cnsh.vnua.edu.vn tap CNTB_2013_28.08.pdf · NT Phương Thảo, NT Lâm Hải, NT Thảo, NT Huệ 2 II. Trang thiết bị phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật C¸c thiết

NT Phương Thảo, NT Lâm Hải, NT Thảo, NT Huệ 1

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT

*********

TÀI LIỆU THỰC HÀNH MÔN

C«ng nghÖ nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt (15 tiÕt)

******

BÀI 1

Tæ chøc phßng thÝ nghiÖm nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc vËt (0 tiÕt)

A.Môc ®Ých, Yªu cÇu:

- Sinh viªn n¾m ®îc tæ chøc cña mét phßng thÝ nghiÖm nu«i cÊy m« tÕ bµo

- N¾m ®îc tªn, tÝnh n¨ng, nguyªn t¾c sö dông mét sè thiÕt bÞ, dông cô chÝnh sö dông trong nu«i cÊy m« tÕ bµo.

B. Néi dung:

I. Tæ chøc phßng thÝ nghiÖm

1. Phßng chuÈn bÞ

§îc bè trÝ liªn hoµn cho çc kh©u : röa vµ thanh trïng dông cô ; pha chÕ vµ khö trïng m«i trêng nu«i

cÊy ; chuÈn bÞ s¬ bé mÉu vËt tríc khi cÊy.

2.Buång cÊy:

Lµ n¬i ®Æt çc bµn nu«i cÊy v« trïng ®Ó tiÕn hµnh çc thao t¸c cÊy mÉu. Yªu cÇu kÝn giã , têng èp g¹ch

men kÝnh , cã m¸y ®iÒu hoµ nhiÖt ®é, cã tñ hay gi¸ ®ùng çc b×nh m«i trêng . Phßng cÊy ph¶i ®îc gi÷ s¹ch sÏ

vµ liªn tôc tiÖt trïng sau khi lµm viÖc b»ng focmon kÕt hîp víi chiÕu ®Ìn tö ngo¹i.

3. Phßng nu«i c©y:

Lµ buång ®Æt çc mÉu nu«i cÊy. Buång nµy cÇn ®¶m b¶o çc ®iÒu kiÖn:

• NhiÖt ®é æn ®inh trong kho¶ng 25-280C.

• ¸nh s¸ng: Cêng ®é ¸nh s¸ng tr¾ng tèi thiÓu ®¹t 2000-3000 lux.

( ChÕ ®é nhiÖt vµ ¸nh s¸nh hoµn toµn cã thÓ ®iÒu khiÓn ®îc theo ý muèn. )

• Gi¸ nu«i c©y: ®îc ®ãng b»ng gç hay kim lo¹i . chia thµnh çc tÇng, mçi tÇng cao 50 cm vµ ®îc lãt

b»ng kÝnh ( 4 - 5 mm ) cho tiÖn lau chïi vµ kh«ng c¶n s¸ng.

4. HÖ thèng vên ¬m, nhµ mµn: n¬i thu thËp duy tr× nguån mÉu tríc khi lµm thÝ nghiÖm vµ ®Ó trång çc c©y

t¹i ra sau nu«i cÊy in vitro


II. Trang thiết bị phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật

Çc thiết bÞ dông cô cÇn thiÕt cho mét phßng nu«i cÊy m« chuyªn nghiÖp ®¬c tæng kÕt díi ®©y ( * chØ

nh÷ng thiÕt bÞ kh«ng hoµn toµn cÇn ph¶i cã vµ cã thÓ thay b»ng çc dông cô ®¬n gi¶n h¬n)

- Nguån cung cÊp ga, níc, ®iÖn vµ cã thÓ kh«ng khÝ nÐn*, èng ch©n kh«ng *

- Thïng ®un níc nãng

- Çc lo¹i b×nh thuû tinh kh¸c nhau

- BÕp h©m nãng cïng khuÊy tõ

- Çc lo¹i c©n (c©n ph©n tÝch , c©n kü thuËt cã thÓ c©n ë khèi lîng nhá chÝnh x¸c ®Õn milligram)

- M¸y trén khi pha lîng lín m«i trêng*

- Lß vi sãng* hay bÕp ®un ®Ó ®un nãng m«i trêng khi trén víi aga

- M¸y ®o PH

- M¸y trng níc cÊt*

- Khö ion

- Tñ cã chøa çc lo¹i ho¸ chÊt kh¸c nhau

- §ång hå ®Þnh giê dïng cho qu¸ tr×nh khö trïng

- Çc gi¸ kim lo¹i ®Ó dùng çc èng nghiÖm khi hÊp trong nåi hÊp

- èng nghiÖm, b×nh chøa

- Tñ sÊy

- Nåi hÊp ( nÕu kh«ng cã cã thÎ sö dông nåi ¸p suÊt nhá)

- Tñ l¹nh cã ng¨n l¹nh s©u

- Khu v« trïng ®Ó chøa m«i trßng dinh dìng, níc khö trïng..

- Gi¸ lµm kh« dông cô

- M¸y röa pipet*

- Bån rña dông cô

C. TiÕn Hµnh:

- Th¨m quan hÖ thèng phßng nu«i cÊy m« tÕ bµo thùc tËp

- Tim hiÓu tªn, tÝnh n¨ng, nguyªn t¾c vËn hµnh mét sè m¸y mãc chÝnh


Bµi 2

Kü thuËt pha chÕ hãa chÊt, m«i trêng nu«I cÊy (6 tiÕt)

A.Môc ®Ých, Yªu cÇu:

- Sinh viªn hiÓu ®îc çc lo¹i nång ®é vµ n¾m ®îc çch pha chÕ, b¶o qu¶n çc lo¹i dung dÞch mÑ

- Sinh viªn biÕt çch pha chÕ çc lo¹i m«i trêng nu«i cÊy kh¸c nhau

B. Néi dung:

I. Giíi thiÖu çc thµnh phÇn dinh dìng chñ yÕu cña m«i trêng nu«i cÊy

Níc

CÇn ®Æc biÖt chó ý ®Õn thµnh phÇn nµy v× níc chiÕm ®Õn 95 % m«i trêng dinh dìng. Nªn sö dông níc cÊt

khi tiÕn hµnh çc thÝ nghiÖm ngiªn cøu. NÕu m«i trêng ®îc chuÈn bÞ cho nu«i cÊy protoplast, tÕ bµo hay

meristem th× nªn dïng níc cÊt 2 lÇn. Hoµn toµn kh«ng nªn sö dông níc m¸y trong nu«i cÊy m«. Trong trêng

hîp níc cÊt kh«ng cã s½n th× còng chØ nªn sö dông nø¬c khö ion, mÆc dÇu níc nµy vÉn cã thÓ chøa çc nguån

l©y nhiÔm h÷u c¬ vµ çc lo¹i vi khuÈn.

Agar

§Ó lµm gi¸ thÓ cho m«i trêng nu«i cÊy, ngêi ta thêng sö dông agar (th¹ch). Agar lµ mét lo¹i polysacarit cña

t¶o. ë 800C th¹ch ng©m níc chuyÓn sang tr¹ng th¸i sol cßn ë 400C th× trë vÒ tr¹ng th¸i gel. Kh¶ n¨ng ngËm

níc cña th¹ch kh¸ cao: 6 - 12 gam/lÝt níc. Th¹ch ë d¹ng gel nhng vÉn ®Ó cho çc ion vËn chuyÓn dÔ dµng.

Mét vÊn ®Ò kh¸c næi lªn lµ ®é tho¸ng khÝ cña m«i trêng th¹ch, ®iÒu nµy cã ¶nh hëng rÊt râ rÖt ®Õn sinh trëng

cña m« nu«i cÊy. Nång ®é cña th¹ch dïng trong nu«i cÊy rÊt dao ®éng tïy thuéc vµo ®é tinh khiÕt cña ho¸ chÊt

vµ môc tiªu nu«i cÊy (thêng tõ 4-12 g/lÝt, trung b×nh 6 - 12 g/lÝt).

M«i trêng láng thêng chØ sö dông cho nu«i cÊy tÕ bµo vµ protoplast. Khi nu«i cÊy trong m«i trêng láng vÊn

®Ò oxygen cµng quan träng h¬n. ChÝnh v× thÕ çc b×nh nu«i cÊy trong m«i trêng láng thêng ph¶i ®Æt trªn m¸y

l¾c hoÆc m« nu«i cÊy ®Æt trªn mét miÕng giÊy thÈm nhóng vµo m«i trêng.

§êng

§êng lµ thµnh phÇn quan trong trong bÊt kú mét m«i trêng dinh dìng nµo. §êng cÇn thiÕt cho sù sinh

trëng vµ ph¸t triÓn v× qu¸ tr×nh quang hîp lµ kh«ng ®ñ do sù sinh tráng ®îc ®Æt trong ®iÒu kiÖn kh«ng thÝch

hîp cho quang hîp hay hoµn toµn kh«ng cã quang hîp (nu«i cÊy trong bãng tèi). Çc m« cã mÇu xanh kh«ng ®ñ

kh¶ n¨ng ®Ó tù dìng in vitro. Qu¸ tr×nh quang hîp còng bÞ h¹n chÕ bëi nång ®é CO2 trong b×nh cÊy. Trªn thùc

tÕ, viÖc bæ sung CO2 lµ rÊt khã kh¨n vµ tèn kÐm.

Nång ®é 1 - 5 % saccharose thêng ®îc sö dông trong in vitro v× ®êng nµy còng ®îc tæng hîp vµ vËn chuyÓn

tù nhiªn bëi thùc vËt. Glucose vµ fructose còng cã thÓ sö dông. Nång ®é sö dông thêng rÊt phô thuéc vµo laäi

vµ tuæi cña mÉu cÊy.

Dinh Dìng kho¸ng (®a lîng, vi lîng)


Çc nguyªn tè ®a lîng:

S¸u nguyªn tè ®a lîng N, P, K, S, Mg, Ca, lµ cÇn thiÕt vµ thay ®æi tuú theo ®èi tîng nu«i cÊy. Nãi chung nång

®é çc nguyªn tè nãi trªn trong m«i trêng kho¶ng trªn 30ppm. Cã nhiÒu m«i trêng cã thµnh phÇn, tû lÖ çc

chÊt kh¸c nhau, con ngêi cã thÓ chän ®Ó sö dông: Dung dÞch Knop (gauthret 1959), Heller (1953), Murashige

vµ Skoog (1962), Gamborg (1968),... Nãi chung m«i trêng giµu nit¬ vµ kali thÝch hîp cho viÖc h×nh thµnh chåi,

cßn m«i trêng giµu kali sÏ xóc tiÕn m¹nh mÏ qu¸ tr×nh trao ®æi chÊt.

- Nit¬ ( N ) : ®îc sö dông ë 2 d¹ng NO3- vµ NH4

+ riªng rÏ hay phèi hîp víi nhau. §iÒu ®¸ng lu ý lµ nÕu chØ

dïng NH4+ ( kh«ng cã NO3

- ) th× sinh trëng cña tÕ bµo gi¶m, thËm chÝ ngõng hoµn toµn. Nguyªn nh©n chÝnh lµ

do qu¸ tr×nh trao ®æi ion cña tÕ bµo x¶y ra lÖch dÉn ®Õn t×nh tr¹ng thay ®æi pH cña m«i trêng . Cô thÓ : khi chØ

dïng NO3- ®é pH cña m«i trêng t¨ng dÇn vµ khi chØ dïng riªng NH4

+ ®é pH cña m«i trêng gi¶m dÇn do tÕ bµo

hÊp thu chóng vµ th¶i ra m«i trêng lo¹i ion cã ho¸ trÞ t¬ng ®¬ng.

- Lu huúnh ( S ) : chñ yÕu vµ tèt nhÊt lµ dïng d¹ng muèi SO4-2 . Çc d¹ng ion kh¸c nh SO3 hay SO2 thêng

kÐm t¸c dông thËm chÝ cßn ®éc.

- Phospho ( P ) : m« vµ tÕ bµo thùc vËt nu«i cÊy cã nhu cÇu phospho rÊt cao. Nã kh«ng chØ lµ mét trong nh÷ng

thµnh phÇn cÊu tróc cña ph©n tö axÝt nucleic mµ khi phospho ë d¹ng H2PO4 vµ HPO4 cßn cã t¸c dông nh mét

hÖ thèng ®Öm lµm æn ®Þnh pH cña m«i trêng trong qu¸ tr×nh nu«i cÊy.

Çc nguyªn tè vi lîng.

Fe, Cu, Zn, Mn, Mo, Bo, I, Co lµ çc nguyªn tè vi lîng thêng ®îc dïng trong m«i trêng nu«i cÊy in vitro.

Çc nguyªn tè nµy ®ãng vai trß quan träng trong çc ho¹t ®éng cña enzym. Chóng ®îc dïng víi nång ®é thÊp

h¬n nhiÒu so víi çc nguyªn tè ®a lîng. Fe thêng t¹o phøc víi çc thµnh phÇn kh¸c nªn tèt nhÊt lµ sö dông Fe

ë d¹ng chelat: Fe - NaEDTA. Phøc nµy sÏ gi¶i phãng Fe cho m«i trêng ë mét ph¹m vi pH réng. Çc dung dÞch

vi lîng thêng dïng lµ: Nistch, (1951), Heller (1953), Murashige-Skoog (1962).

Vitamin

MÆc dï c©y in vitro cã thÓ tù tæng hîp vitamin, nhng kh«ng ®ñ cho nhu cÇu, nªn ph¶i bæ sung thªm vµo m«i

trêng. §¸ng chó ý lµ çc vitamin: thiamin, axit nicotinic, pyridoxin vµ riboflavin. Nång ®é thêng dïng lµ

1mg/lit. Myo-inositol cÇn ®îc bæ sung vµo mét lîng kh¸ lín 50-500mg/lÝt, chÊt nµy tá ra cã t¸c dông kh¸ râ

®Õn sù ph©n chia cña m«.

Trong mét sè trêng hîp ngêi ta cßn ®a vµo m«i trêng vitamin C víi liÒu lîng tõ 1-10mg/lÝt. ë ®©y vitamin

C ®ãng vai trß nh mét chÊt chèng oxy ho¸.

ChÊt ®iÒu hoµ sinh trëng


Çc chÊt ®iÒu tiÕt sinh trëng lµ yÕu tè quan träng nhÊt trong m«i trêng quyÕt ®Þnh kÕt qu¶ nu«i cÊy. Trong 5

nhãm chÊt ®iÒu tiÕt sinh trëng cña thùc vËt: auxin, gibberellin, xytokinin, ethylen, axit absixic th× auxin vµ

xytokinin ®îc sö dông nhiÒu h¬n c¶ rtong nu«i cÊy in vitro.

Auxin

Auxin kÝch thÝch sù h×nh thµnh m« sÑo vµ xuÊt hiÖn rÔ bÊt ®Þnh, kÝch thÝch sù d·n cña tÕ bµo. Çc auxin thêng

sö dông lµ: 2,4D Dicloro phenoxy axetic axit (2,4D), naphtylaxetic axit ( NAA), Indolaxetic axit (IAA).

Trong ®ã 2,4D dÔ g©y ®éc nhng cã t¸c dông rÊt nhËy ®Õn sù ph©n chia tÕ bµo. Nång ®é auxin dïng trong nu«i

cÊy giao ®éng tuú tõng chÊt vµ ®èi tîng nu«i cÊy nhng thêng lµ 10-1-10-6 M.

Cytokinin

KÝch thÝch sù ph©n chia tÕ bµo vµ quyÕt ®Þnh sù ph©n ho¸ chåi. Tû lÖ auxin/xytokinin quyÕt ®Þnh sù ph©n ho¸

cña m« theo híng t¹o rÔ, chåi hay m« sÑo.

Çc cytokinin thêng ®îc sö dïng lµ Benzyladenin (BAP), Kinetin, 2 isopentenyl¹denin (2 iP) vµ Zeatin ( mét

chÊt tù nhiªn). Trong çc chÊt nµy, BAP vµ sau ®ã kinetin ®îc dïng phæ biÕn nhÊt v× cã ho¹t tÝnh cao vµ gi¸

kh«ng ®¾t. ë nång ®é thÊp 10-7 - 10-6 M çc xytokinin kÝch thÝch sù ph©n bµo, nång ®é 10-6 - 10-5 M kÝch thÝch sù

ph©n ho¸ chåi. Trong nu«i cÊy meristem ®Ó kÝch thÝch sù nh©n nhanh ngêi ta thêng dïng nång ®é xytokinin

cao 10-5 - 10-4 M

Çc hîp chÊt tù nhiªn

Çc axit amin, axit h÷u c¬ còng nh hçn hîp kh«ng x¸c ®Þnh nh níc dõa, dÞch chiÕt khoai t©y, thêng ®îc sö

dông mét çch ®Æc biÖt cho tõng ®èi tîng cô thÓ. Díi ®©y lµ mét sè chÊt thêng ®îc dïng:

- Níc dõa: §· ®îc sö dông vµo nu«i cÊy invitro tõ nh÷ng n¨m 1949, ®îc øng dông kh¸ réng r·i trong çc

m«i trêng nh©n nhanh invitro: phong lan, døa... Trong níc dõa thêng chøa çc axit amin, axit h÷u c¬, ®êng,

ARN, AND. §Æc biÖt trong níc dõa cã chøa nh÷ng hîp chÊt quan träng cho nu«i cÊy invitro ®ã lµ:

myoinositol, çc hîp chÊt cã ho¹t tÝnh auxin, çc glucosit cña xytokinin.

- DÞch chiÕt nÊm men (yeast extr t) cã t¸c dông tèt ®èi víi sù ph¸t triÓn cña rÔ nu«i cÊy. Thµnh phÇn ho¸ häc

cã: ®êng, axit nucleic, axit amin, vitamin, auxin, kho¸ng...

- DÞch thuû ph©n casein hay pepton (casein hydrolysat): chñ yÕu ®îc sö dông lµm nguån bæ sung axit amin.

Nguån Çc - bon

C©y in vitro sèng chñ yÕu theo ph¬ng thøc dÞ dìng, mÆc dï díi ¸nh s¸ng nh©n t¹o chóng cã kh¶ n¨ng h×nh

thµnh diÖp lôc vµ quang hîp. V× vËy, nguån c bon díi d¹ng h÷u c¬ lµ thµnh phÇn b¾t buéc cña m«i trêng.

Nguån carbon thêng dïng lµ ®êng s caroza vµ glucoza víi liÒu lîng tõ 20-30g/lÝt. Trong mét sè trêng hîp

®Æc biÖt, cã thÓ sö dông nguån ®êng kh¸c nh maltoza (Raquin 1984) , gal toza vµ l toza (Ankler 1974).

PH

§é pH cña m«i trêng dinh dìng ¶nh hëng trùc tiÕp tíi qu¸ tr×nh thu nhËn çc chÊt dinh dìng tõ m«i trêng

vµo tÕ bµo. V× vËy ®èi víi lo¹i m«i trêng nhÊt ®Þnh vµ ®èi víi tõng lo¹i c©y nu«i cÊy ph¶i ®iÒu chØnh pH cu¶

m«i trêng vÒ ®é thÝch hîp.


Th«ng thêng, ngêi ta pha m«i trêng c¬ b¶n råi bæ sung çc chÊt cÇn thiÕt. Dïng níc cÊt hai lÇn ®Ó lªn thÓ

tÝch råi chØnh pH m«i trêng. pH m«i trêng nu«i cÊy thÝch hîp cho ®a sè lo¹i c©y giao ®éng tõ 5,5 - 5,6.

Trêng hîp pH thÊp th¹ch cã thÓ kh«ng ®«ng sau khi hÊp.

Mét sè m«i trêng phæ biÕn

B¶ng. Thµnh phÇn mét sè lo¹i m«i trêng dïng trong nu«i cÊy m« vµ tÕ bµo thùc vËt

MS WP W B5 SH NN AC

§a lîng

NH4NO3 1650 400 720 400

(NH4)2SO4 134

NH4H2PO4 300

KNO3 1900 80 2500 2500 950

Ca(NO3)2.4H2O 556 300 556

K2SO4 990 900

CaCl2.2H2O 440 96 150 200 166 96

MgSO4.7H2O 370 370 750 250 400 185 370

KH2PO4 170 170 68 170

NaH2PO4 19 150

KCl 65

Vi lîng

MnSO4.4H2O 23,3 5 10 10 25

MnSO4.H2O 22,3 23,3

ZnSO4.7H2O 8,6 8,6 3 2 1 10 8,6

H3BO3 6,2 6,2 1,5 3 5 10 6,2

KI 0,83 0,75 0,75 1 0,83

Na2MoO2.2H2O 0,25 0,25 0,001 0,25 0,1 0,25 0,25

CuSO4.5H2O 0,025 0,025 0,01 0,025 0,2 0,025 0,025

CoCl2.6H2O 0,025 0,025 0,025 0,1 0,025

Na2EDTA 37,3 200 20 37,3

FeSO4. 7H2O 27,8 15 27,8

SodiumFerric

EDTA

30 2,5 30

Vitamin vµ axit

amin

Thiamine HCl 0,1 0,5 10 5 0,5 0,1


Nicotinic axit 0,5 0,1 1 5 5 0,5

Pyridoxine HCl 0,5 0,1 1 0,5 0,5 0,5

Glycine 2 3

Lysine 100

L-Cystein

Folic axit 0,5

Biotin 0,05

Myo-inositol 100 100 100 1000 100 100

§êng

Sucrose (g/l) 30 20 20 20 30 20 20

II. Pha chÕ hãa chÊt, m«i trêng nu«i cÊy

1.Giíi thiÖu çc lo¹i nång ®é

Çc ®¬n vÞ ph©n chia nång ®é

Nång ®é cña bÊt kú hîp chÊt nµo cã thÓ thÓ hiÖn theo mét sè çch. Danh s¸ch sau ®©y giíi thiÖu mét sè ph¬ng

ph¸p tÝnh to¸n nång ®é thêng thÊy trong çc tµi liÖu vÒ nu«i cÊy m«:

- PhÇn tr¨m theo thÓ tÝch (v/v): Dïng cho s÷a dõa, dÞch cµ chua, níc v¾t cam. ThÝ dô nÕu muèn cã 100 ml

cña 5% (v/v), 5 ml níc dõa sÏ ®îc hoµ tan thµnh 100 mL b»ng níc.

-PhÇn tr¨m theo khèi lîng (w/v): Thêng dïng ®Ó thÓ hiÖn nång ®é cña agar hoÆc ®êng. ThÝ dô, ®Ó pha 1 %

dung dÞch agar, hoµ tan 10 g agar trong 1 L m«i trêng dinh dìng.

- Nång ®é ph©n tö: mét ph©n tö cã cïng sè gram víi khèi lîng ph©n tö, v× vËy mét dung dÞch 1 M cã nghÜa lµ

cã 1 mol hîp chÊt trong 1 L dung dÞch vµ 0.01 M sÏ lµ 0.01 lÇn khèi lîng ph©n tö trong 1 L. Mét dung dÞch

millimolar (mM) t¬ng ®¬ng víi 0.01 mol/L vµ mét dung dÞch micromolar(M) lµ 0.000001 mol/L. Çc hîp

chÊt nh chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng thêng t¸c ®éng ë nång ®é micromolar. Nång ®é ph©n tö ®îc sö dông ®Ó so

s¸nh mét çch chÝnh x¸c ho¹t ®éng t¬ng ®èi gi÷a çc hîp chÊt. ThÝ dô, mét nång ®é 1 M cña IAA sÏ chøa

cïng mét sè ph©n tö nh lµ 1 M cña kinetin, mÆc dÇu chóng ta kh«ng thÓ nãi nh vËy khi ®¬n vÞ tÝnh theo khèi

lîng.

-Nång ®é milligram / lÝt (mg/l) mÆc dÇu kh«ng cã ph¬ng ph¸p chÝnh x¸c ®Ó so s¸nh çc hîp chÊt ë møc ph©n

tö, nång ®é mg/l thêng ®îc tÝnh vµ sö dông t¬ng ®èi ®¬n gi¶n bëi v× nã ®o khèi lîng trùc tiÕp. ViÖc ®o trùc

tiÕp nh vËy thêng ®îc dïng cho çc nguyªn tè ®a lîng vµ thØnh tho¶ng dïng cho chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng.

1 mg/L cã nghÜa lµ cho 1 mg chÊt cÇn pha trong thÓ tÝch cuèi cïng lµ 1 L dung dÞch. Mét milligram lµ 10-3 g.

- Nång ®é Micro trªn lÝt (g/L): thêng dïng cho çc nguyªn tè vi lîng vµ ®«i khi cho chÊt ®iÒu hoµ sinh

trëng. Nã cã nghÜa lµ pha 1 g cña hîp chÊt trong 1 L dung dÞch; 1g = 0.001 hoÆc 10-3 =0.000001 hay 10-6.


- Nång ®é ppm: ®«i khi mét sè hîp chÊt trong m«i trêng ®îc thÓ hiÖn qua nång ®é ppm tøc ®¬n vÞ 1 phÇn

triÖu hoÆc 1 mg/L.

2. Pha chÕ dung dÞch mÑ(stock solution)

2.1.Pha chÕ dung dÞch mÑ cho çc chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng vµ vitamin

Dung dÞch mÑ cña vitamin vµ çc chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng cã thÓ ®îc pha ë nång ®é gÊp 100 ®Õn 1000 lÇn so

víi nång ®é yªu cÇu trong m«i trêng. X¸c ®Þnh lîng mong muèn cho mét lÝt m«i trêng, thÓ tÝch dung dÞch

mÑ cÇn thiÕt ®Ó pha liÒu ®ã cña vitamin hoÆc çc chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng vµ thÓ tÝch dung dÞch mÑ muèn pha.

Bíc 1. §Ó pha dung dÞch mÑ cho nicotinic acid, h·y xem cÇn cã mét lîng bao nhiªu cho 1 lÝt m«i trêng. §Ó

vÝ dô, chóng ta sÏ gi¶ ®Þnh sÏ pha m«i trêng MS vµ v× thÕ sÏ cÇn 0.5 mg.

Bíc 2. SÏ rÊt tiÖn lîi nÕu nh cã thÓ cho 0.5 mg nicotinic acid b»ng viÖc cho mét thÓ tÝch dung dÞch nicotinic

acid mÑ t¬ng ®¬ng víi 1 ml. NÕu 0.5 mg nicotinic acid cÇn ph¶i cã trong 1 ml dung dich mÑ th× (gÊp lªn 100)

cÇn 50 mg cho 100ml dung dÞch mÑ. 1 l cã thÓ chøa vµo èng 1.5 ml vµ gi÷ trong tñ l¹nh (-20o C).

Bíc 3. §Ó chuÈn bÞ mét dung dÞch mÑ chÊt ®iÒu hoµ sinh trëng, thÝ dô IBA cho mét m«i trêng ra rÔ. NÕu

cÇn 1.0 mg/l IBA trong m«i trêng nu«i cÊy th× dung dÞch cña chóng ta cÇn chøa 1 mg trong mçi mililiter cña

dung dÞch mÑ IBA. Chóng ta cÇn c©n 100mg IBA cho 100ml dung dÞch IBA mÑ. IBA Ýt hoµ tan trong níc v×

vËy cÇn pha chóng trong mét lîng nhá (-1ml) dung dÞch kiÒm nh lµ 95 % ethanol, 100% propanol, 1 N KOH.

KhuÊy cho ®Õn khi hoµ tan råi thªm tõ tõ phÇn níc cßn l¹i cho ®Õn khi ®¹t thÓ tÝch cuèi cïng lµ 100ml. §¸nh

dÊu tªn dung dÞch mÑ vµ thªm 1 ml cho mçi lÝt m«i trêng. Chøa trong b×nh tèi mÇu vµ cÊt rong tñ l¹nh (4o C).

Chó ý: rÊt nhiÒu chÊt sinh trëng cÇn chó ý ®Æc biÖt khi hoµ tan. IAA, IBA, NAA, 2,4-D, benzyladenine, 2-iP vµ

zeatin cã thÓ hoµ tan trong 95 % ethanol, 100 propanol hoÆc 1 N KOH. Kinetin vµ ABA hoµ tan tèt nhÊt trong 1

N KOH nhng thidiazuron sÏ kh«ng hoµ tan trong c¶ kiÒm vµ base vµ v× vËy cÇn dïng mét lîng nhá

dimethylsulfoxide. B»ng viÖc chØ sö dông 1 ml mçi dung dÞch mÑ, chØ mét lîng rÊt nhá kiÒm bÞ thªm vµo trong

m«i trêng vµ sÏ gi¶m tèi thiÓu t¸c ®éng ®éc.

Bíc 4. ®Ó pha dung dÞch mÑ cña IBA trong trêng hîp chóng ta muèn 5 M dung dÞch IBA trong m«i trêng.

Tra khèi lîng ph©n tö cña IBA lµ 203.2 Sö dïng cïng mét tØ lÖ nh trong 2 thÝ dô tríc, chóng ta muèn cã 5

M hoµ tan vµo m«i rêng b»ng viÖc sö dông 1 ml dung dÞch mÑ IBA. V× vËy ®Ó pha 100ml dung dÞch mÑ, cÇn

ph¶i cã 500 molhoÆc 0.5 mol (mM) trong 100 ml dung dÞch mÑ. NÕu 1 mol lµ 203.2 g, 1mmol lµ 203.2 mg v×

vËy 0.5 mmol IBA x 203.2mg/1mmol = 101.6 mg IBA cÇn cho 100 ml dung dÞch mÑ cña IBA. §Ó chuÈn bÞ


dung dÞch, c©n IBA, hoµ tan trong 1 N KOH nh ®· m« t¶ ë trªn vµ ®¸nh dÉu dung dÞch mÑ vµ cÊt gi÷ trong tñ

l¹nh (4o C) trong b×nh tèi mÇu. Thªm 1 ml dung dÞch mÑ IBA ®Ó ph©n phèi 5 M cho mçi lÝt m«i trêng.

2.2. Dung dÞch mÑ çc muèi kho¸ng

Çc muèi kho¸ng cã thÓ ®îc chuÈn bÞ thµnh d¹ng dung dÞch mÑ gÊp tõ 10 ®Õn 1000 lÇn nång ®é dïng trong

m«i trêng. Çc muèi kho¸ng thêng ®îc ph©n nhãm thµnh 2 nhãm dung dÞch mÑ, mét gåm çc nguyªn tè ®a

lîng vµ mét cho vi lîng, tuy nhiªn trõ khi chóng ®îc gi÷ t¬ng ®èi pha lo·ng (10x) nÕu kh«ng sÏ x¶y ra

hiÖn tîng kÕt tña. §Ó pha ®îc dung dÞch mÑ cã nång ®é ®Ëm ®Æc h¬n, ph¬ng ph¸p thêng sö dông lµ chia

theo nhãm çc ion mµ chóng chøa nh nitrate, sulfate, halide, P, B, Mo, vµ s¾t vµ pha chóng thµnh dung dÞch

meristem 100x. B¶ng 2 liÖt kª çc çc dung dÞch mÑ cho m«i rêng MS pha ë nång ®é 100x tøc 10 ml cña mçi

dung dÞch mÑ ®îc dïng ®Ó pha cho 1 L m«i trêng. Mét sè dung dÞch mÑ cÇn mét sè bíc phô ®Ó çc hîp chÊt

®îc hoµ tan (thÝ dô dung dÞch mÑ NaFeEDTA), hoÆc lµ ®ßi hái ph¶i pha lo·ng liªn tôc ®Ó ®¹t ®îc lîng cùc

nhá cña dung dÞch mÑ (dung dÞch mÑ cña sulfate vµ halide).

§«i khi, mét lîng rÊt nhá cña hîp chÊt nµo ®ã cÇn cho vµo m«i trêng nu«i cÊy vµ v× thÓ rÊt khã c©n mét

lîng t¬ng øng thËm chÝ cho 100x dung dÞch mÑ. V× lîng nhá nh vËy kh«ng thÓ c©n mét çch chÝnh x¸c, Kü

thuËt pha lo·ng liªn tiÕp ®îc sö dông.ThÝ dô sau ®©y m« t¶ lµm thÓ nµo ®Ó pha lo·ng liªn tiÕp ®Ó thu ®îc mét

lîng chÝnh x¸c mét hîp chÊt ( vÝ dô ë ®©y lµ CuSO4. 5H2O) cña m«i trêng cho dung dÞch mÑ thÝch hîp cña

nã.

Dung dÞch mÑ cÇn 2.5 mg CuSO4. 5H2O nh mét phÇn cña dung dÞch mÑ sulfate cña m«i trêng MS. Pha dung

dÞch mÑ ban ®Çu b»ng çch cho 25 mg CuSO4. 5H2O trong 100 ml níc cÊt. Sau khi khuÊy kü lìng, dïng 10

ml dung dÞch nµy (cã chøa 2.5 mg mong muèn) vµ cho vµo dung dÞch sulfate mÑ. Qui tr×nh nµy chØ cÇn 1 lÇn

pha lo·ng nhng bÊt kú mét hîp chÊt nµo còng cã thÓ ®îc pha lo·ng mét hoÆc nhiÒu lÇn ®Ó thu ®îc lîng

mong muèn.

3. Pha chÕ m«i trêng nu«i cÊy

3.1. Thµnh phÇn m«i trêng nu«i cÊy


Bảng 2. Thµnh phÇn m«i trêng MS & çch pha chÕ

Ký hiÖu DD mÑ

Thµnh phÇn Sè mg/ 1 lÝt

MT nu«i cÊy

Sè mg/ 100 ml DD

mÑ

§a lîng

MS1

(20ml/l)

NH4NO3 1650 8250

KNO3 1900 9500

MgSO4.7H2O 370 1850

MS2

(10ml/l)

KH2PO4 170 1700

MS3

(10ml/l)

CaCl2.2H2O 440 4400

Vi lîng

MS4

(10ml/l)

MnSO4.4H2O 23,3 233

ZnSO4.7H2O 8,6 86

H3BO3 6,2 62

KI 0,83 8,3

Na2MoO2.2H2O 0,25 2,5

CuSO4.5H2O 0,025 0,25

CoCl2.6H2O 0,025 0,25

MS5

(5ml/l)

Na2EDTA 37,3 746

FeSO4. 7H2O 27,8 556

Vitamin vµ

axit amin

MS6

(5ml/l)

Thiamine HCl 0,1 2

Nicotinic axit 0,5 10

Pyridoxine HCl 0,5 10

Glycine 2 40

§êng

Myo-inositol 100

Sucrose (g/l) 20-30


3.2. Çch pha chÕ:

- Cho níc khö ion vµo b×nh chøa víi thÓ tÝch kho¶ng 2/3 thÓ tÝch dung dÞch cÇn pha;

- LÇn lît lÊy çc hãa chÊt tõ dung dÞch mÑ víi lîng t¬ng øng cho thÓ tÝch dung dÞch lµm viÖc cuèi cïng cÇn

pha.

- Dïng níc khö ion lÓ lªn thÓ tÝch mong muèn

- ChuÈn PH vÒ gi¸ trÞ mong muèn vµ chia vµo çc b×nh nu«i cÊy

3.3. Khö trïng m«i trêng nu«i cÊy

M«i trêng nu«i cÊy m«, ngoµi viÖc cung cÊp m«i trêng lý tëng cho sù sinh trëng cña çc tÕ bµo thùc vËt cßn

lµ gi¸ thÓ lÝ tëng cho sinh trëng cña nÊm khuÈn. Nu«i cÊy in vitro lµ nu«i cÊy trong ®iÒu kiÖn v« trïng. NÕu

kh«ng ®¶m b¶o tèt ®iÒu kiÖn v« trïng, mÉu nu«i cÊy hoÆc m«i trêng sÏ bÞ nhiÔm, m« nu«i cÊy sÏ bÞ chÕt. §iÒu

kiÖn v« trïng cã ý nghÜa quyÕt ®Þnh víi sù thµnh b¹i cña nu«i cÊy in vitro. V× vËy cÇn khö trïng m«i trêng,

b×nh cÊy, çc dông cô vµ thiÕt bÞ vµ c¶ bÒ mÆt mÉu cÊy.

Ph¬ng tiÖn vµ ho¸ chÊt khö trïng

Nåi hÊp tiÖt trïng: Sö dông cho viÖc khö trïng m«i trêng nu«i cÊy, dông cô nu«i cÊy b»ng h¬i níc cã ¸p suÊt

vµ nhiÖt ®é cao (1,2 - 1,5 atm, 120 - 1300C).

Tñ sÊy: §Ó sÊy kh« çc dông cô thuû tinh vµ dông cô cÊy. Còng cã thÓ sÊy ®Ó tiÖt trïng ë nhiÖt ®é cao (160 -

2000C).

PhÔu läc v« trïng lo¹i micropore ( 0,2 m ): Dïng khö trïng çc lo¹i dung dÞch kh«ng khö trïng ®îc ë nhiÖt

®é cao nh dung dÞch enzym hoÆc mét sè chÊt ®iÒu tiÕt sinh trëng. HiÖn nay ngêi ta thêng sö dông mét hÖ

thèng b¬m khö trïng dung tÝch lín ®Ó thanh trïng çc dung dÞch nu«i cÊy khi nu«i cÊy protoplast hay huyÒn phï

tÕ bµo.

Các loại môi trường cần pha


Bµi 3

Kü thuËt khö trïng mÉu cÊy vµ nu«I CÊy khëi ®éng (0 tiÕt)

BÀI 4

ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI (5 TIẾT)

- Tạo callus/ Chồi: Pentunia, thuốc lá môi trường tương ứng

A. Môc ®Ých, yªu cÇu

- Sinh viªn n¾m b¾t ®îc nh÷ng thao t¸c c¬ b¶n khi sö dông buång cÊy v« trïng.

- Sinh viªn n¾m ®îc çc bíc c¬ b¶n cña kü thuËt khö trïng mÉu cÊy.

- HiÓu ®îc nguyªn t¾c ®iÒu khiÓn sù ph¸t sinh h×nh th¸i trong nu«i cÊy khëi ®éng.

B. Néi dung:

I. Kü thuËt khö trïng mÉu cÊy

VÒ mÆt nguyªn t¾c, cã 4 nguån l©y nhiÔm chÝnh: thùc vËt ( bÒ mÆt còng nh bªn trong), m«i trêng dinh dìng (

khö trïng cha thÝch hîp), kh«ng khÝ vµ ngêi lµm nghiªn cøu ( lµm viÖc cha chÝnh x¸c). Trong 4 nguån nµy

th× quan trong nhÊt lµ b¶n th©n thùc vËt vµ nguång vËt liÖu nªn ®îc khö trïng thÊt tèt tríc khi nu«i cÊy in

vitro.

Khö trïng mÉu cÊy: tríc khi khö trïng, cÇn lo¹i bá ®Êt bÈn hay nh÷ng phÇn ®· chÕt. Sau khi röa s¹ch b»ng

níc th× cã thÓ b¾t ®Çu qu¸ tr×nh khö trïng, thêng diÔn ra nh sau: ng©m nguån mÉu trong dung dÞch alcohol

70% trong vµi gi©y ( acolhol 96 % thêng lµ qu¸ m¹nh, dÉn ®Õn sù mÊt níc qu¸ møc) ®Ó laäi bá çc bät kh«ng

khÝ trªn bÒ mÆt; sau ®ã khö trïng trong 10 - 30 phót trong 1 % NaClO cã chøa vµi giät Tween 20 hay 80 råi röa

l¹i b»ng níc khö trïng (thêng lµ 3 lÇn øng víi mçi 2, 5 vµ 15 phót). Sau çc bíc trªn, cã thÓ tiÕn hµnh c¾t vËt

liÖu thµnh çc mÉu cÊy nhá trong ®iÒu kiªn v« trïng ( buång cÊy) vµ sö dông çc dông cô ®îc khö trïng ( ®Æt

trong cån 96 % sau ®ã ®èt b»ng ngän ®Ìn cån hay èng ga).

Sù khö trïng b»ng ho¸ chÊt

Sù l©y nhiÔm bëi çc vi sinh vËt cã thÓ lo¹i trõ b»ng viÖc sö dông çc ho¸ chÊt khö trïng. Çc ho¸ chÊt thêng

dïng lµ:

- Acolhol (ethanol) cån 70% thêng dïng cho mÉu cÊy v× cån 96 % g©y mÊt níc qu¸ m¹nh.

- ChÊt tÈy hay sodium hypochloride. Nång ®é thêng dïng lµ 1 %. Còng cã thÓ dïng nång ®é cao h¬n nh 1,5

0.2 % NaClO. NÕu mÊu cÊy ®Æc biÖt nh¹y c¶m víi NaClO th× cã thÓ thay thÕ b»ng Ca - hypochloride.

- Ca - hypochloride. Thßng ë d¹ng bét vµ hoµ tan dÔ dµng trong níc. Thêng khö trïng trong 5 - 30 phót ë

nång ®é phæ biÕn lµ 35 - 100 g/ l. Ca (ClO)2 thêng thÊm vµo m« chËm h¬n NaClO.


- Clorua thuû ng©n HgCl2 hoµ tan trong níc. §©y lµ hîp chÊt cùc ®éc f®èi víi c©y còng nh con ngêi vµ ®éng

vËt. Thßng dïng ë nång ®é 0.01 - 0.05 % (w/v) trong 2 - 12 phót. CÇn röa thËt kü vµ níc th¶i kh«ng nªn ®æ

trùc tiÕp vµo m«i trêng mµ kh«ng qua xö lý l¹i.

HiÖu qu¶ khi khö trïng b»ng ho¸ chÊt cã thÓ t¨ng lªn nÕu mÉu ®îc röa thËt lü b»ng níc s¹ch tríc khi khö

trïng. ViÖc ng©m mÉu cÊy trong cån 70 % trong vµi gi©y lµm t¨ng hiÖu qu¶ tiÕp xóc cña ho¸ chÊt lªn bÒ m¹t

mÉu cÊy. Cã thÓ thªm vµo giät Tween 20 hay 80 vµo dung dÞch khö trïng còng lµm t¨ng ®é b¸m dÝnh bÒ mÆt.

KhuÊy mÉu thêng xuyªn khi dïng NaClO vµ nÕu thùc hiÖn trong ®iÒu kiÖn ch©n kh«ng sÏ lµm t¨ng hiÖu qu¶

khö trïng râ rÖt.

Lo¹i ho¸ chÊt, nång ®é vµ thêi gian khö trïng ®îc lùa chän tuú thuéc vµo tõng ®iÒu kiÖn cô thÓ.

II. Nu«i cÊy khëi ®éng

1. Môc ®Ých: n¾m ®îc çc bíc trong kü thuËt khö trïng mÉu vµ t×m hiÓu sù ph¸t sinh h×nh th¸i cña mÉu

®a vµo nu«i cÊy

2. VËt liÖu: v¶y cñ hoa lily/thuốc lá

3. Ho¸ chÊt, m«i trêng nu«i cÊy:

- Çc ho¸ chÊt khö trïng: Cån 70%, Dung dÞch HgCl2 0,1%

- M«i trêng

a. MS + 3 % đường + 0.03 mg/l NAA. (Lily A)

b. MS + 3 % đường + 0.3 mg/l NAA + 3.0 mg/l BA (Lily B)

4. Çc bíc tiÕn hµnh

4. 1. Çch sö dông tñ cÊy v« trïng

- Tríc khi tiÕn hµnh sö dông tñ cÊy, dïng cån 70% lau s¹ch buång cÊy. Sau ®ã ®ãng cöa kÝnh buång cÊy,

bËt ®Ìn tö ngo¹i vµ qu¹t th«ng giã trong 20 phót. Sau ®ã t¾t ®Ìn tö ngo¹i, vÉn bËt qu¹t th«ng giã thªm

10’ n÷a råi bËt ®Ìn chiÕu s¸ng ®Ó lµm viÖc.

4.2. Çc bíc khö trïng mÉu cÊy

- Dïng níc xµ phßng röa thËt s¹ch mÉu cÊy, röa l¹i b»ng níc thêng cho hÕt xµ phßng, röa l¹i b»ng

níc cÊt Cho toµn bé mÉu vµo b×nh ®ùng 200 ml vµ ®em vµo buång cÊy ®Ó khö trïng. Çc bíc khö

trïng trong buång cÊy nh sau:

- Röa b»ng níc cÊt v« trïng 1 lÇn Röa b»ng cån 70% trong 20 gi©y Röa b»ng níc cÊt v« trïng 1

lÇn trong 1 phót Ng©m trong dung dÞch HgCl2 trong 10 -15 phót tuú tõng lo¹i mÉu cÊy, võa ng©m võa


l¾c Röa l¹i b»ng níc cÊt v« trïng 3 lÇn, mçi lÇn 1 phót ThÊm kh« b»ng giÊy v« trïng CÊy vµo

m«i trêng.

4.3. CÊy mÉu

- Mçi sinh viªn sö dông 01 v¶y cñ, c¾t ngang v¶y cñ thµnh tõng l¸t máng dÇy kho¶ng 1-2 mm tèi cÊy vµo

m«i trêng ®· chuÈn bÞ s½n theo thø tù tõ gèc v¶y ®Õn ®Çu v¶y. §¸nh sè theo vÞ trÝ cña çc líp máng v¶y

cñ ®Ó theo dâi sù ph¸t sinh h×nh th¸i.

4.4. Mét sè chØ tiªu cÇn theo dâi

- Thêi gian ph¸t sinh h×nh th¸I ( ngµy); Tû lÖ nhiÔm (%); Tû lÖ t¸i sinh chåi (%); Sè chåi /mÉu cÊy; Tû lÖ

t¸i sinh cñ (%); Tû lÖ t¸i sinh m« sÑo (%)

- Çc hiÖn tîng kh¸c

**********************

bµi 4

kü thuËt Nh©n nhanh In vitro (5 tiÕt)

I. Môc ®Ých, yªu cÇu:

- Sinh viªn hiÓu ®îc çc ®êng híng sö dông trong nh©n nhanh in vitro gièng c©y trång vµ çc thao t¸c

kü thuËt t¬ng øng.

II. Néi dung:

- Nh©n nh©n b»ng phong ph¸p cắt đoạn thân - Nh©n nh©n b»ng phong ph¸p t¸ch chåi ®¬n

III. Çc bíc tiÕn hµnh:

3.1.VËt liÖu: đoạn thân khoai tây/chuối

3.2.Môi trường nhân nhanh

c. Cây hoa Bỏng: MS + 0.5 mg/l BA 3% đường ( POT)

d. Cây chuối (chồi): MS + 2 mg/l BA + 3% đường ( BAN) + 10% nước dừa

3.3. Thao tác:

- Vô trùng buồng cấy

- Cây hoa Bỏng: Nhấc từng cây hoa bỏng in vitro, cắt lấy mô lá rồi cấy vào môi trường đã chuẩn bị sẵn

- Chuối: Dùng panh gắp các cụm chồi từ bình mẫu, tách lấy chồi đơn hoặc cụm chồi rồi cấy vào các bình

môi trường đã chuẩn bị sẵn

- Chỉ tiêu theo dõi: quan sát và ghi chép số liệu sự nhân các chồi mới qua các tuần.



bµi 5

Nu«i cÊy bao phÊn/h¹t phÊn (4 tiÕt)

I. Mục đích, yêu cầu:

- Hiểu và quan sát được các giai đoạn phát triển của hạt phấn

- Nắm được các kỹ thuật thao tác trong nuôi cấy hạt phấn, bao phấn và quan sát được sự phát sinh hình thái từ

hạt phấn, bao phấn.

II. Nội dung:

- Tách, nhuộm và quan sát hạt phấn dưới kính hiển vi

- Tách, nuôi cấy hạt phấn in vitro

IV. Các bước tiến hành

4.1.Vật liệu:

- Bao phấn, hạt phấn Hoa hồng/hoa ly

4.2. Phuơng pháp khử trùng:

-Nụ Hồng: HgCl2 10% trong 15-20 phút

4.3.Môi trưòng nuôi cấy:

- Bao phấn Hoa hồng: MS + 30 g/l đường+ 2 mg/l 2,4-D+ 0,5 mg/l Kinetin (ROS)

4.4. Thao tác:

- Tách, nhuộm bao phấn và quan sát hạt phấn dưới kính hiển vi

- Khử trùng buồng, dụng cụ nuôi cấy

- Khử trùng mẫu cấy

- Dùng dao cắt tách dần các cánh hoa phía ngoài, lấy dao panh gạt các bao phấn, thấm khô rồi cấy vào các

đĩa peptri

- Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ chếtm tỷ lệ tạo calluss và sự phát sinh hình thái khác…


bµi 6

kü thuËt nu«I cÊy ph«I (4 tiÕt)

I.Mục đích, yêu cầu:

Sinh viên nắm được sự phát sinh hình thái từ nuôi cáy phôi non và nắm được các kỹ thuật nuôi cấy phôi

in vitro

II.Nội dung:

- Kỹ thuật nuôi cấy phôi hạt cà chua

III. Các bước tiến hành

3.1.Vật liệu: Quả cà chua xanh, chín

3.2. Môi trường:

a. MS (TOMA)

b. MS + 3 % đường (TOMB)

3.3. Thao tác

- Khử trùng bề mặt quả cà chua bằng thủy ngân 0.1 % hoặc H2O2 đặc (40 %)

- Tách lấy phôi hạt cà chua và cấy vào môi trường đã chuẩn bị sẵn

3.4. Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ nhiễm, tỷ lệ phát sinh hình thái; dạng phát sinh hình thái

***********************************

KỸ THUẬT CẢM ỨNG TẠO CALLUS (4 TIẾT) chuyển lên bài 2

NUÔI CẤY SINH KHỐI CALLUS


- Sinh viên hiểu được ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, loại mô nuôi cấy đến sự hìnht hành callus

II. Nội dung:

- Cảm ứng tạo callus từ mô lá

- Cảm ứng tạo callus từ đoạn thân


3.1.Vật liệu, môi trường nuôi cấy

- Cây thuốc lá in vitro

- Môi trường: MS + 3% sucrose, 1 mg/l BA, and 0.1 mg/l IAA (TOB)

3.2. Thao tác:

- Cắt mô lá với kích thưứoc 0,5-1 cm , tạo vết thưưong cơ giới trên bề mặt rồi cấy vào môi trường đã

chuẩn bị

- Cắt đoạn thân theo chiều dọc, chiều ngang với kích thước từ 0,5 đến 1 cm rồi cấy vào môi trường

3.3. theo dõi: theo dõi sự phát sinh callus của các mẫu cấy khác nhau: mô lá, đoạn thân cắt ngang, đoạn

thân cắt đứng.


bµi 7

KỸ THUẬT TÁCH MERISTEM (5 TIẾT)


- Sinh viên nắm được kỹ thuật tách meristem dưới kính hiển vi

II. Nội dung:

- Tách meristem cây hành tỏi

- Tách meristem chồi ngọn khoai lang

- Tách meristem một số đối tượng khác ( sinh viện tự mang mẫu)


- Sinh viến tiến hành quan sát, tách meristem dưới sinh hiển vi soi nổi

KỸ THUẬT THÍCH NGHI CÂY IN VITRO NGOÀI VƯỜN ƯƠM (5 tiết)

- chuẩn bị giá thể

- chuẩn bị dung dịch dinh dưỡng

Buổi 1: Pha môi trường nuôi cấy

Buổi 2: Các đường hướng phát sinh hình thái

Buổi 3: Nhân nhanh + Hạt phấn

Buổi 4: Meristem + nuôi cấy phôi

Buổi 5 : kiểm tra + ra cây


-

- Các môi trường cần chuẩn bị trong buổi thực hành 1

Mỗi sinh viên tự chuẩn bị các loại môi trường nuôi cấy sau (1 bình/1 loại môi trường)

Môi trường nhân nhanh

a. Hoa Bỏng: MS + 3% đường ( POT)

b. Cây chuối (chồi): MS + 2 mg/l BA + 3% đường ( BAN)

Môi trường nuôi cấy bao phấn hoa hồng

MS + 30 g/l đường+ 2 mg/l 2,4-D+ 0,5 mg/l Kinetin ( ROS)

Môi trường cảm ứng tạo callus (thuốc lá)

MS + 3% sucrose, 1 mg/l BA, and 0.1 mg/l IAA (TOB)

Môi trường nuôi cấy phôi non hạt cà chua

- MS (TOMA)

- MS + 3 % đường (TOMB)

Mỗi sinh viên chuẩn bị 4 bình nhỏ, mỗi bình chứa 15 ml môi trường các loại. Mục có hai loại môi

trường ½ nhóm chuẩn bị môi trường a. ½ nhóm chuẩn bị môi trường b.

Documents

cnsh.vnua.edu.vn tap CNTB_2013_28.08.pdf · NT Phương Thảo, NT Lâm Hải, NT Thảo, NT Huệ 2 II. Trang thiết bị phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật C¸c thiết