CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CHLORAMPHENICOL TRONG THỦY SẢN

8/10/2019 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CHLORAMPHENICOL TRONG THỦY SẢN

http://slidepdf.com/reader/full/cac-phuong-phap-xac-dinh-du-luong-chloramphenicol-trong-thuy 1/32

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

TIỂU LUẬN PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CÔNG CỤ

Đề tài:

CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH

DƢ LƢỢNG CHLORAMPHENICOL TRONG THỦY SẢN

GVHD: TS. Huỳnh Khánh Duy

HV: Nguyễn Thị Bích Duyên

MSHV: 13050181

Lớp: Cao học 2013

TP. Hồ Chí Minh - 2013

WWW.DAYKEMQUYNHON.COM

WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M



Tiểu luận PP -PTCC Ng uyễn Thị Bích Duyên

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC .................................................................................................................. i

MỞ ĐẦU ................................................................................................................... v

Chƣơng 1 TỔNG QUAN VỀ CHLORAMPHENICOL ........................................... 1

1.1 Tính chất hóa lí ................................................................................................ 2

1.2 Nguồn gốc: ...................................................................................................... 2

1.3 Phân bố ............................................................................................................ 2

1.4 Cơ chế kháng khuẩn ........................................................................................ 3

1.5 Tác dụng và tác hại:......................................................................................... 3

1.5.1 Tác dụng ................................................................................................... 3

1.5.2 Tác hại ...................................................................................................... 3

1.6 Tiêu chuẩn ....................................................................................................... 4

Chƣơng 2 CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CAP TRONG THỦY

SẢN ........................................................................................................................... 5

2.1. Tổng quan về sự phát triển của những phƣơng pháp phân tích lƣợng dƣ CAP

trong thủy sản ........................................................................................................ 6

2.2 Sắc kí lỏng (LC) .............................................................................................. 7

2.2.1 LC/APCI/MS[3]

........................................................................................ 7

2.2.1.1Chuẩn bị mấu ...................................................................................... 7

2.2.1.2 Cài đặt thiết bị .................................................................................... 7

2.2.1.3 Kết quả ............................................................................................... 8

2.2.2 LC/MS/MS[7]

........................................................................................... 8

2.2.2.1Thiết bị: ............................................................................................... 8

2.2.2.2 Điều kiện phân tích: ........................................................................... 8

2.2.2.3 Kết quả: .............................................................................................. 9

2.2.3 LC/MS/MS ESI (-)[2]

.............................................................................. 10

2.2.3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu.................................................................... 10

2.2.3.2 Điều kiện thiết bị .............................................................................. 11

2.2.3.3 Kết quả: ............................................................................................ 12

2.3 Sắc kí khí (GC) .............................................................................................. 15

2.3.1 GC/MS/MS[1]

......................................................................................... 16



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




ii

2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu ................................................................................... 16

2.3.1.2 Thông số ........................................................................................... 17

2.3.1.3 Kết quả ............................................................................................. 18

2.4. Phƣơng pháp Kít Elisa [4]

: ............................................................................. 19

2.4.1 Tóm tắt quy trình .................................................................................... 19

2.4.2 Kết quả: ................................................................................................... 20

2.4.3 Kết luận ................................................................................................... 24

2.4.4 Ƣu và nhƣợc điểm .................................................................................. 24

KẾT LUẬN ............................................................................................................. 25

TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 26



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




iii

Danh mục hình ảnh

Hình 1. 1: Cấu trúc phân tử CAP .............................................................................. 2

Hình 2. 1: Kết quả phân tích CAP ............................................................................ 8

Hình 2. 2: Đường chuẩn CAP (0.1 – 1 ppb) ............................................................. 9

Hình 2. 3: Phổ đồ ioin m/z 151.9 ở nồng độ CAP ................................................... 10

Hình 2. 4: Phân tích CAP (5 ng/mL) ....................................................................... 12

Hình 2. 5: Lượng thấp nhất (0.1 ng/mL hoặc 0.01 ng/g của mô tôm) của tiêu chuẩn

chiết của CAP (321.2/152) và tiêu chuẩn nội chuẩn (326/157). ............................ 13

Hình 2. 6: Đường cong tiêu chuẩn CAP từ 0.1 ng/mL đến 200 ng/mL. ................. 14

Hình 2. 7: Đường cong hiệu chuẩn chiết xuất tuyến tính trong khoảng nồng độ từ

0.1 đến 200 ng/mL (0.01 đến 20 ng/g tôm) với giá trị R2 = 0.9997 ........................ 14

Hình 2. 8: Quy trình chuẩn bị mẫu ......................................................................... 16

Hình 2. 9: Nguyên tắc phân mảnh của CAP -TMS ether trong chế độ NCI: (1) m/z

304, (2) m/z 322; (3) m/z 358; (4) m/z 394; và (5) m/z 430 .................................... 18

Hình 2. 10: Xác định CAP ....................................................................................... 18

Danh mục bảng biểu Bảng 1. 1: Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của CAP ................... 4

Bảng 2. 1: Sự phát triển của những phương pháp phân tích dư lược CAP trong

thủy sản ..................................................................................................................... 6

Bảng 2. 2: Thông số GC cho việc phân tích CAP bằng GC -MS 2 ........................... 17

Bảng 2. 3: Thông số khối phổ cho phân tích CAP bằng GC -MS 2 .......................... 17

Bảng 2. 4: Kết quả tỉ lệ dương tính giả trên các mẫu ............................................. 19

Bảng 2. 5: Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỉ lệ dương giả

................................................................................................................................. 20

Biểu đồ 2. 1: Mẫu tôm ............................................................................................ 21

Biểu đồ 2. 2: Cá fillet .............................................................................................. 22

Biểu đồ 2. 3: Mẫu nhuyễn thể ................................................................................. 22

Biểu đồ 2. 4: Mẫu ghẹ, cua ..................................................................................... 22



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




iv

Biểu đồ 2. 5: Mẫu thủy sản tẩm bột ........................................................................ 23

Biểu đồ 2. 6: Mẫu chả giò, há cảo ........................................................................... 23

Biểu đồ 2. 7: Mẫu đồ khô ........................................................................................ 23

Ký hiệu

ACPI: atmospheric pressure chemical ionization

ECD: đầu dò cộng kết điện tử

ESI: ion electronspray

ESI (-): negative ion electronspray

GC: sắc kí khí

LC: sắc kí lỏng

LOD: giới hạn phát hiện

MS: khối phổ



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




v

MỞ ĐẦU

Chloramphenicol (CAP) có đặc tính kháng khuẩn nên thƣờng đƣợc sử dụng

để chữa bệnh trong tôm và đƣợc sử dụng trực tiếp để bảo quản nguyên liệu. Tuy

nhiên, việc sử dụng CAP không đúng cách gây ra hiện tƣợng kháng thuốc và tích

tụ trong thủy sản gây nên những nguy hiểm cho sức khỏe con ngƣời. Hiện nay, ở

Việt Nam đã có nhiều loài thủy hải sản đã bị cảnh báo và cấm xuất khẩu do sử

dụng CAP quá liều lƣợng.

Vì vậy việc xác định CAP trong thủy sản là cần thiết để tránh gây tác hại

cho ngƣời tiêu dùng.

Trong tiểu luận này, em xin trình bày về “Những phƣơng pháp xác định

hàm lƣợng Chlorophenicol trong thủy sản”



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




1

Chƣơng 1

TỔNG QUAN VỀ CHLORAMPHENICOL



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




2

1.1 Tính chất hóa lí CAP có tên khoa học là: 2,2-dicholoro-N-[(1R,2R)-2-hydroxy-1-

(hydroxymethyl)-2-(4-nitrophenyl)ethyl] acetamide.

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử CAP Công thức phân tử: C11H12Cl2 N2O5

CAP là chất độc màu trắng hoặc có ánh vàng với tinh thể hình kim hoặc

phiến dài, không mùi, vị rất đắng. Tính tan: tan tốt trong những dung môi phân cực

nhƣ cồn 96%, propylen gylocol, rất dễ tan trong aceton và ethylacetat, khó tan

trong nƣớc. Độ bền: dung dịch CAP bền vững trong môi trƣờng hơi acid hay trung

tính, bền vững với nhiệt độ (chịu nhiệt đến 1000C)

1.2 Nguồn gốc: Năm 1947 Burlcholder đã phát hiện ra CAP từ môi trƣờng nuôi cấy xạ

khuẩn có tên là Streptomyces Veneduela. Chỉ hai năm sau ngƣời ta đã tổng hợp

đƣợc kháng sinh này. Dƣới tác động của của quá trình chuyển hóa, CAP có thểchuyển hóa thành dạng D-threo-2-amino-(p-nitrophenyl)-1,3-propanediol và dạng

D-glucuronide. Gần 90% lƣợng CAP sẽ bài tiết bằng đƣờng niệu dƣới dạng chuyển

hóa, 15% bài tiết dƣới dạng ban đầu.

1.3 Phân bố

CAP đƣợc phân bố rộng khắp trong cơ thể từ tim, gan, phổi thận, lá lách,

huyết thanh, huyết tƣơng đến dịch màng phổi, dịch cổ trƣớng, tinh dịch, nƣớc bọt,nƣớc tiểu. Nó có khả năng thẩm thấu nhanh qua dạ dày và phân tán nhanh trong cơ

thể. CAP cũng rất dễ hấp thụ vào cơ thể nên khi dùng CAP chữa bện hoăc thêm

vào thức ăn gia súc sẽ tồn dƣ trong thịt, sữa, trứng.

Khi thải vào môi trƣờng, CAP hiện diện dƣới dạng thể khí là chủ yếu. CAP

phát tán trong không khí chủ yếu bởi lắng khô, bám trên các lớp trầm tích và chất

lắng sinh học sống trong nƣớc. Khả năng thay đổi của CAP trong đất cao nhƣng nó

không bốc hơi, kể cá đất khô lẫn đất ẩm. Dƣới tác động phân giải của vi sinh vật,



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




3

CAP có thể bị phân giải trong đất và nƣớc. CAP cũng bị phân giải bởi các vi sinh

vật đƣờng ruột theo đƣờng phân hủy thành gốc amine . Sự hấp thu và bài tiết: CAP

đƣợc hấp thu qua hệ tiêu hóa, và đƣợc đƣợc bài tiết chủ yếu qua thận.

1.4 Cơ chế kháng khuẩn

CAP có thể xâm nhập vào tế bào vi khuẩn và gắn với phần 50S của

Ribosom ức chế tổng hợp protein làm cho vi khuẩn không tổng hợp đƣợc protein

dẫn đến yếu đi và chết. Trong vi lập thể của động vật có vú cũng có Ribosom 50S

nên sẽ bị ảnh hƣởng. Điều này lý giải độc tính cao của CAP.

1.5 Tác dụng và tác hại:

1.5.1 Tác dụng

CAP là kháng sinh có hoạt phổ rộng, tác dụng lên phần lớn các vi khuẩn và

một số loại virut. CAP có nhiều khả năng kháng khuẩn hơn Peniciline và

Steptomycine, diệt đƣợc nhiều loai vi khuẩn Gram dƣơng và Gram âm, xoắn khuẩn

Ricketsia và với cả những vi khuẩn đã kháng Peniciline và Streptomycine.

Ở ngƣời, CAP đƣợc dùng để chữa thƣơng hàn, viêm não, ít đƣợc dùng cho

các trƣờng hợp khác do độc tính cao. Ngoài ra, CAP còn đƣợc bổ sung vào thuốc

mỡ bôi mắt nhằm điều trị bệnh nhiễm trùng mắt nhƣ viêm kết mạc, viêm giác mạc

hoặc có trong thành phần thuốc mỡ bôi cục bộ để điều trị vết thƣơng ngoài da và

tai. Đôi khi CAP đƣợc điều chế ở dạng viên uống hoặc có thể tiêm vào tĩnh mạch

trị các bệnh.

Trong thú y, CAP đƣợc cho vào thức ăn của gia súc để phòng bệnh và cho

vào môi trƣờng sống để chữa bệnh.

Tuy nhiên, do có một số hiệu ứng phụ không mong muốn nên việc ứngdụng CAP trong điều trị có xu hƣớng giảm dần.

1.5.2 Tác hạiKhi sử dụng trong chăn nuôi, một phần kháng sinh chƣa đào thải sẽ tồn dƣ

sang sản phẩm thực phẩm và một lƣợng đáng kể trong thức ăn thừa sẽ thoát ra và

lắng động vào môi trƣờng, theo thời gian có thể dẫn tới các biến đổi về hệ sinh

thái. Vì CAP có thể tồn tại lâu trong thực phẩm , khi thƣờng xuyên sử dụng thực

phẩm này, con ngƣời có thể gặp những nguy cơ nhƣ: hệ sinh vật cũng nhƣ quá



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




4

trình tổng hợp vitamin ở ruột bị thay đổi làm cho các vi khuẩn gây bệnh lờn thuốc.

Do đó muốn tiêu diệt đƣợc cần phải có liều kháng sinh càng ngày càng cao khiến

ngƣời bị nhiễm bệnh ngày càng nặng hơn, khó chữa trị hơn. Ngoài ra, CAP đi vào

cơ thể trẻ sơ sinh có thể gây ra triệu chứng xanh tái dần rồi trị tim mạch và tử vong(do chƣa có đủ men gan để khử CAP); suy tủy, phá hủy cấu trúc tủy xƣơng dẫn

đến thiếu máu, có thể dẫn đến tử vong; có thể tƣơng tác với AND, ARN dẫn đến

những sai lệch về di truyền; gây bạch cầu, giảm hồng cầu, sự thay đổi thành phần

máu xảy ra nếu hàm lƣợng CAP trong máu lớn hơn 25µg/ml; gây viêm lƣỡi, miệng

do thiếu vitamin B2 và PP, bồn nôn, ói, tiêu chảy .

Vì vậy việc xác định CAP trong thủy sản là cần thiết để tránh gây tác hại

cho ngƣời tiêu dùng.

1.6 Tiêu chuẩn

Bảng 1. 1: Yêu cầu của các thị trường về giới hạn phát hiện của CAP Kháng sinh Kí hiệu Giới hạn phát hiện tối thiểu

EU Mỹ Nhật Chloramphenicol CAP 0.3 ppb 0.3 ppb 0.5 ppb



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




5

Chƣơng 2

CÁC PHƢƠNG PHÁP

XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CAP TRONG THỦY SẢN



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




6

2.1. Tổng quan về sự phát triển của những phƣơng pháp phân tích lƣợng dƣCAP trong thủy sản

Bảng 2. 1: Sự phát triển của những phương pháp phân tích dư lược CAP trong thủy sản

Phƣơng pháp Thực phẩm nền LOD (µg/kg) Tham khảo

LC-MS Một số loài thủy sản 0.1 Van de Riet (1992)

GC-ECD Tôm 1 Munns (1994)

LC-MS/MS ESI (-) Tôm <0.5 Pfenning (2002b)

LC-MS/MS Tôm 0.08 Neuhaus (2002)

GC-ECD Tôm 0.05 Ngoc Son (2002)

GC(NCI)-MS Tôm 0.3

LC-MS/MS APCI (-) Tôm 0.1

GC-MS/MS Tôm 0.1 Impens (2003)

LC-MS/MS (ESI) Tôm, cua 0.1 Storey (2003)

Sự phát triển của đầu dò ion hóa áp suất khí quyển (atmospheric pressure

ionization - API) kết hợp với HPLC đã trở thành kĩ thuật đáng tin cậy và phổ biến

nhất trong phân tích lƣợng dƣ CAP. Sự kết hợp này của sắc kí lỏng và khối phổ

(LC-MS) có thể định tính và định lƣợng những hợp chất phân cự c không bay hơi

(nhƣ CAP) mà không cần đồng phân hóa.

Neuhaus và những cộng sự đã mô tả phƣơng pháp LC-MS/MS với LOD

0.08 µg/kg và LOQ 0.3 µg/kg trong tôm. Mottier và những cộng sự đã phát triển

phƣơng pháp dùng LC(ESI)-MS/MS cho thủy sản với giá trị LOD và LOD tƣơng

ứng là 0.003 µg/kg và 0.01 µg/kg.

Impens và những cộng sự đã mô tả phƣơng pháp sàn lọc bằng ELISA và

xác định dƣ lƣợng CAP bằng GC-MS/MS và LC-MS/MS cả hai kĩ thuật đều cho

LOD là 0.1 µg/kg.

Ngày nay, GC-MS và LC-MS/MS là kĩ thuật đáng tin cậy nhất để xác định

dƣ lƣợng CAP trong thủy sản nói riêng và trong mô động vật nói chung.



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




7

2.2 Sắc kí lỏng (LC)

2.2.1 LC/APCI/MS[3]

2.2.1.1Chuẩn bị mấu

1.

Cân 5 g thịt cá và 5 g sodium sulfate

2. Thêm 10 mL ethyl acetate

3. Đồng nhất trong 20 giây

4. Ly tâm mẫu trong 5 phút tại 6000 rpm

5. Tách cặn và lặp lại bƣớc 2 đến 4

6. Kết hợp 2 dung dịch chiết từ ethyl acetate và sấy khô với rotovap tại 400C

7. Hoàn nguyên vớ i 1 mL acetonitrile, thêm 1 mL, lắc và loại bỏ lớp hexane

8. Thêm 1 mL hexane khác, lắc và loại bỏ lớp hexane

9. Sấy khô acetonitrile và hoàn nguyên với 10% acetonitrile trong 10mM

ammonium acetate

10. Lọc vào lọ đựng mẫu tự động

2.2.1.2 Cài đặt thiết bị * Điều kiện LC

Cột: Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18, 3x 150 mm, 5 µm

Dung môi A: Nƣớc với 10 mM ammonium acetate

Dung môi B: Methanol

Gradient: 90/10 A/B 15 phút đến 70/30A/B

Nhiệt độ cột: 400C

Thể tích mẫu: 20 µL

Tốc độ dòng: 0.5 mL/phút

* Điều kiện MSD

Ion hóa: APPI (Negative)

Chế độ quét: 100-400 m/z cho sự tối ƣu hóa

SIM ion: 321 m/z (M-H)-

Nhiệt độ hóa hơi: 3500C



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




8

2.2.1.3 Kết quả

Hình 2. 1: Kết quả phân tích CAP

2.2.2 LC/MS/MS[7]

2.2.2.1Thiết bị: Hệ thống máy LC/MS/MS gồm thiết bị sắc ký lỏng (Dionex Ultimate 3000)

kết nối với đầu dò khối phổ ba tứ cực (Bioapplied System Qtrap 4000); bộ bơm

mẫu tự động; cột sắc ký pha đảo Phenomenex Aqua 5u C18 125A, 50x2mm và cột

bảo vệ pha đảo Phenomenex.

2.2.2.2 Điều kiện phân tích:

* Điều kiện HPLC:

Cột sắc ký Phenomenex Aqua 5u C18 125A, 50x2 mm

Tốc độ dòng: 0,35 - 0,4 ml/phút

Pha động: A (H2O): B (MeOH) theo chƣơng trình gradient

Nhiệt độ cột: 25

0

CThể tích bơm mẫu: 20 µL.



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




9

* Điều kiện đầu dò MS/MS:

Nguồn tạo ion Turbo Spray

Kiểu tạo ion âm, kiểu scan: MRM

Điện thế ion hóa: 4200V

Nhiệt độ ống mao quản: 5000C

2.2.2.3 Kết quả:

* Định lượng CAP dựa trên phân mảnh ion:

CAP đƣợc xác nhận dựa trên phân ion phân tử m/z=321; hai ion xác nhận

m/z = 151,9 và m/z=256,9; và chúng đƣợc định lƣợng dựa trên m/z = 151,9.

Đường chuẩn định lượng CAP

Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng dựa trên 6 điểm chuẩn với các nồng độ chuẩn

0.1 ppb; 0.2 ppb; 0.3 ppb; 0.4 ppb; 0.5 ppb; 1 ppb.

Hình 2. 2: Đường chuẩn CAP (0.1 – 1 ppb)



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




10

Hình 2. 3: P hổ đồ ioin m/z 151.9 ở nồng độ CAP Phƣơng trình đƣờng chuẩn y = 23596 x + 1270.2; đƣờng chuẩn có hệ số

tƣơng quan R 2= 0.9939; giới hạn định lƣợng của phƣơng pháp là 0.03 ng/g, hiệu

suất thu hồi của phƣơng pháp 87.93 – 116.80 %

2.2.3 LC/MS/MS ESI (-)[2]

2.2.3.1 Quy trình chuẩn bị mẫu

Mẫu tôm đƣợc chuẩn bị nhƣ sau:

1. Đồng nhất mẫu: 100 g tôm đƣợc rã đông, thêm nƣớc và xay bằng máy xay

sinh tố

2. Cân 5 g mẫu tôm đã đƣợc đồng nhất cho và ống polypropylene 15 mL

3. Thêm 50 µL dung dịch nội chuẩn CAP – d5 (ISTD) và khuấy trộn kỹ để

đảm bảo sự phân bố đồng đều của ISTD trong mẫu.

4. Thêm 2 mL nƣớc và khuấy trôn kỹ

5. Thêm 5 mL ethyl acetate. Cho vào ống để khuấy cơ và khuấy kĩ khoảng 30

phút

6. Ly tâm ở 7000 rpm trong 15 phút

7. Chuyển phần nổi trên bề mặt vào ống polypropylene 15 mL

8. Thêm 5 mL Ethyl acetate vào tissue pellet ở bƣớc 7 và lập lại quy trình

chiết.



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




11

9. Sấy bã dƣới khí N2 ở 550C

10. Hoàn nguyên với 300 µL methanol và pha loãng thành 10 mL với nƣớc.

Tại thời điểm này, mẫu đã sẵn sàng để chiết pha rắn (SPE)

2.2.3.2 Điều kiện thiết bị * SPE

Cartridge: Strata – X

Điều kiện: 3 mL Methanol (1-2 mL/phút)

Cân bằng: 3 mL nƣớc (1-2 mL)

Nạp: Trích 10mL mẫu mô tôm (1 mL/phút)

Rửa: 3 x 1 mL nƣớc

Sấy: >10’’ Hg trong 5-10 phút để loại bỏ lƣợng nƣớc dƣ

Chiết: 3 x 1.0 mL Ethyl acetate (1mL/phút)

Dry down: khí N2 ở 550C

Hoàn nguyên: 500 µL Acetonitrile/ nƣớc (20:8)

* Điều kiện LC-MS/MS

Cột: Kinetex 2.6 µm C18, 50 x 2.1 mm

Pha động: A: 5mM Ammonium bicarbonate, B: Acetonitrile

Gradient:

Time B (%)

0.00 5

2.00 5

2.01 95

4.50 95

Tốc độ dòng: 0.4 mL/phút

Thể tích tiêm: 0.4 mL/phút

Nhiệt độ: 250C

Mẫu: 1. CAP, 2 CAP-d5

Đầu dò: API 4000~ MS/MS, ESI-

Chế độ quét: MRM

Nhiệt độ: 45

0

Mẫu: 1. Chloramphenicol



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




12

2. Chloramphenicol-d5

2.2.3.3 Kết quả: Việc sử dụng kỹ thuật Kinetex ® cho phép việc rửa giải rất nhanh của CAP

ở 2.15 phút (hình 2.4). Trong chế độ ESI, CAP đƣợc phát hiện bằng việc quan sát

sự chuyển đổi khối lƣợng 321.2/152 và chất nội chuẩn CAP-d5 bằng việc quan sát

sự chuyển đổi khối lƣợng 326.0/157.0. Sự chuyển đổi khối lƣợng 321.2/152 đƣợc

chọn cho việc định lƣợng bởi vì m/z 152 cho cƣờng độ ion sản phẩm mạnh nhất. sự

chuyển đổi khối lƣợng 321.2/257.2 cung cấp sản phẩm ion lớn thứ 2 và đƣợc chọn

cho việc xác nhận.

Hình 2. 4: Phân tích CAP

Một đỉnh tạp chất, tách tại 3.0 phút, đƣợc thu trong các mẫu tôm chiết xuất

nhƣng đƣợc tách ra một cách dễ dàng với peak CAP (hình 2 .5). Sự hiện diện của

peak tạp chất tƣơng tự đã đƣợc báo cáo trƣớc đây bởi USFDA6. Tuy nhiên, với kĩ

thuật vỏ-lõi Kinetex và những điều kiện sử dụng ở đây, tạp chất đƣợc tách tốt và

không nhiễu vào lƣợng CAP. Một lợi ích khác so với phƣơng pháp USFDA là thời

gian chu kì LC ngắn hơn một cách đáng kể (4.5 phút so với 20.5 phút), cho phép

tăng đáng kể công suất và hiệu suất.



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




13

Hình 2. 5: Lượng thấp nhất (0.1 ng/mL hoặc 0.01 ng/g của mô tôm) của tiêu chuẩn chiếtcủa CAP (321.2/152) và tiêu chuẩn nội chuẩn (326/157).

Mũi tạp chất tách tại 3.0 phút đƣợc tách tốt khỏi CAP và không ảnh hƣởng

đến việc định lƣợng. 0.1 ng/g CAP trong tôm dùng ống Strata-X SPE và cộtKinetex C18 LC

Đƣờng cong hiệu chuẩn tiêu chuẩn đƣợc dựng trong khoảng nồng độ từ 0.1

ng/mL đến 200 ng/mL bằng cách vẽ tƣơng đối (diện tích mũi của CAP/ diện tích

mũi của IS) so với nồng độ. Khoảng nồng độ này tƣơng ứng từ 0.1 ng/g – 20 ng/g

(0.01 – 20 ppb) trong mô tôm. Đƣờng cong hiệu chuẩn tiêu chuẩn thì tuyến tính

trong khoảng hiệu chuẩn với giá trị của R 2 = 0.9998 (hình 2.6). Tại mức nông độ

tiêu chuẩn thấp nhất (0.1 ng/mL) tín hiệu nhiễu là 115.9 (hình 2.5), vì vậy giới hạn

định lƣợng (LOQ) đƣợc ƣớc lƣợng là ≤ 0.01 ng/mL, điều này tƣơng ứng từ ≤ 0.001

ng/g trong tôm hoặc ≤ 0.001 ppb.



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




14

Hình 2. 6: Đường cong tiêu chuẩn CAP từ 0.1 ng/mL đến 200 ng/mL. Ion định lƣợng đƣợc dùng là 321.2/152. Phƣơng trình tuyến tính y =

0.2663x + 0.2169 với R 2 = 0.9998

Hình 2. 7: Đường cong hiệu chuẩn chiết xuất tuyến tính trong khoảng nồng độ từ 0.1 đến200 ng/mL (0.01 đến 20 ng/g tôm) với giá trị R2 = 0.9997

Kết quả thu đƣợc từ phƣơng pháp này thì tốt hơn so với những phƣơng pháp

đƣợc cháp nhận hiện nay bởi USFDA do LOQ là 0.001 ng/g (0.3 ppb) và LOD là

0.08 ng/g (0.08 ppb). Dựa trên đƣờng cong hiệu chuẩn tiêu chuẩn, phƣơng pháp

này cung cấp LOQ 0.001 ng/g (0.001 ppb) thấp hơn 300 lần so với báo cáo từ

những phƣơng pháp của USFDA.



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




15

2.3 Sắc kí khí (GC)

Sự hiện diện của những nhóm chức phân cực trong phân tử CAP đòi hỏi cần

có 1 giai đoạn đồng phân hóa, thƣờng là thông qua phản ứng sylic hóa trƣớc khi

phân tích sắc kí khí. Việc đính thêm những nhóm chức đặc trƣng trên phân tử CAPcó thể làm giảm LOD của đầu dò ECD và MS. Phản ứng sylic hóa thƣờng đƣợc

xúc tác bởi axit hoặc bazơ. Những tác chất thƣờng đƣợc dùng để sylic hóa bao

gồm:

- Hỗn hợp của hexamethyldisilazane (HMDS), trimethylchlorosilane

(TMCS) và pyridine

- N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamide (BSTFA)

- Hỗn hợp của BSTFA và TMCS

- N-methyl-N-trimethylsilyl-trifluoroacetamide (NSTFA)

Đầu dò ECD đƣợc sử dụng rộng rãi để phân tích CAP. Phƣơng pháp GC-

ECD cho phân tích CAP trong cơ tôm có LOD là 1 µg/kg (Munns, 1994)

GC kết hợp với MS, những kĩ thuật ion hóa thông dụng nhất là ion hóa hóa học

(CI) và electron impact (EI)

Ion hóa hóa học âm (NCI) cho số lƣợng mảnh vỡ ít. Tuy nhiên, ion phân tử

luôn nằm trong vùng phổ. Nhờ sự hiện diện của hai nguyên tử Chlorine trong phân

tử CAP, GC-MS trong NCI là một trong những kĩ thuật đáng tin cậy nhất, nó cũng

là phƣơng pháp thông dụng nhất cho việc xác định lƣợng dƣ của CAP. GC-MS

trong EI là chế độ ít nhạy nhất. Tuy nhiên, nó tạo phổ của những phân mảnh, vì

vậy có thể lƣu trữ dữ liệu điện tử cho mục đích tham khảo.



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




16

2.3.1 GC/MS/MS[1]

2.3.1.1 Chuẩn bị mẫu

Phân tích GC-MS2

Hình 2. 8: Quy trình chuẩn bị mẫ u Bên cạnh phát hiện với MS trong chế độ EI, CAP cũng có thể đƣợc xác định

bằng cách dung kĩ thuật ion hóa mềm NCI. Bởi vì nguyên tử Cl trong cấu trúc

phân tử, dẫn đến việc làm giảm giới hạn phát hiện so với việc cùng EI



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




17

2.3.1.2 Thông số

Bảng 2. 2: Thông số GC cho việc phân tích CAP bằng GC -MS 2

Thông số GC

Chia dòng/ không chia dòng (chế độ không chia dòng)

Nhiệt độ

Tốc độ chia

Van chia đóng tại

Van chia mở tại

Chương trình nhiệt độ GC

Nhiệt độ ban đầu

Đoạn 1

Đoạn 2

Khí mang

Dòng cột

2600C

60 ml min-1

-0,10 min

1.00 min

900C (giữ 1 phút)

2800C (20

0C min

-1)

2800C (giữ 15 phút)

Helium

0.91 ml min-1

Bảng 2. 3: Thông số khối phổ cho phân tích CAP bằng GC -MS 2

Thông số GCQ plus

Nhiệt độ nguồn ion

Nhiệt độ chuyển dòng

Khí tinh khiết (ion hóa hóa học âm)

Dòng khí tinh khiết

2000C

2750C

Methane

0.3 ml min-1



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




18

2.3.1.3 Kết quả

Hình 2. 9: Nguyên tắc phân mảnh của CAP -TMS ether trong chế độ NCI: (1) m/z 304, (2)m/z 322; (3) m/z 358; (4) m/z 394; và (5) m/z 430

Sau khi đồng phân hóa với MSTFA thành Chloramphicol-trimethylsilyl

ether (CAP-TMS) và hòa tan trong Toluene, giới hạn phát hiện là 0.005 ng µl -1có

tỷ lệ tín hiệu/nhiễu nhỏ nhất và bằng 3. Nguyên tắc phân mảnh của CAP-TMS

đƣợc giải thích trong khối phổ, nhƣ hình 2.9.

Hình 2. 10: Xác định CAP

Mặc dù thời gian đồng phân hóa không phải rất quan trọng, nhƣng kết quảtối ƣu thu đƣợc sau 90 phút. Thật quan trọng để phân tích mẫu trong vòng 24 giờ



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




19

sau khi đồng phân hóa. Bởi vì TMS ether dễ bay hơi, sự bay hơi của MSTFA sau

khi đồng phân hóa rất quan trọng và không kéo dài hơn 8 phút. Khi phân tích trong

chế độ quét toàn bộ GC-MS2m/z 304, 322, 358, 394 và 340 đặc trƣng cho CAP

2.4. Phƣơng pháp Kít Elisa [4]:

Phƣơng pháp phân tích dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên – kháng thể

(Enzyme – Linked Immunosorbent Assay (ELISA)) là một công cụ hiệu quả cho

mục đích thử nghiệm sàn lọc. Tuy nhiên, có những yêu cầu khắt khe về LOD và độ

không đảm bảo đo và các tỷ lệ dƣơng tính giả và âm tính giả của xét nghiệm.

2.4.1 Tóm tắt quy trình

Kít thử ELISA: Kít thử của các hang R -Biopharm và TAPB

Quy trình chuẩn bị mẫu: Dƣ lƣợng CAP trong 3 g mẫu đƣợc trích ly bằng 6

mL ethyl acetate. Dịch chiết đƣợc cô đến khô ở 500C dƣới dòng N2. Cặn khô đƣợc

hòa tan trong 1 mL đệm và làm sạch bằng 1 mL hexan. Hàm lƣợng CAP trong dịch

chiết đƣợc phân tích với kít thử ELISA

Bảng 2. 4: Kết quả tỉ lệ dương tính giả trên các mẫu

Quy trình thử nghiệm với ELISA: qui trình xác định hàm lƣợng CAP trong

dịch chiết trên ELISA tuân thủ theo đúng hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Mỗi loạt thử

nghiệm đều có kèm theo mẫu chứng âm và chứng dƣơng để kiểm soát chất lƣợng

kết quả thử

Giới hạn phát hiện: 0.1ppb



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




20

2.4.2 Kết quả: Tỷ lệ dƣơng tính giả trên ELISA

Trong tổng số 13.418 mẫu thủy sản các loại đã qua phân tích sàn lọc bằng

ELISA thì có 167 mẫu là dƣơng tính giả, chiếm 1.3% tổng số mẫu đã phân tích.Điều này cho thấy, ELISA là một công cụ hữu hiệu cho việc sàn lọc các mẫu thủy

sản đối với chỉ tiêu CAP.

Tỉ lệ dƣơng tính giả đối với nhóm sản phẩm thủy sản tẩm bột (tôm, cá, mƣc

tẩm bột), chả giò – há cảo là khá cao (12.2% và 13.8%) so với các đối tƣợng mẫu

thủy sản cùng loại ở dạng chƣa phối chế (tôm, cá, mực, ghẹ) (≤ 1.5%). Điều này

cho thấy lƣợng tinh bột có trong mẫu phân tích có ảnh hƣởng đáng kể đến độ chính

xác của xét nghiệm ELISA. Hiện tƣợng dƣơng tính giả là do phản ứng không đặchiệu của kháng thể với các chất nền trong dịch chiết. Trong trƣờng hợp này có thể

rút ra nhận xét rằng tinh bột có trong mẫu là tác nhân chính dẫn đến phản ứng

không đặc hiệu và gây ra dƣơng tính giả.

Bảng 2. 5: Tương quan giữa nồng độ CAP xác định bằng ELISA và tỉ lệ dương giả

Tỉ lệ dƣơng tính giả đối với thủy sản khô cũng khá cao (18.2%), đặc biệtthƣờng có hiện tƣợng tạo nhũ trong giai đoạn làm sạch dịch chiết bằng hexan. Hiện



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




21

tƣợng này có lẽ do ảnh hƣởng của các chất phụ gia thêm vào để bảo quản hàng

thủy sản khô. Các sản phẩm dạng mắm gây ra một tỉ lệ dƣơng tính giả rất cao

(43.3%), cho thấy cần phải có quy trình xử lý mẫu chuyên biệt cho các đối tƣợng

này

Kết quả thực nghiệm về tƣơng quan giữa nồng độ CAP bằng ELISA và tỉ lệ

dƣơng tính giả đƣợc tổng hợp tại bảng 2.5. Với hàm lƣợng CAP có giá trị từ

0.3ppb trở lên, thì tỉ lệ dƣơng giả giảm mạnh, đặc biệt thủy sản tẩm bột (từ 18.2 %

còn 1.36%) và không có dƣơng giả đối với nhuyễn thể.

Với những kết quả nêu trên có thể đƣa ra nhận định rằng hiện tƣợng phát

hiện dƣơng giả trên xét nghiệm ELISA là phổ biến đối với tất cả các loại mẫu thủy

sản. Tuy nhiên mức độ ảnh hƣởng của nền mẫu tới kết quả của phép thử ELISA là

khác nhau giữa các loại thủy sản khác nhau. Ảnh hƣởng của nền mẫu đối với đối

tƣợng thủy sản khô, các loại thực phẩm dạng tẩm bột, phối chế (chả giò, há cảo…)

là rất đáng kể. Tuy nhiên ở hàm lƣợng phát hiện là > 0.3ppb tỉ lệ này là chấp nhận

đƣợc cho tất cả các loại nền mẫu khác nhau (ngoại trừ mắm).

* So sánh sự tƣơng đồng kết quả phân tích giữa ELISA và LC-MS/MS

Kết quả thực nghiệm trên các mẫu thủy sản nhiễm CAP của ELISA và LC-

MS/MS đƣợc trình bày trong các biểu đồ từ 2.1-2.7 Các giá trị hàm lƣợng CAP xác

định bằng ELISA và LC-MS/MS trên cùng một mẫu đƣợc thể hiện trên cùng một

cột.

Biểu đồ 2. 1: Mẫu tôm



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




22

Biểu đồ 2. 2: Cá fillet

Biểu đồ 2. 3: Mẫu nhuyễn thể

Biểu đồ 2. 4: Mẫu ghẹ, cua



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




23

Biểu đồ 2. 5: Mẫu thủy sản tẩm bột

Biểu đồ 2. 6: Mẫu chả giò, há cảo

Biểu đồ 2. 7: Mẫu đồ khô



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




24

Nhƣ thể hiện tại các biểu đồ 2.1-2.7, kết quả phân tích cho thấy giá trị hàm

lƣợng CAP phát hiện bằng ELISA (màu vàng) luôn cao hơn giá trị phát hiện bằng

LC-MS/MS (màu đỏ) đối với tất cả các loại mẫu thủy sản đã nghiên cứu. Điều này

một lần nữa thể hiện ảnh hƣởng của nhiễu nền của mẫu đến kết quả của ELISA.

2.4.3 Kết luận

Tỷ lệ dƣơng tính giả nói chung không cao cho các dạng mẫu thủy sản tƣơi

chƣa qua chế biến (0.5 – 1.5%) điều này cho thấy ELISA là một công cụ hữu hiệu

cho việc sàng lọc CAP với các đối tƣợng mẫu này. Tuy nhiên đối với nhóm thực

phẩm thủy sản phối chế, tỉ lệ dƣơng tính giả là rất đáng kể (12.5 – 43.3%) nên cần

lƣu ý khi tiến hành phân tích, đồng thời nó gây tăng số lƣợng mẫu cần phải kiểm

khẳng định bằng LC-MS/MS.

Với những kết quả nêu trên, phân tích khẳng định trên LC-MS/MS cho các

mẫu dƣơng tính trên ELISA vẫn rất cần thiết

2.4.4 Ƣu và nhƣợc điểm

* Ƣu điểm

ELISA là cách dễ dàng để sàn lọc cho mẫu thủy sản chứa CAP. Phƣơng

pháp này cho hiệu quả cao, nhanh, dễ dàng để xử lý, thậm chí giới hạn phát hiện

nhạy và cho phép phân thích một lƣợng lớn thể tích mẫu trong thời gian ngắn.

* Nhƣợc điểm [8]

Hàm lƣợng CAP phát hiện bằng ELISA luôn cao hơn giá trị phát hiện bằng

LC-MS/MS. Điều đó thể hiện ảnh hƣởng của cả nhiễn nền của mẫu đến kết quả

ELISA



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




25

KẾT LUẬN

Các phƣơng pháp phân tích sử dụng sắc ký có ghép khối phổ nhƣ GC -MS,

GC-MS/MS, LC-MS, LC-MS/MS đều đáp ứng đƣợc yêu cầu phân tích. Tuy nhiên,

những phƣơng pháp này không chỉ có chi phí cao về thiết bị, vận hành mà còn đòi

hỏi kỹ năng và trình độ của ngƣời kiểm nghiệm

Phƣơng pháp ELISA cho hiệu quả cao, nhanh chóng, nhạy và cho phép

phân tích một lƣợng lớn thể tích trong thời gian thể tích mẫu trong thời gian ngắn



W

W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M




TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Sandra Impens et al. “Screening and Confirmation of Chloramphenicol in

Shrimp Tissue using ELISA in Combination with GC-MS2 and LC-MS

2”,

Analytica Chimica Acta 480, pp.153-163, 2003.

[2] P.J. Koerner et al. Improved Analytical Method for the LC/MS/MS Analysis of

Chloramphenicol in Shrimp and Other Marine Food Products using Strata – X

Solid Phase Extraction Cartridges and Kinetex 2.6 µm Core-Shell Columns

[3] LC/MS Applications for Drug Residues in Foods

[4] Neuhaus et al. “Analysis of Chloramphenicol in Shirm, U.S. FDA” –

Laboratory Information Bullentin No. 4290, 18(9).

[5] Z. Yang et al. “Analysis of Chloramphenicol by Negative Ion Electrospray

LC/MS/MS”, No. 3.r2, 2003

[6] S.M. Raffi, T.V. Suresh, “Screening of Chloramphenicol in wild and cultured

shrimp Penaeus monodon by competive enzyme linked Immunosorbent assay,

Interational conference on chemical”, Biological and Environment Sciences,

Bangkok Dec. 2011

[7] T.D Nguyen et al. Ealuation of Elimination of Chloramphenicol in Shrimp

(Peanaeus monodon) under Experimental Coditions Using LC/MS/MS

[8] A.D. Nguyen et al. Đánh giá kết quả thử nghiệm dư lương Chloramphenicol

trong thủy sản bằng Kít Elisa thông qua phân tích khẳng định bằng LC -MS/MS

[9] Wongtavatchai et al. “Who Food Additives series: 53, Chloramphenicol”.

[Online] Dec.11, 2013, http://www.inchem.org/documents/jecfa/jecmono/v53je03.htm


W

W

D

Y

K

E

M

QU

Y

N

H

O

N

U

C

O

Z

CO

M

http://www.inchem.org/documents/jecfa/jecmono/v53je03.htm




Documents

CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG CHLORAMPHENICOL TRONG THỦY SẢN