Upload
others
View
22
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
[J].Cytokine Growth Factor Rev,2006,17(6):441-450.[9] Ichinose K,Kawasaki E,Eguchi K.Recent advancement of
understanding pathogenesis of type 1 diabetes and potentialrelevance to diabetic nephropathy[J].Am J Nephrol,2007,27(6):554-564.
[10]Tsiotra PC,Tsigos C,Yfanti E,et al.Visfatin,TNF-alphaand IL-6 mRNA expression is increased in mononuclear cellsfrom type 2 diabetic women[J].Horm Metab Res,2007,39(10):758-763.
[11]殷俊,林宣,何汉武.2型糖尿病肾病患者外周血单个核细胞
Toll样受体4的表达及TNFα水平的研究[J].临床内科杂志,
2009,26(5):318-320.[12]李国霞,蒋玲,李幸,等.TNFα、CD11a在糖尿病大鼠肾组织中的
表达及意义[J].山东医药,2008,48(29):40-41.[13]熊狄,李赘.氟伐他汀对糖尿病大鼠TNFα表达的干预作用研
究[J].江西医药,2009,44(5):438-441.[14]张丽娜,谢席胜,左川,等.人参皂甙 Rgl对糖尿病肾病大鼠
TNF-α、MCP-1表达的影响[J].四川大学学报(医学版),2009,
40(3):466-471.[收稿日期]2011-05-03
[作者简介]陈敏纯,女,学士,药师,电话:13991328425,E-mail:minchun.chen@163.com [通讯作者]文爱东,男,硕士,主任药师,电话:029-
84773636,E-mail:adwen@fmmu.edu.cn
液相色谱-串联质谱法测定人血浆氯吡格雷浓度及其生物等效性评价
陈敏纯,鹿成韬,贾艳艳,宋颖,李雪晴,杨静,丁莉坤,文爱东 (第四军医大学西京医院药剂科,陕西 西安710032)
[摘要] 目的:建立液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定人血浆中氯吡格雷的浓度,研究2种硫酸氢氯吡格雷片的人体药
动学及相对生物利用度。方法:血浆样品中加入内标美利曲辛,经乙腈沉淀蛋白提取,采用液相色谱-串联质谱法。用建立的
方法测定20例健康男性受试者单剂量口服硫酸氢氯吡格雷受试制剂或参比制剂后的血药浓度,求得药动学参数,并对2种制
剂的生物等效性进行评价。结果:在0.02~20 ng·mL-1内呈良好的线性关系,方法回收率98.4%~103.2%,日内、日间RSD均小于15%。单次口服75 mg硫酸氢氯吡格雷受试制剂或参比制剂后的Cmax分别为(1.9±1.5)ng·mL-1和(1.8±1.1)ng·
mL-1;tmax分别为(0.8±0.5)h和(1.0±0.8)h;t1/2分别为(3.4±1.6)h和(3.5±1.5)h;AUC(0-48)分别为(4.4±4.3)h·ng·
mL-1和(4.4±4.6)h·ng·mL-1;AUC(0-∞)分别为(4.7±4.4)h·ng·mL-1和(4.7±4.7)h·ng·mL-1。受试制剂对参比制剂的
相对生物利用度为(98.2±32.8)%。结论:该方法灵敏,无杂质干扰。测得的受试制剂与参比制剂的主要药动学参数之间无
明显差异,表明2种制剂在人体内生物等效。
[关键词] 硫酸氢氯吡格雷;液相色谱-串联质谱;药动学;生物等效性[中图分类号]R969.1 [文献标识码]A [文章编号]1001-5213(2012)06-0421-04
Determination of clopidogrel in human plasma by LC-MS/MS and its application to bioequiavail-ability
CHEN Min-chun,LU Cheng-tao,JIA Yan-yan,SONG Ying,LI Xue-qing,YANG Jing,DING Li-kun,
WEN Ai-dong(Department of pharmacy,Xijing Hospital of the Forth Military Medical University,Shanxi Xi'an 710032,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE To determine clopidogrel in human plasma by LC-MS/MS method,and to investigate its pharmaco-kinetics and relative bioavailability.METHODS Clopidogrel concentrations in plasma precipitated by methyl cyanides were de-terminated by LC-MS/MS.The test and reference formulations were given to 20 healthy male volunteers.Pharmacokinetics
and bioequivalence were evaluated.RESULTS The calibration curve was linear within the range of 0.02-20 ng·mL-1.The
method recovery was 98.4%-103.2%.RSDs of intra-day and inter-day were less than15%.After a single oral dose of 75 mgclopidogrel hydrogen sulphate test or reference tablets,the main pharmacokinetic parameters were as follows:Cmax(1.9±1.5)
ng·mL-1 and(1.8±1.1)ng·mL-1;tmax(0.8±0.5)h and(1.0±0.8)h;t1/2(3.4±1.6)h and(3.5±1.5)h;AUC(0-48)(4.4±
4.3)h·ng·mL-1 and(4.4±4.6)h·ng·mL-1;AUC(0-∞)(4.7±4.4)h·ng·mL-1 and(4.7±4.7)h·ng·mL-1,respectively.
Relative bioavailability was(98.2±32.8)%.CONCLUSION The method is sensitive with no endogenous interference.No sig-nificant difference exists among the main pharmacokinetic parameters for the test and reference tablets.The two formulations
are bioequivalence.
KEY WORDS:clopidogrel hydrogen sulphate;LC-MS/MS;pharmacokinetics;bioequiavailability
氯吡格雷是噻吩并吡啶类衍生物,作为一种前 体药物,该药在体内经肝脏代谢生成活性代谢产物,
·124·中国医院药学杂志2012年第32卷第6期Chin Hosp Pharm J,2012 Mar,Vol 32,No.06
可选择性地、不可逆地与血小板膜表面嘌呤二磷酸腺苷(ADP)受体结合,使纤维蛋白原无法与糖蛋白
GPⅡb/Ⅲa受体结合,从而抑制血小板相互聚集。临床上被广泛应用于心肌梗死、脑梗死和周围动脉缺血等动脉血栓性疾病的治疗[1]。氯吡格雷经胃肠道吸收后在人体内迅速代谢,其原型药物的血药浓度极低,较难测定,目前国外仅有几篇文献报道[2-4]。本研究建立了LC-MS/MS法测定氯吡格雷在人血浆中的药物浓度,该方法简单,最低定量下限为0.02ng·mL-1,且具有血浆用量少,分析时间短等优点,并采用该法对中国健康受试者单次口服75 mg硫酸氢氯吡格雷片剂后的药动学参数和生物等效性进行了研究,为临床用药提供依据。
1 材料
1.1 仪器 Agilent 1200液相色谱-串联质谱联用仪,含:双高压泵、自动进样器、柱温箱、电喷雾离子化接口、三重四极杆质谱检测器;色谱工作站:Agi-lent ChemStation;DAS统计软件。
1.2 药品与试剂 受试制剂:硫酸氢氯吡格雷片(南京正大天晴制药有限公司,规格:75 mg/片,批号100601);参比制剂:硫酸氢氯吡格雷片[波立维,赛诺菲安万特(杭州)制药有限公司,规格:75 mg/片,批号2632];硫酸氢氯吡格雷化学对照品(江苏正大天晴药业股份有限公司,批号201005012,含量
100.0%,干燥失重0.0%);内标物:盐酸美利曲辛(江苏恩华药业股份有限公司,批号为20100428);乙腈为色谱级,甲醇、甲酸均为分析纯试剂;纯净水:自制。
2 方法与结果
2.1 试验对象 20名男性健康受试者,体质量58~68 kg,年龄32~40岁,经体检证明肝、肾功能正常,心电图正常。试验方案和知情同意书经医院伦理委员会审批同意后,受试者均了解所进行试验的目的、方法和意义,并书面签署知情同意书。试验期间统一饮食。试验期间禁止剧烈活动,禁止吸烟、饮酒或含药物、酒精的饮料等。给药方案与血样采集试验方案经中国人民解放军第四军医大学第一附属医院药物临床试验机构伦理委员会(IEC或IRB)审核批准实施,试验采用标准二阶段交叉设计(Two-period Crossover Design)自身对照试验方法,按自身交叉对照试验方案将20名受试者随机分为试验组(T)和参比组(R)。第一阶段T组口服受试制剂
T,R组口服参比制剂 R,剂量均为单剂量口服75mg;经2周清洗期后2组交换品种进行第2阶段试验。受试者禁食12 h后,早晨空腹给药,用250 mL
温开水吞服药物,服药后4 h进统一食谱的标准餐。受试者口服药物前和服药后15,30,45 min,1.0,
1.5,2.0,3.0,4.0,6.0,8.0,12.0,24.0,36.0,
48.0h分别采集静脉血4 mL,血样置肝素化的离心管中离心5 min(4 000 r·min-1),分离血浆,置-20℃保存待测。
2.2 血药浓度测定
2.2.1 LC-MS/MS条件 色谱条件:色谱柱:Dia-monsil C18(2)(150 mm×4.6 mm,5μm,Dikma);流动相:0.1%甲酸甲醇(A)-0.1%甲酸溶液(B);洗脱梯度:0min(70%A)-0.75 min(95%A)-4.5 min(95%A)-4.6 min(70%A)-6.0min(70%A);流速1.0mL·min-1,柱后分流7∶3进行质谱测定;柱温:30℃;质谱条件:电喷雾离子化正离子 MRM检测(ESI+),毛细管电压3.50 kV,脱溶剂温度350℃,脱溶剂气500 L·h-1,反吹气40 L·h-1,检测氯吡格雷和美利曲辛锥孔电压依次为24,24 V;碰撞能量依次为16,24 eV。用于定量分析的离子反应氯吡格雷[M+H]+离子为m/z 322.0→212.1;内标美利曲辛[M+H]+离子为m/z292.1→232.1。
2.2.2 血样预处理 精密吸取血浆0.4 mL置1.5mL聚塑离心管中,精密加入甲醇溶液(或在标准曲线与质量控制样品制备时加入相应标准溶液)40
μL,再精密加入内标溶液40μL(40 ng·mL-1),涡
旋混匀30 s,精密加入乙腈溶液800μL,涡旋混匀1min后,16 000 r·min-1离心10 min,取上清液30
μL进行LC-MS/MS分析。
2.2.3 标准曲线的制备 取空白血浆0.4 mL,精密吸取各浓度氯吡格雷标准溶液40μL,分别置1.5mL的聚塑离心管中,配制成含氯吡格雷分别0.02,
0.05,0.2,1.0,2.0,5.0,20.0ng·mL-1的溶液,按“2.2.2”项下的方法操作,记录氯吡格雷峰面积(As)与内标色谱峰面积(Ar)。以峰面积比R(R=As/Ar)对质量浓度(C,ng·mL-1)进行权重回归(1/C×C)。求得直线回归方程R=0.495 9 C +0.007 943,r=0.999 3,表明氯吡格雷血浆质量浓度在0.02~20.0ng·mL-1范围,色谱响应线性关系良好。
2.2.4 方法专属性 在本试验条件下,测得空白血浆、空白血浆加入对照品和内标及实测血浆样品的典型色谱图见图1。结果表明,氯吡格雷和内标的保留时间分别是4.9,4.8 min。空白血浆中内源性物质不干扰样品峰的测定,本方法具有较高的特异性,能准确测定血浆中氯吡格雷的浓度,灵敏度较高。
·224· 中国医院药学杂志2012年第32卷第6期Chin Hosp Pharm J,2012 Mar,Vol 32,No.06
图1 LC-MS/MS法测定血浆中氯吡格雷的色谱图
A.空白血浆;B.空白血浆加入氯吡格雷(2.0ng·mL-1)对照品和内标;C.受试者E单次服药(T)30 min后的血浆样品
Fig 1 LC-MS/MS chromatogram of clopidogrelA.blank plasma;B.blank plasma spiked with clopidogrel(plasmaconcentration:2.0ng·mL-1)and IS;C.plasma sample at 30 min af-ter an oral dose of 75 mg clopidogrel to a healthy volunter
2.2.5 方法精密度与准确度 取空白血浆0.4mL,按“2.2.2”项下的方法制成含氯吡格雷分别为
0.2,2.0,15.0ng·mL-1的质控(QC)样品,每一浓度进行5样本分析,连续测定3 d,根据当日标准曲线,求算QC样品浓度,根据QC样品结果计算方法的日内、日间精密度和准确度,精密度用RSD(%)表示,准确度用RE(%)表示,结果见表1。
2.2.6 提取回收率 取空白血浆0.4 mL,按“2.2.2”项下的方法制成含氯吡格雷分别为0.2,
2.0,15.0ng·mL-1的质控(QC)样品,每一浓度进行5样本分析。同时另取空白血浆0.4 mL,除不加标准系列溶液和内标溶液外,按“2.2.2”项下操作,残留物加入相应浓度的氯吡格雷系列溶液和内标溶液,每一浓度进行3样本分析,获得相应峰面积。比较2种测定结果,计算提取回收率,结果见表1。表1 方法精密度和准确度及提取回收率试验测定结果(n
=5,珚x±s)
Tab 1 Precision,accuracy and recovery for the determina-tion of clopidogrel in plasma(n=5,珚x±s)
加入量/ng·mL-1
提取回收率/%氯吡格雷 内标
准确度/%RSD/%
日间 日内0.2 83.8±3.8 103.2 14.0 10.12.0 80.1±5.2 82.6±4.4 98.5 7.3 5.215.0 75.2±1.4 98.4 13.8 5.9
2.2.7 血浆样品稳定性试验 取空白血浆0.4mL,按“2.2.2”项下的方法制成氯吡格雷分别为
0.2,15.0ng·mL-1的血浆样品数份(每一浓度3样本分析),1份样品立即进行分析,1份室温放置24 h后进行分析,1份在冰冻(-20℃)条件下保存24 h后于室温中融解进行分析,1份冻融2次后进行测定,1份冻融3次后进行分析,确定冻融稳定性。1份冰冻30 d后进行分析,1份冰冻60 d进行分析,结果表明,氯吡格雷血浆样品具有良好的稳定性,结果见表2。
表2 稳定性试验结果(n=3)
Tab 2 Stability of clopidogrel in plasma(n=3)
贮藏条件质量浓度/ng·mL-1 RSD/% RE/%加入量 测得量
立即分析 0.2 0.2 7.2 3.615.0 15.1 2.7 21.3
室温放置24 h 0.2 0.2 7.2 3.615.0 15.3 13.1 6.5
冰冻-解冻1次 0.2 0.2 15.0 7.915.0 15.1 10.8 5.2
冰冻-解冻2次 0.2 0.2 1.8 9.815.0 14.8 6.6 3.0
冰冻-解冻3次 0.2 0.2 6.6 14.115.0 15.0 6.9 3.4
冰冻30 d 0.2 0.2 4.6 4.315.0 14.5 9.1 11.5
冰冻60 d 0.2 0.2 3.2 5.715.0 14.3 6.3 3.6
2.2.8 基质效应 取空白血浆0.4 mL,除不加标准系列溶液和内标溶液外,按“2.2.2”项下操作,残留物以相应浓度的氯吡格雷系列溶液和内标溶液,每一浓度进行5样本分析,获得相应峰面积。同时比较相同浓度的氯吡格雷和内标标准溶液的峰面积,每一浓度进行5样本分析,计算基质效应。试验结果显示采用本方法时,样品各浓度点与内标的基质效应在85%~115%范围内,无明显基质效应,表明基质效应不影响测定的精密度和准确度。
2.2.9 血浆样品测定与质量控制 测定血浆样品时,每天建立一条标准曲线,并随行测定低、中、高3浓度的 QC样品。根据当日标准曲线,求算 QC样品和未知样品的浓度,当 QC样品 RSD≤15%时,
当日数据方可接受。
2.2.10 数据处理方法 以梯形法求算2种硫酸氢氯吡格雷片的 AUC(0-48)和 AUC(0-∞),Cmax和tmax取实测值,Cmax和AUC经对数转换后,将受试制剂T的Cmax和AUC分别与参比制剂R的Cmax和 AUC作双单侧t检验统计处理,将受试制剂 T的tmax实测值与参比制剂R的tmax实测值采用非参数 Wilc-oxon法统计处理,分析药物间、个体间及周期间变异的统计学意义。
2.3 结果
2.3.1 药动学参数 20名受试者单剂量口服2种硫酸氢氯吡格雷片制剂中氯吡格雷的平均药时曲线见图2,主要药动学参数见表3。
2.3.2 生物等效性 将主要药动学参数AUC(0-48)、
AUC(0-∞)、Cmax进行方差分析和生物等效性评价。结果显示受试制剂和参比制剂的药动学参数Cmax、
AUC(0-48)、AUC(0-∞)经对数转换后进行方差分析,并进一步采用双向单侧t检验和[1-2α]%置信区间法进行生物等效性评价,其中tmax采用非参数法
·324·中国医院药学杂志2012年第32卷第6期Chin Hosp Pharm J,2012 Mar,Vol 32,No.06
图2 20名健康受试者单次口服75 mg硫酸氢氯吡格雷片受试或参比制剂后的平均药-时曲线(珚x±s,n=20)
-●-受试制剂;-▲-参比制剂
Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of test or referenceformulations after a single oral dose of 75 mg in20 healthy male vol-unteers(珚x±s,n=20)
-●-reference;-▲-test
表3 单剂量口服硫酸氢氯吡格雷片受试或参比制剂75 mg后的主要药动学参数(珚x±s,n=20)
Tab 3 Pharmacokinetic parameters after the administration
of a single dose of 75 mg test or reference tablets(珚x±s,n=
20)
参数 受试制剂 参比制剂Cmax/ng·mL-1 1.9±1.5 1.8±1.1tmax/h 0.8±0.5 1.0±0.8t1/2/h 3.4±1.6 3.5±1.5
AUC(0-48)/h·ng·mL-1 4.4±4.3 4.4±4.6AUC(0-∞)/h·ng·mL-1 4.7±4.4 4.7±4.7
F/% 98.2±32.8
(Wilcoxon符号秩检验)检验法。结果表明:Cmax、
AUC(0-48)、AUC(0-∞)均拒绝生物不等效假设。受试制剂中Cmax、AUC(0-48)、AUC(0-∞)的90%置信区间分别为77.7%~94.3%、87.2%~98.4%、88.1%~99.4%;两制剂的tmax经非参数法检验无显著性差异(P>0.05),表明两制剂生物等效。
2.3.3 不良反应观察 本次试验中20名健康受试
者单剂量口服用药后未见明显不良反应。
3 讨论国外仅有几篇文献报道[2-4],均为采用液质联用
方法测定,样品分离富集均采用液-液萃取的方法,本试验所建立的方法采用乙腈沉淀蛋白提取血浆中药物,血浆处理简单易操作;血浆用量少(0.4 mL);流动相采用梯度洗脱,分析时间短,氯吡格雷和内标的保留时间分别是4.9,4.8 min,可满足临床大批量生物样品的测定和药动学研究。
氯吡格雷在人体中血药浓度较低,仪器条件要求高,本实验采用LC-MS/MS方法,最低检测限为
0.02 ng·mL-1,能够满足实验条件,可用于血药浓度监测、群体药动学/药效学和临床个体化给药的研究。参考文献:[1] Geiger J,Brich J,Liedl P,et al.Specific impairment of hu-
man platelet P2Y(AC)ADP receptor mediated signaling by theantiplatelet drug clopidogrel[J].Arterioscler Thromb VascBiol,1999,19:2007-2011.
[2] Robinson A,Hillis J,Neal C,et al.The validation of a bioan-alytical method for the determination of clopidogrel in human
plasma[J].Chromatogr B,2007,848:344-354.[3] Nirogi RVS,Kandikere VN,Shukla M,et al.Quantification
of clopidogrel in human plasma by sensitive liquid chromatog-raphy/tandem mass spectrometry[J].Rapid Commun MassSpectrom,2006,20:1695-1700.
[4] Beom SS,Sun DY.Determination of clopidogrel in human
plasma by liquidchromatography/tandem mass spectrometry:
application to a clinical pharmacokinetic study[J].BiomedChromatogr,2007,21:883-889.
[收稿日期]2011-09-03
[作者简介]舒成仁,男,博士,副主任药师,电话:0714-6265539,E-mail:397112615@qq.com [通讯作者]黎维勇,男,主任药师,教授,E-mail:
Liweiyong@yahoo.com
硫酸氢氯吡格雷片的人体生物等效性
舒成仁1,2,卫乐乐2,黄露2,黎维勇2 (1.黄石市中心医院药剂科,湖北 黄石435000;2.华中科技大学附属协和医院药剂科,湖北 武汉430022)
[摘要] 目的:研究硫酸氢氯吡格雷片受试制剂与参比制剂的人体生物等效性。方法:30名健康男性志愿者随机交叉单剂量
口服硫酸氢氯吡格雷试验片或对照片150 mg,采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法测定血浆中氯吡格雷羧酸代
谢产物浓度。用DAS软件计算两者的药动学参数,并评价其生物等效性。结果:受试制剂与参比制剂的tmax分别为(0.98±
0.34)、(0.86±0.36)h;Cmax分别为(8 994.7±3 515.6)、(9 677.0±3 838.1)ng·mL-1;t1/2分别为(7.0±2.4)、(7.0±1.8)h;
AUC0→24分别为(31 670.1±13 545.7)、(32 887.4±14 907.5)ng·h·mL-1;AUC0→ ∞ 分别为(34 096.8±14 482.3)、
(35 550.4±16 455.5)ng·h·mL-1。受试制剂的相对生物利用度为(97.7±16.6)%。结论:2种制剂具有生物等效性。
[关键词] 硫酸氢氯吡格雷片;高效液相色谱-串联质谱法;羧酸代谢产物;生物等效性[中图分类号]R969.1 [文献标识码]A [文章编号]1001-5213(2012)06-0424-04
·424· 中国医院药学杂志2012年第32卷第6期Chin Hosp Pharm J,2012 Mar,Vol 32,No.06