Coltivazione dei batteriIdentificazione dei microrganismi

G I O VA N N I D I B O N AV E N T U R A

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C D S M E D I C I N A E C H I R U R G I A

U N I V E R S I TÀ “ G . D ’A N N U N Z I O ”, C H I E T I - P E S C A R A

A A 2 0 1 5 - 2 0 1 6

Terreni di colturaTerreno di coltura: mezzo nel quale o sul quale può avvenire lo sviluppo e la crescita in vitro di un microrganismo

Caratteristiche:

concentrazione adatta di nutrienti per la crescita batterica

adeguato grado di umidità

reazione (pH) adatta

sterili e protetti da qualsiasi inquinamento

Terreni di colturaContenuto qualitativo

Peptoni: insieme di composti idrosolubili, ottenuti per idrolisi (acida od enzimatica) delle proteine (caseina, soja, ecc.)

NaCl: aggiunto in concentrazioni adeguate per le necessità osmotiche richieste, in vivo, da alcuni microrganismi parassiti

Zuccheri: glucosio, lattosio, mannite, aggiunti per scopi specifici in terreni particolari

Estratti di lievito, carne, d’organo: forniscono fattori di crescita e sali inorganici

Arricchimenti: sangue lisato, emoglobina, latte disidratato, gelatina vitamine; necessari per la crescita di batteri più “esigenti” dal punto di vista nutrizionale

Supplementi selettivi: specifici (antibiotici) od a spettro meno definito (sali biliari, cristalvioletto, sodio-azide)

Indicatori: coloranti (fenolo, blu di bromo fenolo, rosso fenolo, verde di bromo cresolo, ecc.); a valori critici di pH del terreno ne causano il viraggio, fornendo in tal modo informazioni sul metabolismo fermentativo del batterio

Terreni di colturaClassificazione

In base allo stato fisico:

Terreni LIQUIDI (brodi): componenti sciolti in acqua e sterilizzati.

Terreni SOLIDI: possono essere naturalmente tali (terreno alla patata) o vengono solidificati per aggiunta di un agente gelificante (agar, gelatina, silica-gel)

In base alla composizione chimica:

Terreni MINIMI: per la crescita dei soli batteri autotrofi. Gli elementi essenziali (N, C, S, P) sono presenti come sali inorganici in composizione e quantità note.

Terreni SINTETICI (o Definiti): nota la formulazione chimica di ogni ingrediente; le singole sostanze di cui il batterio necessita sono presenti in quantità note.

Terreni COMPLESSI: non è nota l’esatta composizione chimica. Comprendono la maggior parte dei terreni usati in laboratorio (estratto di carne di bue, cuore, cervello, ecc.).

Terreni di colturaClassificazione

In base alla funzione:

Terreni di ARRICCHIMENTO (o ELETTIVI): la specie microbica di interesse vi cresce in un tempo assai più breve rispetto ad altre specie microbiche.

Terreni SELETTIVI: contengono sostanze batteriostatiche (sali biliari, tellurito di K, NaCl, azide sodica, cetrimide, cristalvioletto, antibiotici) a concentrazione nota che inibiscono o rallentano lo sviluppo di molte specie microbiche, ma non di altre. Utilizzati per l’isolamento di specifici microrganismi da campioni altamente contaminati.

Terreni DIFFERENZIALI: contengono sostanze indicatrici di particolari reazioni biochimiche che avvengono nel terreno stesso. Usati per la ID di specifici microrganismi.

Terreni di colturaPreparazione

1. Pesata degli ingredienti

2. Dissoluzione degli ingredienti

3. Correzione del pH al valore desiderato

4. Distribuzione nei recipienti (terreni liquidi)

5. Sterilizzazione terreni (calore umido: agar e brodi; filtrazione: brodi)

6. Distribuzione in capsule di Petri (terreni solidi)

7. Controllo della sterilità dei terreni

Terreni di colturaTecniche di semina

Semina per isolamento

Tecnica più frequentemente utilizzata per ottenere la crescita di colonie separate.

Lo striscio avviene mediante utilizzo di un'ansa sterile (bisogna evitare contaminazioni crociate con altri microrganismi presenti sulla superficie di tale oggetto).

Prevede una serie di semine in differenti aree della superficie dell’agar, in modo da disperdere le varie cellule presenti sull'ansa (prelevate da brodocoltura o da altra crescita su agar).

Terreni di colturaTecniche di semina

Semina per inclusione

Agevola la conta delle colonie batteriche.

La sospensione batterica viene miscelata, in capsula/piastra Petri sterile, al terreno agarizzato allo stato liquido (che, raffreddandosi, successivamente gelificherà). Mixare mediante movimenti orari, antiorari e a croce.

Solitamente, l’agar si cimenta con differenti diluizioni, in soluzione fisiologica (NaCl 0.9%) sterile, del campione.

Terreni di colturaTecniche di semina

Semina per infissione

Mediante un ago da inoculo, il campione viene seminato nello spessore del terreno agarizzato.

Consente di valutare il rapporto del metabolismo batterico con O2 sulla base della altezza in cui si osserva crescita: nella parte alta (AEROBIO), sul fondo (ANAEROBIO), diffusa (ANAEROBIO FACOLTATIVO)

Consente di valutare la motilità del microrganismo: se la crescita è diffusa, il batterio possiede flagelli.

Consente di valutare specifiche attività enzimatiche: proteasi, ureasi, produzione indolo

Terreni di colturaUtilizzo in Microbiologia diagnostica

Cetrimide Agar

Selettivo per l’isolamento e l’identificazione presuntiva di Pseudomonasaeruginosa. Magnesio cloruro e potassio solfato stimolano la produzione di pigmento. Cetrimide – composto ammonio quaternario verso cui P. aeruginosa è resistente - inibisce la crescita di gran parte dei microrganismi.

Columbia Blood Agar Base

Di uso generale, oppure quale base per terreni addizionati di sangue (S. aureus, streptococchi emolitici) e selettivi (cocchi Gram+, H. pylori, Gardnerella).

Hektoen Enteric Agar

Differenziale e selettivo per Salmonella e Shigella dalle altre Enterobacteriaceaein campioni enterici. I sali biliari inibiscono la crescita della normale flora Gram+. Presenza di tiosolfato (fonte di S) e sali di ferro (citrato ammonio ferrico) per evidenziare la produzione di H2S (colonie nerastre, Salmonella)

Terreni di colturaUtilizzo in Microbiologia diagnostica

Columbia blood agar base (Streptococcus poyogenes)

Cetrimide agar (Pseudomonas aeruginosa)

Hek

toen

ente

ric

agar

Terreni di colturaUtilizzo in Microbiologia diagnostica

MacConkey agar

isolamento e conta dei coliformi e degli Enterobatteri (Escherichia coli, Klebsiella spp, Salmonella spp, Shigella spp). Cristalvioletto e sali biliari inibiscono la crescita di Gram+. Il lattosio evidenzia la capacità fermentante: colonie fermentanti lac+ (Klebsiella, E. coli, Enterobacter aerogenes) appaiono di rosa acceso, incolori quelle non fermentanti lac- (Salmonella, Shigella, Proteus, Serratia, P. aeruginosa).

Wilkins-Chalgren Anaerobe Agar

non selettivo, per la crescita e tests di sensibilità degli anaerobi.

Urea broth base (terreno di Christensen)

evidenziazione attività ureasica delle Enterobacteriaceae mediante il viraggio di un indicatore di pH (rosso fenolo).

Terreni di colturaUtilizzo in Microbiologia diagnostica

MacConkey agar (lac+ vs lac-)

Urea broth base(Helicobacter pylori)

Wilkins-Chalgren Anaerobe Agar(Bacteroides fragilis)

Terreni di colturaUtilizzo in Microbiologia diagnostica

Mannitol Salt Agar

selettivo e differenziale per stafilococchi; elevata [NaCl] inibisce crescita di altri batteri; sistema fermentante: mannitolo e rosso fenolo; S. aureus, fermentante, produce colonie con alone giallo-brillante, mentre stafilococchi coagulasi-negativi (es. S. epidermidis), non fermentanti, formano colonie rosso porpora

Salmonella-Shigella Agar (SS Agar)

selettivo e differenziale per Salmonella e Shigella; sodio citrato, sali biliari e verde brillante inibiscono la crescita di Gram+ e alcuni enterobatteri; sistema fermentante: lattosio e rosso neutro; Proteus e Salmonella presentano colonie con centro nero, dovuto alla precipitazione del ferro solfuro, indotta dalla produzione di H2S a partire da sodio tiosolfato presente nel terreno

Saboraud Dextrose Agar

terreno acidificato per l’isolamento di diversi funghi e lieviti: Candida albicans(colonie incolori/rosa), Candida non-albicans (colonie rosa scuro/rosse)

Terreni di colturaUtilizzo in Microbiologia diagnostica

Agar sale-mannite Saboraud Dextrose agar(Candida albicans)

Agar Salmonella-Shigella(colonie nere di Salmonella, incolori quelle di Shigella)

Terreni «dedicati»Isolamento di agenti eziologici poco frequenti

Campione Diagnosi presuntiva Batteri patogeni Terreni per l'isolamento

Feci Colera Vibrio choleraeVibrio parahaemolyticus

Acqua peptonata alcalina

Faringe Infiammazione ostruttiva epiglottide e faringe

Faringite membranosa

Haemophilus influenzae

Corynebacterium diphteriae

Agar sangue cioccolatoAgar Casman

Agar LoefflerAgar TinsdaleTerreno al tellurito di sodio

Tampone rinofaringeo

Pertosse Bordetella pertussis Bordet-Gengou

Escreato Tubercolosi

Micosi polmonare

Mycobacterium tuberculosis

Blastomyces dermatitidis

Lowenstein-JensenMiddlebrook 7H-11

Brain-heart Infusion agarUrina Leptospirosi Leptospira spp. Semisolido di Fletcher

Sangue, midollo osseo o biopsia

Brucellosi Brucella spp. Agar brucella

Terreni «dedicati»Isolamento di anaerobi ed «esigenti»

Terreno Scopo

Agar sangue Terreno in piastra non selettivo di uso generale

Agar cioccolato Utilizzato principalmente per l'isolamento di Haemophilus e Neisseria; usato anche per l'isolamento di anaerobi esigenti

Agar MacConkey Isolamento di bacilli Gram- aerobi ed anaerobi facoltativi

Agar sangue feniletil alcool Isolamento cocchi Gram+ anerobi facoltativi ed anaerobi obbligati Gram+ e Gram-

Terreno al tioglicolato + emina + vitamina K1

Brodo di arricchimento utilizzato per arricchire i terreni in piastra particolarmente se il campione è scarso

Terreno di Thayer-Martin modificato Impiegato per arricchire i terreni per anaerobi quando si sopetta nel campione la presenza di Neisseria gonorrhoeae o N. meningitidis

Agar sangue kanamicina-vancomicina Isolamento selettivo di bacilli anaerobi Gram-

Crescita battericaDefinizioni

Crescita vs Tolleranza

la crescita presuppone attiva divisione cellulare (riproduzione) e, quindi, aumento di biomassa; si usa il suffisso “-fili”

in condizioni non permissive per la crescita, alcuni microrganismi possonosopravvivere ma non riprodursi, si usa il suffisso “-tollerante”

Esempio:

- un batterio “termofilo” cresce in presenza di elevate temperature

- un batterio “termotollerante” sopravvive ad elevate temperature, ma cresce a temperature inferiori

Obbligato (stretto) vs facoltativo

“Obbligato” (o “stretto”): una data condizione è necessaria per la crescita

“Facoltativo”: il microrganismo può crescere in quella condizione, sebbene non necessaria; viene spesso usato in presenza di condizioni sub-ottimali.

Esempio:

- un “termofilo obbligato” necessita di elevate temperature per la sua crescita

- un “termofilo facoltativo” può crescere sia ad alte che basse temperature

Crescita battericaRegolazione: temperatura

La maggior parte dei batteri cresce in un intervallo termico di circa 20°C, esibendo la massima velocità di crescita ad un certo “optimum termico”

Psicrofili: crescono nel range 0 – 20 °C (Listeria monocitogenes; Flavobacterium)

Mesofili: crescono nel range 10 – 50 °C (maggior parte; E. coli)

Termofili: crescono nel range 40 – 75 °C (Bacillus stearotermophilus)

Ipertermofili: crescono nel range 70 – 110 °C (Pyrodictium brockii)

Crescita battericaRegolazione: pH

La maggior parte dei batteri cresce a valori di pH compresi tra 6 ed 8, esibendo la massima velocità di crescita ad un certo “optimum di pH”

Acidofili: crescono al di sotto di pH 6 (pH 2-6, generalmente); funghi e lieviti generalmente più tolleranti vs batteri (pH 5-6)

Neutrofili: crescono a pH 6-8; la maggior parte dei batteri

Alcalofili: crescono a pH > 8 (pH 8-9.5, generalmente)

Crescita battericaRegolazione: pressione osmotica

Crescita battericaRegolazione: alofilia

Alofili:

crescono ad elevate concentrazioni saline (generalmente 1 M), sopportando elevate pressioni osmotiche e bassa aw;

microrganismi alotolleranti (1-6% NaCl), alofili (6-15% NaCl), alofili estremi (15-30% NaCl)

queste condizioni sono incompatibili con la vita di gran parte deimicrorganismi

Crescita battericaRegolazione: O2

Aerobi obbligati: crescono soltanto in presenza di O2

Aerobi facoltativi: crescono meglio in presenza di O2, ma anche in assenza

Anaerobi obbligati: crescono in assenza di O2

Anaerobi facoltativi: crescono meglio in assenza di O2, ma anche in presenza

Microaerofili: crescono in presenza di (O2 5%, CO2 10%, N2 85%)

Giara per anaerobiosi

Figure 6.5

Cappa (camera) per anaerobiosi

Crescita battericaAtmosfera «controllata»: anaerobiosi

Carbossifilia (5% O2, 10% CO2, 85% N2)

Giara con “candela”

Sistemi per generazione di carbossifilia

Crescita battericaAtmosfera «controllata»: carbossifilia

Identificazione dei microrganismi1. Caratteristiche microscopiche (morfologia, organizzazione)

Colorazione di Gram

Colorazione di Ziehl-Neelsen

2. Caratteristiche macroscopiche (colturali) tipo (aspetto) coloniale

emolisi, viraggio terreno, sciamaggio (motilità), etc.

crescita su terreni selettivi

3. Caratteristiche biochimiche

4. Caratteristiche antigeniche (ID sierologica)

5. Tipizzazione fagica

6. Identificazione genotipica

ID dei microrganismi Aspetto macroscopico delle colonie

Rilievo

Forma

Superficie

Margine

ID dei microrganismiAspetti macroscopici (emolisi)

Staphylococcus aureusStreptococcus pyogenes

Emolisi completa (β-emolisi)

ID dei microrganismiAspetti macroscopici (fermentazione)

Agar sale mannite.

A) Il mannitolo non viene fermentato (S. epidermidis); il terreno non vira.

B) Fermentazione del mannitolo ad opera di S. aureus; il terreno vira al giallo.

A B

ID dei microrganismiAspetti macroscopici (sciamaggio)

Proteus mirabilis.

Il batterio si muove grazie ai numerosi flagelli disposti alla superficie cellulare (peritrico), formando «fronti» concentrici (sciamaggio).

ID dei microrganismiCaratteristiche biochimiche

Enterobacteriaceae, in particolare:

capacità di utilizzare determinati substrati come unica fonte di carbonio

• acidi organici o loro sali (acetato, citrato, malonato) + indicatore pH (blu di bromotimolo: vira al blu a pH basico)

presenza di particolari enzimi

• ureasi, lisina- ornitina-decarbossilasi, arginina-diidrolasi, beta-galattosidasi, ureasi

produzione di specifici prodotti metabolici terminali

• H2S, indolo, acetoino (reazione di Voges-Proskauer)

capacità di fermentare particolari zuccheri (O-F test)

• 1% carboidrato + indicatore pH + campanella di Durhan (produzione di gas)

API (bioMérieux) Identification System

ID dei microrganismiCaratteristiche biochimiche

ID dei microrganismiCaratteristiche antigeniche

La ricerca di Ag specifici avviene mediante utilizzo di Ab specifici.

Utilizzo di antisieri (Ab specifici) per reazione di agglutinazione

colonia stemperata in NaCl + antisiero specifico

reazione positiva: agglutinazione dei microrganismi

Utilizzo di sferule di latex quali «carrier» di Ag o Ab (reazione macroscopica di agglutinazione)

Possibile tipizzazione specifica ed intra-specifica (tipi sierologici o sierotipi)

Agglutinazione

Ab

Ag

latex bead

ID dei microrganismiTipizzazione fagica

Nell’ambito di una stessa specie possiamo rinvenire differenti ceppi batterici (sottospecie o tipi), ciascuno dei quali caratterizzato da un peculiare grado di virulenza.

E’ possibile utilizzare la tecnica della tipizzazione fagica a fini identificativi e/o epidemiologici (studio delle modalità di diffusione dell’infezione).

Questo è il caso di S. aureus:

estremamente sensibile a numerosi (20) virus batterici (batteriofagi o fagi) virulenti (litici)

sensibilità non uniforme (ceppo-specifica)

individuazione di “tipi fagici”

ID dei microrganismiTipizzazione fagica

ID dei microrganismiIdentificazione molecolare

Polymerase Chain Reaction (PCR)

amplificazione di sequenze “bersaglio”, specifiche per il genere, la specie o lo stipite batterico

elevata sensibilità (necessarie poche copie del target di partenza) e specificità

sequenziamento genico (genotipizzazione)

RNA ribosomale

grandi quantità di rRNA altamente conservate in specie differenti

presenza di sequenze di rRNA “specifiche” per specie e tipo. Il grado di differenza nell’rRNA di due batteri è funzione diretta della «vicinanza» filogenetica: piccole differenze sono suggestive per una “vicinanza” tra le specie, mentre grandi differenze indicano una distanza maggiore

l’individuazione di un pattern in rRNA che non trovi riscontro in nessuna altra sequenza nota, indica la scoperta di una nuova specie.

ID dei microrganismiIdentificazione molecolare