ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

*****

Bùi Thị Thùy Dung

PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM

CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƢỞNG

MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2016

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

*****

Bùi Thị Thùy Dung

PHÂN LẬP CÁC CHẤT TỪ DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM

CÓ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ TĂNG TRƢỞNG

MỘT SỐ DÒNG TẾ BÀO UNG THƢ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Cán bộ hƣớng dẫn: TS. Phạm Thị Lƣơng Hằng

PGS. TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung

Hà Nội – Năm 2016

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

i

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên , tôi xin gƣ̉i lời cảm ơn sâu sắc nhất tới TS. Phạm Thị Lƣơng

Hằng và PGS.TS. Hoàng Thị Mỹ Nhung, ngƣời đa ̃trƣc̣ tiếp hƣớng dâñ , tạo moị

điều kiêṇ thuâṇ lơị , giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoc̣ tâp̣ và hoàn thành luâṇ

văn. Các cô không chỉ là những ngƣời truyền đạt cho tôi những kiến thức mà còn

hỗ trợ tôi rất nhiều về vật chất. Tôi thấy mình thật may mắn khi đƣợc là học trò

của các cô.

Tôi xin gƣ̉i lời cảm ơn chân thành nhất tới ThS. Bùi Thị Vân Khánh, ThS.

Nguyêñ Đắc Tú , nhƣ̃ng ngƣời chi ̣, ngƣời anh tâṇ tình hƣớng dâñ tôi nhƣ̃ng ki ̃

thuâṭ đầu tiên khi bƣớc chân vào phòng thí nghiêṃ . Anh, chị không chỉ truyền đạt

cho tôi nhƣ̃ng kinh nghiêṃ trong công viêc̣ mà cả nhƣ̃ng kinh nghiêṃ quý báu

trong cuôc̣ sống, đó se ̃là nhƣ̃ng hành trang mà tôi se ̃luôn mang theo sau này .

Xin gửi lời cảm ơn đến CN. Nguyễn Thị Thu Hà, CN. Hà Hữu Cƣờng,

CN. Nguyễn Thị Loan, CN. Vũ Anh Công đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá

trình làm thí nghiệm.

Xin gƣ̉i lời cảm ơn sâu sắc nhất tới các thầy cô và cán bô ̣trong Khoa Sinh

học, đăc̣ biêṭ là các thầy cô trong Bô ̣môn Sinh hoc̣ tế bào và Bộ môn Sinh lí

Thực vật và Hóa sinh đa ̃giúp đỡ , tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành lu ận

văn này.

Và, tôi xin chân thành cảm ơn các anh chi ̣ , các bạn và các em trong Phòng

thí nghiệm Nuôi cấy Tế bào ngƣời và động vật cũng nhƣ Phòng thí nghiệm

Nuôi cấy Mô thực vật và Vi tảo đa ̃luôn đồng hành , quan tâm và giúp đỡ tôi

trong thời gian tham gia nghiên cƣ́u taị đây . Sƣ ̣quan tâm , chia sẻ của các bạn và

các em là động lực lớn lao với tôi trong những lúc mệt mỏi và khó khăn nhất . Tôi

sẽ không bao giờ quên thời gian làm việc đầ y ắp tiếng cƣời cùng các baṇ trong hai

gia đình lớn ở trƣờng Đại học khoa học tự nhiên Hà Nội.

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

ii

Xin gửi lời cảm ơn đến Quỹ phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia

(NAFOSTED) đã tài trợ kinh phí cho nghiên cứu này trong đề tài mang mã số

106.16-2012.24

Cuối cùng, tôi xin gƣ̉i lòng biết ơn sâu sắc và lớn lao nhất đến gia đình tôi ,

nhƣ̃ng ngƣời đa ̃hy sinh cả vâṭ chất và tinh thần , luôn yêu thƣơng , ủng hộ , đôṇg

viên và tôn troṇg moị quyết điṇh của tôi . Mỗi khi nghi ̃về gia đình tôi nhƣ đƣơc̣

tiếp thêm sƣ́c maṇh để vƣ̃ng tin hoàn thành tốt luận văn này.

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

Học viên

Bùi Thị Thuỳ Dung

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

iii

BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT

Tƣ̀ viết tắt Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt

ED50 Median effective dose Liều có hiệu quả ở 50% số

động vật thí nghiệm

EtOAc Ethyl acetate Dung môi ethyl acetate

HCT116 Human colon carcinoma cell Dòng tế bào ung thƣ đại

trực tràng

HepG2 Hepatocellular carcinoma G2 Dòng tế bào ung thƣ gan

IC50 Half maximal inhibitory

concetration

Nồng độ ức chế 50% số tế

bào

LC/MS Liquid chromatography–mass

spectrometry Sắc kí lỏng - khối phổ

LD50 Median lethal dose 50% Liều gây chết trung bình

MCF7 Breast adenocarcinoma cell Dòng tế bào ung thƣ vú

MeOH Methanol Dung môi methanol

MIC

Minimal inhibitory

concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

n-Hex n-Hexan Dung môi n-Hexan

OD Optical Density Mật độ quang học

SRB Sulforhodamine B Sulforhodamine B

TLC Thin-layer chromatography Sắc kí bản mỏng

MỤC LỤC

https://en.wikipedia.org/wiki/Liquid_chromatography%E2%80%93mass_spectrometryhttps://en.wikipedia.org/wiki/Liquid_chromatography%E2%80%93mass_spectrometry

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

iv

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 2

1.1. Vi khuẩn lam ................................................................................................... 2

1.1.1.Đặc điểm hình thái và sinh lí của vi khuẩn lam ................................... 2

1.1.2.Phân loại vi khuẩn lam ......................................................................... 3

1.2. Tiềm năng phát triển dƣợc phẩm điều trị ung thƣ từ vi khuẩn lam ................ 4

1.3. Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn lam .................... 9

1.4. Phân tách các hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam ..................................... 13

Chƣơng 2- VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 15

2.1. Vật liệu .......................................................................................................... 15

2.1.1. Các chủng vi khuẩn lam .................................................................... 15

2.1.2. Dòng tế bào........................................................................................ 16

2.2. Các nội dung chính trong nghiên cứu ........................................................... 17

2.3. Các phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................ 17

2.3.1. Đánh giá khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào .................................. 17

2.3.2. Chuẩn bị dịch chiết từ sinh khối vi khuẩn lam Nostoc sp. APD4 ..... 19

2.3.3. Phƣơng pháp sắc kí cột silica gel ..................................................... 20

2.3.5. Phƣơng pháp LC/MS ......................................................................... 21

Chƣơng 3- KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................... 22

3.1. Đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ...................................... 22

3.1.1.Kết quả hoạt hóa tế bào ...................................................................... 22

3.1.2.Xác định chỉ số IC50 của các dịch chiết từ vi khuẩn lam .................... 22

3.2. Phân lập các chất có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào từ vi khuẩn lam Nostoc

sp. APD4 .............................................................................................................. 29

3.2.1.Sự phân tách bằng cột sắc ký silica gel .............................................. 29

3.2.2. Sự phân tách bằng cột sắc kí sillica gel lần 2 .................................... 32

3.2.3. Sự phân tách bằng cột sắc kí silica gel lần 3 ..................................... 35

3.3. Xác định khối lƣợng phân tử của hoạt chất bằng phƣơng pháp LC/MS ...... 37

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

v

KẾT LUẬN .......................................................................................................... 43

KIẾN NGHỊ ......................................................................................................... 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................... 45

PHỤ LỤC

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Cryptophycin 1 [36]. ............................................. 5

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

vi

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Borophycin [17]. .................................................. 7

Hình 2.1. Các chủng vi khuẩn lam dùng trong nghiên cứu ................................... 16

Hình 3.1. Các dòng tế bào ung thƣ dùng trong phép thử hoạt tính ........................ 22

Hình 3.2. Tế bào MCF7 ở mẫu đối chứng sau 48h thử nghiệm ............................ 23

Hình 3.3. Tế bào MCF7 dƣới tác dụng của dịch chiết APD4- EtOAc .................. 24

Hình 3.4. Tế bào HCT116 dƣới tác dụng của dịch chiết APD4- EtOAc ............... 24

Hình 3.5. Tế bào HepG2 dƣới tác dụng của dịch chiết APD4- EtOAc ................. 24

Hình 3.6. Đƣờng cong đáp ứng liều của các dịch chiết có hoạt tính trên hai dòng tế

bào MCF7 và HCT116. .......................................................................................... 27

Hình 3.7. Đƣờng cong đáp ứng liều của dòng tế bào MCF7 đối với Taxol .......... 28

Hình 3.8. Các phân đoạn rửa giải từ dịch chiết APD4-Met ................................... 30

Hình 3.9. Hình dạng tế bào MCF7 khi đƣợc ủ với phân đoạn DE5 ...................... 32

Hình 3.10. Sắc kí cột silica gel cho phân đoạn có hoạt tính (DM-E). ................... 33

Hình 3.11. Tế bào MCF7 khi ủ với phân đoạn DP1 và DP5 ở nồng độ 50µg/ml . 34

Hình 3.12. Sắc ký đồ TLC của phân đoạn DP1 và DP5 ....................................... 35

Hình 3.13. Tế bào MCF7 dƣới tác dụng của phân đoạn DF4 ................................ 36

Hình 3.14. Sắc kí đồ của phân đoạn DF2 ở bƣớc sóng 256nm .............................. 37

Hình 3.15. Sắc kí đồ của phân đoạn DF4 ở bƣớc sóng 256nm .............................. 38

Hình 3.16. Phổ khối lƣợng của hợp chất P3 xuất hiện ở phút 23,6 ....................... 39

Hình 3.17. Kết quả tra cứu hợp chất có trọng lƣợng phân tử từ 795-796 dalton

tháng 10/2016. ........................................................................................................ 40

Hình 3.18. Công thức cấu tạo của Apratoxin E [26]. ............................................ 41

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Một số chất có khả năng kháng ung thƣ đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam

[39]. .......................................................................................................................... 8

Bảng 2.1. Các chủng vi khuẩn lam dùng trong thí nghiệm đánh giá hoạt tính ...... 15

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

vii

Bảng 3.1. Giá trị tăng sinh A% của các dịch chiết có hoạt tính ức chế sự tăng sinh

tế bào dòng MCF7 .................................................................................................. 25

Bảng 3.2. Giá trị tăng sinh A% của các dịch chiết có hoạt tính ức chế sự tăng sinh

tế bào dòng HCT116 .............................................................................................. 26

Bảng 3.3. Giá trị IC50 của một số dịch chiết có hoạt tính ....................................... 27

Bảng 3.4. Giá trị IC50 của Taxol trên ba dòng tế bào MCF7, HCT116 và HepG2 28

Bảng 3.5. Khối lƣợng các phân đoạn từ dịch chiết của chủng APD4 .................... 31

Bảng 3..6. Khối lƣợng khô của các phân đoạn thu đƣợc từ cột silica gel lần 2 .... 34

Bảng 3.7. Khối lƣợng các phân đoạn thu đƣợc từ cột sắc ký silica gel lần 3 ........ 36

Bảng 3.8. Tỷ lệ tƣơng đối về hàm lƣợng của các chất trong phân đoạn DF4 ....... 38

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

1

MỞ ĐẦU

Sự xuất hiện của bệnh ung thƣ đã và đang là mối đe dọa tính mạng con

ngƣời hàng đầu trên thế giới với tỷ lệ mắc phải ngày càng tăng . Theo số liêụ báo

cáo của Viện nghiên cứu quốc tế về ung thƣ , trong năm 2012, trên toàn thế giới

có hơn 8,2 triệu ngƣời chết vì các loại bệnh ung thƣ khác nhau. Các chuyên gia

cảnh báo nếu con ngƣời không sớm tìm đƣợc biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn

tốc độ phát triển nhƣ hiện nay của căn bệnh này thì tới năm 2035, ung thƣ sẽ

cƣớp đi sƣ ̣sống của ít nh ất 24 triệu ngƣời [14]. Hóa trị và xạ trị từ lâu là phƣơng

pháp đƣợc sử dụng phổ biến trong điều trị ung thƣ, tuy nhiên hai phƣơng pháp

này có nhiều tác dụng phụ, ảnh hƣởng xấu tới sức khỏe ngƣời bệnh, hoặc ngƣời

bệnh có thể tử vong trƣớc khi tiêu diệt đƣợc tận gốc các tế bào ung thƣ . Bởi vâỵ,

viêc̣ tìm ra môṭ loaị thuốc đăc̣ hiêụ điều tri ̣ ung thƣ và an toàn v ới ngƣời bệnh là

môṭ vấn đề r ất cấp bách hiêṇ nay . Trong công cuộc tìm kiếm đó, các hợp chất từ

thiên nhiên đƣợc quan tâm nhiều hơn cả bởi chúng đã có mặt trong các bài thuốc

dân gian từ lâu và có độ an toàn cao.

Vi khuẩn lam là nguồn giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học với tiềm

năng dƣợc phẩm có ý nghĩa quan trọng. Chúng cho thấy khả năng chống lại các

khối u, kháng virus, kháng khuẩn, kháng nấm. Một số hợp chất đƣợc phân lập và

tinh sạch từ vi khuẩn lam đã cho kết quả bƣớc đầu thành công trong các thử

nghiệm điều trị ung thƣ lâm sàng. Các hợp chất này đƣợc xem là hợp chất tiên

phong cho sự phát triển, tổng hợp các hợp chất dẫn với hoạt tính sinh học tốt hơn.

Từ các kiến thức nhƣ trên, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: “Phân lập các

chất từ dịch chiết vi khuẩn lam có khả năng ức chế tăng trƣởng một số dòng tế

bào ung thƣ” với mục đích:

1. Đánh giá được khả năng ức chế tăng trưởng của dịch chiết từ 9 chủng vi

khuẩn lam lên 3 dòng tế bào ung thư phổ biến ở Việt Nam.

2. Tìm ra được hợp chất có khả năng kháng ung thư từ dịch chiết vi khuẩn lam

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

2

Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Vi khuẩn lam

1.1.1. Đặc điểm hình thái và sinh lí của vi khuẩn lam

Vi khuẩn lam là vi khuẩn quang hợp cổ xƣa, xuất hiện trên trái đất từ 3,5 tỉ

năm về trƣớc. Bằng việc tạo ra khí oxy nhƣ một sản phẩm phụ của quá trình quang

hợp, vi khuẩn lam đƣợc cho là đã chuyển đổi khí quyển ở thời kì sơ khai từ tính

khử sang tính ô-xi hóa, từ đó làm thay đổi thành phần sự sống trên Trái Đất. Chính

vì vậy, chúng đƣợc xem là nhóm sinh vật tiên phong trong quá trình sản xuất ra

khí oxy giúp hình thành sự sống trên Trái Đất ngày nay.

Vi khuẩn lam trƣớc đây còn đƣợc biết đến với tên gọi là tảo lam bởi chúng

có cơ chế quang hợp giống tảo (nhóm sinh vật nhân chuẩn) với sắc tố quang hợp

nằm trên màng thylakoid. Tuy nhiên, cấu tạo tế bào của chúng giống với sinh vật

nhân sơ (Prokaryote) hơn là sinh vật nhân chuẩn (Eukaryote) vì chúng không có

màng nhân, vật liệu di truyền không liên kết với protein histone, thiếu màng bao

quanh các bào quan nhƣ bộ máy Golgi, lục lạp, ty thể, lƣới nội chất. Vi khuẩn lam

có ribosome 70S và có cấu trúc thành tế bào gồm các lớp peptidoglycan. Màu

xanh của vi khuẩn lam là do sự kết hợp của chlorophyll a (xanh lục) và các sắc tố

phụ phycocyanin (xanh lam), allophycocyanin (xanh lam), phycoerythin (màu đỏ).

Các sắc tố này kết hợp với nhau theo tỷ lệ và thành phần nhất định để thích ứng

với môi trƣờng sống [9].

Vi khuẩn lam có hai hệ thống quang hệ I và II nằm trên màng thylakoid (trừ

chi Gleobacter). Trong quang hệ II có phycobiliprotein có chức năng giống các

sắc tố “ăng-ten” bắt giữ năng lƣợng sáng cho chlorophyll a. Năng lƣợng ánh sáng

sau đó sẽ đƣợc chuyển từ quang hệ II sang quang hệ I - nơi chúng đƣợc chuyển

thành năng lƣợng hóa học trong đó có phân tử cao năng lƣợng nhƣ ATP và

NADPH+H. Phân tử cao năng này sẽ đƣợc sử dụng để cố định CO2 thành

carbohydrate thông qua chu trình Calvin. Vi khuẩn lam thực hiện quang hợp trong

điều kiện hiếu khí với H2O là chất cho điện tử và O2 là sản phẩm phụ đƣợc tạo ra.

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

3

Tuy nhiên, một số chủng vi khuẩn lam có thể sống trong điều kiện kị khí bằng

cách sử dụng quang hệ I và chất cho điện tử H2S, H2 hoặc các hợp chất hữu cơ [9].

Vi khuẩn lam có thể đƣợc tìm thấy gần nhƣ trong mọi môi trƣờng sống trên

đất liền nhƣ đất, đá ẩm, đá trong các hoang mạc thậm chí kể cá các loại đá tại châu

Nam Cực và trong môi trƣờng nƣớc nhƣ trong các đại dƣơng, môi trƣờng nƣớc

ngọt [8].

Vi khuẩn lam đã và đang đƣợc nghiên cứu trong một số lĩnh vực, đem lại

giá trị kinh tế vô cùng to lớn nhƣ:

Làm phân bón sinh học cho lúa và các cây trồng khác bởi nhiều

chủng vi khuẩn lam có các tế bào dị hình, có khả năng cố định nitơ khí quyển giúp

tăng năng suất cây trồng.

Vi khuẩn lam là một nguồn protein đơn bào có ý nghĩa quan trọng.

Các chủng không độc nhƣ Spirulina sp. đã đƣợc nuôi trên quy mô lớn để làm thực

phẩm bổ sung cho ngƣời và làm thức ăn giàu protein cho gia súc.

Các chất chuyển hóa thứ cấp từ vi khuẩn lam là nguồn dƣợc liệu

quan trọng cho việc phát triển thuốc và điều trị bệnh.

1.1.2. Phân loại vi khuẩn lam

Phân loại sinh học là một phƣơng pháp theo đó các nhà sinh học lập nhóm

và phân loại các loài sinh vật theo những nguyên tắc nhất định. Mỗi nhóm sinh vật

có tên gọi riêng và đƣợc phân định dựa trên những đặc điểm xác định về hình thái,

trình tự DNA,…Căn cứ vào mối quan hệ giữa các nhóm, ngƣời ta sắp xếp chúng

theo thứ tự bằng hoặc phân cấp cao hơn trên cây phân loại.

Dựa trên hệ thống phân loại vi khuẩn của Bergey, vi khuẩn lam đƣợc chia

thành 5 bộ [41]:

Bộ Chroococcales: Dạng đơn bào, tế bào dạng đơn lẻ hoặc tập trung

lại thành đám. Các tế bào phân chia theo 1; 2 hoặc 3 mặt phẳng đối xứng

hoặc nảy chồi. Ví dụ các chi: Microcystis, Prochlorococcus, Prochloron,

Synechoccus.

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

4

Bộ Pleurocapsales: Dạng đơn bào, tế bào dạng đơn lẻ hoặc tập trung

lại thành đám. Ví dụ các chi: Chroococcidiopsos, Myxosarcina, Pleurocapsa.

Bộ Oscillatoriales: Dạng sợi đơn, không có tế bào dị hình. Ví dụ các

chi: Oscillatoria, Spirulina, Lyngbya, Trichodesmium, Planktothrix.

Bộ Nostocales: Dạng sợi, không phân nhánh, có tế bào dị hình, có

khả năng cố định nitơ. Ví dụ các chi: Nostoc, Calothrix, Nodularia.

Bộ Stigonematales: Dạng sợi, phân nhánh, có tế bào dị hình để cố

định nitơ. Ví dụ các chi: Fischerella, Hapalosiphon, Westiellopsis.

Sự phân loại vi khuẩn lam truyền thống thƣờng dựa trên hình thái của

chúng. Tuy nhiên, chỉ dựa vào tiêu chí hình thái có thể không chính xác vì một số

chủng vi khuẩn lam có sự thay đổi về hình thái khi đáp ứng với các điều kiện môi

trƣờng khác nhau. Sử dụng các trình tự DNA 16S để làm thƣớc đo phân loại đang

là hƣớng đi nhiều tiềm năng vì DNA không bị ảnh hƣởng bởi các điều kiện môi

trƣờng. Sự kết hợp giữa phƣơng pháp truyền thống và phƣơng pháp hiện đại giúp

quá trình phân loại vi khuẩn lam chuẩn xác hơn.

1.2. Tiềm năng phát triển dƣợc phẩm điều trị ung thƣ từ vi khuẩn lam

Trong số 974 hợp chất mới đƣợc giới thiệu làm thuốc trên thế giới những

năm 1981-2006, 63% có nguồn gốc từ các sản phẩm thiên nhiên. Trong đó, 6% là

các sản phẩm thiên nhiên, 33% là các dẫn xuất tổng hợp dựa trên các kiến thức thu

đƣợc từ các sản phẩm tự nhiên và 24% là sản phẩm bắt chƣớc sản phẩm tự nhiên.

Bên cạnh đó, đối với các dƣợc phẩm điều trị ung thƣ, 78% là sản phẩm tự nhiên

hoặc có nguồn gốc từ các sản phẩm tự nhiên [29]. Đại đa số các sản phẩm tự nhiên

bắt nguồn từ nấm, vi khuẩn và thực vật. Hiện nay, các nhà khoa học đang nghiên

cứu phát triển nguồn dƣợc phẩm từ hợp chất thiên nhiên theo hai hƣớng, đó là:

phân tích sâu hơn các hợp chất có mặt trong nguồn tài nguyên cũ đã đƣợc biết đến

và hƣớng tới nguồn tài nguyên mới dồi dào, phong phú hơn. Trong đó, vi khuẩn

lam đang là đối tƣợng tiềm năng đƣợc chú ý theo hƣớng nghiên cứu thứ hai.

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

5

So sánh với các loại thuốc từ vi khuẩn nói chung, vi khuẩn lam nổi trội hơn

hẳn nhờ có mặt những hợp chất tiềm năng kháng ung thƣ. Các nhà nghiên cứu đã

chỉ ra 6% đến 10% dịch chiết từ vi khuẩn lam đang đƣợc nuôi cấy có khả năng

tiêu diệt tế bào ung thƣ ở ngƣời, 0,8% trong tổng số 2000 dịch chiết vi khuẩn lam

có độc tính đối với các khối u rắn [27]. Theo báo cáo của Patterson, ông và cộng

sự đã tiến hành sàng lọc trên quy mô lớn sử dụng 1000 chủng vi khuẩn lam từ các

môi trƣờng sống khác nhau. Quá trình sàng lọc đã cho thấy khoảng 7% dịch chiết

có khả năng ức chế sự tăng sinh của dòng tế bào ung thƣ KB [31].

Các nghiên cứu của Gerwick và cộng sự tập trung vào việc sàng lọc các hợp

chất kháng ung thƣ của các chủng vi khuẩn lam sống trong môi trƣờng nƣớc biển.

Kết quả nghiên cứu cho thấy có tới 40% các chất từ vi khuẩn lam thu đƣợc có hoạt

khả năng chống lại ung thƣ, ngăn ngừa khối u. Chúng cũng là nguồn giàu các hợp

chất peptide và polyketide, các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh có thể là

nguồn hợp chất tạo dƣợc phẩm kháng ung thƣ mới [16].

Một số lƣợng lớn các hợp chất đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam có hoạt tính

ức chế sự trùng hợp tubulin đang là đối tƣợng đƣợc nghiên cứu để phát triển thuốc

kháng ung thƣ.

Đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam Nostoc sp. ATCC 53789, Cryptophycin là

một trong những ứng cử viên đƣợc phát hiện sớm và có tiềm năng cao cho loại

dƣợc phẩm mới chống ung thƣ. Ở nhóm Cryptophycin có hơn 25 thành viên có

hoạt động mạnh gây bất ổn tubulin, trong đó Crytophycin 1 có hoạt tính mạnh

nhất [36].

Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Cryptophycin 1 [36].

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

6

Curacin A đƣợc phân lập từ chủng vi khuẩn lam Lyngbya majuscule có khả

năng ức chế sự tăng sinh tế bào và có độc tính mạnh với các tế bào ung thƣ đại

tràng, thận và vú. Chúng hoạt động bằng cách liên kết với vị trí bám trên tubulin

ngăn cản sự tổng hợp vi ống, từ đó ức chế sự phân chia và tăng sinh tế bào. Tuy

nhiên Curacin A ít tan trong nƣớc vì vậy khi tiến hành thử nghiệm trên mô hình in

vivo đã gặp nhiều khó khăn. Để khắc phục hiện tƣợng trên, các nhà khoa học đã

tìm cách tổng hợp hợp chất có đặc tính sinh học tƣợng tự Curacin A với tính tan

tốt hơn [15, 40].

Dolastatin 10 đƣợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1987 bởi Pettit từ loại

sinh vật biển Dolabella auricularia và đƣợc Luesch phân lập từ vi khuẩn lam

Symploca sp. năm 2001. Dolastatin 10 ức chế ức tăng sinh tế bào trong các thử

nghiệm in vivo ở các bệnh bạch cầu, u lympho [35].

Một thành viên khác trong nhóm Dolastatin là Dolastatin 15 còn đƣợc dùng

trong thử nghiệm trên mô hình in vitro với hoạt tính sinh học tƣơng tự là ức chế

tăng sinh tế bào và ức chế sự gia tăng kích thƣớc khối u động vật. Tuy nhiên, hợp

chất này có hiệu suất tổng hợp rất thấp và khả năng tan trong nƣớc hạn chế. Chính

điều này đã thôi thúc các nhà khoa học tổng hợp thành công các chất có hoạt tính

sinh học tƣơng tự Dolastatin 15 với hiệu suất tổng hợp cao, tính tan ổn định, đó là:

ILX-651 và LU3793. Các chất này đã đƣợc thử nghiệm lâm sàng tại pha II. Nhìn

chung, các hợp chất Dolastatin có cơ chế hoạt động ức chế quá trình lắp ráp vi ống

khi bám vào tubulin. Ngoài ra, chúng còn tham gia vào quá trình apoptosis thông

qua sự can thiệp vào protein Bcl-2 [35].

Hai chất có khả năng gây độc đến tế bào đƣợc nhiều nghiên cứu đề cập đến

đó là: Borophycin và Apratoxin A. Borophycin là phức hợp của boron và

polyketide đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam Nostoc linckia và Nostoc

spongiaeforme. Borophycin có khả năng kháng ung thƣ ở dòng tế bào ung thƣ biểu

bì và ung thƣ đại trực tràng ở ngƣời [17].

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

7

Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Borophycin [17].

Apratoxin A là chất chuyển hóa thứ cấp đƣợc phân lập lần đầu tiên từ vi

khuẩn lam Lyngbya majuscule. Apratoxin A có cấu trúc hỗn hợp peptide-

polyketide dạng vòng, gồm một vòng thiazoline. Đây là chất có khả năng gây độc

mạnh đối với tế bào ung thƣ bởi khả năng kích thích tế bào phân chia bị bắt giữ ở

pha G1, gây ra quá trình apoptosis (chết theo chƣơng trình). Mặc dù chất này có

khả năng gây độc ở 60 dòng tế bào khối u nhƣng các nhà nghiên cứu vẫn chƣa tìm

ra cơ chế hoạt động của chúng [4].

Theo nghiên cứu của Martins và cộng sự khi cho tế bào HL-60 tiếp xúc với

dịch chiết của các chủng vi khuẩn lam Synechocytis sp. và Synechococcus sp. đã

có hiện tƣợng apoptosis xuất hiện ở tế bào thử nghiệm. Cụ thể, có sự biến đổi ở

phần màng tế bào, tế bào bị co rút và bắt đầu xuất hiện hiện tƣợng phân mảnh

nhân. Bên cạnh đó, một glycoside đƣợc phân lập từ Lyngbya sp. hay Anabaena sp.

cũng tham gia vào quá trình thúc đẩy tế bào ung thƣ tham gia vào chu trình

apoptosis với dấu hiệu ban đầu là ngƣng tụ chất nhiễm sắc và phân mảnh nhân.

Các sản phẩm từ dịch chiết vi khuẩn lam (Bảng 1.1) còn gây ảnh hƣởng đến sự

sinh trƣởng và phát triển của các dòng tế bào ung thƣ, đƣa chúng vào chu trình

chết tế bào thông qua các hoạt động nhƣ: bắt giữ tế bào trong chu kì tế bào, làm rối

loạn chức năng ty thể, lạp thể, gây ra các hoạt động oxi hóa, thay đổi caspase để

ngăn chặn không cho chúng tham gia vào các quá trình cắt nối hay thay đổi họ

protein Bcl-2 và thay đổi hoạt động của các kênh vận chuyển trên màng ty thể, đây

đều là những con đƣờng trực tiếp dẫn tới apoptosis [7].

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

8

Bảng 1.1. Một số chất có khả năng kháng ung thƣ đƣợc phân lập từ

vi khuẩn lam [37].

STT Tên chất Từ vi khuẩn lam Dòng tế bào tác động

1 Ankaraholide A Geitlerinema sp. Các dòng tế bào ung

thƣ: phổi H460, vú

MDA-MB 435, đại

trƣc tràng LoVo, vòm

họng KB

2 Apratoxin A-G Lyngbya majuscule

Lyngbya sp.

Lyngbya sordida

Lyngbya bouilloni

Ung thƣ máu U2OS,

cổ tử cung HeLa, phổi

H460, đại trực tràng

HCT116.

3 Belamide A Symploca sp. Ung thƣ đại trực tràng

HCT116

4 Calothrixin A Calothrix sp. Ung thƣ cổ tử cung

HeLa

5 Caylobolide A Lyngbya majuscula Ung thƣ đại trực tràng

HCT116

6 Dolastatin 10 Symploca sp. Ung thƣ phổi các

dòng: H69, H82,

H446 và H510, ung

thƣ máu lympho.

7 Cryptophycin 1 Nostoc sp. Ung thƣ vú ở ngƣời

MDA-MB-435, ung

thƣ phổi A549.

8 Curacin A Lyngbya majuscula Ung thƣ phổi A549

9 Symplostatin 1 Symploca hydnoides Ung thƣ vú ở ngƣời

MDA-MB-435

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

9

10 Malevamide D Symploca hydnoides Ung thƣ phổi A549,

HT29, ung thƣ da

SKMEL-28.

1.3. Các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh học từ vi khuẩn lam

Hợp chất tự nhiên (hay hợp chất thiên nhiên) là các chất hóa học có nguồn

từ tự nhiên hoặc đƣợc con ngƣời tách ra từ các loài động vật, thực vật có trong tự

nhiên có thể có hoạt tính sinh học hoặc tác dụng dƣợc học dùng để làm thuốc [5].

Chúng là nguồn cung cấp các cấu trúc dẫn đƣờng để tổng hợp các chất tƣơng tự

nhƣng đạt hiệu quả dƣợc lí và an toàn cao hơn, đƣợc xem là mốc khởi đầu trong

quá trình tổng hợp và sản xuất thuốc.

Vào năm 1891, Albrecht Kossel đề xuất chia các hợp chất tự nhiên thành

hai nhóm chính, đó là: các hợp chất sơ cấp và các hợp chất thứ cấp [22]. Trong đó,

các hợp chất thứ cấp không thực sự cần thiết cho sự sống của bản thân sinh vật

nhƣng chúng gây tác động đến các sinh vật khác, làm tăng khả năng cạnh tranh

của các sinh vật trong môi trƣờng sống. Do có khả năng điều chỉnh con đƣờng

truyền và sinh hóa tín hiệu, một vài chất chuyển hóa thứ cấp có tính chất dƣợc liệu

hữu ích.

Các hợp chất sinh học của vi khuẩn lam cung cấp một nguồn dƣợc liệu mới,

nhiều tiềm năng. Sự đa dạng và mới lạ của các chất tìm thấy trong vi khuẩn lam

đƣợc so sánh với xạ khuẩn- nhóm vi khuẩn cung cấp nhiều dƣợc phẩm quan trọng

[3, 34]. Các chất đƣợc tìm thấy trong vi khuẩn lam gồm nhiều nhóm chất khác

nhau bao gồm: alkaloid, terpenoid, polyketide và peptide không phụ thuộc

ribosome. Phần lớn các sản phẩm này đƣợc sản xuất thông qua con đƣờng sinh

tổng hợp polyketide (PKS) và peptide không phụ thuộc vào ribosome (NRPS)

hoặc phối hợp cả hai [24]. Các nhóm chất từ vi khuẩn lam thể hiện nhiều hoạt tính

sinh học khác nhau: kháng khuẩn, kháng ung thƣ, kháng virus, ức chế miễn dịch,

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

10

ức chế hoạt động của proteinase, đây đều là những mục tiêu nghiên cứu quan trọng

của sinh y học.

1.3.1. Nhóm các chất alkaloid

Sự phân lập và định tính alkaloid đƣợc bắt đầu từ rất sớm, vào những năm

1960. Đây là nhóm các chất có độc tính cao, chỉ với liều vài milligram đã có thể

gây tử vong cho ngƣời. Các alkaloid có tác dụng sinh học rất đa dạng, chủ yếu làm

dƣợc phẩm nhƣ: các thuốc ức chế thần kinh trung ƣơng (morphin, scopolamine, L-

tetrahydropalmatin), các thuốc điều trị bệnh tim (ajmalin), các thuốc điều trị bệnh

cao huyết áp (reserpine, ajmalixin),…Mỗi alkaloid khác nhau có hoạt tính sinh học

khác nhau, trong đó, vài chục alkaloid đƣợc sử dụng rộng rãi trong y học và trong

nông nghiệp [1].

Anatoxin-a là sản phẩm đƣợc phát hiện vào những năm đầu của thập niên

1960 và đƣợc phân lập lần đầu tiên vào năm 1972 bởi J. P. Devlin từ chủng vi

khuẩn lam Anabeana flos aquae. Chúng đƣợc biết đến với cái tên “Yếu tố gây chết

nhanh” (Very Fast Death Factor), bởi chúng có khả năng gây độc nhanh và mạnh

lên hệ thần kinh làm co giật và tử vong do liệt hô hấp. Bằng cách liên kết với thụ

thể nicotinic acetylcholine (nAchR) trên màng tế bào thần kinh, Anatoxin-a thay

đổi hoạt động của các kênh vận chuyển ion qua màng làm cho các cation không

thể đi qua màng, cuối cùng dẫn đến tắc nghẽn sự truyền tín hiệu xung thần kinh

[10].

Cylindrospermopsin là một alkaloid tự nhiên mang độc tính đƣợc phân lập

từ các loài vi khuẩn lam: Cylindrospermopsis raciborskii, Umezakia natans,

Aphanizomenon ovalisporum, Anabaena bergii và Raphidiopsis curvata. Cấu trúc

hóa học của chất này đƣợc phát hiện vào năm 1992, bao gồm một trycyclic

guanidine liên kết với hydroxymethyluracil. Dựa trên cấu trúc nucleotide và khả

năng phản ứng của guanine và nhóm sulphate của Cyclindrospermopsin, các nhà

nghiên cứu chỉ ra rằng, chất này có khả năng liên kết với DNA/RNA của đối

tƣợng thí nghiệm. Cụ thể, có sự liên kết giữa chúng với DNA ở gan chuột trong

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

11

mô hình nghiên cứu in vivo, Cyclindrospermopsin gây ra sự phá vỡ DNA ở gan

đồng thời làm tăng số lƣợng các nucleic nhỏ ở tế bào ung thƣ máu lympho dòng

WIL2-NS [38].

1.3.2. Nhóm các chất terpenoid

Các terpenoid có vai trò và chức năng đa dạng trong các hoạt động sinh

học. Chúng có thể là các hormones (gibberellins, abscisic acid), các sắc tố quang

hợp (phytol, carotenoids), các chất dẫn truyền điện tử (ubiquinone, plastoquinon)

hay các chất tham gia cấu trúc màng tế bào (phytosterol). Ngoài các chức năng về

sinh lí, trao đổi chất và xây dựng cấu trúc, một số hợp chất terpenoid đặc biệt, chủ

yếu thuộc gia đình terpenoid có mạch cacbon C10, C15, C20 còn tham gia vào quá

trình “giao tiếp” và “phòng vệ” nhƣ: chất hấp dẫn côn trùng thụ phấn, hỗ trợ quá

trình phát tán hạt giống, kháng sinh, tạo chất độc đối với động vật ăn cỏ.

Ở vi khuẩn lam, terpenoid đƣợc tổng hợp bằng con đƣờng methylerythritol-

phosphate (MEP). Nghiên cứu của Kaneko và cộng sự cho thấy, các gen mã hóa

cho mỗi enzyme tham gia vào con đƣờng sinh tổng hợp MEP đã đƣợc tìm thấy

trong genome của Synechocystis sp. cũng nhƣ trong genome của nhiều loài vi

khuẩn lam khác [30].

Đƣợc phân lập từ vi khuẩn lam Tolypothrix nodosa, Tolypodiol là một

diterpenoid đã đƣợc nhận diện bằng NMR và phân tích khối phổ. Tolypodiol thể

hiện hoạt tính kháng viêm mạnh ở tai chuột với ED50 bằng 30µg/tai [32].

1.3.3. Nhóm các chất polyketide.

Là nhóm các sản phẩm thứ cấp có sự đa dạng về cấu trúc và chức năng

đƣợc phân lập từ nguồn sinh vật khác nhau: vi khuẩn, nấm, thực vật, côn trùng.

Các sản phẩm phân lập có đặc tính dƣợc lí quan trọng nhƣ: kháng khuẩn, kháng

nấm, chống kí sinh trùng, chống khối u với phổ hoạt động rộng, có tác dụng trên

nhiều đối tƣợng

Ở vi khuẩn lam, polyketide đƣợc tổng hợp bởi chuỗi các phản ứng liên tục

đƣợc xúc tác bởi các enzyme polyketide synthenase (PKS)- đây là nhóm lớn các

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

12

đa enzyme chứa nhóm phối hợp với vị trí hoạt động. Các phản ứng diễn ra theo

từng bƣớc bằng cách hoạt hóa 2; 3; 4-cacbon khởi đầu nhƣ acetyl-CoA, propionyl,

CoA, butyryl-CoA thành malonyl-, methylmalonyl- và ethylmalonyl- CoA. Các

gen PKS đƣợc phát hiện ở vi khuẩn lam nhờ nghiên cứu đột biến gen transposon ở

tế bào dị hình có khả năng cố định ni-tơ [11].

Coibacin A-D là một polyketide đƣợc phân lập từ một loài vi khuẩn lam

Oscillatoria sp. ở biển Panama. Nghiên cứu đã chứng minh, Coibacin A-D có khả

năng ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thƣ H460 với giá trị IC50 từ 11,4-34,5µM.

Chúng cũng có khả năng kháng viêm dựa trên khảo nghiệm nitric oxide, trong đó,

Coibacin B thể hiện khả năng kháng viêm mạnh nhất. Ngoài ra, sự có mặt của

Coibacin A còn làm giảm các cytokine nhƣ TNF-α và IL-6 ở tế bào chuột

RAW264.7 đã đƣợc kích thích bằng lipopolysaccharide [2].

1.3.4. Nhóm các chất peptide không phụ thuộc ribosome

Là sản phẩm của hệ thống sinh tổng hợp của các enzyme nonribosomal

peptides synthetase. Các peptide không phụ thuộc ribosome bao gồm D- và L-

amino acid, protein và axit amin, axit hydroxyl, ornithine, acid β-amin và các

thành phần dị biệt khác. Chúng có thể đƣợc sửa đổi bởi glycosyl hóa, N-methyl

hóa, hoặc acyl hóa. Ngoài sự đa dạng về cấu trúc, các peptide không phụ thuộc

ribosome có phổ rộng các hoạt động sinh học, một trong số đó có nhiều hữu ích

trong y học, nông nghiệp và nghiên cứu sinh học. Các peptide không phụ thuộc

ribosome bao gồm các kháng sinh nổi tiếng, chất ức chế miễn dịch, tác nhân kháng

u và các độc tố [25].

Microcystin là là chất chuyển hóa đầu tiên khẳng định có tồn tại con đƣờng

chuyển hóa không phụ thuộc ribosome. Theo báo cáo của Chorus và Bartram,

Microcystin là sản phẩm của các vi khuẩn lam Microcytis aeruginosa, Anabaena

flos-aquae, Oscillatoria agardhii và một số loài thuộc chi Nostoc [19]. Chúng đặc

biệt ức chế protein phosphatase loại 1 và 2A ở sinh vật nhân thực Eukaryote.

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

13

Microcystis có thể gây tổn thƣơng gan nghiêm trọng do sự vận chuyển tích cực

của chúng vào tế bào gan và cũng là nguyên nhân gây ngộ độc cho con ngƣời [28].

1.4. Phân tách các hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam

Sự phát triển của kĩ thuật sắc kí đã giúp một bƣớc tiến lớn cho quá trình

phân tách các hợp chất thiên nhiên có trong vi khuẩn lam

Các hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam đƣợc tồn tại trong một hỗn hợp

phức tạp gồm nhiều chất với cấu tạo khác nhau. Với các hợp chất quan tâm khác

nhau, ngƣời ta sẽ sử dụng các phƣơng pháp khác nhau để thu đƣợc hiệu quả tối ƣu

nhất. Ví dụ ở loài vi khuẩn lam Spirulina sp., các chất có khả năng chống ô-xi hóa

đƣợc phân tách bằng cách sử dụng sắc kí cột có điều chỉnh tốc độ chảy và áp suất

dung môi trong khi phƣơng pháp chƣng cất đƣợc sử dụng để thu lấy các chất có

khả năng kháng virus. Sự phân tách các hợp chất này phụ thuộc vào các yếu tố

nhƣ: tính tan trong dung môi, độ ổn định của chất, lƣợng chất có trong hỗn hợp

[23].

Các hợp chất thiên nhiên có cấu trúc hóa học khác nhau đƣợc phân tách từ

chủng vi khuẩn lam Spirulina platensis bằng phƣơng pháp chiết lỏng cao áp (PLE-

Pressurized Liquid Extraction). Các yếu tố nhƣ: dung môi phân cực (methanol,

ethanol, n- hexan, nƣớc), nhiệt độ tách chiết, thời gian và sự phân bố mẫu bên

trong tế bào tách chiết đƣợc tối ƣu. Bằng cách kết hợp PLE với các kĩ thuật sắc kí

khác nhƣ: sắc kí bản mỏng TLC để kiểm tra độ phân tách của các băng chất, sắc kí

lỏng hiệu năng cao kết hợp với đầu dò (HPLC-DAD) để xác định chất đƣợc phân

tách ở mỗi băng, các chất đƣợc phát hiện có thể là α- và β-carotene, β-

cryptoxanthin,…Ngoài ra, TLC còn đƣợc dùng phối hợp với phƣơng pháp điện di

mao quản kết hợp khối phổ (EC/MS- Capillary electrophoresis - Mass

spectrometry) để tăng hiệu quả tách chiết lƣợng chất giàu phycobiliprotein trong

thời gian ngắn nhất [18].

Hàm lƣợng carotenoid có mặt trong loài vi khuẩn lam S. platensis đƣợc xác

định bằng phƣơng pháp chiết siêu tới hạn (SFE- Supercritical fluid extraction).

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

14

Đây là phƣơng pháp sử dụng dung môi CO2 ở nhiệt độ và áp suất vƣợt qua giới

hạn của chất. Kết quả cho thấy, hàm lƣợng carotenoid thu đƣợc từ loài vi khuẩn

lam này cao hơn hẳn khi sử dụng các phƣơng pháp khác [18].

Nhƣ vậy, ngoài các phƣơng pháp tách chiết truyền thống nhƣ: chiết lỏng-

rắn (SLE- Solid liquid extraction), chiết lỏng-lỏng (LLE- Liquid–liquid extraction)

với nhƣợc điểm sử dụng một lƣợng lớn dung môi và tốn nhiều thời gian tách chiết

nhƣng hiệu quả tách chiết không cao thì sự ra đời của một số phƣơng pháp mới

nhƣ: chiết lỏng cao áp, chiết chất lỏng siêu tới hạn,…để tăng hiệu quả tách chiết

và phân đoạn các hợp chất thiên nhiên từ vi khuẩn lam. Ngoài ra, ngƣời ta cũng có

thể dùng phối hợp các phƣơng pháp phân tích để đem lại hiệu quả nghiên cứu tốt

nhất nhƣ: sắc kí lỏng hiệu năng cao kết hợp với khối phổ (LC/MS- Liquid

chromatography- mass spectrometry), sắc kí khí kết hợp khối phổ GC/MS (Gas

chromatography- mass spectrometry), sắc kí lỏng hiệu năng cao kết hợp hai lần

khối phổ (LC/MS-MS- Liquid chromatography- mass spectrometry/mass

spectrometry) nhằm dự đoán khối lƣợng và cấu trúc của phân tử hợp chất quan

tâm.

Lịch sử nghiên cứu việc phân lập các chất tinh khiết từ vi khuẩn lam có

những hƣớng đi thay đổi tiến bộ theo thời gian, thay vì sử dụng phƣơng pháp vật

lí, hóa học để tìm ra nhiệt độ sôi, sự khác biệt so với các chất đã biết và xác định

khối lƣợng phân tử cần một lƣợng mẫu lớn, thời gian xử lí mẫu lâu, phức tạp thì

các phƣơng pháp hiện đại đƣợc sử dụng nhƣ khối phổ, công hƣởng từ hạt nhân

giúp xác định chất quan tâm nhanh chóng, dễ dàng với 1 lƣợng mẫu nhỏ giúp quá

trình phân tách chất đạt hiệu quả tối đa.

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

45

TÀI LIỆU THAM KHẢO

TIẾNG VIỆT

1. Phan Quốc Kinh, (2011), "Giáo trình các hợp chất thiên nhiên có hoạt tính sinh

học". Nhà xuất bản giáo dục Việt Nam.

TIẾNG ANH

2. Balunas M.J., Grosso M.F., Villa F.A., Engene N., Mcphail K.L., Tidgewell K.,

Pineda M.L., Gerwick L., Spadafora C., Kyle D.E., and Gerwick W.H.,

(2012), "Coibacins A-D, antileishmanial marine cyanobacterial

polyketides with intriguing biosynthetic origins", Organic letters, 14(15),

pp. 3878-81.

3. Burja A.M., B. Banaigs, E. Abou-Mansour, J. Grant Burgess, and P.C. Wright,

(2001), "Marine cyanobacteria - a prolific source of natural products",

Tetrahedron, 57(46), pp. 9347-9377.

4. Chen J. and Forsyth C.J., (2004), "Total synthesis of the marine cyanobacterial

cyclodepsipeptide apratoxin A", Proceedings of the National Academy of

Sciences of the United States of America, 101(33), pp. 12067-72.

5. Chin Y.-W., Balunas M. J., Chai H. B., and Kinghorn A.D., (2006), "Drug

discovery from natural sources", The AAPS journal, 8(2), pp. E239-

E253.

6. Chun G., Lee Y.B., Kim D.J., Cho W.J, Lee S.K., Chung H.J., and Ahn C.H.,

(2014), "Characterization of a novel small molecule inhibitor with potent

anticancer activity", Cancer research, 70(8), pp. 3562.

7. Costa M., Costa-Rodrigues J.,Fernandes M.H., Barros P., Vasconcelos V., and

Martins R., (2012), "Marine cyanobacteria compounds with anticancer

properties: a review on the implication of apoptosis", Mar Drugs, 10(10):

pp. 2181-207.

8. De Los Rios A., Grube M., Sancho L.G., and Ascaso C., (2007),

"Ultrastructural and genetic characteristics of endolithic cyanobacterial

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

46

biofilms colonizing Antarctic granite rocks", FEMS microbiology

ecology, 59(2), pp. 386-95.

9. Devi T.I., Koijam L.,Singh O.A.,Tiwari O.N. and Sharma G.D., (2010),

"Assessment of cyanobacterial biodiversity through molecular

approaches and possible exploitation for value addition", Assam

University Journal of Science & Technology : Biological and

Environmental Sciences, 6 (1), pp. 93-101.

10. Dittmann E. and Wiegand C., (2006), "Cyanobacterial toxins--occurrence,

biosynthesis and impact on human affairs", Molecular nutrition & food

research, 50(1), pp. 7-17.

11. Dittmann E., Neilan B.A., and Borner T., (2001), "Molecular biology of peptide

and polyketide biosynthesis in cyanobacteria", Applied Microbiol

Biotechnol, 57(4), pp. 467-73.

12. Elliott A. and Pace D.M., (1963), "Observations on the effects of Methanol and

formaldehyde on estabilished cell lines cultivated in vitro”, Canadian

Journal of Biochemistry and Physiology, 41(2), pp. 299-304.

13. Fang W., Liu S., and Nie Y., (2011), "Anticancer activity of chamaejasmine:

effect on tubulin protein", Molecules, 16(8), pp. 6243-54.

14. Ferlay J.,Soerjomataram I., Dikshit R., Eser S., Mathers C., Rebelo M, Parkin

D., Forman D., and Bray F., (2015), "Cancer incidence and mortality

worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012",

International journal of cancer, 136(5), pp. E359-86.

15. Gerwick W.H., Proteau P.J., Nagle D.G., Hamel E., Blokhin A., and Slate D.L.,

(1994), "Structure of Curacin A, a Novel Antimitotic, Antiproliferative

and Brine Shrimp Toxic Natural Product from the Marine

Cyanobacterium Lyngbya majuscula", The Journal of Organic

Chemistry, 59(6), pp. 1243-1245.

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

47

16. Gerwick, W.H., Byrum T., Carland T., (2008),“Integratingchemical and

biochemical approaches to natural products drug discovery from marine

cyanobacteria”, International Conference on Newer Developments in

Drug Discovery from Natural Products and Traditional Medicines, pp.

33-43.

17. Hemscheidt T., Puglisi M.P., Larsen L.K., Patterson G.M., Moore R., Rios J.,

and Clardy J., (1994), "Structure and biosynthesis of borophycin, a new

boeseken complex of boric acid from a marine strain of the blue-green

alga Nostoc linckia", The Journal of Organic Chemistry, 59(12), pp.

3467-3471.

18. Ibañez E., Herrero M., Mendiola J.A., and Castro-Puyana M. (2012),

“Extraction and Characterization of Bioactive Compounds with Health

Benefits from Marine Resources: Macro and Micro Algae,

Cyanobacteria, and Invertebrates”, Marine Bioactive Compounds:

Characterization and Applications, pp. 55-98.

19. Ingrid Chorus, Jamie Bartram, (1999), Toxic Cyanobacteria in Water: A Guide

to their Public Health Consequences, Monitoring and Management,

Chemical Rubber Company Press.

20. James J Pitt (2009), “Principles and Applications of Liquid Chromatography-

Mass Spectrometry in Clinical Biochemistry”, Clin Biochem Reviews,

30(1), pp.19–34.

21. Kenneth G. Macleod and Simon P. Langdon, (2011), “Essential Techniques of

Cancer Cell Culture”, Cancer cell culture- Methods and Protocol, 88,

pp.17-23

22. Kossel A., (1981), "The chemical composition of the cell", Archiv für

Physiologie, 61(10), pp. 181-186.

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

48

23. Kwei C.K.,(2012), Elucidation and isolation of specific bioactive compound in

cyanobacteria isolates, Thesis (Ph.D): Chemical Engineering, University

of Adelaide

24. Mandal S. and Rath J., (2015), “Secondary Metabolites of Cyanobacteria and

Drug Development”, Extremophilic Cyanobacteria For Novel Drug

Development, pp. 23-43.

25. Martínez-Núñez M.A, (2016), "Nonribosomal peptides synthetases and their

applications in industry", Sustainable Chemical Processes, 4(1), pp. 13.

26. Matthew S., Schupp P., and Luesch H., (2008), "Apratoxin E, a cytotoxic

peptolide from a guamanian collection of the marine cyanobacterium

Lyngbya bouillonii", Journal of natural products, 71(6), pp. 1113-6.

27. Moore R.E., Corbett, T. H., Patterson, G. M. L., and Valeriote, F. A. ,(1996),

“The Search for New Antitumor Drugs from Blue-Green Algae”,

Current Pharmaceutical Design, 2(3),pp. 317-330.

28. Neilan B.A., Dittmann E., Rouhiainen L., Bass L.A., Schaub V., Sivonen K.,

and Börner T., (1999), "Nonribosomal Peptide Synthesis and

Toxigenicity of Cyanobacteria", Journal of Bacteriology, 181(13), pp.

4089-4097.

29. Newman D.J. and G.M. Cragg, (2007), "Natural Products as Sources of New

Drugs over the Last 25 Years", Journal of natural products, 70(3), pp.

461-477.

30. Pattanaik B. and P. Lindberg, (2015), "Terpenoids and their biosynthesis in

cyanobacteria", Life (Basel, Switzerland), 5(1), p. 269-93.

31. Patterson G.M.L, (1991), "Atineoplastic activity of cultured blue-green algae

(Cyanpphyta)". Journal of Phycology, 27(4), pp. 530-536.

32. Prinsep M.R., Thomson R.A., West M.L., and Wylie B.L., (1996), "Tolypodiol,

an antiinflammatory diterpenoid from the cyanobacterium Tolypothrix

nodosa", Journal of natural products, 59(8), pp. 786-8.

Luận văn cao học 2016 Bùi Thị Thùy Dung

49

33. Sherma J., (2006), Thin-Layer Chromatography, in Encyclopedia of Analytical

Chemistry, John Wiley & Sons, Ltd.

34. Shimizu Y., (1996), "Microalgal metabolites: a new perspective", Annual

review of microbiology, 50, pp. 431-65.

35. Simmons T.L., Andrianasolo E., Mcphail K., Flatt P., and Gerwick W.H,

(2005), "Marine natural products as anticancer drugs", Molecular cancer

therapeutics, 4(2), pp. 333-42.

36. Smith C.D., Zhang X., Mooberry S.L., Patterson G.M., and Moore R.E., (1994),

"Cryptophycin: a new antimicrotubule agent active against drug-resistant

cells", Cancer research, 54(14), pp. 3779-84.

37. Subramaniyan Vijayakumar M.M., (2015), "Pharmaceutical applications of

cyanobacteriad-A review", 5(1), Journal of Acute Medicine, pp.1-9.

38. Vasas G., G. Borbely, P. Nanasi, and P.P. Nanasi, (2010), "Alkaloids from

cyanobacteria with diverse powerful bioactivities", Medicinal Chemistry,

10(10), pp. 946-55.

39. Voigt W., (2005), "Sulforhodamine B assay and chemosensitivity", Molecular

Medicine, 110, pp. 39-48.

40. Wipf P., Reeves J.T. and Day B.W., (2004), "Chemistry and biology of curacin

A", Current pharmaceutical design, 10(12), pp. 1417-37.

41. Zakhia F., Jungblut A.J., Taton A.,Vincent W.F., and Wilmotte A., (2008),

“Cyanobacteria in Cold Ecosystems”, Psychrophiles: from Biodiversity

to Biotechnology, pp. 121-135