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家畜繁殖において人工授精(AI)の成功率を上げる"精液のその場処理技術“
～元気な精子の捕集と性分離の両立
独立行政法人産業技術総合研究所 生産計測技術研究センター
主任研究員 山 下 健 一
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本技術のポイント その場で使える器具、元気な精子を従来
法の百万倍の効率で捕集、そのまま人工
授精へ 元気な精子を集めるだけでなく、性比を偏
らせた精液調製技術 外国の特許に左右されず、任意の種牛の
精液を処理できる性選別技術
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畜産における繁殖
畜産の中でも「牛」をターゲット ・・・牛は経済動物・法律でも特別扱い
・1年一産で1頭しか生まない
・用途により性別要求が異なる（肉牛・乳牛） ・繁殖のほぼすべてが「人工的な交配」で、
そのうちのほとんどが、体外受精ではなく「人工授精」。 ※ちなみに、その繁殖技術の多くは、人間の不妊治療の知見を活かしている。
人工授精では、体外受精に比して、 高濃度・高活力・多量の精液が必要。
さらに、性別の産み分けも重要。
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繁殖技術開発による生産性向上 牛だって生き物… 期待通りに妊娠出産してくれるわけではない 一度の1頭しか生まれない 1か月子牛の誕生が遅れると利益が5万円単位で吹き飛ぶ 妊娠しないと牛乳出ないし 牛は夏に弱い…じゃあ、冬に頑張って働くとか無理 どの季節にも出荷し続けないといけないし
畜産業における経営の計画性向上の大前提は、 所望の時期に、 所望の性別を 妊娠させること
妊娠中
現状の問題点 下がり続ける妊娠成功率 一部の著名な種牛の精液による人工授精で繁殖 精液の配布形態は、0.5mL入りストローの凍結品→標準規格 解凍すると、生きている精子は2-5割。
死んだ精子由来の成分が邪魔をして 受胎率が大幅に低下。
緻密な繁殖計画と収益向上を可能にする、繁殖用精液処理技術 ①元気に動く精子の割合を高め、②希望の性の精子を得る技術
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元気な精子の割合を高める技術
これまでにも、元気な精子だけを捕集する（または、死んでいるものを取り除く）方法の報告や実用技術はすでにあった。
「Washing(含Centrifugation)」一旦全部遠心で落として展開液…元気分けというより成分分離。生存率気にしていない。 「Migration」生きているものだけが自力で泳いで移動できる。低収率。Migration chamberやWangTube。臨床応用中。 「Filtration」充填剤が高価。高収率。駆動力として遠心が必要・・・そもそも精子を遠心したくない。 マイクロ流体を利用したものも・・・生きている精子は横方向に逃げ出せることを利用したもの。
<従来技術との比較＞
せいぜい数十～数百程度の精子を対象としたものだった （体外受精用途）
一方、人工授精用途では、数千万の精子が必要
このギャップを克服するために、新しい発想の流体制御技術を考案
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研究計画立案に至る知識と経験
2002 2010 2006 2004 2008
高分子鎖の自発的伸長と理論的解明
分析チップへ応用
相溶な2液の境界を担体として利用
層流が分子の形を変える
×
DNA伸長下での効率的2本鎖形成
最初の反応性制御の例
-0.0015
0
200 250 300
分子の配向状態の分光分析
独自の機材開発を通じた偏光分析
LD
速
遅
層流下化学反応の熱力学的理解
°∆°∆
+
°∆=
HSCt
HR
Tm 4ln1
層流によるエントロピー制御＝秩序性の制御
層流下化学反応の反応速度論解析
層流による見かけの活性化エネルギーの制御
特異的酵素反応の機構解明
酵素と基質の効率的な複合体形成を突き止める
分子集合体の層流下再構成による均一化
どんなにバラバラからでも圧倒的再現性
層流による分子認識制御
DNAの相補配列認識能を層流で制御
×
2012
精子を流れで導く
自力で運動するものも層流で操る
「流れ」を使った制御技術；分子から精子へ 精子はそれ自体が動く・・・このことを積極的利用した流れ制御 精子の染色体を直接観るわけではない、まったく新しい発想
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ところで…マイクロ流体と層流
マイクロ流路内の流れは
層流
一方向的応力場環境 （特殊な力学的溶媒環境）
高度な流体制御性
(太さ数百μm程度)
乱流
一分子中に異なる流速作用
可溶な溶媒どうしが併走
流れを流路の形と速さで完全制御
どこで何が起こるかを容易に計算可能
異方的な溶媒や分子の衝突
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層流中での精子の動き これまでと違って、精子は、それ自体が自力で動き回る。
精子が泳いでいる方向
流れの方向
ランダムに泳ぎ回る精子は、層流中に置かれることで、条件次第でみんな一斉に同一方向へ泳ぎだす。 いわゆる「rheotaxis」として知られる現象。
精子の運動能力と層流の組み合わせ ※発表では、動画を使用します。
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二段階の層流による誘き寄せ
精製後精液 生存率95％ 濃度12百万/mL
精製前精液 生存率21％ 濃度69百万/mL
精子が泳いでいる方向
元気な精子だけが、自力で泳いで移動中
※濃度は、死んだ精子も含めたもの
精子が泳いでいる方向
流れの方向
基本的な考え方 黒毛和種の凍結精液を用いた場合の結果の一例 ! ポイント：生存率 × 濃度 = ほぼ一定
解凍精液を入れる液溜めと細い流路の間に、「薄い層状の領域」を設ける
運動速度 行動性質 を設計に反映
解凍精液を投入する液溜め
薄い層状の領域 この部分では、遅い層流。渦をできるだけ避けつつ、精子の運動特性を最大限に引き出す。 精液中のゴミ（毛や希釈液由来物）などを取り除き、生きている精子だけがこの領域に入り込むことができる。ただし、奇形や正しくない運動をするもの（例えば、ぐるぐる回る）も含めて、生きているものをすべて捕集。
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流路形状の最適化 この部分の形状の最適化で、効率百万倍！
「数値流体力学計算」
角があると渦ができる カド
レイノルズ数を低く層流を維持 適切な流速分布 渦や澱みのない軌跡分布 角を丸くしても澱む
カド
遅
速
ゆっくり たくさん捕捉
だんだん速く狙った運動能力
を捕捉
計算機上なら、凝った形状も気軽に試せる
↑正対位置から
鳥瞰図→
×
×
＋ 精子の層流中での 運動に関する知見
設計に反映
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狭い流路へ誘導される精子
※発表では、動画を使用します。
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運動してきた精子の回収
※発表では、動画を使用します。
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牛の雌雄産み分け でも、XY分け自体は、特に目新しくもない…かもしれない。
多くの報告 都市伝説も
発情から受精のタイミングが → 早いと雌、遅いと雄・・・が多いらしい・・・？
Reprod. Dom. Anim. 38, 224–227, 2003 人工授精前に、精液を放置しておく時間を変えると、性比が変化 Zygote, 11, 229-235, 2003 時間を変えて二重層チューブを使ってswim-upすることで性比を変化 Reprod. Dom. Anim. in press (DOI:10.111/rda.12252) Swim-upで長距離泳げるのはY Int. J. Andrology, 35, 880–886, 2012 精液を遠心するだけでYの割合が上がる Theriogenology 79, 890–894, 2013 ovsynch法でも、タイミングで性比に差が付きますが、季節変動もあり
＜タイミング法により、70％程度の産み分けはできている＞
＜唯一の商用技術；米国の技術＞ フローサイトメトリー法によりXY分けを行った性選別精液
長所：90％という高い性選択性 短所：低い受胎率、厳しいライセンス条件、高価
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産み分けはなぜできているのか？ 性ごとに違う精子の生化学的な性質を調べてみる。
Capacitationの利用 精子は卵子の突入するだけじゃない・・・ 多段のステージを突破するために、様々な生理学的・運動機能的変化を経る。XYで時間が違う。
エネルギー産生回路の利用 栄養を得るための代謝回路の微妙な違いを利用する。
抗原-抗体反応の利用 Yに特異的な抗原に対する抗体はすでに市販中。「MEA1」「SRY」…アフィニティクロマトや分解酵素等の利用。
Theriogenology, 55, 3-14, 2001 他
Mol.Reprod. Dev., 72, 201-207, 2005など。エネルギー産生回路は
複雑であるが、性選別の観点から整理された図が、米国特許US2010/0081862やUS2010/0087702にある。
SRY（性決定遺伝子のひとつ） MEA1（性決定遺伝子ではないが、Y染色体上に特異配列を持つ）
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XY分けのストラテジー
Y
X
Capacitationタイミング 精子能獲得
Y X
Capacitation
Capacitation
寿命
このタイミングではXもYも捕捉されるが、Capacitationを誘導することで雄を優先的に得られる。
このタイミングでは、X精子の運動能力が優勢であり、雌を優先的に得ることができる。
エネルギー産生回路の違い
精子はスタミナが必要
XとYでエネルギー産生回路に違いあり。 阻害段階を変えることで、XとYに運動能力の差をつける
特異的抗原の利用 アフィニティ クロマト型
キラー複合体型
「運動能力の差で分ける」という本技術を、XY分けの新しい手法とする。 完全停止でなくても、少しだけ運動能力に差を付ければいい。
時間
時間
or
壊す方については、 EP 2 402 757 A2 に報告あり
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精子の運動を利用したXY分けの実例 Capacitationタイミングを利用した方法
単に、一定時間静置後に、前述の「元気分け」を行うだけ。
X Y 9時間 43％ 57％
15時間 60％ 40％
X Y 6時間 38％ 61％
15時間 40％ 60％
黒毛和種A
黒毛和種B
ホルスタイン種A X Y
3時間 50％ 50％ 15時間 57％ 43％
・この方法は、本質的にX狙いの方が簡単 ・牛によって、狙いを定める時間が異なる おそらく、製造ロット（凍結までの放置時間や採精季節など）によっても違うと想像 ・現状では、濃度を無視すれば、7：3くらいは達成。
性比は、リアルタイムPCRで決定。 繰り返し再現性は、CV値にしておよそ±10％ Y
X
Capacitation
Capacitation
寿命 時間 時間
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精子の運動を利用したXY分けの実例 エネルギー産生回路の違いを利用した方法
ホルスタイン種B X Y
条件① 36％ 64％ 条件② 35％ 65％
Yのエネルギー産生を加速する 試薬を添加した場合の結果
・Capacitationによる方法よりは、牛の個性は反映されにくい。 ・現状では、濃度を無視すれば、70%くらいは達成。
Y
X
黒毛和種B X Y
条件③ 35％ 65％
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新技術の特徴・従来技術との比較
• 従来法の百万倍の処理効率で、人工授精にそのまま使える「高活力精液」調製技術
• 生死だけではなく、運動能力ごとに捕集する技術
• 運動能力別捕集技術を応用した精子の性分離技術
• 所望の時期に、所望の性別で妊娠することによる、畜産の生産性と計画性向上
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新技術の特徴・従来技術との比較
• 精子へのダメージレス • お好きな雄牛の精液を、必用に応じて処理 • 圧倒的に安価な手法
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想定される用途
• 家畜繁殖用精液の性能向上・高付加価値化 • 家畜繁殖用精液の製造時に事前処理、または人工授精等使用時にその場処理
• 精液の活度と性選別性能のバランスをご自由にチョイス
• 不妊治療における、人工授精（AI）や体外受精（IVF）の精液前処理の簡略化
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実用化に向けた課題
• 処理量は、現状、規格ストロー数本分のプロトタイプ。大量処理（せいぜい10倍？）用は、必要に応じて検討
• 性選別精度は一つの手法で70％程度達成。
さらなる向上のため、既存技術を応用したアフィニティクロマト方式を併用予定
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企業への期待
• 簡便に使用することのできる、ディスポ器具やキットの製造と販売
• 大規模農場での繁殖作業の受託により、実効的な出荷サイクル期間の短縮効果
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本技術に関する知的財産権 • 発明の名称：精子の選抜部構造及び同精子の選抜部構造を備えた精子スクリーニング装置並びに人工授精用精子液の調製方法
• 出願番号：特願2013-219451（国内優先権主張出願） • 出願人：独立行政法人産業技術総合研究所 • 発明者：山下健一、宮崎真佐也、永田Maria Portia
B.、前田英明 ならびに上記を基礎出願とするPCT出願 • PCT/JP2014/50013
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お問い合わせ先
独立行政法人産業技術総合研究所
イノベーションコーディネーター
犬 養 吉 成
ＴＥＬ 0942-81-4002
ＦＡＸ 092-292-5998
e-mail [email protected]
