Espectrofotometra UV-visibleDeterminaciones AnalticasSeparaciones analticasIntroduccin a la cromatografa

Prof. Mg. Juan Salazar DazPARTE IV: PRINCIPIOS DE INSTRUMENTACION Y CROMATOGRAFIA

ESPECTROFOTOMETRA

Medicin de la cantidad de energa radiante que absorbe un conjunto de elementos o un elemento en su estado puro, en funcin de la longitud de onda de la radiacin.

Las mediciones se hacen a una determinada longitud de onda.

Luz absorbidaamarillo-verde520 - 550violeta380 - 420amarillo550 - 580azul-violeta420 - 440anaranjado580 - 620azul440 - 470rojo620 - 680verde-azul470 - 500prpura680 - 780verde500 - 520verde500 - 520prpura680 - 780verde-azul470 - 500rojo620 - 680azul440 - 470anaranjado580 - 620azul-violeta420 - 440amarillo550 - 580violeta380-420amarillo-verde520 - 550complementarioESPECTRO VISIBLE Y COLORES COMPLEMENTARIOSUNA SOLUCIN SE V COLOR AZUL CUANDO SE ILUMINA CON LUZ POLICROMTICA Y ABSORBE TODOS LOS COLORES EXCEPTO EL AZUL, QUE ES EL COLOR QUE DEJA PASAR.

Espectrofotometra como procedimiento analtico

Las ESPECTROFOTOMETRIAS se fundamentan, en la medicin de la absorcin de radiacin visible por sustancias coloreadas.

Cuando la muestra a determinar no posee coloracin, se lleva a cabo un tratamiento de color empleando substancias que reaccionen de forma proporcional con el compuesto en estudio.

Para la medicin es posible usar 2 tipos de equipos: Colormetro yEspectrofotmetro.El Colormetro (Mtodo colorimtrico), La longitud de onda de medida, se selecciona por medio de filtros pticos que son insertados en este.En el Espectrofotmetro,(Mtodo espectrofotomtrico); la longitud de onda es seleccionada mediante dispositivos monocromadores los cuales estn integrados al equipo.

Fundamentos de la colorimetraUna solucin que absorbe el rojo, pero no el amarillo y el azul, con la combinacin de estos emerger un color verde. VERDE

Para elegir con cual filtro podramos leer una solucin, depender del color que tenga la solucin.Para una solucin de color rojo, no se deber utilizar un filtro de color rojo porque precisamente ese es el color que no absorbe.El manual del fotocolormetro, tiene una tabla para determinar qu filtro se debe emplear de acuerdo al color de la solucin a estudiar.

Color del filtroRango espectralSoluciones coloreadasAzul400-465Roja, Naranja,Amarilla, Verde, TurbiasVerde500-570Roja, Amarilla, Violeta, Naranja, AzulRojo640-700Azul, Verde, Amarilla

Colormetro

ESPECTROFOTMETRO:Instrumento que descompone un haz de luz, en bandas de longitudes de onda especficas, formando un espectro atravesado por numerosas lneas oscuras y claras, semejante a un cdigo de barras del objeto, con el propsito de identificar, calificar y cuantificar su energa.

Espectrofotmetro Mecanismo Interno

Porque leer a diferentes l (longitudes de onda) compuestos parecidos pero diferentes?Para determinar la concentracin de un compuesto en particular se indica una longitud de onda (l) especfica a la que hay que leer con el colormetro o espectrofotmetro. Cada sustancia qumica, absorbe con mayor o menor intensidad en zonas del espectro visible o no visible, conformando en su conjunto el espectro de absorcin de tal sustancia.

ESPECTROFOTOMETRO

Cada sustancia sea complejo simple, presenta un espectro de absorcin caracterstico.

Las longitudes de onda con mayorabsorcin (picos) son aquellas conlas que se leer la muestra para determinar su concentracin.

La relacin entre Absorbancia a l determinada y su C es directamente proporcional.a mayor C mayor proporcin de luz absorbida.

Absorbancia

SELECCIN DE LA LONGITUD DE ONDA DE TRABAJOAlAconcentracinbanda Bbanda Abanda Abanda CMedir la absorbancias con la l max. de absorcin, se logran mximas sensibilidades. lejos del mximo de absorcin, pequeas variaciones de medida conducirn a grandes errores.

espectro de absorcin de la clorofila

Cubeta rectangularDiferentes tipos de Cubetas para muestras.

Se construye para analizar una muestra de concentracin desconocida.Se prepara soluciones del patrn de concentraciones conocidas de las cuales se mide su absorbancia (con estos datos de C y A, se construye la curva patrn).En la curva es posible interpolar la concentracin del problema, sabiendo la Absorbancia de la muestra. Anlisis mediante la Curva Patrn

ABS0RBANCIAInterpolacinAbsorbancia del problema

Grfico1

0

0.112

0.234

0.345

0.458

0.559

Absorbancia

Concentracin mg/lt

CURVA PATRN

Hoja1

Concentracin mg/lt0246810

Absorbancia00.1120.2340.3450.4580.559

Hoja2

Hoja3

La Absorbancia tiene una relacin lineal con la concentracin, entonces la relacin de proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentracin ser:A1 / A2 = C1 / C2 Donde:A1 = Absorbancia del problema.A2 = Absorbancia del estndar de concentracin conocida.C1 = Concentracin del problema.C2 = Concentracin del estndar.

Si despejamos C1, tendremos:

(A1 (problema) (Conc estndar)Conc. (problema) = ========================== A2 (estndar)

Ej. Determinacin de Glucosa. Se prepara los tubos para la lectura de la curva patrn, el tubo blanco (1) contiene todos los componentes excepto la glucosa con el fin de poder calibrar la absorbancia del equipo a cero .

Compuesto1 (blanco)234567Glucosa 0,1 mg/ml (mL)0.00.10.20.40.60.81.0Agua destilada (mL)1.00.40.90.80.20.60.0Fenol al 5% (mL)1.01.01.01.01.01.01.0Acido sulfrico (mL)5.05.05.05.05.05.05.0

RESULTADO de la curva patrn de la glucosa. La Absorbancia se mide con el Espectrofotmetro a 490 nm.

TubosAbsorbancia1020.13530.25340.41750.65860.57470.768

Grfico3

0

0.135

0.253

0.417

0.658

0.574

0.768

Tubos

Absorbancia

Curva de calibracin de glucosa

Hoja1

TubosAbsorbancia

10

20.135

30.253

40.417

50.658

60.574

70.768

Hoja1

0

0

0

0

0

0

0

Tubos

Absorvancia

Curva de calibracin de glucosa

Hoja2

Hoja3

RELACIONES MAS IMPORTANTES EN CALCULOS ESPECTROFOMETRICOS

Transmitancia: fraccin de radiacin incidente transmitida por la disolucin.ABSORBANCIA: La absorbancia de una disolucin aumenta a medida que aumenta la atenuacin del haz.PO = potencia del haz de la radiacin incidente.PT = potencia del haz de la radiacin transmitida.

Transmitancia: fraccin de radiacin que una sustancia deja pasar cuando la radiacin atraviesa la muestra. T : valor de 0 hasta 1. %T :valor de 0 hasta 100 %Absorbancia: Atenuacin de la intensidad de la radiacin cuando esta incide sobre una muestra. O cantidad de energa que la sustancia toma para pasar a un estado ms excitado. Cuando no hay absorcin: Po= PT ; entonces A=0Al absorber el 99% de la radiacin, solo se transmite el 1%, entonces: A=2

RELACIN ENTRE ABSORBANCIA Y CONCENTRACIN: LEY DE BEERLey de Lambert-Beer: la Absorbancia es directamente proporcional a la longitud b de la trayectoria a travs de la solucin y a la concentracin C del analito o especie absorbente.a y , cte de proporcionalidad. absortividad. (a) (si C=g/L) y Absortividad molar() , si C = moles/Litro.b: recorrido de la radiacin a travs de la muestra.(ancho de cubeta)cm.c: concentracin expresada en g/L , mg/L, moles/Litro.En una mezcla de varias sustancias que absorben:A = A1 + A2 + .... + AnA = 1 b c1 + 2 b c2 + . +n b cnSiendo 1, 2, , n los componentes absorbentes.

APLICACIONESMEZCLAS DE ANALITOSSe hace mediciones de absorbancia de la mezcla, a las longitudes de onda de cada componente de la mezcla.

PROBLEMAS

Problema 1Tras las diluciones adecuadas, una disolucin patrn di las concentraciones de hierro que se muestran a continuacin. El complejo de hierro (II)/1,10-fenantrolina se desarroll entonces en alcuotas de 25,0 mL de estas disoluciones, a continuacin cada una de ellas se diluy a 50,0 mL. Se leyeron las siguientes absorbancias a 510 nm.Conforme se indica a continuacin.Conc.de Fe(II) 2 5 8 12 16 20(en ppm)Absorbancia, 0,164 0,425 0,628 0,951 1,260 1.582(cubetas de 1cm) Construir una curva de calibrado (Curva Patrn) a partir de estos datos.

PROBLEMA 2El mtodo desarrollado en el Problema (1), se aplica a la determinacin rutinaria de hierro en alcuotas de 25,0 mL de aguas naturales. Determinar la concentracin (en ppm Fe) de las muestras que dieron los datos de absorbancia que siguen (en celdas de 1,00 cm): (a) 0,107 (b) 0,721 (c) 1,538

PROBLEMA 3Una alcuota de 25,0 mL de una solucin acuosa dequinina se diluy a 50,0 mL y se encontr que tena una absorbancia de 0,832 a 348 nm cuando se meda en una celda de 2,00 cm. Una segunda alcuota de 25,0 mL se mezcl con10,00 mL de una disolucin que contena 23,4 ppm dequinina; despus de diluir a 50,0 mL, esta disolucintenia una absorbancia de 1,220 (cubetas de 2,00 cm).Calcular las partes por milln de quinina en lamuestra.

PROBLEMAS:4. La escala de cierto espectrofotmetro manual va de cero a 100 % de transmitancia. Cuales son los valores de absorbancia que corresponden a estos extremos de la escala?. Resp. y cero.5. Convierta los siguientes valores de por ciento de transmitancia a valores de absorbancia:a) 94 ; b) 75 ; c) 40 ; d) 5 ; e) 1,0 Resp. a) 0,027 ; b) 0,125 c) 0,3986. Una solucin estndar de 5 ml que contiene 20 microgramos de hierro, se desarrollo el color mediante 1,10-fenantrolina, que forma complejo coloreado con el Fe2+ dando [Fe(Fen)3]2+ de color rojo intenso. Luego se diluy a un volumen final de 10,0 mL. Se encontr que la absorbancia de la solucin a 510 nm en una celda de 1,00 cm fue de 0,397. Calcule la absortividad molar del complejo. Resp. 1,11 x 104.

7. Un compuesto de P.M.= 100 tiene una absortividad molar de 1,0 x 105. Cuantos grs. se deben disolver en 1 litro de solucin para que despus de diluirla 200 veces la solucin tenga una absorbancia de 0,500 en una celda de 1,0 cm. ? Resp. 0,100 g8. La acetona disuelta en etanol tiene un mximo de absorcin a 362 nm con absortividad molar de 21 000. Se llev una solucin de 2 mg de acetona en 800 mL de alcohol a una cubeta de 10 mm, calclese la absorbancia prevista.9. Se observ que una vitamina tena un mximo de absorcin a 264 nm con absortividad molar de 23 000. Se disolvieron 59,4 mg de la vitamina en 500 mL de etanol. Cuando se llev la solucin a una cubeta de 1,0 mm, se obtuvo una absorbancia de 0,555. Calclese el peso molecular de la vitamina.

FIN

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