Colorimetria y Espectrofotometria

Colorimetría yColorimetría y Espectrofotometríap

Determinación de la concentraciónDeterminación de la concentración de un soluto

“Técnicas Instrumentales de Análisis en Bioquímica” J. M. García Segura y otros.

Técnicas Fundamentales en Biología 2009‐2010

q g yEditorial Síntesis, 1996. Capítulo 2: Espectroscopía de absorción ultravioleta‐visible

Radiación electromagnéticaRadiación electromagnética: propagación a través del espacio de una perturbación electromagnética producida en algún punto del mismo

H. Hertz, 1884: La luz es un tipo de radiación electromagnética que puede ser detectada por el ojo humano (luz visible)

Espectroscopía: técnica de análisis molecular basada en el estudio de las interacciones que seEspectroscopía: técnica de análisis molecular basada en el estudio de las interacciones que se producen entre las radiaciones electromagnéticas y las moléculas

Puede ser considerada desde un punto de vista corpuscular y ondulatorio (espectroscopía)

P á t d l dParámetros de la onda:

Longitud de onda (λ): distancia que existe entre dos puntos en los que el valor del campo eléctrico (E) es el mismo (módulo, dirección y sentido)

Unidades de longitud (nm), sirve para establecer una clasificación de las radiaciones electromagnéticas

En otras espectroscopías también se utilizan otros parámetros como el número de ondasEn otras espectroscopías también se utilizan otros parámetros como el número de ondas (oscilaciones/unidad de longitud) y la frecuencia (oscilaciones/unidad de tiempo)

Intensidad (I) : energía que atraviesa la unidad de área, perpendicular a la dirección de propagación por unidad de tiempopropagación, por unidad de tiempo


Ondas electromagnéticas:Representación de dos ondas electromagnéticas, A y B, con el mismo sentido de propagación e igual longitud de onda, pero diferentes en cuanto al máximodiferentes en cuanto al máximo valor de módulo del vector de campo eléctrico (Eo y Eo’) y, por tanto, de distinta intensidad


Espectro de radiaciones electromagnéticasLas longitudes de onda que definen cada región corresponden a valores orientativos, pues se trata de una variación continua




I ió d l di ió• Dispersión

Interacción de la radiación UV‐Visible con la materiaCuando la radiación electromagnética atraviesa la materia se pueden producir tres tipos de fenómenos: dispersión, absorción y emisiónabsorción y emisión.

Dispersión: retraso de la radiación, disminución de la velocidad de propagación a través p p gde ese medio y reducción de la intensidad.

Una de las manifestaciones macroscópicas de este efecto es la refracción que se concreta en el índice de refracción, definido como el cociente entre lacomo el cociente entre la velocidad de la radiación en el vacío y en el medio considerado


I ió d l di ió• Absorción


Absorción: Si a las moléculas presentes en el medio se les hace interaccionar con radiación electromagnética de una frecuencia tal que su energía coincida con la diferencia existente t d i l l t ó ientre dos niveles electrónicos,

tendrá lugar una transición electrónica. Se requiere radiación electromagnética de λ<1.000 nm gque coincide con la región del espectro correspondiente al UV‐Visible. Si ocurre esto, no se

d di ió i b ióproduce dispersión sino absorción


I ió d l di ió• Emisión


Emisión: El retorno de los electrones excitados al estado fundamental se puede producir p pemitiendo luz. Estas emisiones se denominan radiativas y pueden ser Fluorescentes (F) o Fosforescentes (P)(P)


Ecuación de Lambert‐Beer. Coeficiente de extinción

Si un haz de luz atraviesa un material que contiene cromóforos será absorbida y la intensidad de la luz emergente será:

I = I0 – Ia

donde I es la intensidad de luz absorbida durante el trayecto La ecuación que gobierna estedonde Ia es la intensidad de luz absorbida durante el trayecto. La ecuación que gobierna este comportamiento es conocida como Ley de Lambert:

dI(x)/I(x) = -kdxDonde I(x) es la intensidad de luz en el medio estudiado cuando la radiación ha recorrido una distancia x. Integrando la ecuación entre I e I0 y entre 0 y 1, se convierte en:

LnI - LnI0 = -kl o I = I0e-kl0 0

Donde I e I0 son las intensidades de luz emergente e incidente, k es el coeficiente de absorción que depende de las moléculas de ese medio y l es el espesor de dicho medio

Cuando se estudia la absorción de moléculas biológicas se trabaja con disoluciones acuosas SiCuando se estudia la absorción de moléculas biológicas se trabaja con disoluciones acuosas. Si se quiere cuantificar un soluto, habrá que usar un disolvente que no absorba a la misma longitud de onda, por lo que la absorción de la disolución será función directa de la concentración de soluto: Ley de Beer:


concentración de soluto: Ley de Beer:

I = I0e-2,303εCl

Ecuación de Lambert‐Beer. Coeficiente de extinción

donde C es la concentración de soluto y ε un coeficiente de extinción molar a la λconsiderada. ε es una medida de la capacidad que tiene cada cromóforo de absorber radiación. Sus unidades son M‐1 cm‐1. En vez de espesor del medio (l) se habla de paso óptico (l), la distancia en cm que recorre la radiación al atravesar la disolución.

En la práctica no se mide la intensidad de la luz absorbida sino otras magnitudes relacionadas: la Transmitancia, T, y la Absorbancia, A, ambas adimensionales:

T = I/I0100 ; A = log I0/IT I/I0100 ; A log I0/IA partir de las ecuaciones anteriores se deduce la Ley de Lambert‐Beer:

A = εClAbsorbancia es directamente proporcional a la concentración de soluto

Coeficiente de extinción molar: absorbancia de una disolución 1 M de un soluto para un paso óptico de 1 cmp

Densidad óptica: absorbancia de una muestra cuando el paso óptico es de 1 cm


V i ió d lVariación de la Transmitancia, T y de la Absorbancia, A, en función de la concentraciónLa variación de la transmitancia tiene un comportamiento exponencial

La variación de la Absorbancia se trata de una proporcionalidad directa

Carácter aditivo de laCarácter aditivo de la AbsorbanciaLa absorbancia de una disolución es l d l b b i dla suma de las absorbancias de sus componentes

Permite descontar directamente la contribución del disolvente cuandocontribución del disolvente cuando se realiza la medida experimental de la absorbancia de un producto en disolución


RELACIÓN ENTRE TRANSMITANCIA Y ABSORBANCIA

Io I1 I2 I3 I4

100 10 1 0,1 0,01

T 10% 1% 0,01%0,1%

A 1 2 3 4

T 50 25 10 10100

A 0 0,3 0,6 1 2 ∞

Rango aceptable de medidas de A


Espectrofotómetros

Luz policromática (varias λ)Halógenas: 250‐700 nmDeuterio: para UV

¿Cómo funciona? http://www.uhu.es/quimiorg/db.html


Espectrofotómetros

DU800 UV/Visible Spectrophotometer (Beckman‐Coulter)

Spectronic 20 (Bausch & Lomb)


EspectrofotómetrosDe doble haz


Monocromadores

Amontonamiento de las longitudes de onda mayores

Descomposición más homogéneamayores


Cubetas de espectrofotómetro

1 cm0,1 cm

UV: cristal de cuarzoVisible cristal o plástico

3 ml 1,5 ml 0,8 mlcircular

Visible: cristal o plástico


Flujo continuo

Aplicaciones• Espectrofotometría de proteínas

• Espectrofotometría de ácidos nucleicosEspectrofotometría de ácidos nucleicos

• Colorimetría• Cálculo de la concentración a partir de la medida de absorbanciaCálculo de la concentración a partir de la medida de absorbancia• Específico y sensible, pero se necesita una recta de calibrado• Método de Lowry para cuantificar la concentración de proteína de una

disolucióndisolución

• Enzimoinmunoensayo (ELISA)• Reacción colorimétrica para detectar inmunocomplejos (antígeno‐anticuerpo)• Reacción colorimétrica para detectar inmunocomplejos (antígeno‐anticuerpo)• Más barato, seguro y sensible que el radioinmunoensayo (RIA)

• Turbidometrías• Medida del número de células de un cultivo

• Ensayos enzimáticos• Medida de la velocidad de la reacción catalizada por una enzima


Espectrofotometría de proteínasAminoácidos aromáticos

Enlace peptídico Grupos Enlace peptídicoprostéticos


Espectrofotometría de ácidos nucleicosEspectros de absorción de ácidos nucleicosy proteínas en el UV próximo (230‐330 y p p (nm)

Espectros de absorción de DNA en formaEspectros de absorción de DNA en forma de doble hélice (trazo continuo) y completamente hidrolizado (discontinuo): Efecto hipocrómicoEfecto hipocrómicoEl polímero absorbe menos que los monómeros constituyentes


Espectrofotometría de ácidos nucleicosCurva de desnaturalización del DNARepresentación de la A260 nm de una disolución de un ácido nucleico en función de la temperatura

Al desaparecer el efecto hipocrómico, como consecuencia de la desnaturalización, aumenta la absorbanciaa esa λ

Relación entre la Tm de un DNA y su contenido en G+CCuanto mayor es el porcentaje de G+C mayor es la temperatura de fusión (separación de las dos hebras) de esa molécula de DNA


Ensayos enzimáticosVariación de la absorbancia de una reacción enzimática en función del tiempoDe 1 a 4 cantidades decrecientes deDe 1 a 4 cantidades decrecientes de enzima

La velocidad inicial de la reacción se calcula ti d l di t d l ta partir de las pendientes de las rectas

La velocidad de la reacción es directamente proporcional a la cantidad de

Espectros de absorción de NADH y NAD+ y

enzima (la concentración de sustrato es saturante)

cinética de una reacción de óxido‐reducciónSH2 + NAD+ ↔S + NADH + H+

Reacciones acopladas:1) D‐Alanina + α‐cetoglutarato

↔piruvato + D‐glutamato2) Pi NADH H+ ↔l NAD+


2) Piruvato + NADH +H+ ↔lactato + NAD+

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