái, sinh lý hoặc hoá sinh đặc trƣng, khác biệt với các nhóm

khác. Cách phân loại này thƣờng đƣợc các nhà phân loại học, sinh học vận

dụng để định loại, đặt tên khoa học cho những mẫu vật mới.

Phân loại sinh học loài: là nhóm cá thể có khả năng giao phối với

nhau tạo con lai hữu thụ, không giao phối sinh sản với các nhóm khác. Cách

16

này đƣợc sử dụng để nghiên cứu quá trình tiến hóa và khảo sát các mối quan

hệ về gien [8].

Những vấn đề tồn tại trong việc phân biệt và định loại các loài trên thực tế

thƣờng phức tạp hơn rất nhiều so với lý thuyết (Rojas, 1992; Stanley, 1992). Một

loài có thể có rất nhiều phân loài mà ta có thể dễ dàng phân biệt những sự khác

nhau theo đặc điểm cấu tạo và hình thái. Ngƣợc lại, các phân loài đôi khi giống

nhau đến mức tƣởng nhƣ chúng là các thành viên của cùng một loài. Trong thiên

nhiên đôi khi cũng tồn tại các loài “đồng hình”, các loài này rất giống nhau về cấu

tạo hình thái hay sinh lý nhƣng lại cách ly về mặt sinh học và không giao phối đƣợc

với nhau [8], [22].

Qua đó, ta thấy những nghiên cứu về phân loại học để xác định loài của một

nhóm loài và định loài của những mẫu vật mới đƣợc thu thập chƣa đƣợc biết đến

tạo cơ sở xây dựng và bảo vệ sự đa dạng loài là rất cần thiết.

2.3.3.3. Đa dạng di truyền

Là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học, tạo nên sự khác biệt của

các cá thể trong quần thể và nghiên cứu về đa dạng di truyền cũng là các nghiên cứu

cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về loài.

Sự đa dạng về mặt di truyền trong loài thƣờng bị ảnh hƣởng bởi những tập

tính sinh sản của các cá thể trong quần thể. Một quần thể là một nhóm cá thể giao

phối đƣợc với nhau tạo ra con lai hữu thụ. Trong loài có thể bao gồm một hay nhiều

quần thể.

Các cá thể trong một quần thể thƣờng có bộ gien khác nhau. Sự đa dạng về

bộ gien này là do các cá thể có các gien khác nhau, dù chỉ là rất ít. Gien là đơn vị di

truyền cùng với nhiễm sắc thể đặc trƣng cho những protein riêng biệt.

Những hình thái khác nhau của gien đƣợc thể hiện bằng những alen và

những khác biệt do sự đột biến. Những alen khác nhau của một gien có thể ảnh

hƣởng đến sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau.

Những sự khác biệt về gien trong di truyền học đƣợc tăng dần khi con cái

nhận đầy đủ tổ hợp gien và nhiễm sắc thể của bố mẹ thông qua sự tái tổ hợp của các

17

gien trong quá trình sinh sản. Các gien trao đổi trong quá trình giảm phân và một tổ

hợp mới đƣợc thiết lập khi nhiễm sắc thể của cả bố và mẹ kết hợp thành một tổ hợp

thống nhất mới cho con cái.

Tổng các gien và alen trong một quẩn thể là vốn gien của quần thể và những

tổ hợp của các alen mà mỗi cá thể có đƣợc gọi là kiểu di truyền (genotype). Kiểu

hình (phenotype) của mỗi cá thể đƣợc biểu hiện đặc trƣng bởi các kiểu di truyền

trong từng môi trƣờng nhất định.

Số lƣợng khác biệt nhau về gien trong một quần thể đƣợc xác định bởi số

gien trong vốn gien đó, thƣờng mỗi gien có nhiều hơn một alen (các gien đa hình)

và số các alen cho mỗi một gien đa hình. Sự tồn tại của các gien đa hình cho phép

các cá thể trong quần thể có thể có kiểu gien dị hợp tử, có nghĩa là cá thể nhận đƣợc

những alen khác nhau từ các gien của mỗi bố mẹ. Sự khác biệt về gien cho phép các

loài thích ứng đƣợc với sự thay đổi của môi trƣờng [9], [22].

2.3.4 Hiện trạng đa dạng sinh học ở Việt Nam

Việt Nam là một trong mƣời nƣớc có hệ sinh thái phong phú nhất trên thế

giới. Việt Nam có khoảng 10 % số loài sinh vật của thế giới. Song sự đa dạng này

đang bị đe dọa vì môi trƣờng sống bị hủy hoại bởi tình hình tăng dân số, việc xây

dựng đập nƣớc và đƣờng xá cũng nhƣ việc mở rộng các hoạt động công nghiệp.

Tình trạng tăng dân số và đô thị hoá đang gây sức ép đối với năng lực bảo vệ môi

trƣờng.

Mặc dù diện tích che phủ của rừng đã tăng lên, song mối quan tâm thực sự

là vấn đề chất lƣợng. Một nửa số rừng nguyên sinh đã bị mất. Hiện có 700 loài

sinh vật nằm trong danh sách các loài có nguy cơ tuyệt chủng. Mức độ ô nhiễm

thƣờng xuyên vƣợt quá mức độ cho phép, và riêng mức độ bụi ở các khu đô thị ít

nhất cũng cao gấp đôi so với tiêu chuẩn tối đa. Vì vậy mà các loài sinh vật bị tiêu

diệt dần và một số loài có nguy cơ tuyệt chủng, làm ảnh hƣởng xấu đến đa dạng

sinh học [8].

18

2.4. Phƣơng pháp chiết tách DNA thực vật

DNA thực vật là nguyên liệu quan trọng trong những nghiên cứu đa dạng

sinh học [6]. Có nhiều quy trình ly trích DNA tổng số nhƣ quy trình của Scott

O.Rogers và Arnold J.Bendich (1994), quy trình của Doyle và Doyle (1987, 1990),

quy trình của Ziegenhagen và Fladung (1997). Mỗi phƣơng pháp đều có ƣu và

khuyết điểm riêng. Chúng ta có thể dựa vào đối tƣợng cũng nhƣ yêu cầu về chất

lƣợng, số lƣợng DNA cần thu để chọn phƣơng pháp cho thích hợp. Ngoài ra, giá

thành cũng là một trong những yếu tố quyết định đến việc lựa chọn phƣơng pháp

tách chiết thích hợp. Mục đích cuối cùng là để thu đƣợc DNA tinh khiết cho những

phân tích tiếp theo [2], [12], [14].

Quy trình chiết tách gồm 3 bƣớc cơ bản sau:

Bƣớc 1: Phá màng tế bào và màng nhân. Mô đƣợc nghiền trong một hỗn hợp

chất tẩy (SDS, sarcosyl, CTAB) và proteinase (proteinase K). Hỗn hợp này có tác

dụng phá vỡ màng tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra môi trƣờng đồng thời

phân hủy các protein liên kết với DNA.

Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là

các protein dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các loại phân tử khác nhau

(nucleic acid / protein) trong hai pha không hòa tan (phenol, chloroform / nƣớc).

Mẫu đƣợc lắc thật mạnh trong một dung dịch chloroform và phenol, dung dịch này

có tác dụng làm biến tính protein mà không hòa tan nucleic acid. Protein sau

khi bị biến tính sẽ không còn hòa tan trong pha nƣớc có chứa nucleic acid và

sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nƣớc và pha phenol

chloroform. Pha nƣớc có chứa nucleic acid đƣợc thu nhận lại.

Bƣớc 3: Tủa nucleic acid. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol.

Nucleic acid sẽ đƣợc thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn tủa đƣợc rửa trong

ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc isopropanol còn dính lại trên mẫu.Mục

đích của việc tủa là nhằm thu nhận nucleic acid dƣới dạng cô đặc, nhằm bảo vệ

chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể hòa tan chúng lại

trong dung dịch theo nồng độ mong muốn.

19

2.5. Polymerase Chain Reaction (PCR)

2.5.1. Khái niệm

Kỹ thuật PCR đƣợc nhà khoa học Mỹ Mullis và cộng sự phát minh vào năm

1985. Đây là phƣơng pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một

cách đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq DNA polymerase từ một

lƣợng DNA mẫu rất nhỏ. Đây là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng

DNA rất đơn giản và hiệu quả. Bằng kỹ thuật PCR, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu

và đồng nhất sẽ đƣợc thu nhận từ DNA mẫu [8].

2.5.2. Thành phần và vai trò của các chất trong phản ứng PCR

DNA mẫu:

Đƣợc ly trích từ nhiều bộ phận khác nhau của đối tƣợng nghiên cứu bằng

nhiều phƣơng pháp khác nhau. DNA thực vật thƣờng đƣợc ly trích từ mô lá, DNA

động vật đƣợc ly trích từ máu, lông, mô.

Trong kỹ thuật PCR, yêu cầu về độ tinh sạch của DNA mẫu không cần cao.

Tuy nhiên để thu đƣợc kết quả tốt nhất nên sử dụng DNA mẫu thực sự tinh khiết.

Số lƣợng DNA cần cho một phản ứng PCR khoảng 10 – 50 ng DNA thuần

khiết [1]. Nồng độ DNA có thể xác định đƣợc dựa vào chỉ số đo OD (mật độ quang)

ở độ dài sóng 260 nm và 280 nm. Khi DNA tinh khiết, lƣợng DNA đƣợc tính theo

công thức :

DNA (ng/ l) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * n

Trong đó:

OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 260nm

OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 280nm

n: Độ pha loãng (thƣờng n = 100)

Primer (mồi):

Cặp primer quyết định sự thành công của kỹ thuật PCR. Nếu primer đƣợc

thiết kế đúng thì đoạn DNA đích sẽ đƣợc khuếch đại chính xác [2].

20

Cặp primer là một đoạn acid nucleid có trình tự liên kết đặc hiệu với đoạn

DNA cần khuếch đại. Phản ứng PCR sử dụng một cặp primer đặc hiệu bao gồm F –

primer (mồi xuôi) và R – Primer (mồi ngƣợc).

dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP):

Gồm dATP, dCTP, dTTP, dGTP đƣợc sử dụng với nồng độ nhƣ nhau.

Dung dịch buffer:

Tạo môi trƣờng thuận thích hợp nhất để Taq polymerase hoạt động.

Taq DNA polymerase:

Là một loại enzyme polymerase bền với nhiệt, cô lập từ vi khuẩn Thermus

aquaticus sống ở suối nƣớc nóng, có vai trò kéo dài đoạn DNA cần khuếch đại.

Ion kim loại Mg++

:

Tạo điều kiện thuận lợi cho Taq polymerase hoạt động.

2.5.3. Nguyên tắc của phản ứng PCR

Hình 2.5. Sơ đồ tóm tắt nguyên lý kỹ thuật PCR.

Nguyên lý kỹ thuật PCR

Từ 30 – 40

chu kỳ

Bƣớc 1:

Biến tính

Bƣớc 2: Bắt

cặp

Bƣớc 3: Nối

dài

21

Phản ứng PCR đƣợc thực hiện qua 30 - 40 chu kỳ. Mỗi chu kỳ bao gồm các

bƣớc: biến tính DNA, bắt cặp, kéo dài [7].

Biến tính: Hai mạch của chuỗi xoắn kép đƣợc tách ra nhờ nhiệt độ cao

(94 - 960 C).

Bắt cặp: Nhiệt độ phản ứng giảm xuống để primer liên kết vào các mạch

của DNA đích theo nguyên tắc bổ sung (nhiệt độ này phụ thuộc vào primer nhƣng

thƣờng là 50 - 560 C).

Kéo dài: Kéo dài dây mới nhờ primer dƣới sự thực hiện của Taq DNA

polymerase (720 C).

Sau 30 - 40 chu kỳ, tiếp tục ủ ở 4oC trong 5 - 15 phút để hoàn thiện các sản

phẩm PCR.

2.6.4. Ứng dụng của kỹ thuật PCR

Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử,

với nhiều ứng dụng trong sinh học, trong y khoa, trong nông nghiệp và trong nhiều

lĩnh vực khác.

Trong nghiên cứu genomic: multiplex PCR.

Trong nghiên cứu y học: Phát hiện, chẩn đoán đƣợc nhiều loại bệnh do virus,

vi khuẩn, ký sinh trùng gây ra.

Trong nông nghiệp: Chọn lọc giống cây trồng nhờ chỉ thị DNA (MAS), kiểm

tra kết quả chuyển gien [8].

2.5.5. Ƣu và nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR

Ưu điểm của kỹ thuật PCR

Cho kết quả nhanh, nhạy, chỉ cần một lƣợng nhỏ DNA là có thể thực hiện.

Độ nhạy rất cao.

Thao tác đơn giản.

Thời gian thực hiện nhanh.

Độ tinh sạch của mẫu không cần cao.

Lƣợng mẫu cần ít.

22

Nhược điểm của kỹ thuật PCR [1], [7]

Do quá nhạy nên kỹ thuật PCR có thể cho kết quả dƣơng tính giả. Trong

một số trƣờng hợp vi sinh vật gây bệnh đã chết hoặc chƣa đủ lƣợng gây bệnh thì

phản ứng PCR vẫn cho kết quả dƣơng tính.

Kích thƣớc của đoạn khuếch đại bị giới hạn. Phản ứng PCR chỉ cho kết

quả tốt khi thực hiện với những đoạn DNA có kích thƣớc dƣới 1,5 kb. Với những

đoạn có kích thƣớc trên 3kb, phản ứng PCR tỏ ra vô hiệu.

Sự sao chép bởi Taq DNA polymerase cho tỉ lệ sai sót khá cao (đến 10-4

,

nghĩa là cứ khoảng 10000 nucleotid thì enzyme có thể gắn sai một nucleotid)

2.6. Các chỉ thị phân tử dùng trong nghiên cứu tính đa dạng di truyền

Nguồn gốc tính đa dạng sinh học ở thực vật nói riêng và ở sinh vật nói

chung nằm ở thứ tự các bộ ba trên phân tử DNA làm nên bộ máy di truyền của

chúng. Hiếm có các cá thể trong cùng một loài hoặc cùng một giống có thứ tự

các bộ ba trên DNA trong bộ gien giống hệt nhau. Việc xác định tính đa dạng

sinh học cực kì quan trọng trong chọn giống vì các vật liệu di truyền dùng để

lai tạo thƣờng đƣợc đòi hỏi có tính đa dạng càng lớn càng tốt [8].

Để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các cá thể, quần thể về căn bản

ngƣời ta thƣờng dựa trên các chỉ thị DNA. Chỉ thị DNA có thể đƣợc chia làm

hai nhóm:

Nhóm không dựa trên PCR (non PCR-based): RFLP

Nhóm dựa trên PCR (PCR-based): SSCP, SSR, RAPD, AFLP

Các phƣơng pháp này đều sử dụng sản phẩm DNA đã đƣợc chiết tách, tinh

sạch từ khâu ly trích.

2.6.1. Nhóm không dựa trên PCR

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

Là phƣơng pháp dùng để so sánh DNA của các cá thể khác nhau sau khi cắt

mẫu DNA bằng một enzyme giới hạn. Nếu trình tự DNA của hai cá thể cùng loài

giống nhau hoàn toàn thì sau khi cắt DNA bằng enzyme giới hạn cùng loại sẽ thấy

23

các băng DNA hoàn toàn giống nhau về số lƣợng và kích thƣớc. Ngƣợc lại nếu có

sự khác nhau về trình tự DNA (khác giống hoặc do đột biến) thì sẽ có sự khác nhau

về các băng DNA.

Phƣơng pháp tiến hành: DNA sau khi tách chiết đƣợc phân cắt bằng một

enzyme nhất định, rồi chạy điện di, lúc này các đoạn DNA tách riêng ra với nhau

tùy theo kích thƣớc của nó chạy trên gel agarose. Những đoạn DNA này đƣợc

chuyển từ gel sang một thể rắn (tấm lọc nitrocellulose hoặc màng lọc bằng nylon),

nơi nó bị cố định. Sau giai đoạn trƣớc khi lai DNA, ngƣời ta cố định các vị trí trên

màng, nơi quá trình lai DNA sẽ xảy ra. Các DNA (gien liên kết với marker) sẽ gắn

với nucleic acid thăm dò (probe, hay RFLP marker) đƣợc đánh dấu bằng phóng xạ.

Quá trình lai giữa DNA và probe nhƣ vậy đƣợc gọi là lai DNA. Sau khi lai, tấm lọc

hay màng lọc đƣợc rửa để loại bỏ các probe không gắn, hoặc gắn yếu với DNA

đang nghiên cứu. Tiếp sau đó, DNA lai với probe tự ghi trên biểu đồ phát xạ. Sau

khi điện di, gel đƣợc chụp dƣới tia cực tím. Các đoạn DNA xuất hiện thành các đốm

liên tục. DNA lai với probe sẽ cho tín hiệu khi thể hiện ra trên phim X – quang. Các

sọc có tính đa hình (polymorphism) có thể đƣợc quan sát để đánh giá [10].

RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhƣng quy trình thực hiện

phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe ngƣời thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số

lƣợng và chất lƣợng rất cao. Do đó, ngƣời ta có xu hƣớng áp dụng những marker

đơn giản hơn, an toàn hơn, trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase [3], [4], [11].

2.6.2. Nhóm dựa trên PCR

2.6.2.1 SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism)

Ngƣời ta đã tìm thấy có sự chuyển dịch của đoạn DNA dạng dây đơn, ngắn,

trong điều kiện chƣa qua quá trình biến tính DNA thành dây đơn . Ngƣời ta giả định

rằng: sự thay đổi chuỗi mã di truyền DNA là do sự thay đổi ngoại hình của dây đơn

(single – strand conformation). Sự thay đổi này làm cho DNA chuyển dịch trên gel,

tạo ra thể đa hình [1], [4].

24

Trong phân tích SSCP, phản ứng chuẩn PCR đã hoàn thành. Sản phẩm của

PCR này lại bị mở dây đơn lần nữa và ngâm vào trong nƣớc đá. Khi đó hiện tƣợng

snap – back sẽ xảy ra trên cấu trúc thứ cấp. Để tránh hiện tƣợng đứt gãy cấu trúc thứ

cấp, các mẫu phải đƣợc xử lý trong điều kiện lạnh. Nếu P32

đƣợc dùng trong PCR,

thì phim chụp X – quang sẽ thể hiện vị trí của DNA trên gel. Nếu không, ngƣời ta

sẽ dùng bạc để nhuộm gel. DNA khi nhuộm bằng bạc sẽ nhạy cảm gấp trăm lần

nhuộm Ethidium bromide [11].

SSCP marker là công cụ rất mạnh và nhanh, nhƣng nó chỉ áp dụng cho việc

tìm kiếm thể đa hình của những đoạn phân tử DNA tƣơng đối ngắn. SSCP có thể

xác định tính chất dị hợp tử của những đoạn phân tử DNA (có cùng trọng lƣợng

phân tử), và nó có thể phân biệt đƣợc sự thay đổi của một vài nucleotide nào đó.

Ngƣời ta cho nó là công cụ hữu dụng trong xét nghiệm bệnh di truyền ở ngƣời.

Trong thực vật, SSCP chƣa đƣợc phát triển nhiều. Ngƣời ta hi vọng, SSCP marker

sẽ giúp cho việc phân nhóm di truyền ở con lai trở nên dễ dàng hơn, khi chúng ta có

primer thích hợp đối với tính trạng quan trọng nào đó [11].

2.6.2.2. Microsatellite (SSR: Simple Sequence Repeat)

SSR là các trình tự hai nucleotide ((AC)n, (AG)n, (AT)n) hoặc ba nucleotide

((TAT)n, (TCT)n, (CAG)n) lặp lại. Do vậy nguyên tắc của phƣơng pháp này là dựa

trên sự khuếch đại các trình tự lặp lại trên bộ gien bằng các primer đặc hiệu có khả

năng bổ sung vào hai đầu của locus microsatellite. Sản phẩm PCR là các đoạn DNA

có chiều dài khác nhau do sự biến thiên về độ dài đƣợc tách ra trên gel

polyacrylamid hoặc trong mao quản của máy giải trình tự DNA. Do số lần lặp lại

cao của microsatellite ở các cá thể nên sự đa hình cao hơn ở các trƣờng hợp khác

nhƣ RFLP, RAPD và sự đa hình ở các cá thể khác nhau tất nhiên là khác nhau.

Chiều dài các đoạn DNA qua điện di thƣờng có kích thƣớc 100 – 200 bp. Tuy

nhiên, SSR thƣờng đƣợc phân tích trên DNA hệ gien nhỏ mang trình tự lặp lại và

kích thƣớc của chúng đƣợc nhận biết sau khi điện di trên gel [4], [11].

SSR đƣợc thực hiện theo bốn bƣớc:

Tách chiết và tinh sạch DNA của các mẫu nghiên cứu.

25

Thực hiện phản ứng khuếch đại qua PCR với các primer đặc trƣng

cho các đoạn lặp đơn giản.

Điện di kết quả trên gel polyacrylamid và tính toán số liệu, xác định

mức độ giống và khác nhau giữa các đoạn lặp DNA.

Xử lý số liệu bằng các phần mềm nhƣ Map Marker Program,

SYSTAT, NTSYSpc lập bản đồ di truyền và dựng cây phát sinh chủng loại.

2.6.2.3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP, đa hình chiều dài các đoạn DNA đƣợc khuếch đại chọn lọc, do Vos

và cộng sự phát minh 1975, là kỹ thuật đƣợc áp dụng để phân tích tính đa dạng của

sinh vật từ hàng trăm đoạn DNA giới hạn đã đƣợc khuếch đại đồng thời nhờ phản

ứng PCR [13], [18], [20].

Trên nguyên tắc, AFLP gồm hai nội dung cơ bản:

Cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn có bổ sung các adapter đặc hiệu

tạo nên các đoạn có đầu mút giống nhau, đặc trƣng cho các primer đã chọn

trƣớc. Adapter là một đoạn oligonucleotide đôi, đƣợc tổng hợp nhân tạo và

có trình tự tƣơng ứng với trình tự ở đầu đoạn DNA đƣợc phân cắt bởi một

loại enzyme nhất định.

Nhân đoạn DNA bằng kỹ thuật PCR qua hai giai đoạn với hai loại

primer khác nhau.

Các thành phần tham gia trong phản ứng AFLP:

Các enzyme:

Để cắt DNA của bộ gien, 2 enzyme cắt hạn chế đƣợc sử dụng:

MseI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định là 4 base

EcoRI: Là enzyme cắt ở vị trí xác định là 6 base

Sau phản ứng cắt, có ba loại đoạn DNA thu nhận đƣợc: một loại đoạn DNA

đƣợc cắt bởi EcoRI ở cả hai đầu kết thúc, một loại đoạn DNA đƣợc cắt bởi EcoRI ở

một đầu kết thúc này và MseI ở đầu kết thúc khác, và một loại đoạn DNA đƣợc cắt

bởi MseI ở cả hai đầu kết thúc [13].

26

Hình 2.6. Cơ chế cắt của enzyme MseI và EcoRI.

Adapter:

Adapters là trình tự sợi đôi chuyên biệt cho cả vị trí của EcoRI và vị trí của

MseI. Sự gắn kết của adapter đối với DNA đã đƣợc cắt thay đổi vị trí cắt để ngăn

chặn sự phân cắt thứ hai xảy ra sau khi đã gắn kết [13].

Hình 2.7. Cơ chế gắn của adapter MseI và adapter EcoRI.

Các primer: Có hai loại primer đƣợc sử dụng:

Primer dùng trong khuếch đại tiền chọn lọc:

EcoRI A 5’-GAC TGC GTA CCA ATT CA-3’

MseI C 5’-GAT GAG TCC TGA GTA AC-3’

Primer này đƣợc thiết kế tƣơng ứng với adapter đã sử dụng, đồng thời có gắn

thêm một nucleotide ở đầu 3’ để chọn lọc những đoạn DNA cần khuếch đại, cụ thể

là EcoRI gắn thêm nucleotide A và MseI gắn thêm nucleotide C ở đầu 3’.

Kết quả chủ yếu của việc chọn trƣớc PCR là các đoạn DNA đó có một vị trí

cắt của MseI và EcoRI, và cũng có nucleotide quan tâm. Bƣớc khuếch đại tiền chọn

lọc sẽ làm giảm đi sự phức tạp trong việc thu nhận những đoạn DNA [13].

27

Hình 2.8. Cơ chế khuếch đại tiền chọn lọc trong phản ứng AFLP.

Primer dùng trong khuếch đại chọn lọc:

Là các primer khuếch đại tiền chọn lọc đƣợc thêm vào từ 1 đến 2 nucleotide

ở đầu 3’. Ví dụ: EcoRI A gắn thêm CT và MseI C gắn thêm AG vào đầu 3’.

Kết quả là so với primer đƣợc thiết kế tƣơng ứng với adapter thì primer

khuếch đại chọn lọc có thêm ba nucleotide ở đầu 3’. Điều này giúp cho việc lựa

chọn các đoạn DNA chặt chẻ hơn, giảm sự phức tạp khi đọc kết quả các đoạn DNA

trên gel.

Sau khi đƣợc khuếch đại PCR với các primer này, kết quả của mỗi mẫu đƣợc

phân tích trên máy giải trình tự DNA.

Việc chọn lựa sự khuếch đại với hai primer EcoRI và MseI là khuếch đại chủ

yếu các đoạn DNA đƣợc gắn hai primer EcoRI-MseI. Các đoạn DNA EcoRI-EcoRI

không đƣợc khuếch đại. Các đoạn DNA MseI-MseI không đƣợc nhận biết trong quá

trình khuếch đại do không chứa chất phát huỳnh quang. Chỉ có những sợi chứa

EcoRI đƣợc nhận biết [1], [13].

EcoRI 5’FAM-GACTGCGTACCAATTC ACT-3’

MseI 5’-GATGAGTCCTGAGTAA CAG-3’

28

Hình 2.9. Cơ chế khuếch đại chọn lọc trong phản ứng AFLP.

Trên cơ sở đó quy trình thực hiện AFLP có thể gồm bốn bƣớc cơ bản:

Tách chiết và tinh sạch DNA.

Cắt các mẫu DNA nghiên cứu bằng các cặp enzyme giới hạn chọn lọc

có bổ sung adapter tƣơng ứng.

Tiến hành PCR hai giai đoạn với hai loại primer đặc hiệu, primer 1 +

1 nucleotide và primer 2 + 2 nucleotide.

Phân tích kết quả bằng các phần mềm thông dụng, lập cây phát sinh

chủng loại để xác định sự khác biệt di truyền và đa dạng sinh học của các

mẫu nghiên cứu.

Ta có thể tóm tắt kỹ thuật AFLP nhƣ sau:

29

Hình 2.10. Cơ chế phản ứng trong kỹ thuật AFLP.

Kỹ thuật AFLP có các ƣu điểm:

Lƣợng DNA cần cho phản ứng rất ít.

Cho kết quả nhanh, ổn định và các lần lặp lại có độ tin cậy cao do kỹ thuật

AFLP có các điều kiện nghiêm ngặt của phản ứng PCR.

Kỹ thuật AFLP thực hiện trên nhiều đối tƣợng sinh vật khác nhau.

Không cần biết trật tự nucleotide của hệ gien.

Tạo nhiều băng khuếch đại – khả năng tạo đa hình cao, chỉ thị phân tử cho

lƣợng thông tin cao.

AFLP đƣợc ứng dụng trong việc xây dựng bản đồ gien thực vật bao gồm:

Thiết lặp nhóm gien liên kết nhau trong một thể nhiễm sắc trong quá

trình cho tạp giao.

Làm bão hòa các vùng có gien lạ đƣa vào.

Ƣớc lƣợng mức độ có quan hệ giữa các giống.

30

2.6.2.4. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Là phƣơng pháp xác định sự đa hình về kích thƣớc các đoạn DNA sau khi

thực hiện PCR mẫu DNA thí nghiệm. Kỹ thuật này cho phép phát hiện thể đa hình

mà không cần biết trƣớc thứ tự các nucleotide bằng cách dùng các primer tổng hợp,

mạch đơn, ngắn, dãy mã đƣợc thiết kế ngẫu nhiên để thực hiện PCR [4]. Sau khi bắt

cặp tại các vị trí chuyên biệt trên sợi DNA, primer tiến hành sự khuếch đại để tạo ra

các đoạn có kích thƣớc khác nhau, có khi lên tới 2 kb. Các đoạn với kích thƣớc khác

nhau này đƣợc nhận biết bằng điện di [11]. Một primer có thể tạo nên sự đa hình

DNA giữa các cá thể và các đoạn đa hình này có thể đƣợc dùng nhƣ những marker

để xác định sự đa dạng di truyền. RAPD đƣợc xem nhƣ một phƣơng pháp tạo sự đa

hình DNA nhanh và hữu hiệu [7]. Các bộ kit primer dùng cho RAPD đã đƣợc

thƣơng mại hóa trên thị trƣờng và các primer cũng rất dễ đƣợc tổng hợp. Về trang

thiết bị chỉ cần có máy PCR và hệ thống điện di. Cần quan tâm đến yếu tố nồng độ

DNA, điều kiện thí nghiệm, chƣơng trình chạy PCR và cần lựa chọn primer thích

hợp cho sự đa hình cao.

Có thể tóm tắt kỹ thuật RAPD nhƣ sau:

3’ 1 2 3 5’

DNA mẫu

5’ 4 5 6 3’

Hình 2.11. Sự bắt cặp và khuếch đại trong phản ứng RAPD – PCR.

Chú giải: Các mũi tên biểu thị cho các primer (các primer có trình tự giống

nhau, khoảng 10 nucleotide); các số 1, 2, 3, 4, 5, 6 tƣợng trƣng cho các vị trí trên

DNA mẫu mà primer gắn vào; các primer bắt cặp vào các vị trí 1, 2, 3 trên mạch

đơn DNA mẫu 3’- 5’, các primer bắt cặp vào các vị trí 4, 5, 6 trên mạch đơn DNA

mẫu 5’ - 3’. Trong trƣờng hợp này, có 2 sản phẩm PCR đƣợc tạo thành:

Sản phẩm B Sản phẩm A

31

Sản phẩm A: Là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai

vị trí 2 và 5.

Sản phẩm B: Là sản phẩm PCR khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai

vị trí 3 và 6.

Không có sản phẩm PCR hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 1 và 4

do hai vị trí này quá xa nhau để cho phép hoàn thành sự khuếch đại.

Không có sản phẩm hình thành bởi các primer nằm ở vị trí 2 và 4, 3 và

5, do các primer không có chiều hƣớng vào nhau.

Kỹ thuật RAPD đƣợc thực hiện theo ba bƣớc cơ bản:

Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR

Điện di trên gel Agarose hoặc gel Polyacrylamid

Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng

(NTSYSpc, UPGMA cluster, Gelcompar, lập dendrogram) các số liệu thu đƣợc cho

thấy sự gần gũi hoặc cách biệt di truyền của các mẫu nghiên cứu.

Tuy nhiên trong thực tế khi thực hiện phản ứng RAPD – PCR thƣờng gặp phải một

số vấn đề sau:

Nồng độ DNA mẫu khác nhau có thể làm thay đổi số băng trên bảng gel

điện di. Vì vậy nồng độ DNA mẫu thích hợp cho mỗi phản ứng là 20 – 50 ng.

PCR buffer thƣờng đƣợc cung cấp theo Taq DNA polymerase và có thể

có hoặc không có Mg2+

. Kỹ thuật RAPD phụ thuộc rất nhiều vào nồng độ Mg2+

, nếu

nồng độ Mg2+

khác nhau thì sản phẩm RAPD sẽ khác nhau.

Taq DNA polymerase của các nhà sản xuất khác nhau cho kết quả sản

phẩm khác nhau rất lớn. Vì vậy, loại Taq DNA polymerase và nồng độ của Taq đòi

hỏi phải chính xác và đƣợc xác định qua thực nghiệm.

Chu kỳ nhiệt có thể có sự thay đổi về số chu kỳ và nhiệt độ, điều này

phụ thuộc vào máy PCR và độ dày của eppendorf [1], [8].

Ƣu điểm của kỹ thuật RAPD [11]:

Không đòi hỏi chất lƣợng DNA mẫu cao, lƣợng DNA mẫu cần ít.

32

Dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trƣớc trình tự bộ gene

của đối tƣợng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản.

Thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao.

Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thƣờng đƣợc sử dụng kết hợp

với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị

phân tử có độ tin cậy cao.

Nhƣợc điểm của kỹ thuật RAPD [11]:

Độ chính xác không cao, kết quả không ổn định.

Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhƣng khả năng xuất hiện

đa hình thấp và độ tin cậy không cao.

Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ tin cậy không cao.

33

Phần 3

VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành

3.1.1. Thời gian tiến hành

Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 4/2007 đến tháng 8/2007.

3.1.2. Địa điểm

Các mẫu lá cây mắm trắng (Avicennia alba) đƣợc thu thập tại Khu dự trữ sinh

quyển rừng ngập mặn Cần Giờ TP Hồ Chí Minh.

Mẫu lá đƣợc ly trích DNA và thực hiện phân tích RAPD tại Trung tâm Phân

tích Thí nghiệm Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.

3.2. Vật liệu nghiên cứu

3.2.1. Mẫu thực vật

Địa điểm lấy: Mẫu đƣợc lấy tại một số tiểu khu của Khu dự trữ sinh quyển

rừng ngập mặn Cần Giờ.

Cách lấy mẫu: Lấy mẫu theo hai đƣờng chéo của rừng, một theo đƣờng bộ

và một theo đƣờng sông. Lấy theo khoảng cách, khoảng 1 km lấy một mẫu, ghi

nhận các đặc tính hình thái (thân cây to, mọc khỏe hoặc yếu ớt, các cây có khối u,

hình dáng dị thƣờng) và tọa độ vị trí nơi lấy mẫu bằng máy định vị GPS.

Chọn những lá tƣơi tốt, còn non, thƣờng là phần ngọn của các cành. Lấy 8 –

10 lá trên mỗi cây. Kí hiệu cho mẫu theo kiểu AAxx

Trong đó: AA: tên loài (Avicennia alba) và xx: số thứ tự.

Bảo quản và vận chuyển mẫu: Lá đƣợc cho vào bịch nylon, buộc kín miệng,

bảo quản tạm thời trong thùng xốp lạnh, sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm,

bảo quản.

34

3.2.2. Hóa chất thí nghiệm

3.2.2.1. Hóa chất dùng trong ly trích DNA

HÓA CHẤT CÔNG DỤNG CÁCH PHA

CTAB

(C19H42NBr,

M=364,5 g/mol)

Phá vỡ màng tế bào,

màng nhân

Hòa tan trong nƣớc cất 2 lần ở

65oC

Ethanol 100% Tủa DNA ở nồng độ

muối Sodium acetate

cao và nhiệt độ thấp

Dung dịch gốc

Ethanol 70% Rửa DNA Pha với tỷ lệ 7 thể tích ethanol

100% và 3 thể tích nƣớc cất 2

lần đã hấp tiệt trùng

Iso Propanol Tủa DNA ở nhiệt độ

thấp, không cần muối

Sodium Acetate

Dung dịch gốc

Chloroform Biến tính protein và

các sắc tố có trong

mẫu. Tách lớp sau khi

ly tâm

Dung dịch gốc

Iso Amylalcohol Tránh tạo bọt trong

quá trình vortex hay ly

tâm tốc độ cao

Dung dịch gốc

Hỗn hợp

Chloroform:Isoamyl

Alcohol (24:1)

Biến tính protein và

các sắc tố trong mẫu.

Tách lớp sau khi ly

tâm, DNA đƣợc phóng

thích sẽ nằm trong pha

nƣớc ở lớp trên

Pha với tỷ lệ 24 thể tích

Chloroform và 1 thể tích

Isoamyl Alcohol

EDTA 0,5M

(C10H14N2Na2O3, M=372,54

g/mol)

Gắn nối các ion hóa trị

II (Mg++

, Ca++

…) có

trong dịch ly trích,

ngăn chặn sự hoạt

động của các enzyme

phân hủy DNA. Các

enzyme này hoạt động

rất mạnh nếu có sự có

mặt của các ion hóa trị

II nhất là ion Mg++

Pha 100ml:

- 18,622 g bột EDTA + 80ml

nƣớc cất 2 lần. Khuấy tan.

- Chỉnh pH đạt 8, thêm nƣớc

cất 2 lần cho đủ 100ml.

- Hấp 121oC/20phút trƣớc khi

dùng.

NaCl 5M (M=58,5 g/mol) Môi trƣờng đệm thuận

lợi cho việc kết tủa

DNA

Pha 100ml:

- 29,25 g NaCl + 100ml nƣớc

cất 2 lần. Khuấy tan.

- Hấp 121oC/20 phút trƣớc

khi dùng.

35

TE 10X Dung dịch Stock Pha 100ml:

- 10ml Tris-HCl 1M + 2ml

EDTA 0,5M + 88ml nƣớc

cất 2 lần.

- Hấp 121oC/20 phút trƣớc

khi dùng.

TE 1X Hòa tan DNA Pha 100ml: 10ml TE 10X +

90ml nƣớc cất 2 lần

EB (Extraction Buffer) Dung dịch ly trích Pha 100ml:

- 57ml nƣớc cất 2 lần + 2g

CTAB (lắc nhẹ trong bồn ủ

65oC cho tan, hạn chế tạo

bọt).

- Thêm vào 28ml NaCl 5M +

10ml Tris-HCl 1M + 4ml

EDTA 0,5M + 1ml

Mercaptro Ethanol.

- Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC,

tránh ánh sáng trực tiếp.

Sodium Acetate 3M

(CH3COONa, M=82 g/mol)

Dung dịch đệm, làm

tăng lực ion trong dịch

trích, tạo điều kiện

thuận lợi cho DNA kết

tủa với ethanol 100%

trong điều kiện -20oC

Pha 100ml:

- 24,6g bột Sodium Acetate +

100ml nƣớc cất 2 lần.

Khuấy tan.

- Hấp 121oC/20 phút trƣớc

khi dùng

RNase (Ribonuclease)

(10%, w/v)

Enzyme thủy phân

RNA có trong dịch

trích

Pha 1ml:

- 10mg bột RNase + 1ml

nƣớc cất 2 lần.

- Bọc giấy bạc, trữ ở 4oC,

tránh ánh sáng trực tiếp.

Mercaptro Ethanol Bảo vệ DNA Dung dịch gốc

PVP (polyvinylpyrrolydol) Biến tính các hợp chất

phenol

Dạng bột, sử dụng 2g PVP,

thêm vào thành phần của dịch

trích EB

3.2.2.2. Hóa chất dùng trong kiểm tra DNA

Nƣớc cất 2 lần khử ion

TE 1X

TAE 0,5 X

Loading dye 6X

Ethidium bromide

36

3.2.2.3. Hóa chất dùng để thực hiện phản ứng RAPD

Nƣớc cất 2 lần khử ion, hấp khử trùng và chiếu tia UV

dNTP 25mM (Promega)

Buffer free Mg2+

10X (Promega)

MgCl2 25mM (Promega)

Taq DNA Polymerase 5U (Promega)

Primer: Sử dụng 7 primer có trình tự và Tm nhƣ sau:

Primer OPAC10 _ 5’AGC AGC GAG G3’, Tm = 34

Primer 1 (OPA02) _ 5’TGC CGA GCT G3’, Tm = 40,7

Primer 2 (OPA03) _ 5’AGC CAG CCA C3’, Tm = 34,3

Primer 9 (OPN03) _ 5’GGT ACT CCC C, Tm = 33,9

Primer OPA05 _ 5’AGG GGT CTT G3’, Tm = 34,2

Primer OPA10 _ 5’GTG ATC GCA G3’, Tm=30,7

Primer RAH8 _ 5’GAG AGC CAA C 3’, Tm = 31,9

3.2.3. Dụng cụ và thiết bị thí nghiệm

Chén sứ và chày giã (Đức)

Máy Vortex (IKA - Đức)

Cân điện tử (Ohaus - Mỹ)

Bồn ủ nhiệt (Memmert-Anh)

Máy hút và tủ cấy vô trùng (Việt Nam /Anh)

Tủ sấy (Jencons-Anh)

Máy vi ly tâm lạnh (Hettich - Đức)

Bồn điện di (Biorad)

Nồi hấp Autoclave (ToMy - Nhật Bản)

Lò Viba (Electrolux)

Máy chụp ảnh DNA (Biorad - Thụy Điển)

Đầu típ các loại (Đức)

37

Máy đo hấp thu quang phổ (HP - Mỹ)

Máy PCR (PTC 100 - MJ)

Tủ lạnh các loại (Sanyo - Nhật Bản)

Eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml (Pháp)

Pipet các loại (Nichiryo - Nhật Bản)

3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

3.3.1. Phƣơng pháp ly trích DNA

Chúng tôi đã tiến hành thực hiện ly trích DNA theo các quy trình sau:

Quy trình 1: Theo quy trình ly trích mẫu tƣơi (Doyle và Doyle (1988)) nhƣng

không sử dụng Rnase. Gồm 11 bƣớc:

Bƣớc 1: Cân 0,15 g lá đã rửa sạch. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào cối, nghiền

lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ. Ủ ở 650C trong 45 phút.

Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), vortex 10 phút,

ly tâm 14.000 vòng/5 phút ở 100C.

Bƣớc 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2.

Bƣớc 4: Thêm 300 l dung dịch isopropanol lạnh. Để tủa ở – 200C qua đêm.

Bƣớc 5: Li tâm 14.000 vòng/5 phút ở 100C.

Bƣớc 6: Thêm vào 300 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút

Bƣớc 7: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3 M, và 640 l Ethanol 100%,

trộn đều và để – 200C trong 60 phút.

Bƣớc 8: Li tâm 14.000 vòng/10 phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong.

Bƣớc 9: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 14.000 vòng/2

phút ở 100 C, đổ bỏ dịch trong.

Bƣớc 10: Lặp lại bƣớc 9. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở

370C trong 30 phút.

Bƣớc 11: Bảo quản mẫu ở 40C.

38

Quy trình 2: Cải tiến quy trình của Doyle: thay đổi thời gian và số vòng ly tâm,

thời gian ủ, trọng lƣợng mẫu.

Bƣớc 1: Lấy 0,2 g lá đã rửa sạch, lau khô. Cho 1,2 ml dịch trích EB vào

eppendorf, nghiền lá với dung dịch này. Vortex thật kỹ ở tốc độ thấp (800

vòng/phút). Ủ ở 650C trong 60 phút.

Bƣớc 2: Thêm 500 l Chloroform: isoamyl alcohol (24: 1), đảo nhẹ vài lần,

li tâm 10.000 vòng/20 phút ở 100C.

Bƣớc 3: Chuyển lấy dịch trong lặp lại bƣớc 2. Thu đƣợc V l dịch nổi.

Bƣớc 4: Thêm V l dung dịch Isopropanol lạnh. Để tủa ở – 200C qua đêm.

Bƣớc 5: Li tâm 8.000 vòng/20 phút ở 100C. Đổ bỏ dịch trong.

Bƣớc 6: Cho vào 300 l TE 1X, ủ ở 370C trong 30 phút.

Bƣớc 7: Thêm 20 l muối Sodium acetate 3M, và 640 l Ethanol 100%, trộn

đều và ủ – 200C trong 60 phút.

Bƣớc 8: Li tâm 8.000 vòng/15 phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong.

Bƣớc 9: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 6.000 vòng/5

phút ở 100C, đổ bỏ dịch trong.

Bƣớc 10: Lặp lại bƣớc 9. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở

370C trong 30 phút.

Bƣớc 11: Bảo quản mẫu ở 40C.

Quy trình 3: Cải tiến quy trình 2, bổ sung PVP 2% vào dịch trích EB.

Quy trình 4: Cải tiến quy trình 3, nghiền mẫu trong N2 lỏng thay vì nghiền mẫu

trong dích trích EB, tăng số vòng vortex.

Bƣớc 1: Cân 0,4 g lá non rửa sạch và lau khô, nghiền trong N2 lỏng, cho vào

eppendorf.

Bƣớc 2: Thêm 1 ml dịch trích EB, vortex đều cho đến khi hỗn hợp có màu

đồng nhất ở 14.000 vòng/phút trong khoảng 1 phút. Ủ ở 650C trong 1 giờ.

Bƣớc 3: Ly tâm 10.000 vòng/20 phút. Thu đƣợc V µl dịch nổi.

39

Bƣớc 4: Thêm V Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều. Ly tâm

10.000 vòng trong 20 phút ở 40C. Thu dịch nổi.

Bƣớc 5: Lập lại bƣớc 4.

Bƣớc 6: Thêm 300 µl Isopropanol lạnh. Đảo trộn kỹ. Ủ - 200C qua đêm.

Bƣớc 7: Ly tâm 8.000 vòng trong 15 phút. Đổ bỏ dịch trong, thu kết tủa.

Bƣớc 8: Thêm 300 l TE 1X, đem ủ ở 370C trong 30 phút. Thêm 20 l

Sodium acetate 3M và 64 l Ethanol 100%, trộn đều, đem ủ - 200C trong 1 giờ.

Bƣớc 9: Li tâm 15 phút, 8.000 vòng ở 40C, đổ bỏ dịch trong.

Bƣớc 10: Rửa cặn với 400 l Ethanol 70% bằng cách ly tâm 5 phút 6.000

vòng ở 100C, đổ bỏ dịch trong.

Bƣớc 11: Lặp lại bƣớc 10. Để khô cặn, hoà tan cặn trong 100 l TE 1X, ủ ở

370C trong 30 phút, bảo quản mẫu ở - 20

0C.

3.3.2. Kiểm tra DNA ly trích

3.3.2.1 Kiểm tra định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di trên gel

Mẫu DNA ly trích đƣợc điện di trên gel agarose 1% ở hiệu điện thế 100 V,

cƣờng độ dòng điện 400 mA trong 20 phút.

Sau khi chạy điện di xong, ngâm gel trong hỗn hợp Ethidium Bromide

0,5 g/ml và TAE 0,5X trong 15 phút. Gel sau khi nhuộm đƣợc rửa nhẹ dƣới vòi

nƣớc sạch và đƣa vào máy chụp ảnh DNA.

Dƣới tia UV, Ethidium Bromide liên kết với sợi đôi DNA sẽ phát quang và

tạo thành các băng trên gel [6], [7].

3.3.2.2 Kiểm tra định lƣợng DNA bằng quang phổ kế

Hàm lƣợng DNA trong mẫu ly trích đƣợc tính theo công thức sau:

DNA (ng/ l) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * n

Trong đó:

OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 260nm

OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 280nm

40

n: Độ pha loãng (thƣờng n = 100)

Cách tiến hành:

Xây dựng đƣờng chuẩn: Dùng dung dịch TE 1X để tạo đƣờng chuẩn.

Pha loãng dung dịch DNA đến nồng độ thích hợp để đo (thƣờng pha

loãng 100 lần) với dung dịch TE 1X. Hút 20 l dung dịch DNA cho vào Curvette,

hòa tan với 1,8 ml TE 1X. Tiến hành đo OD [7].

3.3.3. Thực hiện kỹ thuật RAPD

Nhằm tìm ra quy trình chạy RAPD phù hợp và tối ƣu cho cây mắm trắng,

chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng RAPD trên 2 thí nghiệm:

Thí nghiệm 1: Khảo sát quy trình phản ứng RAPD trên 2 nghiệm thức

Sử dụng primer OPAC10 và primer 1

Mục đích: Khảo sát quy trình RAPD – PCR trên cây mắm trắng

Chỉ tiêu đánh giá: Các băng DNA trên gel điện di

Nghiệm thức 1: Sử dụng thành phần các chất và chu kì nhiệt của Lâm Vỹ

Nguyên, 2006 theo bảng 2.1 và 2.2 nhƣ sau:

Bảng 2.1. Thành phần hóa chất cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1

Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối

PCR buffer 10X 2,5 l 1X

MgCl2 25 mM 2,5 l 2,5 mM

dNTP 10 mM 0,25 l 100 M

Primer 100 pmol/ l 6,5 l 26 pmol/ l

Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U

DNA mẫu 40 ng/ l 1 l 40 ng

H2O 12,05 l

Tổng thể tích phản ứng 25 l

41

Bảng 2.2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1

Số chu kì Nhiệt độ (0C) Thời gian (phút)

1 94 3

40

94 1

Ta 1

72 2

1 72 15

Hold 40 C

Trong đó: Ta(OPAC10) = 36 và Ta(primer1) = 38

Nghiệm thức 2: Sử dụng thành phần các chất và chu kì nhiệt của Nguyễn

Hồng Phong, 2007 (Kết quả chƣa công bố) theo bảng 2.3 và 2.4 nhƣ sau :

Bảng 2.3. Thành phần hóa chất trong phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2

Hóa chất Nồng độ đầu Thể tích sử dụng Nồng độ cuối

PCR buffer 10X 2,5 l 1X

MgCl2 25 mM 3 l 3 mM

dNTP 25 mM 0,2 l 0,2 mM

Primer 100 M 0,3 l 1,2 M

Taq DNA polymerase 5 U 0,2 l 1 U

DNA mẫu 40 ng/ l 1 l 40 ng

H2O 17,8 l

Tổng thể tích phản ứng 25 l

Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2

Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian

1 94 5 phút

42

40

94 30 s

Ta 30 s

72 1 phút

1 72 5

Hold 40 C

Trong đó: Ta (OPAC10) = 36 và Ta (primer1) = 38

Thí nghiệm 2: Khảo sát khả năng cho sản phẩm khuếch đại của các primer.

Sử dụng 5 primer OPA05, OPA10, RAH8, primer 9, primer 2

Điều kiện thí nghiệm nhƣ ở nghiệm thức 2, thí nghiệm 1.

Trong đó :

Ta (OPA05) = 36

Ta (OPA10) = 34

Ta (primer2) = 36

Ta (primer9) = 36

Ta (primerRAH8) = 34

2.3.4 Phân tích số liệu trên phần mềm NTSYSpc2.1

Nguyên tắc của phần mềm là dựa trên sự có mặt hay không của các băng

DNA quan tâm trên gel điện di dƣới dạng mã hóa theo ma trận với các thông số

0 và 1 (0: không có băng, 1: có băng). Phần mềm sẽ xử lý và xây dựng nên cây

phân nhóm di truyền, qua đó ta có thể quan sát đƣợc mức độ gần gũi hay xa

cách về mặt di truyền giữa những bộ gel nghiên cứu.

43

Phần 4

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Kết quả thu thập mẫu mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ

Trong công tác thu thập mẫu, chúng tôi gặp nhiều trở ngại trong việc tìm

kiếm những mẫu có đặc tính khác nhau, có hình dáng khác lạ hoặc đặc tính đặc biệt

nhƣ trong dự kiến đã đề ra. Một trong những nguyên nhân chính của vấn đề này là

do việc đi lại trong rừng rất hạn chế bởi những vùng đất lún hoặc ngập nƣớc, vì thế

chúng tôi chƣa thể đi sâu để tìm những mẫu này.

Trong thời gian tiến hành đề tài, chúng tôi đã tiến hành thu thập đƣợc 50 mẫu

lá mắm trắng phân bố theo hai đƣờng chéo của rừng ngập mặn Cần Giờ, một chạy

dọc theo đƣờng bộ và một chạy theo đƣờng sông.

Hình 4.1. Bản đồ vị trí lấy mẫu tại Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ.

Trong những mẫu đã thu thập, cho thấy công tác thu thập mẫu trải rộng trên

nhiều tiểu khu. Do đó, mặc dù số lƣợng mẫu chỉ là 50 nhƣng nó cũng mang đƣợc

tính đại diện cho quần thể mắm trắng của rừng.

44

4.2. Kết quả quá trình bảo quản mẫu

Sau khi đƣợc đem về phòng thí nghiệm, đầu tiên mẫu đƣợc bảo quản ở 40C.

Kết quả, chỉ sau 2-3 ngày, thấy xuất hiện những dấu hiệu hóa nâu trên lá. Khi lấy

mẫu ra khỏi bịch nilon ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, mẫu lập tức hóa nâu và chuyển

sang đen. Theo chúng tôi, điều này có thể là do bảo quản mẫu ở điều kiện này, các

enzyme trong lá vẫn hoạt động và các hoạt động chuyển hóa trong lá vẫn xảy ra dẫn

đến sự hóa nâu của lá.

Thay đổi điều kiện bảo quản ở - 200C, sau 15 – 20 ngày, màu sắc mẫu bắt

đầu sậm hơn. Khi lấy mẫu ra ở điều kiện phòng thí nghiệm, mẫu nâu hóa nhẹ sau 5

phút. Nguyên nhân có thể là do khi trữ ở - 200C, các tinh thể nƣớc có kích thƣớc lớn

đã đƣợc tạo thành và phá vỡ vách cellulose của tế bào lá. Ở điều kiện nhiệt độ

phòng, các tinh thể nƣớc tan ra làm cho hợp chất phenol có trong tế bào lá đƣợc

phóng thích ra ngoài và làm hóa nâu mẫu lá. Tuy nhiên vẫn có thể tiến hành ly trích

DNA trên những mẫu này do mẫu chƣa hóa đen hoàn toàn.

4.3. Kết quả quy trình ly trích DNA tổng số

Ban đầu, khi sử dụng quy trình ly trích 1, kết quả điện di cho thấy phần lớn

có nhiều vệt smear trên gel và sản phẩm không mong muốn cũng rất nhiều. Chỉ số

đo OD của những mẫu này chỉ từ 1,0 – 1,5. Mặc dù chúng tôi đã cố gắng nghiền

nhẹ, đều tay và chuyển sang quy trình 2, giảm số vòng ly tâm và tăng thời gian ly

tâm và ủ mẫu ở quy trình 1, nhƣng kết quả vẫn không tốt hơn, tuy vết smear ít hơn

nhƣngsản phẩm không mong muốn lại rất nhiều và lƣợng DNA thu đƣợc rất ít, chỉ

số OD của những mẫu này cũng chỉ dao động từ 1,1 – 1,6. Điều này cho thấy rằng

những mẫu này chƣa đủ tinh sạch để có thể tiến hành cho những phân tích tiếp theo.

Theo chúng tôi điều này có thể là do mắm trắng là cây của vùng ngập mặn,

lá mắm trắng có hàm lƣợng muối, polysaccharide và các hợp chất phenol nhiều hơn

so với những cây bình thƣờng, do đó việc tiến hành ly trích theo quy trình 1 và 2

không thể loại hết những hợp chất này. Có thể sự tồn tại các hợp chất này ở hàm

lƣợng cao nhƣ vậy trong lá sẽ làm ảnh hƣởng xấu đến tác dụng của các hóa chất

45

dùng trong ly trích, làm DNA dễ bị tổn hại trong các thao tác vortex hay ly tâm, từ

đó dẫn đến việc DNA bị gãy nhiều. Vì các lí do này, chúng tôi đã quyết định sử

dụng quy trình 3, bổ sung PVP2% vào thành phần của dịch ly trích EB, với mục

đích loại bỏ các hợp chất phenol có trong lá tốt hơn.

Hình 4.2. Kết quả ly trích theo quy trình 1 và quy trình 2.

Kết quả điện di trên gel agarase 1% cho thấy việc sử dụng quy trình 3 làm

giảm đáng kể sản phẩm không mong muốn. Chỉ số đo OD của những mẫu này từ

1,6 – 2, có thể sử dụng để thực hiện phản ứng RAPD.

Hình 4.3. Kết quả ly trích theo quy trình 3.

Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy quá trình nghiền mẫu trong dịch trích EB có

một số hạn chế là tốn nhiều thời gian, công sức và cho kết quả không ổn định, còn

phụ thuộc nhiều vào thao tác nghiền mẫu. Ngoài ra thao tác nghiền phải đƣợc tiến

hành trong các tủ hút để tránh sự khuếch tán của Mercaptro ethanol vào không khí

sẽ gây ra mùi khó chịu và gây nhều tác dụng xấu nếu nhƣ hít phải. Đồng thời, nhằm

thu đƣợc những mẫu DNA tinh sạch hơn với độ tin cậy cao hơn, chúng tôi quyết

Nhiều

vết

smear

trên

46

định tiếp tục thử nghiệm quy trình 4, nghiền mẫu trong N2 lỏng thay vì nghiền trong

EB và sử dụng các bƣớc tiếp theo giống nhƣ quy trình 3.

Hình 4.4. Kết quả ly trích theo quy trình 4

Kết quả đạt đƣợc tốt hơn hẳn. Kết quả điện di ở hình 3.5 cho thấy việc gãy

DNA đã giảm xuống, các băng DNA dày và sáng. Chỉ số đo OD từ 1,75 – 2,2.

Những mẫu này đáp ứng đựoc các yêu cầu về độ tinh sạch, và có thế đƣợc dùng cho

các nghiên cứu về đa dạng di truyền.

Nhƣ vậy việc nghiền mẫu trong N2 tỏ ra hiệu quả hơn nhiều so với nghiền

trong dịch trích EB là không cần phải nghiền trong tủ hút, lá dễ nghiền hơn do đã

khô cứng và giòn trong N2 lỏng. Ngoài ra mẫu có thể nghiền mạnh tay mà không sợ

làm gãy DNA, kết quả thu đƣợc tốt hơn, tốn ít thời gian và công sức hơn.

Với kết quả nhƣ trên, chúng tôi quyết định tiến hành ly trích DNA theo quy

trình cải tiến (đƣợc chỉ rõ ở sơ đồ 3.1) để lấy nguyên liệu cho phân tích RAPD.

Hình 4.5 Kết quả ly trích theo quy trình 4

36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

1 2 3 4 5 6 8 9 10 11 12 13 14 15 16 18 19

47

Sơ đồ 4.1. Sơ đồ tóm tắt quy trình ly trích 4

Đây là một quy trình ổn định và có độ tin cậy, vấn đề còn lại chỉ là thao tác

hút dịch trong sau mỗi lần ly tâm đòi hỏi phải cẩn thận, tránh hút vào lớp ngăn cách

giữa 2 pha. Chúng tôi tiến hành ly trích 48 mẫu lá mắm trắng, kết quả thu đƣợc 40

mẫu cho băng DNA rõ nét, 6 mẫu cho băng DNA mờ (mẫu ở vị trí 1,2,3,4,19,33) và

2 mẫu cho băng DNA rất mờ ( mẫu số 31 và 50), đạt tỉ lệ 83%. Với kết quả này,

các mẫu thu đƣợc hoàn toàn có thể thực hiện phản ứng RAPD.

4.4. Kết thực hiện phản ứng RAPD

4.4.1. Kết quả thí nghiệm 1

Nghiệm thức 1:

Nghiền 0,4 g lá

trong N2 lỏng

thành bột mịn

Thêm 1 ml dịch trích

EB, vortex kĩ, ủ

650C/1 giờ

Thêm 1V hỗn hợp

CIA, đảo đều. Ly

tâm 11.000 vòng/15

phút/40C, thu V’

dịch trong

Thêm V’ hỗn hợp

CIA, đảo đều. Ly

tâm 11.000 vòng/15

phút/40C, thu dịch

trong.

Thêm

Isopropanol theo

tỉ lệ 1:1, ủ ở

- 200C qua đêm

Ly tâm 9.000

vòng/20

phút/40C, đổ bỏ

dịch trong, thu

tủa

Ly tâm 11.000

vòng/15 phút/ 40C,

thu V dịch nổi.

Thêm 300µl TE1X,

ủ 370C/30 phút.

Thêm 20 µl Sodium

acetate và 640 µl

Ethanol 100%, đem

ủ -200C/1 giờ

Ly tâm 8.000/20

phút/40C. Đổ bỏ

dịch trong, thu tủa.

Rửa cặn với 300 µl

Ethanol 70% bằng

cách ly tâm 5

phút/6.000 vòng

Lặp lại bƣớc 10, làm

khô tủa DNA trong

không khí.

Hòa tan tủa

trong 100 µl

TE1X, ủ ở

370C/30 phút.

Bảo quản ở

-200C

48

Sử dụng primer OPAC10 và primer 1 với thành phần các chất và chu kì nhiệt

đã nêu ở bảng 2.1 và 2.2 để thực hiện phản ứng RAPD, chúng tôi thu đƣợc kết quả

là không có băng nào trên gel điện di, nhƣ thể hiện ở hình 3.6

Hình 4.6. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 1

Trong nghiệm thức này, chúng tôi đã sử dụng quy trình phân tích RAPD của

Lâm Vỹ Nguyên, 2006 cho cây đƣớc. Mặc dù với quy trình này, Lâm Vỹ Nguyên

đã thu đƣợc kết quả rất tốt. Theo chúng tôi, điều này có thể là do một số lý do sau:

Thao tác của chúng tôi còn chƣa chính xác.

Đây chƣa phải là quy trình phù hợp cho cây mắm trắng.

Nghiệm thức 2:

Khi sử dụng primer OPAC10 và primer 1 với chu kì nhiệt và thành phần hóa

chất nhƣ đã đƣa ra trong bảng 2.3 và 2.4, chúng tôi thu đƣợc 4 băng khi chạy với

primer OPAC10, và chỉ 1 băng khi chạy với primer 1 nhƣ ở hình 3.7

Hình 4.7. Kết quả thực hiện phản ứng RAPD ở nghiệm thức 2

Không

có sản

phẩm tạo

thành

Avicennia officinalis

Avicennia alba

Avicennia marina

OPAC10 Primer 1

49

Từ kết quả này, chúng tôi kết luận rằng thực hiện phản ứng RAPD theo điều

kiện ở nghiệm thức 2 này là phù hợp cho cây mắm trắng. Với OPAC10, chúng tôi

thu đƣợc 4 băng cho mỗi mẫu DNA đem phân tích. Các băng tách rõ và có thể quan

sát bằng mắt thƣờng.

Với primer 1, tuy kết quả PCR tốt nhƣng chúng tôi chỉ thu đƣợc chỉ 1 băng

đồng hình duy nhất. Do chỉ có 1 băng nên kết quả thu đƣợc ở thí nghiệm này không

có ý nghĩa trong việc so sánh sự đa dạng di truyền trên cây mắm trắng. Tuy nhiên

khi so sánh kết quả này với kết quả chạy primer 1 trên 2 loài mắm đen (Avicennia

officinalis) và mắm biển (Avicennia marina), chúng tôi kết luận có thể đây là băng

đặc trƣng không những chỉ cho cây mắm trắng mà còn cho cả chi Avicennia và có

thể là một vùng bảo tồn của chi Avicennia, là chỉ thị phân tử để phân biệt chi mắm

với các chi khác trong họ Avicenniacea. Kết quả điện di với ladder cho thấy băng

này có kích thƣớc khoảng 400 bp. Với kết quả nhƣ trên, chúng tôi quyết định khảo

sát thêm một số primer khác với mong muốn tìm đƣợc primer cho sản phẩm khuếch

đại trên gel cao hơn nhƣ trong thí nghiệm 2.

Hình 4.8. Kết quả điện di sản phẩm RAPD với primer 1 trên cây mắm đen

(Avicennia officinalis)

Băng đặc trưng 400 bp

Ladder 1kb

50

4.4.2. Kết quả thí nghiệm 2

Hình 4.9. Sản phẩm RAPD ở thí nghiệm 3 trên cây mắm trắng.

Với các primer đã sử dụng, chỉ có primer OPA05 và OPA10 không cho băng

nào, primer 9 và primer 2 đều cho 3 băng, primer RAH8 chỉ cho 2 băng. Theo

chúng tôi, lý do không có băng ở mẫu thực hiện với primer OPA05 và OPA10 là do

các primer này đã đƣợc bảo quản trong thời gian dài (từ năm 2004), hoạt tính có

thể đã giảm đi, vì vậy không xảy ra phản ứng khuếc đại. Ở các primer khác, mặc dù

có cho băng, nhƣng số băng còn ít (chỉ từ 2 – 3 băng), do đó chúng tôi không chọn

để phân tích đa dạng di truyền.

Với kết quả trên, chúng tôi quyết định sử dụng primer OPAC10 để thực hiện

phản ứng RAPD, phân tích đa dạng di truyền trên cây mắm trắng.

4.5. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền cây mắm trắng tại Khu Dự trữ

sinh quyển Cần Giờ

Chúng tôi đã tiến hành phản ứng RAPD với primer OPAC10 sử dụng thành

phần hóa chất và chu kì nhiệt ở nghiệm thức 2, thí nghiệm 1 trên 16 mẫu DNA đã ly

trích có kết quả đo OD đạt từ 1,8 -2,2. Kết quả có 2 mẫu không cho sản phẩm

khuếch đại. Đối chiếu với thao tác thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy đây là mẫu cuối

cùng khi chúng tôi tiến hành chia từ ống trộn chính sang các eppendorf khác, sự hao

Primer 2 Primer 9 RAH8 OPA05 OPA10

51

hụt không thể tránh khỏi khi tiến hành với những thể tích nhỏ nhƣ vậy, do đó nồng

độ thành phần các chất ở mẫu này có thể đã bị thay đổi, do đó phản ứng khuếch đại

đã không xảy ra.

Với 16 mẫu thực hiện phản ứng RAPD – PCR, chúng tôi thực hiện thành

công 14 mẫu (chiếm tỉ lệ 87%), thu đƣợc tổng cộng là 49 băng, với 7 băng có kích

thƣớc khác nhau, trung bình 3,5 băng/mẫu. Số băng tối đa chúng tôi thu đƣợc là 5

băng (ở 2 mẫu 11.AA07 và 5A.AA19), số băng ít nhất là 2 băng (thu đƣợc đƣợc ở

2mẫu 11.AA09 và 11.AA11). Măc dù số băng còn thấp nhƣng cũng thấy xuất hiện

những băng đa hình ở những mẫu này. Kết quả thu đƣợc 6 băng đa hình (chiếm tỉ lệ

85%) và 1 băng đồng hình (chiếm tỉ lệ 15%) có kích thƣớc khoảng 200 bp.

Hình 4.10. Kết quả thực hiện RAPD trên cây mắm trắng.

Trong các mẫu phân tích, băng đồng hình 200 bp luôn xuất hiện, vì vậy

chúng tôi nghĩ rằng có thể đây là băng đặc trƣng để phân biệt giữa cây mắm trắng

với các cây khác trong chi mắm. Từ kết quả điện di thu đƣợc trên gel điện di, chúng

tôi mã hóa số liệu thành dạng nhị phân 1 và 0 (1 là có băng, 0 là không có băng), và

đem kết quả này phân tích với phần mềm NTSYSpc2.1 để phân tích sự đa dạng di

truyền. Kết quả chúng tôi thu đƣợc cây phân nhóm của các mẫu đã phân tích.

AA01 AA03 ladder AA06 AA07 AA08 AA09 AA11 AA12 AA13 AA19 AA25 ladder AA32 AA45 AA47 AA48 AA49

52

Hình 4.11. Cây phân nhóm di truyền 14 mẫu mắm trắng phân tích

Với 14 mẫu đem phân tích chia thành 2 nhánh chính có khoảng cách phân

nhóm là 0,55. Nhóm I gồm 5 mẫu 10A.AA12, 2B.AA48, 6B.AA32, 10A.AA13 và

1.AA49. Nhánh này lại chia thành 2 nhánh phụ có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,81

– 1, điều này cho thấy có sự tƣơng đồng cao giữa 5 mẫu này. Đặc biệt giữa 2 cặp

mẫu 10A.AA13 và 1.AA49; 10A.AA12 và 2B.AA48, có hệ số đồng dạng lên đến 1,

chứng tỏ những cặp mẫu này có bộ gien hoàn toàn giống nhau. Mặc dù các mẫu này

đƣợc lấy ở các tiểu khu khác nhau và khoảng cách cũng khá xa nhau. Điều này có

thể là do chúng là những cây đƣợc tái sinh cùng thời điểm từ một nguồn cây mẹ

giống nhau do đó mang bộ gien giống nhau. Bên cạnh đó, khi so sánh tọa độ lấy

mẫu của những mẫu này, chúng tôi nhận thấy chúng đƣợc lấy tại những tiểu khu

liền kề nhau dọc theo đƣờng thủy, nhƣ vậy theo chúng tôi nhận định, có thể đây là

một dạng phát tán tự nhiên của cây mắm trắng.

Trong nhánh II gồm 5 mẫu còn lại đƣợc chia làm nhiều nhánh nhỏ, phức tạp,

có hệ số đồng dạng di truyền từ 0,63 – 1. Đáng chú ý là 2 mẫu 17A.AA01 và

17A.AA03 có hệ số đồng dạng di truyền là 1. Hai mẫu này đều đƣợc lấy từ tiểu khu

17, mẫu 17A.AA01 là cây con, trong khi mẫu 17A.AA03 là cây đã trƣởng thành.

Coefficient

0.55 0.66 0.78 0.89 1.00

10A.AA12

17.AA01

17.AA03

21.AA06

11.AA09

11.AA11

5A.AA19

10B.AA25

7.AA45

11.AA07

10A.AA12

2B.AA48

6B.AA32

10A.AA13

1.AA49

53

Điều này cho thấy có thể đây là những cây đƣợc phát tán tự nhiên hoặc đƣợc trồng

từ một nguồn gốc chung. Tƣơng tự, hai mẫu 11.AA09 và 11.AA11 đƣợc lấy tại tiểu

khu 11 cũng có hệ số đồng dạng di truyền là 1, và đều là cây con. Nhƣ vậy, có thể

chúng cũng đƣợc phát tán tự nhiên cùng một nguồn gốc chung, hoặc có thể là cây

đƣợc tái sinh theo các chƣơng trình phục hồi rừng với cùng một nguồn cây giống.

Nhƣ vậy một cách tổng quát, kết quả phân tích trên phần mềm NTSYSpc2.1

cho thấy quần thể mắm trắng tại khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ có hệ số đồng dạng

di truyền tƣơng đối cao, từ 0,55 – 1, và có đến 3 cặp mẫu có hệ số này là 1. Điều

này có thể nhận định rằng sự đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng nơi đây ở

mức thấp. Ở những mẫu đƣợc lấy theo đƣờng bộ và lấy theo đƣờng sông đều cho

thấy có vài trƣờng hợp hệ số đồng dạng di truyền là 1. Với kết quả nhƣ vậy, chúng

tôi nhận định rằng, mắm trắng tuy là cây tiên phong của rừng ngập mặn nhƣng nó

không phải là cây chủ lực của rừng Cần Giờ, chủ yếu là mọc tự nhiên. Công tác tái

tạo, trồng mới quần thể mắm trắng cũng ít đƣợc tiến hành do đó sự phân bố rộng

của mắm trắng có thể chủ yếu là do tính thích nghi, sinh trƣởng mạnh của cây mắm

trắng trên những rừng ngập mặn, hình thức sinh sản chủ yếu là của mắm trắng là tự

thụ phấn và phát tán, lan rộng nhờ vào hạt và cây con mọc lên từ rễ chính, trong đó

hình thức phán tán của hạt chiếm ƣu thế hơn ở cây mắm trắng. Ở những cây mọc

theo sông, nhờ dòng nƣớc mà hạt mắm trắng đƣợc mang khắp nơi. Có thể vì lý do

này mà tính đa dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại nơi đây ở mức thấp. Bên

cạnh đó cũng nguồn giống cây mắm trắng đƣợc tái sinh lúc ban đầu chủ yếu lấy từ

nguồn giống tại chỗ do đó mức độ đa dạng về di truyền thấp là điều hoàn toàn có

thể xảy ra.

Nhƣ vậy càng về sau, hệ số đồng dạng di truyền của quần thể mắm trắng tại

nơi đây sẽ càng tăng cao hơn nữa do sự tự thụ phấn và lại giống. Điều này có thể

dẫn đến sự hủy diệt quần thể mắm trắng nơi đây khi có dịch bệnh, sâu hại tấn công

trên diện rộng. Vì vậy các công tác tái tạo, phục hồi tính đa dạng di truyền của cây

mắm trắng cần đặc biệt đƣợc chú trọng để nâng cao tính đa dạng của quần thể mắm,

giữ gìn tính đa dạng sinh học rừng và giữ gìn một hệ sinh thái rừng bền vững.

54

Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1. Kết luận

Mẫu lá mắm trắng không giữ đƣợc lâu trong điều kiện bảo quản 40C và

chỉ giữ đƣợc khoảng 1 tháng ở điều kiện -200C.

Quy trình ly trích 4, sử dụng N2 lỏng khá ổn định (đạt tỉ lệ 83%), cho

DNA đạt tiêu chuẩn trong phân tích sinh học phân tử.

Quy trình RAPD theo nghiệm thức 2, sử dụng primer OPAC10 cho kết

quả khá ổn định, vấn đề còn lại chỉ là do thao tác, nên trộn thật kĩ để đảm bảo nồng

độ các chất đƣợc chính xác.

Primer 1 cho 1 băng có kích thƣớc 400 bp đặc trƣng cho cả 3 loài mắm

đƣợc khảo sát.

Phân tích kết quả thực hiện phản ứng RAPD với primer OPAC10 trên

quần thể mắm trắng tại Khu dự trữ sinh quyển rừng Cần Giờ cho hệ số đồng dạng

di truyền trong cây nhân nhóm di truyền dao động từ 0,55 – 1.

Sự đa dạng di truyền quần thể mắm trắng tại đây ở mức thấp.

55

5.2. Đề nghị

Khảo sát thêm các primer khác trên cây mắm trắng cho số sản phẩm khuếch

đại nhiều hơn, có ý nghĩa hơn trong việc nghiên cứu đa dạng di truyền.

Phân tích trên số lƣợng mẫu lớn hơn để cho kết quả chính xác hơn.

Tách riêng băng 400 bp khi chạy RAPD với primer 1 và băng 200 bp khi

chạy với primer OPAC10 đem giải trình tự phục vụ cho công tác phân loại giống

giữa cây mắm trắng với các cây khác trong họ Avicenniacea.

Phải có chính sách làm giàu nguồn tài nguyên di truyền, nâng cao tính đa

dạng và bảo đảm sự phát triển bền vững của Khu Dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn

Cần Giờ nói chung và của quần thể mắm trắng (Avicennia alba) nói riêng. Trong

công tác tái tạo quần thể mắm trắng, nên thu thập thêm nhiều nguồn giống từ các

địa phƣơng khác, và nên trồng xen kẽ những cây thuộc những tiểu khu khác nhau

và xen kẽ những cây trên đƣờng thủy, đƣờng bộ, để nâng cao tính đa dạng vốn có

của quần thể mắm trắng tại Khu Dự trữ sinh quyển Cần Giờ.

56

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TRONG NƢỚC

1. Phạm Văn Bình, 2005. Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều

(Acanardium occidentale L.) hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng kỹ thuật RAPD

và AFLP. Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.

2. Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 2002. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục.

3. Phạm Thành Hổ, 1998. Di truyền học. Nhà xuất bản Giáo Dục, TP Hồ Chí Minh

4. Phạm Thành Hổ, 2006. Bài giảng Một số chỉ thị phân tử và ứng dụng trong công

tác giống cây trồng.

5.Lê Văn Khôi, Viên Ngọc Nam, Lê Đức Tuân, 2006. Khôi phục và phát triển bền

vững hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh (1978 – 2000).

Nhà xuất bản Nông Nghiệp.

6. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp cơ bản trong nghiên cứu Công nghệ sinh

học. Nhà xuất bản Nông nghiệp.

7. Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu, 2005. Sinh học phân tử giới thiệu phương pháp

và ứng dụng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp.

8. Lâm Vỹ Nguyên, 2006. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền của cây đƣớc đôi

(Rhizophora apiculata BLUME) ở khu Dự trữ sinh quyển Rừng ngập mặn Cần Giờ

bằng kỹ thuật RAPD. Đại học Nông Lâm.

9. Phạm Bình Quyền, 2002. Đa dạng sinh học. Nhà xuất bản Đại học quốc gia Hà

Nội.

10. Lê Duy Thành, 2001. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. Nhà xuất bản khoa

học và kỹ thuật Hà Nội. 159 trang.

11. Nguyễn Đức Thành, 2004. Một số kỹ thuật chỉ thị phân tử. Nhà xuất bản Viện

khoa học và công nghệ Việt Nam – Viện Công nghệ sinh học Hà Nội.

57

12. Bùi Trang Việt, 2002. Bài giảng Sinh học phân tử. Đại học Nông Lâm TP Hồ

Chí Minh.

TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI

13. Ambike Baldev Gaikwad. Amplified Fragment Length polymorphism (AFLP)

technique.

14. Kazutoshi Okuno and Shuichi Fukuoka, 1998. Manual for DNA extraction in

plants. Japan international cooperation agency.

TRANG WEB

15. http://mekonginfo.org/mrc_en/contac.nsf/$FILE/Mamldong.htm

16. http://species.wikimedia.org/wiki/Avicennia_alba

17. http://vi.wikipedia.org/wiki/M%E1%BA%AFm_(c%C3%A2y)

18. http://www.biotech.ufl.edu/WorkshopsCourses/

Word_files/AFLP%20Workshop%20Manual.doc

19. http://www.dulichvn.org.vn/thongtinquanly/dautudulich/kdl_cangio.htm

20. http://www.keygien.com/technologies/technologies_aflp.htm

21. http://www.vacne.org.vn/Gioi%20thieu/gioithieu.htm

22. http://www.vacne.org.vn/Thongtin_Hoatdong/Q4_06.htm#Sinh%20Quyen

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Bảng thống kê các mẫu mắm trắng được thu thập tại Khu Dự trữ

sinh quyển Cần Giờ

STT Tên mẫu Tên tiểu

khu lấy

Tọa độ GPS Đặc điểm hình thái

48P UTM

1 AA01 17 0707699 1153876 Cây non, nhiều hoa, chƣa trái

2 AA02 17 0706956 1153990 Cây cao, lá xanh tƣơi, nhiều trái

3 AA03 17 0706752 1154072 Cây già, sâu bệnh nhiều

4 AA04 21 0706678 1154972 Thân nhỏ, lùn, nhiều cành ngang

5 AA05 21 0706898 1156443 Cây to cao nhung chƣa thấy hoa trái.

6 AA06 21 0706380 1157741 Cây trẻ, có hoa, chƣa trái, lá bị sâu

7 AA07 11 0705765 1158774 Cây trẻ, tƣơi tốt, cành lá xum xuê,

hoa trái rất nhiều.

8 AA08 11 0705441 1159250 Cây trƣởng thành, cao, lá xanh tốt

9 AA09 11 0705161 1159715 Cây non, chƣa có hoa, trái, sâu nhiều.

10 AA10 11 0704781 1160407 Lá có nhiều vết sâu bệnh, già cỗi

11 AA11 11 0704086 1161940 Cây già cỗi, sâu nhiều, lá bạc xám.

12 AA12 10A 0703881 1162362 Cây non, sâu nhiều.

13 AA13 10A 0703258 1163077 Cây cao, to , lá tƣơi tốt, không bị sâu

so với những cây xung quanh.

14 AA14 10A 0702913 1163559 Thân nhỏ, cành gầy guộc, bị sâu

15 AA15 5 0702489 1164263 Cây cao, ốm, nhiều cành, lá già cỗi

16 AA16 5 0701380 1165102 Cây mọc trong gò mối, già cỗi

17 AA17 5 0700452 1165786 Không bị sâu bệnh mặc dù những

cây gần kề có rất nhiều bệnh tích

18 AA18 5 0700650 1166971 Thân rất gầy, ít sâu bệnh, có trái

19 AA19 5 0700167 1167848 Cây non, tuoi tốt

20 AA20 5 0699834 1168876 Cây đã già, cao, nhiều sâu

21 AA21 5 0699673 1169617 Cây to, cao, tƣơi tốt

22 AA22 5 0699710 1169929 Cây cao, nhiều sâu

23 AA23 10B 0704861 1161423 Thân to, cành nhiều, lá bị sâu nhẹ

24 AA24 10B 0704929 1161680 Rất ít cành, không bị sâu, chƣa có hoa

25 AA25 10B 0704353 1167004 Ít bị sâu bệnh so với cây xung quanh

26 AA26 10A 0704815 1162305 Cây cao, là cằn cỗi, sâu nhiều

27 AA27 10A 0704402 1162602 Thân cong queo, nhiều cành

28 AA28 10A 0704558 1162782 Cây cao, to , tƣơi tốt

29 AA29 10A 0704676 1163013 Nhiều trái, tƣơi tốt

30 AA30 10A 0704682 1163310 Thân ốm, ít hoa, nhiều sâu

31 AA31 6B 0705498 1163893 Lá xanh tƣơi, hoa nhiều

32 AA32 6B 0706990 1163864 Cây non, không sâu

33 AA33 6B 0707502 1163708 Cây nhiều hoa, cành nhiều

34 AA34 6B 0708076 1163518 Thân thẳng, nhiều cánh, lá tốt

35 AA35 7 0710899 1165414 Lá bị nâu, nhiều sâu bệnh

36 AA36 7 0711177 1165656 Cây non,rất tƣơi tốt

37 AA37 7 0711211 1165828 Thân nhỏ, cao chƣa có hoa

38 AA38 7 0711384 1166061 Cây non, sâu nhiều

39 AA39 2B 0712166 1167219 Cây cao, lá không sâu, ít cành

40 AA40 2B 0712411 1167411 Thân nhiều cành, hoa lá tƣơi tốt

41 AA41 7 0712675 1167702 Cây trƣởng thành, rất xanh tốt

42 AA42 7 0712901 1167384 Hoa rất to, cây xanh tốt

43 AA43 7 0713223 1167803 Thân nhỏ, nhiều canh, có hoa

44 AA44 7 0713506 1168311 Thân to, lá rất tƣơi tốt

45 AA45 7 0714012 1168222 Lá bạc nhiều, ít sâu bệnh, thân cao

46 AA46 7 0714263 1168125 Thân nhỏ, bị sâu nhẹ

47 AA47 2B 0715316 1168346 Nhiều cành, lá xanh tốt

48 AA48 2B 0715338 1168639 Chƣa có hoa, cây to, cao

49 AA49 1 0713958 1169946 Cây non, lá bị sâu nhẹ

50 AA50 1 0713439 1170475 Cây rất cao, nhiều cành, bị sâu nhiều

Phụ lục 2. Bảng chỉ số đo OD của các mẫu ly trích

# Name Dilut. Factor Ratio Abs<260nm> Abs<280nm>

1 AA05 1.00000 1.91300 0.12156 6.3545E-2

2 AA06 1.00000 1.83980 0.10012 5.4418E-2

3 AA08 1.00000 1.90610 7.0246E-2 3.36853E-2

4 AA09 1.00000 1.98070 9.9778E-2 5.0376E-2

5 AA10 1.00000 2.03590 0.14718 7.2293E-2

6 AA11 1.00000 1.92170 9.4518E-2 4.9186E-2

7 AA12 1.00000 2.08880 0.15239 7.2957E-2

8 AA13 1.00000 2.03000 8.8066E-2 4.3383E-2

9 AA14 1.00000 2.04050 0.10603 5.1963E-2

10 AA15 1.00000 1.98990 0.11276 5.6663E-2

11 AA16 1.00000 2.02680 0.19094 9.4208E-2

12 AA18 1.00000 1.97070 6.2707E-2 3.1819E-2

13 AA20 1.00000 2.04920 3.7462E-2 1.8581E-2

14 AA21 1.00000 2.07400 1.6814E-2 8.1072E-3

15 AA22 1.00000 1.88520 2.2685E-2 1.2033E-2

16 AA23 1.00000 2.79790 2.9511E-3 1.0548E-3

17 AA24 1.00000 2.08490 3.0027E-2 1.4402E-2

18 AA25 1.00000 1.79140 8.1058E-2 4.5249E-2

19 AA26 1.00000 1.83270 7.9355E-2 4.3300E-2

20 AA27 1.00000 1.84070 7.8523E-2 4.2660E-2

21 AA28 1.00000 1.96280 0.12397 6.3162E-2

22 AA29 1.00000 1.97520 0.12302 6.2280E-2

23 AA30 1.00000 2.18210 2.5607E-2 1.1735E-2

24 AA32 1.00000 2.16600 2.5790E-2 1.1907E-2

25 AA34 1.00000 1.95050 0.53627 0.27494

26 AA35 1.00000 2.06870 1.16020 0.56084

27 AA36 1.00000 2.25560 2.9507E-2 1.3082E-2

28 AA37 1.00000 2.22720 3.0115E-2 1.3522E-2

29 AA38 1.00000 2.23550 1.9769E-2 8.8434E-3

30 AA39 1.00000 2.16300 2.0506E-2 9.4805E-3

31 AA40 1.00000 2.11070 1.6807E-2 7.9627E-3

32 AA41 1.00000 2.09760 3.6278E-2 1.7295E-2

33 AA42 1.00000 1.98150 6.2750E-2 3.1669E-2

34 AA43 1.00000 2.04170 0.18972 9.2922E-2

35 AA44 1.00000 2.02050 0.11123 5.5.50E-2

36 AA45 1.00000 2.04880 0.10576 5.1622E-2

37 AA46 1.00000 2.03360 8.7981E-2 4.3263E-2

38 AA47 1.00000 2.09790 0.15192 7.2417E-2

39 AA48 1.00000 1.98180 9.1039E-2 4.5937E-2

40 AA49 1.00000 2.00540 9.8450E-2 4.9093E-2

Phụ lục 3. Bảng mã hóa kết quả điện di các mẫu đem chạy RAPD trong phân

tích với phần mềm NTYSYSpc2.1

Tên mẫu 450bp 390bp 330bp 300bp 200bp 100bp 50bp

17.AA01 0 0 0 1 1 1 0

17.AA03 0 0 0 1 1 1 0

21.AA06 1 0 0 1 1 1 0

11.AA07 1 0 1 1 1 1 0

11.AA09 0 0 0 1 1 0 0

11.AA11 0 0 0 1 1 0 0

10A.AA12 0 0 1 0 1 1 0

10A.AA13 0 1 1 0 1 1 0

5A.AA19 0 1 0 1 1 1 1

10B.AA25 0 1 0 1 1 1 0

6B.AA32 0 0 1 0 1 0 0

7.AA45 1 1 0 1 1 1 0

2B.AA48 0 0 1 0 1 1 0

1.AA49 0 1 1 0 1 1 0