Embed Size (px)
Citation preview
211
ESTANDARIZACIÓN DE MEDICIÓN CERCANA DE REFLECTANCIA EN HOJAS DE
Carica papaya L. INFECTADAS CON PRSV-p
Alejandro del Jesús Trejo Pérez34*, Juan Antonio Villanueva Jiménez34, José López Collado34,
Mónica de la Cruz Vargas Mendoza34 y Luis René Sagredo Hernández35
Resumen
La detección oportuna es un paso importante para el control de enfermedades
vegetales que afectan los rendimientos de producción del cultivo de papayo Carica
papaya L. Los equipos espectrorradiométricos (ESPC) que miden reflectancia (RF)
son un método emergente no invasivo para la detección de enfermedades en
plantas. El objetivo fue establecer una metodología para la estandarización de
tomas de lecturas de RF en hojas de C. papaya infectada con el Virus de la Mancha
Anular del Papayo (PRSV-p). Las lecturas de RF consideraron el ángulo de posición
del ESPC, el área de la muestra, la distancia entre la muestra y el lente de colimación
del ESPC, el horario de toma de lecturas de RF y la calibración del equipo. Se
analizaron las lecturas de RF de dos grupos de plantas (sanas e infectadas con PRSV-
p), y se encontraron diferencias entre los dos grupos en la región visible (VIS) (>400-
700 nm) y la región del borde rojo RE (>640-740 nm) del espectro electromagnético.
Los datos obtenidos por el STS-VIS pueden ser más homogéneos, que cuando no se
toman en cuenta las variables antes mencionadas para la toma de lecturas de RF
en plantas de invernadero. Así, la reflectancia se puede utilizar para detectar
cambios en diferentes etapas de infección en hojas de papayo ocasionados por la
enfermedad del PRSV-p. Esta metodología puede ser replicada o mejorada para
utilizarse en el estudio de síntomas de daños en hojas ocasionados por
fitopatógenos en plantas de papayo, con potencial para su uso en otras plantas de
importancia económica.
34 Colegio de Postgraduados, Campus Veracruz 35 Universidad Autónoma de la Ciudad de México * [email protected].
212
Palabras claves: espectrorradiometría, método no invasivo, región RE, región VIS,
virus fitopatógeno
Introducción
En Veracruz, el Virus de la Mancha Anular del Papayo (PRSV-p) puede ocasionar
pérdidas de 30 a 100% (Hernández-Castro et al., 2015). Detectar, evaluar y cuantificar
una enfermedad fitopatológica en una planta o en cultivos es relevante cuando la
pérdida se relaciona con dicha enfermedad (Bock et al., 2010). Los equipos
espectrorradiométricos evalúan la reflectancia, irradiancia, fluorescencia y color en
hojas de plantas a través de diversas longitudes de onda del espectro
electromagnético (desde 280 a 2800 nm). Estos equipos son rápidos, robustos,
confiables, precisos y no invasivos para la detección de plantas con estrés fisiológico,
lesiones y enfermedades, por lo que estos sistemas constituyen un método
emergente para detectar y cuantificar síntomas causados por plagas y
enfermedades en plantas. La capacidad que tienen las hojas de las plantas para
absorber, reflejar o transmitir la radiación solar en distintas longitudes de onda
depende de los compuestos bioquímicos (pigmentos fotosintéticos, proteínas y
contenido de agua, entre otros), la fisiología y estructura de las hojas (Bock et al.,
2010). Cambrón-Sandoval et al. (2011) afirmaron que las plantas sometidas a estrés
(falta de agua, de nutrientes esenciales, ataque de fitopatógenos, heladas y sequias)
tienden a perder capacidad fotosintética y disminuyen el contenido de clorofila A y
B de sus hojas. La clorofila A, es el pigmento principal que transforma la energía
lumínica en energía química y se considera un pigmento activo. La clorofila B
absorbe la luz en longitudes de onda diferentes a la clorofila A y se considera un
pigmento accesorio. Estudios espectrorradiométricos han mostrado que el
espectro de RF de una planta sana es diferente al de una planta con deficiencia de
nutrientes, estrés o enferma (Lorenzo et al., 2017; Chen et al., 2018). Por lo general, el
espectro de RF de plantas sanas en VIS se caracteriza por una fuerte absorción en
el azul (400-500 nm), un incremento en la RF en el verde (500-600 nm). En
213
promedio, el pico de RF se observa a los 540 a 560 nm, y no excede de 20% del total
de la radiación incidente reflejada (Horler et al., 1982; Aguilar, 2015). Tal como sucede
en la región azul, una mayor absorción en el rojo (600-700 nm) permite observar
una disminución de la RF. En esta región del espectro, se nota un cambio brusco de
la RF (> 690 nm), conocido como borde rojo (RE), el cual es mayor a 50% del total de
radiación reflejada (Baranoski y Rokne, 2005). En la Figura 1 se muestra la
reflectancia de una hoja sana de C. papaya. L.
Figura 1. Espectro de reflectancia de una hoja sana de papayo (C. papaya L.).
Los espectros de RF de hojas evaluados en condiciones de campo e invernaderos, y
en laboratorio son realizados de manera distinta. En el caso de las pruebas
realizadas en campo e invernadero, los espectros de RF dependen de variables
dinámicas que pueden controlarse (el ángulo de posición del ESPC con respecto a
la hoja de la planta, el área de la muestra, la distancia entre la muestra y el lente de
colimación del ESPC, el horario de toma de lecturas de RF y la calibración del equipo
ESPC) y de otras que no pueden controlarse en estas condiciones (fuente de luz,
nubosidad, precipitación y temperatura). Por tanto, realizar lecturas de RF en
condiciones de campo e invernadero permite comprender el fenómeno de la
producción agrícola, pero obtener datos es más difícil en comparación con los
experimentos realizados en laboratorio.
El objetivo del presente trabajo fue presentar una metodología para la
estandarización de tomas de lecturas de RF en hojas de C. papaya L. infectadas con
el PRSV-p en condiciones de invernadero. Detectar síntomas tempranos del PRSV-
214
p permitirá que los tomadores de decisiones tengan información para reducir los
niveles de infestación del virus en la parcela y así evitar altos niveles de infestación
del virus.
Materiales y métodos
Zona de estudio
El estudio se desarrolló de mayo a agosto de 2019, en un invernadero dentro de las
instalaciones del Colegio de Postgraduados, Campus Veracruz (96.343647° LN,
19.194224° LO). Predomina el clima cálido sub-húmedo con lluvias en verano (Aw2),
con medias anuales de temperatura de 25.7°C, precipitación de 1116 mm, altitud de
27 m y radiación solar de 4.6 kWh m-2/día (NASA, 2019; CONABIO, 2019; INEGI, 2019).
Cultivo de plantas e inoculación del patógeno.
Las plantas de papayo, variedad Maradol Roja (Semillas del Caribe®, México) se
desarrollaron en un sustrato comercial (COSMOPEAT®) en bolsas negras de plástico
(40 x 38 cm) en un invernadero a temperaturas promedio de 39/23°C (día / noche) y
humedad relativa (HR) >42%, (datalogger Sper Scientific®), fotoperiodo de 14 h
luz/10 h oscuridad y radiación solar diaria >400 μmol m-2/s/día. Las plantas se
regaron según fue necesario y se fertilizaron mensualmente con 20 mg de abono
granulado NPK 12-08-16 + microelementos (Blaukorn® classic). Para la obtención de
plantas enfermas, se inocularon de manera mecánica 10 plantas de papayo con el
PRSV-p. Se utilizó el procedimiento reportado por Cabrera-Mederos et al. (2017).
Como testigo, se utilizaron 10 plantas de papayo con el mismo procedimiento de la
inoculación mecánica, pero solo con agua destilada. Todas las plantas en el
experimento contaban con 105 días después del trasplante.
Medición de la RF de las hojas.
El Sistema de medición de la ESPC (Figura 2) diseñado para la estandarización de la
metodología propuesta consistió en utilizar un STS-VIS Miniature Spectrometer
215
(Ocean Optics®), con rango espectral 339-822 nm (VIS y RE) y resolución de 0.45 nm;
fibra óptica QP600-025-VIS.NIR como cable de conexión entre el STS-VIS, lente de
colimación serie 74-UV (lente óptico curvado, ángulo de visión 25°, que ayuda a
hacer paralela a la luz que entra en el espectrorradiómetro) y estándar de
reflectancia blanco W-S1 (utilizado para calibrar el equipo con reflectancia mayor a
98% en todo el rango del espectro del equipo) y para calibración de RF el Software
Oceanview®, para obtener espectros de RF en archivos ASCII para su posterior
análisis.
Figura 2. Variables externas a las mediciones de RF en condiciones de invernadero.
Se diseñó un soporte para el control de la distancia entre el lente de colimación y la
muestra, de 5 cm; el mismo soporte controla el ángulo de 45° y el área de muestreo
de 25 cm2, con la finalidad de homogenizar las lecturas de RF registradas por el
software (Figura 3). Se estandarizó el horario de toma de datos de RF, de 11:00 a 15:00
h, horario con menor nubosidad local en los meses de junio a agosto.
216
Las mediciones de reflectancia se realizaron sobre la superficie adaxial (haz) de cada
hoja sana e infectada, a partir de cuatro días de la inoculación (DDI); después de 24
días del experimento, se redujeron a 3 días y posteriormente a dos. Las lecturas de
RF se registraron en 10 hojas de 10 plantas sanas y 10 hojas de 10 plantas enfermas.
Se tomaron cinco repeticiones de cada lectura.
Figura 3. Soporte del STS-VIS que controla las variables de distancia, ángulo y área de la muestra.
Configuración del software
El software incluye funciones de procesamiento de señal, como el suavizado de
pixeles y el promedio de la señal. El software visualiza, almacena y recupera los datos
en tiempo real, lo que permite evaluar la efectividad de la configuración de
parámetros para el correcto funcionamiento del sistema. En la ventana de
“Acquisition Group Window” se establece la configuración de acondicionamiento
de la señal que recibe el espectrorradiómetro para procesar datos. Aquí, ciertos
controles solicitan datos de configuración como los indicados en el Cuadro 1.
217
Cuadro 1. Parámetros de control de la configuración del software y su función que realiza en la calibración.
Control Función
Tiempo de integración
A mayor tiempo de integración, el detector monitorea más tiempo los fotones entrantes. Ajusta el tiempo de integración: la mayor cantidad de luz que anticipa para su aplicación, genera una señal de aprox. 85% la capacidad del espectrómetro. Se establece una línea azul horizontal en 85%. Para este estudio se utilizaron 110 ms.
Escaneos al promedio
Especifica el número de adquisiciones espectrales discretas que el controlador del dispositivo acumula antes de que OceanView reciba un espectro. Cuanto mayor sea el valor, mejor será la relación señal: ruido (S: N). El S: N mejorará por la raíz cuadrada del número de exploraciones promediadas.
Ancho del Vagón “Boxcar Width”
Establece el ancho de suavizado del vagón, técnica que promedia los datos espectrales. Un valor de 5, promedia cada punto de datos según el intervalo del espectrorradiómetro con 5 puntos a su izquierda y 5 puntos a su derecha. Cuanto mayor sea este valor, más suaves serán los datos y mayor será el S: N, que mejorará por la raíz cuadrada del número de píxeles promediados.
Corrección de la línea base Muestra el control de corrección de no linealidad.
Corrección de No-linealidad Habilita la característica de linealidad del detector.
Modo de disparo Selecciona el modo de disparo para el dispositivo. Los modos de disparo disponibles varían según el dispositivo utilizado, en este caso “On Demand”.
Resolución Se coloca a 1024 pixeles que es cada nm que se muestra de 339 a 822 nm.
Se utilizó al sol como fuente de luz, por ser ésta la principal fuente de energía en los
agroecosistemas. La calibración del STS-VIS para medidas de reflectancia se realizó
con el software OCEANVIEW®, al colocar el STS-VIS con sus complementos en el
soporte, apuntando hacia el estándar blanco WS-1 para la referencia blanca (100%);
para la referencia oscura (0%) se bloqueó la luz del lente de colimación con un tapón
completamente oscuro. El proceso de medición fue el siguiente: referencia a blanco
→ referencia a oscuro → hoja de papayo sana → referencia a blanco → hoja de papayo
infectada por el virus. Este proceso permitió homogenizar y comparar lecturas,
cuando las condiciones de luminosidad (movimiento del sol) varían, dependiendo
el tiempo de toma de lecturas de RF.
218
Análisis estadístico
Se realizó una prueba de T de student de dos muestras apareadas (10 hojas sanas
de 10 plantas y 10 hojas enfermas de un total de 20 plantas) en rangos de longitudes
de onda de interés, en las regiones UV, VIS y RE. El análisis estadístico y los
espectrogramas de RF se obtuvieron con el programa R Studio.
Resultados y discusión
Como es posible observar en la Figura 4 y el Cuadro 2, los síntomas del PRSV-p en
hojas de papayo infectadas de manera mecánica en condiciones del invernadero,
aparecieron a los 60 ddi. Cuando la enfermedad empezó a mostrar síntomas en
hojas del estrato superior de la planta en niveles 1 y 2 (de una escala de 6
calificaciones de Cabrera-Mederos et al. (2017), se distinguían zonas verdes claras y
oscuras distribuidas en la superficie adaxial de la hoja, así como aclaramiento de
nervaduras principales de la hoja (Figura 4D). Se han reportado diversos periodos
de tiempo en los que aparecen síntomas iniciales (en niveles 1 y 2 de la escala de
Satendra) del PRSV-p en plantas de papayo. Dependiendo de la temperatura, los
síntomas pueden aparecer de 10 a 20 días DDI (25°C), sin llegar a manifestarse
síntomas de esta severidad a los 34 DDI (42°C) (Cabrera et al., 2009; Satendra et al.,
2010). Asimismo, Noa-Carrazana et al. (2006) consideraron que existe una
correlación de la diversidad de los aislados mexicanos de PRSV-p dependiendo del
origen geográfico del virus aislado. Lo anterior sugiere que hay una gran variabilidad
en el desarrollo de síntomas de la enfermedad de acuerdo a la temperatura y al sitio
en el cual se manifieste la enfermedad.
En el Cuadro 2 se puede observar que incluso en la región UV, hubo un cambio en
las propiedades espectrales, mientras que en el VIS y la región RE se produjo un
cambio más significativo.
219
Cuadro 2. Análisis de tres diferentes regiones del espectro electromagnético y su relación con dos grupos de plantas a los 60 DDI.
Región (nm) Grupo Promedio Varianza Probabilidad
UV (400–430 ) Sana 3.438 0.051
1.19 x10-10 Enferma 4.167 1.401
VIS (540-560) Sana 9.749 0.448
1.97 x10-35 Enferma 13.345 11.454
RE (690-710) Sana 10.863 24.620
2.08 x10-21 Enferma 13.596 36.775
Con la metodología desarrollada para el control de diversas variables externas, la RF
es una técnica que puede ayudar a detectar síntomas en diferentes etapas de
infección del PRSV-p en hojas de papayo, debido a que la infección provoca una
reducción en el contenido de clorofila A y B en hojas que muestran síntomas, lo que
ocasiona ineficiencia fotosintética en las plantas afectadas. Las variables
ambientales de temperatura y precipitación se consideran determinantes para el
desarrollo de la enfermedad en condiciones de campo o semicontroladas (Satendra
et al., 2009; Cabrera-Mederos et al., 2017).
Las regiones del visible, borde rojo e infrarrojo del espectro electromagnético, se
caracterizan por permitir información de los niveles de estrés fisiológico en plantas,
así como detectar el contenido de clorofila en plantas y hojas (Sankaran et al., 2010;
Aguilar, 2015; Brugger et al., 2019). Los índices de reflectancia cercana a 500 nm
pueden proporcionar un indicador de la función fotosintética de la planta, vinculado
a la eficiencia de luz de fotosistema II, mientras que, aquellos cercanos a los 700 nm,
proveen información de características de una vegetación verde (Figura 4). Las
técnicas espectrorradiométricas se pueden potenciar con el uso de imágenes
multiespectrales e hiperespectrales, por ser más robustas, precisas y confiables,
aunque usan enormes cantidades de memoria, la cuales ya se han utilizado en para
la detección de síntomas de plagas y enfermedades en hojas, plantas y áreas de
varios cultivos.
220
Figura 4. Espectrogramas obtenidos de dos grupos de hojas de papayo, sana (verdes) e inoculada (rojos). A) porcentaje de RF de hojas sanas y enfermas a 339-822 nm, capacidad del STS-VIS; B) Región del VIS; C) región del RE; D) el cuadro rojo en las fotografías representa el espacio donde se realizó la RF en hojas de papayo.
La estandarización de una metodología para medición cercana de lecturas de RF
en hojas de papayo, puede permitir homogenizar la toma de muestra de lecturas
de RF. El sistema detectó el nivel 1 y 2 de síntomas de la escala, lo cual es importante
en la detección de dicha enfermedad, detectar los primeros síntomas podría reducir
la eliminación de plantas dentro de los cultivos, las cuales son una fuente potencial
de transmisión del virus.
Conclusiones
1. La RF es una técnica adecuada para detectar el PRSV-p en hojas de papayo en
condiciones de invernadero. Las regiones del espectro electromagnético VIS y RE
221
proporcionan información útil para analizar los síntomas de la enfermedad en
diferentes etapas en una hoja enferma y compararla con una sana.
2. La metodología para la estandarización de espectros de RF dependió de variables
dinámicas que pueden controlarse (el ángulo de posición del ESPC con respecto
a la hoja de la planta, el área de la muestra, la distancia entre la muestra y el lente
de colimación del ESPC, el horario de toma de lecturas de RF y la calibración del
equipo ESPC) y de otras que no pueden controlarse en estas condiciones (fuente
de luz, nubosidad, precipitación, temperatura).
3. Por lo tanto, realizar lecturas de RF en condiciones de campo o invernadero
utilizando como fuente de luz solar permitió comprender el fenómeno.
Agradecimientos
Al CONACYT, Instituto para la Excelencia de los Clústeres S.A. de C.V. y Colegio de
Postgraduados, Campus Veracruz, por los apoyos otorgados.
Literatura Citada
Aguilar, R: N. 2015. Remote sensing as a tool for competitiveness of agriculture. Rev.
Mex. Cienc. Agríc. 26:399-405.
Baranoski, G. V. G. and J. G. Rokne. 2005. A practical approach for estimating the red
edge position of plant leaf reflectance. Int. J. Remote Sens. 26:503-521.
Bock, C. H., G. H. Poole, P.E. Parker and T. R. Gottwald. 2010. Plant disease severity
estimated visually, by digital photography and image analysis, and by
hyperspectral imaging. Plant Sci. 29:59-107.
Brugger, A., J. Behmann, S. Paulus, H-G. Luigs, M. T. Kuska, P. Schramowski, K.
Kersting, U. Steiner and A-K. Mahlein. 2019. Extending hyperspectral imaging
for plant phenotyping to the UV-range. Remote Sens. doi: 10.3390/rs11121401.
222
Cabrera-Mederos, D., M. Cruz, C. F. Nome, F. Giolitti and O. Portal. 2017.
Aggressiveness of Cuban papaya ringspot virus isolates on Carica papaya L.
cv. Maradol Roja under Greenhouse Conditions. J. Plant Physiol. Pathol. 5:1-5.
Cambrón-Sandoval, V. H., M. L. España-Boquera, N. M. Sánchez-Vargas, C. Sáenz-
Romero, J. J. Vargas-Hernández and Y. Herrería-Diego. 2011. Chlorophyll
production in Pinus pseudostrobus juveniles under different development
environments. Rev. Chapingo Cienc. Amb. 17: 253-260.
Chen, T., R. Zeng, W. Guo, X. Hou, Y. Lan and L. Zhang. 2018. Sensors.
doi:10.3390/s18092798.
CONABIO (Comisión Nacional para el Conocimiento y Uso de la Biodiversidad). 2019.
Climatología Estado de Veracruz.
http://www.conabio.gob.mx/informacion/gis/ [Consultado el 20 de enero de
2019].
Hernández-Castro, E., A Damián-Nava, J.A. Mora-Aguilera, J.A. Villanueva-Jiménez
JA, D. Vargas-Álvarez and F. Palemón-Alberto. 2015. Incidence of the papaya
ringspot virus (PRSV-p) and management in the state of Guerrero, Mexico. In:
Dimitrov TS and Vitanova II. Tropical Fruits. Nova Science Publishers Inc. 119-
127 pp.
Horler, D. N. H., M. Dockray and J. Barber. 1982. The red edge of plant leaf reflectance.
Int. J. Remote Sens. 4:273-288.
INEGI (Instituto Nacional de Estadistica y Geografía). 2019. Radiación solar República
Mexicana. https://www.inegi.org.mx/datos/ [Consultado el 20 de enero de
2019].
Lorenzo, G.A; L. Mascarini and M. N. Gonzalez. 2017. Dosis de N sobre reflectancia
espectral, contenido de clorofila y nutrientes en plantas de gerbera. Hort. Bras.
35:278-285.
NASA (National Aeronautics and Space Administration). 2019. ARGIS web
application. https://power.larc.nasa.gov/data-access-viewer [Consultado el 20
de enero de 2019].
Noa-Carrazana, J. C., González-de-León, D., Ruiz-Castro, B. S., Piñero, D. and Silva-
Rosales, L. 2006. Distribution of Papaya ringspot virus and Papaya mosaic virus
in papaya plants (Carica papaya) in Mexico. Plant Dis. 90:1004-1011.
Sankaran S., A. Mishra, R. Ehsani and C. Davis. 2010. A review of advanced techniques
for detecting plant diseases. Comp. Electron. Agric. 72:1-13.
223
Satendra, K. M., V, P. Singh, R. K. Jainy and S. Praveen. 2009. Ambient temperature
perception in papaya for papaya ringspot virus interaction. Virus Genes
38:429-434.
