CONSEJO NACION

SECRETARIA NACIO

FONDO NACIONA

F

UNIVERSIDA

“DETERMINACIÓN DE TREN NIÑOS CON DIAGNÓ15;17 EN LEUCEMIA PRO

PR

Dr. A

AL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA –CONCYNAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA-SENACY

AL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYTFACULTAD DE MEDICINA

D DE SAN CARLOS DE GUATEMALA.

INFORME FINAL

RANSLOCACIONES CROMOSÓMICAS 4;11ÓSTICO DE LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGOMIELOCÍTICA AGUDA POR MEDIO DE RT

ROYECTO FODECYT No. 90-2006

ALBERTO GARCÍA GONZÁLEZ Investigador Principal

GUATEMALA, junio del 2009.

T-

YT-

T-

Y 12;21

UDA Y

T-PCR”.

ii

AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro

del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la

Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología-SENACYT- y al consejo Nacional de

Ciencia y Tecnología –CONCYT-.

iii

Resumen El objetivo principal fue determinar la frecuencia de las translocaciones cromosómicas

4;11 y 12;21 en niños con Leucemia Linfoblástica Aguda LLA y 15;17 en Leucemia

Promielocítica Aguda LPMA. El presente estudio es descriptivo, cuyas muestras

fueron procesadas durante 20 meses en niños menores de 17 años de la Unidad de

Oncología Pediátrica-UNOP-. El procesamiento de las muestras y el análisis de los

datos se realizaron en el Laboratorio de Biología Molecular y Celular de la Facultad de

Ciencias Médicas, Universidad de San Carlos de Guatemala. Para la detección de las

translocaciones cromosómicas se utilizó la técnica de la Reacción en Cadena de la

Polimerasa con la Retrotranscripción Reversa (RT-PCR) con oligonucleótidos

específicos utilizados según el protocolo BIOMED 1.En total se procesaron 95

muestras: 90 con LLA y 5 con LPMA . De los 5 casos de niños con LLA menores de

1 año de edad se detectó la translocación 4;11 en 4 ( 80%) ; a 28 casos con LLA se

detectó translocación 12;21 (31.1 %) y en 5 casos con diagnóstico de LPMA se detectó

translocación 15;17 ( 100 %) .En conclusión los resultados obtenidos son similares a la

literatura consultada. Se recomienda a las autoridades de UNOP incluir dentro del

protocolo de diagnóstico y manejo clínico de los niños, según el tipo de leucemia, la

detección de translocación cromosómica para decidir las pautas de tratamiento

respectivas; realizar estudios prospectivos de detección de la enfermedad mínima

residual en aquellos casos tratados con la translocación detectada especialmente

Translocación 4;11 y 15;17. Palabras clave: Leucemia Linfoblástica Aguda, Leucemia Promielocítica Aguda, translocación cromosómica, Retrotranscripción y Reacción en Cadena de la Polimerasa

iv

Abstract

The principal aim was to determine the frequency of translocations

chromosome 4, 11 and 12, 21 in children with Acute lymphoblastic leukemia ALL

and translocation 15, 17 in Acute Promyelocytic Leukemia LPMA. The present study is

descriptive, whose samples were processed for 20 months in children

under 17 years of the Pediatric Oncology Unit-UNOP-. The sample processing and data

analysis were conducted in Laboratory of Molecular and Cell Biology, Faculty of

Medical University of San Carlos de Guatemala. For the detection of chromosomal

translocation technique was used in the reaction Reverse Transcription with Polymerase

Chain Reaction (RT-PCR) Specific primers used according to the protocol BIOMED 1

In total 95 samples were processed: 90 with ALL and 5 with LPMA. Of the 5

cases of children with ALL under 1 year old; the translocation 4; 11 were detected

4 cases (80%) to 28 cases with ALL were detected translocation 12; 21 (31.1

%) And in five cases diagnosed with LPMA translocation was detected 15; 17

(100%). In conclusion the results obtained are similar to

literature. It is recommended that authorities include UNOP- within the protocol of

diagnosis and clinical management of children as the type of leukemia, screening for

chromosomal translocation decide the respective treatment guidelines, studies

Prospective detection of minimal residual disease in those cases treated with specially

detected translocations 4;11 and 15;17.

Key Words: Acute Lymphoblastic Leukemia, Acute Promyelocytic Leukemia, Chromosomal

Translocation Reverse transcription and Polymerase Chain Reaction.

v

Sinopsis del Investigador Principal

Dr. Alberto García González

Nació en la ciudad de Guatemala en el año de 1965. Realizó estudios de primaria y

nivel Medio en el Colegio Liceo Javier. Graduado de Médico y Cirujano en el año 1989,

en la Universidad de San Carlos de Guatemala; realiza estudios de posgrado en

Ginecología y Obstetricia del año 1991 al 1994 en el hospital San Juan de Dios.

Profesor titular por oposición de Biología Celular y Molecular, Facultad de

Medicina , Universidad de San Carlos de Guatemala, desde 1995 a la fecha, actualmente

coordinador de esta unidad académica.

Realizó estudios en Biología Molecular en Italia, Milán, Centro de investigaciones

para la Leucemia “Tettamanti” hospital San Gerardo. Con énfasis en Anomalías

cromosómicas en Leucemia infantil.

Así mismo obtuvo capacitaciones en Detección y tipificación del Virus del

Papiloma Humano en el Instituto Nacional de Cancerología de México en el año 2006 y

2008.

Inicia líneas de investigación en Biología Molecular en la Facultad de Medicina de

la Universidad de San Carlos de Guatemala; gestionando la formación del primer

laboratorio de este tipo en dicha institución.

Ha obtenido reconocimientos dentro de su labor investigativa, siendo el último en

noviembre del 2,008 el reconocimiento del Investigador del año, otorgado por la

Dirección General de Investigación –DIGI- de la Universidad de San Carlos de

Guatemala.

vi

Sinopsis de Investigador Asociado

Dr. César Vásquez Galván

Médico y Cirujano egresado de la USAC y ha sido profesor de Biología Celular y del

Centro de Investigación en Ciencias de la Salud –CICS- de la Facultad de Ciencias

Médicas, siendo actualmente Profesor Titular de Microbiología en la misma Facultad.

Ha estudiado las siguientes maestrías: Maestría en Ciencias (Biología Celular),

Maestría en Docencia Universitaria y actualmente estudia el doctorado en Investigación

de la Universidad Mariano Gálvez.

Ha desarrollado los siguientes trabajos de investigación: “Bases bioquímicas de la

Isquemia y reperfusión”, “Modelos experimentales fisiológicos para estudios

bioquímicos: el corazón aislado refundido”, “Influencia de los antiinflamatorios no

esteroideos sobre la fosforilación oxidativa” en el Instituto Nacional de cardiología

“Ignacio Chávez” de México, en donde participó en la organización de la unidad de

corazón prefundido.

Ha escrito las siguientes tesis de maestrías: “Modulación de la contractilidad y de la

fosforilación oxidativa en corazones prefundidos” y “Secuenciación Genética de las

Pseudomonas”.

Ha publicado diferentes artículos en revistas nacionales e internacionales.

Actualmente es el representante de la Facultad de Ciencias Médicas ante la

Comisión Intersectorial de Biotecnología, de la cual ha sido electo como Secretario,

Presidente alterno y Presidente.

Institución Ejecutora

Laboratorio de Biología Celular y Molecular de la Facultad de

Ciencias Médicas de la Universidad de San Carlos de Guatemala,

USAC.

Instituciones Colaboradoras:

Unidad Nacional de Oncología Pediátrica-UNOP-

vii

Agradecimientos

Especialmente

Al Dr. Jesús Arnulfo Oliva Leal, Decano de la Facultad de Ciencias Médicas, por su confianza y

apoyo al desarrollo de la presente investigación.

A los doctores Federico Antillón K y Mauricio Castellanos por su apoyo institucional.

A Vicenzo Rossi y Andrea Biondi por sus asesoría y tutoría, Departamento de Investigación

Tettamanti, Hospital San Gerardo Monza, Milan Italia.

A La Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de San Carlos de Guatemala

Al Dr. César Vásquez Galván y Norma Marroquín Lang por su valiosa y activa labor en la

realización de la investigación.

viii

Dedico la presente investigación

A Dios Omnisciente, fortaleza mía

A mi esposa Brenda e hijos Alberto Carlos y Brenda Abigail por su amor y comprensión

ix

INDICE GENERAL

Resumen iii

Abstract iv

PARTE I

I.1 Introducción 1

I.2 Planteamiento del problema 3

I.2.1 Antecedentes en Guatemala 3

I.2.2 Justificación del Trabajo de investigación 5

I.3 Objetivos 6

I.3.1 Objetivo General 6

I.3.2 Objetivos Específicos 6

I.4 Materiales y Métodos 7

I.4.1 Localización del Laboratorio 7

I.4.2 Muestras Obtenidas 7

I.4.3 Criterios de la población estudiada 7

I.4.4 Duración del trabajo 7

I.4.5 Procesamiento de las muestras 7

I.4.6 Variables e indicadores 8

I.4.7 Material y equipo utilizado en el laboratorio 9

I.4.7.1 Reactivos utilizados en la investigación 9

I.4.7.2 Descartables 10

I.4.7.3 Aparatos y equipos en el laboratorio 10

I.5 Plan de Investigación 11

I.5.1 Etapa Uno. Selección de participantes 11

I.5.1.1 Clasificación de los casos 11

I.5.1.2 Solicitud del Consentimiento Informado 11

I.5.1.3 Boleta de recolección de datos del paciente 12

I.5.2 Etapa dos, Recolección y procesamiento de muestras 12

I.5.2.1 Extracción de muestras 12

I.5.2.2 Ingreso de las muestras al laboratorio 12

I.5.2.3 Procesamiento de las muestras en el laboratorio 13

I.6 Análisis e interpretación de resultados 13

I.6.1 Prevalencia según tipo de translocación 13

I.6.2 Prevalencia de translocación positiva según tipo de translocación y sexo 13

I.6.3 Promedio de edad de pacientes según tipo de leucemia 15

1.6.4 Frecuencia de lugar de procedencia de los pacientes según tipo de Leucemia 15

I.7 Técnicas a utilizar en el proceso de la investigación 15

I.8 Tratamiento de deshechos 15

I.9 Resultados e impacto del estudio 16

x

Parte II

Marco teórico

II.1. Generalidades del cáncer a nivel celular 17

II.2. Translocaciones cromosómicas y cáncer 17

II. 3. Leucemia Linfoblástica Aguda y translocaciones cromosómicas 18

II.3.1Translocación 4;11 con fusión de genes MLL-AF4 en Leucemia Linfoblástica

Aguda 19

II.3.1.1. Diseño de los primers ó nucleótidos iniciadores para detectar

translocación 4;11 20

II.3.2 Translocación cromosómica 12;21 TEL-AML 1 en LLA 19

II.3.2.1 Diseño de los primers ó nucleótidos iniciadores para

detectar translocación 12;21 22

II.4. Leucemia Promielocítica Aguda(LPMA) 23

II.4.1 Leucemia Promielocítica Aguda (LPMA) y Translocación cromosómica

15;17 23

II.4.1.1 Diseño de los primers para detectar translocación 15;17 24

II.5. Técnicas para el análisis genético de los tumores pediátricos 25

II.5.1 La transcripción Reversa- PCR 25

II.5.2 Transcripción Reversa en cadena de la Polimerasa (RT-PCR) en

translocaciones cromosómicas 25

II.6 Factores de riesgo y pronóstico en LLA y LPMA 28

II.7 PCR del gen Abelson ABL 29

II.8. Protocolo BIOMED-1 30

PARTE III

III.1 Resultados 32

III 1.1.Frecuencia de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) y Promielocítica Aguda

(LPMA) 32

III.1. 2. Detección de translocación cromosómica 4;11 32

III. 1. 3. Detección de translocación cromosómica 12;21 32

III .1 .4 .Detección de translocación cromosómica 15;17 31

III.1. 5 Características generales de los pacientes estudiados en UNOP según el

tipo de Leucemia 35

III.1.5.1 Pacientes con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) y

Leucemia Promielocítica Aguda (LPMA) según sexo. 35

III.1. 5.2 Procedencia de los pacientes con diagnóstico de Leucemia

Linfoblástica Aguda (LLA) y Leucemia Promielocítica Aguda (LPMA) 36

III.1.5.3 Distribución de pacientes con diagnóstico de LLA y LPMA según edad 36

III.2 Discusión de resultados 38

PARTE IV

IV 1 Conclusiones 39

IV 2 Recomendaciones 40

IV 3 Referencias bibliográficas 41

xi

IV 4 Anexos 45

IV 5 Registro Fotográfico 60

PARTE V Informe Financiero

V.1 Descripción del Presupuesto Global del Proyecto, ejecutado 65

xii

TABLAS

Tabla 1 Primers ó iniciadores para RT-PCR análisis de T (4;11)(q21;q23)

con fusión de genes MLL-AF4 20

Tabla 2 Primers ó iniciadores para análisis de RT-PCR de t(12;21) (p13;q12)

con fusión de genes TEL-AML 1 22

Tabla 3 Primers para detección de translocación 15;17 24

Tabla 4 Factores de riesgo que determinan Bueno ó mal pronóstico

en pacientes Con LLA 29

Tabla 5 Protocolo estandarizado de RT-PCR 31

xiii

FIGURAS

Figura 1. Clasificación de los pacientes según diagnóstico y translocación a

Investigar 11

Figura 2 Cronograma de Actividades específicas según diagnóstico clínico

del Paciente 14

Figura 3 Cambios generales en células con translocaciones cromosómicas 17

Figura 4 Frecuencia de translocaciones en Leucemia Linfoblástica Aguda

en niños 19

Figura 5 Foto con luz ultravioleta de Translocación cromosómica 4;11 20

Figura 6 Translocación Cromosómica 4;11 MLLA-AF4 en Leucemia

Linfoblástica Aguda 21

Figura 7 Translocación cromosómica 12;21 TEL-AML 1 en LLA 22

Figura 8 Foto con rayos ultravioleta en gel de productos de PCR T 12;21 23

Figura 9 Translocación cromosómica 15;17 PML/RARA EN Leucemia

Promielocítica Aguda 26

Figura 10 Foto de electroforesis de productos de PCR para detectar

Translocaciones 15;17 (BCR 1,2 y3) 27

Figura 11 Transcripción Reversa 27

Figura 12 Separación de células Mononucleares en sangre 28

Figura 13 Extracción de RNA de células Mononucleares 28

Figura 14 Foto PCR ABL 30

xiv

GRAFICAS

Gráfica 1 Detección de translocación cromosómica 4;11 en niños

menores de 1 año con LLA 33

Gráfica 2 Detección de translocación cromosómica 12;21 en niños

menores de 17 años con LLA 33

Gráfica 3 Detección de translocación cromosómica 15;17 en niños

menores de 17 años con LPMA 34

Gráfica 4 Detección de subtipos BCR1 y BCR3 de translocación

cromosómica 15;17 en niños menores de 17 años con LPMA 34

Gráfica 5 Niños con diagnósticos de LLA y LPMA según sexo 35

Gráfica 6 Niños con diagnóstico de LLA y LPMA según edad 37

xv

CUADROS

Cuadro 1 Variables e indicadores 8

Cuadro 2 Frecuencia de tipos de Leucemias referidas por UNOP durante 20

meses 32

Cuadro 3 Procedencia de pacientes con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica

Aguda (LLA) y Leucemia Promielocítica Aguda (LPMA) referidos de

UNOP durante 20 meses 36

PARTE I

I.2 Introducción

La translocación cromosómica es el intercambio de segmentos de ADN ó genes entre dos cromosomas, de tal forma que un cromosoma puede contener segmentos de ADN ajenos y así causar trastornos en el comportamiento patológico a nivel celular en algunos procesos neoplásicos, cánceres ó tumores. (J La detección de dichas transmás específicas para enfermedadee incluso criterios de selección de esquema de quimioterapia apropia La presente investigación dete4;11 , 12;21 en pacientes con Lecon Leucemia Promielocítica Aguen Unidad Nacional de Oncología La Reacción en Cadena de lasiglas en ingles RT- PCR) es un mriegos directos en el paciente, ya qal inicio de los estudios de labestudio se realizó con sólo una tomcentímetros cúbicos, para detectar En UNOP, las Leucemias senfermedades oncológicas. Del toLeucemias Mieloides. La Unidad de Oncológica Pedleucemia; se ha estimado que se adiagnósticos clínicos(LLA y LPMAun tiempo de 20 meses; que incluyaceptaron colaborar con la investien el laboratorio de la Facultad dVer el diagrama de actividades fig En el presente estudio se procescon los criterios de inclusión; lassiendo el 94.74 % y 5 con diagprocesadas. Salieron del estudio 3muestras de mala calidad. Según el diagnóstico de la LeucLLA se investigó la Translocacisolamente a los infantes menores y 2 página 33. Habiéndose deteTranslocaciones 4;11 en niños men

orde L , 2004)

locaciones contribuyes como Leucemia Linpacientes candidatos pdo según sea el caso. (

ctó las diversas translucemia Linfoblásticada-LPMA-, en paciePediátrica –UNOP- en

Polimerasa a partir étodo biomolecular cue se elabora en mueoratorios generales pa de muestra de sang

la translocación crom

on diagnosticadas ental de las Leucemias

iátrica es el Centro Ntiende un promedio ). La toma de muestr

ó recolección de muesgación y posteriormene Medicina, CUM (Cura 2 página 14.

aron un total de 95 m cuales 90 fueron denóstico de LPMA sie6 muestras por tener

emia se procedió a deón 12;21 a todos losde 1 año se investigó ctado el 31.1 % deores de 1 año.

1

a establecer pautas de tratamiento foblástica Aguda y Mieloide Aguda ara transplante de Médula ósea ó el

Biondi A., et al, 1992)

ocaciones cromosómicas aberrantes Aguda-LLA- y 15;17 en pacientes ntes menores de 17 años, atendidos Guatemala .

de Transcripción Inversa (por sus on alta sensibilidad que se aplica sin stra de sangre periférica. Se realizan revio a quimioterapia. El presente re por paciente, aproximadamente 3 osómica.

el 39 % del total de todas las el 75 % son LLA y el 3 a 5 % son

acional de atención a los niños con de 100 casos por año con estos dos as y su procesamiento se realizó por tra sanguínea en todos los casos que te el procesamiento de las muestras entro Universitario Metropolitano).

uestras de pacientes que cumplieron pacientes con diagnóstico de LLA ndo el 5.26 % del total de muestras otro tipo de diagnóstico ó por ser

tectar el tipo de translocación. Para pacientes hasta 17 años de edad, la translocación 4;11, ver gráficas 1 translocación 12;21 y 80 % de

2

Para los niños con LPMA se investigó la presencia de translocación 15;17, la cual se investigó dos subtipos ó variantes de translocaciones 15 ;17 denominadas BCR 1 y 3, ver gráficas 3 y 4 página 31. En el presente estudio se detectó en el 100% de los casos algún subtipo de translocación 15;17. Siendo detectado el subtipo BCR 1 con el 40 % y el BCR 3 con el 60 %. La detección de translocaciones según tipo de leucemia da importante información al médico tratante ya que en los casos que se detecte translocación 12;21 indica que el pronóstico es favorable, iniciando medidas terapéuticas menos agresivas ó tóxicas en cuanto al uso de quimioterapia; no así en los casos que se detecte la translocación 4;11, siendo esta de mal pronóstico en niños menores de 1 año, los cuales se darán tratamientos paliativos . En los casos de LPMA la detección de la translocación 15;17 permite al clínico elegir el medicamento apropiado, el cual es ácido retinoico ATRA. La presente investigación da un impacto dentro del manejo clínico y terapéutico de los casos, contribuyendo así a mejorar el diagnóstico y tratamiento de los casos tempranamente. Elevando la calidad en el manejo inicial del paciente ya que debe elaborarse la prueba RT-PCR previo a planificar el tratamiento. No se contaba con la elaboración de dicha prueba por no haber personal capacitado. El actual estudio complementa la investigación Biomolecular en Leucemias iniciada hace 2 años, siendo el primer estudio de Investigación en translocación 9;22 en leucemia Linfoblástica aguda y Mieloide Crónica, realizado con el apoyo financiero de SENACYT en su división FODECYT y la Facultad de Medicina de la Universidad de San Carlos. Determinando la prevalencia de las diversas translocaciones en estas leucemias se podrá establecer en el protocolo de UNOP la realización de estas. La determinación de estas translocaciones complementa el estudio de la mayoría de las mismas. Futuras investigaciones podrán derivarse de esta, ya que se puede realizar seguimiento de los pacientes con translocaciones, posteriormente al tratamiento inicial, detectando así “la enfermedad mínima residual”. Palabras claves RT-PCR reacción en cadena de la polimerasa a partir de la transcripción inversa. MLL y AF4 genes ubicados normalmente en cromosomas 11 y 4 TEL Y AML 1 genes ubicados normalmente en cromosomas 12;21 PML y RARA genes ubicados normalmente en los cromosomas 15 y 17

respectivamente Primers llamados oligonucleótidos iniciadores ò cebadores, sondas de ADN de 20 a

22 nucleótidos. LLA leucemia linfoblástica aguda. LPMA leucemia promielocìtica aguda.

Translocaciòn fusión aberrante de genes entre distintos cromosomas UNOP Unidad Nacional Oncológica Pediátrica. CUM Centro Universitario Metropolitano.

3

I.2 Planteamiento del problema: Actualmente, se sabe que algunas enfermedades oncológicas, tales como las leucemias, tienen trastornos a nivel cromosómico, siendo una de ellas la translocación de genes entre dos cromosomas, las cuales intercambian segmentos de ADN recíprocamente entre cromosomas no homólogos.(Passarge E., 2004). 1.2.1 Antecedentes en Guatemala El análisis molecular de las alteraciones comunes en células leucémicas han contribuido grandemente a la comprensión de la patogénesis y pronóstico de las leucemias especialmente LLA y LPMA. Las aberraciones genéticas más frecuentes incluyen las expresiones aberrantes de protooncogenes, translocaciones cromosómicas que codifican actividad quinasas , alteraciones en factores de transcripción , y la hiperdiploidía que envuelven más de 50 cromosomas. Estas alteraciones genéticas transforman a las células normales en oncogénicas.( Solomon E, et al., 1991) Desde 1959 se identificó la primera anomalía cromosómica, Peter Novell y David Hungerford lo asociaron a leucemia mieloide crónica. Observaron el acortamiento del cromosoma 22 y le denominaron cromosoma Philadelphia.(Nowell & Hungerford, 1962)

Al principio pensaron que se trataba de una dilección ò acortamiento del cromosoma 22, hasta que en 1972 Rowley descubre que es una translocación entre cromosomas 9 y 22. La identificación del cromosoma Ph (philadelphia) se realizó al principio por cariotipo, usando tinción de Giemsa ò Wright.( Rowley, 1975) Desde 1970, el rango de cura de la Leucemia Linfoblástica Aguda en niños ha incrementado dramáticamente, del 30 al 80%. Esto se debe a los descubrimientos tanto clínico como biomolecular-citogenético; uno de los factores que han influido en estos resultados es debido a los hallazgos de translaciones los cuales pueden orientar al clínico las pautas de tratamiento.( Naomi J., 2004) En 1990 las técnicas evolucionaron a Hibridación In-situ fluorescente (FISH) , y pruebas biomoleculares tales como Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) en 1996 siendo esta última la más sensible de todas. La PCR es un método que amplifica in vitro un segmento de ADN específico, dependiendo de los cebadores ò iniciadores que se acoplan a los extremos de dichos segmentos de ADN.( Raimondi SC, 1989) En Europa desde 1999, se ha establecido un protocolo de estudios en las aberraciones cromosómicas; el cual inicia extrayendo el RNA de las células mononucleares, después se realiza transcripción inversa sintetizando ADNc y posteriormente se realiza PCR detectando la respectiva translocación. Dicho proceso se denomina RT-PCR . (Dongen JJM et al., 1999) ver anexos del 5 al 8 páginas de la 52 a 56. Desde el descubrimiento de la primer fusión de genes BCR-ABL en T 9;22 han ido identificándose más fusiones de genes producto de las translocaciones entre cromosomas, los cuales tienen papel importante en leucemias linfoides y mieloides, dentro de las más importantes están T4;11 y T 12;21 para la Leucemia linfoblástica aguda y la T 15;17 para la Promielocítica Aguda.( Donadieu J, 2001). En Guatemala se inició en el año 2006 la detección de la translocación cromosómica 9;22 en sus genes BCR-ABL en niños con Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) y Mieloide

4

crónica (LMC) aplicando la técnica RT-PCR. Este proyecto de investigación se llevó a cabo gracias a la cooperación y avales de La Facultad de Medicina de La Universidad de San Carlos de Guatemala y CONCYT por sus siglas Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología. En las leucemias linfoblástica aguda se puede encontrar la translocación de genes MLL / AF4 A ubicados normalmente en los cromosomas 11 y 4 respectivamente, la cual llamaremos t 4;11 y TEL / AML1 ubicados normalmente en cromosomas 12 y 21 respectivamente, la cual llamaremos t 12;21. Para la Leucemia Promielocítica aguda se puede encontrar la translocación de genes PML / RARA ubicados normalmente en los cromosomas 15 y 17 respectivamente la cual llamaremos t 15;17. Dichas translocaciones promueven cambios en el control genético y comportamiento de la célula. (Dongen J., 1999) En Guatemala no hay estudios en la detección de dichas translocaciones, en Centroamérica solamente en Costa Rica si hay estudios desde 1999. Este estudio aporta información epidemiológica local sobre la prevalencia del hallazgo de translocación 4;11 y 12;21 en pacientes con LLA y la translocación 15;17 en LPMA.

El presente estudio detectó la prevalencia de las translocaciones en los pacientes con leucemias linfoblástica y Promielocítica Aguda a través del método biomolecular RT-PCR ( por sus siglas en inglés Reacción en Cadena de la Polimerasa Transcripción Inversa). Actualmente en UNOP no se sabe cual es la prevalencia de las translocaciones mencionadas en los casos de LLA y LPMA, los cuales representan juntos el 80 % de todos los casos de leucemias atendidas.

En la Unidad Nacional de Oncología Pediátrica –UNOP- los pacientes con LLA se clasifican en dos grupos de buen o mal pronóstico, dependiendo de la presencia de factores de riesgo, tales como: Edad, Recuento de glóbulos blancos, Inmunofenotipo, Index DNA (ver tabla 4 página 29). Según la clasificación, reciben el tratamiento respectivo. Sin embargo, se han observado recaídas posteriores al tratamiento planificado en pacientes que habían sido clasificados como de buen pronóstico. Algunos de estos casos se han podido detectar translocación cromosómica 9:22 ABL/BCR, muestras enviadas a USA. En el caso de las translocaciones 4;11 en LLA se relaciona con mal pronóstico si se encuentra en niños menores de 1 año, a pesar de los tratamientos agresivos en quimioterapia; en el caso de detectar la Translocación 12;21 se relaciona con buen pronóstico, si se presenta en niños menores de 17 años con LLA y se puede modificar el manejo de quimioterapia, siendo este menos tóxico y mejor tolerado por el niño(a). (Cazzaninga G et al., 2002) En LPMA los casos que tienen translocación 15;17 son pacientes que les favorece el tratamiento con ácido Retinóico y tienen mejor pronóstico de sobrevida. Al no tener este tipo de translocación se deberá optar por otros tratamientos alternativos. (Bonnet D. , 1997)

5

I.2.2 Justificación del trabajo de investigación Dentro de las enfermedades oncológicas ó cáncer son las denominadas leucemias, las cuales pueden afectar tanto a los adultos como a niños. En Guatemala se atiende alrededor de 100 casos anuales de niños con Leucemias Linfoblásticas Agudas (LLA) y 5 Promielocítica Aguda (PMLA) en la Unidad de Oncología Pediátrica-UNOP-. Los avances en las enfermedades como el cáncer, permiten no solamente conocer su etiología ó causa, sino el comportamiento de la célula, la cual es la unidad estructural y funcional del organismo humano. En recientes investigaciones acerca de leucemias indican que se han detectado la presencia de translocaciones cromosómicas, las cuales ocurren dentro del núcleo celular. Al conocer si existe ó no la translocaciones puede orientar al Médico tratante la mejor opción en tratamiento. El presente trabajo de investigación aportó información a –UNOP- , la cual beneficia directamente a los niños en la planificación del tratamiento de los pacientes que sufren de estas enfermedades . A nivel de la comunidad científica médica se aporta información tanto epidemiológica como complemento para elaborar protocolos del manejo de las distintas leucemias en niños menores de 17 años. La modificación del protocolo de manejo consistirá en incluir esta prueba diagnóstica molecular para documentar y planificar el tratamiento adecuado según sea el tipo de leucemia y la translocación cromosómica diagnosticada.

6

1.3 Objetivos: 1.3.1 General:

Determinar la prevalencia de translocación cromosómica 4;11 y 12;21 en pacientes con diagnóstico clínico de LLA y translocación 15;17 en pacientes con diagnóstico clínico de LPMA atendidos en UNOP, mediante la aplicación del método biomolecular de RT-PCR.

1.3 2. Específicos:

1.3.2.1 Determinar la presencia de translocación cromosómica 4;11 en niños menores de 1 año con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda atendidos en –UNOP-.

1.3.2.2 Determinar la presencia de translocación cromosómica 12;21 en niños menores

de 17 años con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda atendidos en –UNOP-.

1.3.2.3 Determinar la presencia de translocación 15;17 en niños menores de 17 años

con diagnostico de Leucemia Promielocítica Aguda atendidos en –UNOP-.

1.3.2.4 Describir a la población en estudio de acuerdo a las características de sexo, edad y lugar de procedencia.

7

I.4 Materiales y Métodos I.4.1 Localización del laboratorio: Las muestras se procesaron en el laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de San Carlos de Guatemala, Centro Universitario Metropolitano. Ciudad de Guatemala. El laboratorio está ubicado a 2 cuadras de la Unidad Nacional de Oncología Pediátrica, UNOP, zona 11, anexo al Hospital Roosevelt. La latitud es 14° 37´15´´ Norte y a una longitud de 90° 31´36´´ Oeste.

I.4.2 Muestra Obtenida: las muestras fueron de sangre ó medula ósea de 95 niños(as) de UNOP, menores de 17 años; con diagnóstico clínico de Leucemia linfoblástica aguda LLA y Leucemia Promielocítica Aguda LPMA previo a cualquier tratamiento. Las muestras de sangre ó medula ósea no debió de haber tenido más de 48 horas, posterior a su obtención, para ser procesadas. Las muestras fueron tomadas por el personal médico de UNOP. I.4.3 Criterios de la población estudiada: I.4.3.1 Criterios de inclusión: Ambos sexos, menores de 17 años de edad, originarios de cualquier parte del país y no haber recibido ningún tratamiento antes de este estudio. I.4.3.2 Criterios de exclusión: pacientes ya tratados con quimioterapia, muestra obtenida de sangre ó medula ósea de más 48 horas. I.4.4 Duración del trabajo de campo: elaborado en un período de 20 meses, el cual concluyó en octubre del 2008. . I.4.5 Procesamiento de las muestras: las muestras debieron estar con anticoagulante EDTA y mantenerlas refrigeradas a 4 °C previamente a su envío. A continuación se presentan los procesamientos que se ejecutaron en cada muestra de los ó las pacientes atendidas en UNOP.

1. Separación de células Mononucleadas, gradiente de Ficoll y se mezclaron con Ticionato de Guanidio (buffer de lisis) posteriormente se congelaron a – 20°C

2. Extracción de RNA de los mononucleares / 2do día según el método de cloroformo-isoamílico y etanol, al haber congelador a menos 80°C. Cuando no hubo se procedía el mismo día la síntesis de ADNc ya que es muy inestable el RNA.

3. Síntesis de ADNc (transcripción inversa)/ 3er. día. Se puede guardar a -20°C. Este producto deberá ser utilizarlo no más de 2 semanas. Debido a que observamos que pierde su calidad

4. PCR gen constitutivo ABL con electroforesis y toma de foto con cámara UV/4to.día

5. PCR para translocación 12;21 para pacientes menores de 17 años y 4;11 a menores de 1 año con LLA. PCR para detectar translocación 15;17 a menores de 17 años con diagnóstico de LPMA posteriormente electroforesis y toma de foto con cámara UV/ 5to día

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1.4.6 VARIABLES e INDICADORES Las variables del estudio son presentadas a continuación en el cuadro 1 , en ella se describe las variables, su definición y el indicador utilizado. CUADRO No 1

Fuente: Fodecyt No 90 - 2006

VARIABLES DEFINICIÓN INDICADOR

Prevalencia de

translocación

Pacientes positivos para translocación 4;11, 12;21 y 15;17 dividido por la población total estudiada de cada tipo de leucemia por 100, durante 9 meses

N casos positivos X 100 total casos según leucemia(LLA ó LPMA)

Sexo

Condición orgánica de masculino(M) ó femenino (F)

M____ F____

Edad

Tiempo de vida en años y meses Años_______ Meses _______

Procedencia Lugar de origen Departamento_________ Municipio_____________

Tipo de leucemia

LLA. Leucemia linfoblástica aguda, diagnosticada por histopatología en médula ósea, realizada en UNOP LPMA. Leucemia promielocítica Aguda, diagnosticada por histopatología en médula ósea, realizada en UNOP

LLA LPMA

Translocación cromosómica 4;11

*Fusión de genes MLL-AF4 translocación en los casos con diagnóstico de LLA, menores de 1 año *Ausencia de translocación 4;11

Prueba de RT-PCR positivo________ negativo _______

Translocación cromosómica 12;21

*Fusión de genes TEL-AML1 translocación en los casos con diagnóstico de LLA todos los niños menores de 17 años. *Ausencia de translocación 12;21

Prueba de RT-PCR positivo________ negativo _______

Translocación cromosómica 15;17

*Fusión de genes PML-RARA translocación en los casos con diagnóstico de LPMA todos los niños menores de 17 años. *Ausencia de translocación 15;17

Prueba de RT-PCR positivo________ negativo _______

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I.4.7 Material y Equipo utilizado en el laboratorio

1.4.7.1 Reactivos utilizados en la investigación � Kits para 100 muestras de PCR (Biomed platìnium ) invitrogen, código

10966-034 de 10000 unidades.2.5 U/ul para 250 reacciones, 3 kits � Kits para 100 muestras de síntesis de ADNc invitrogen Superscript. Código 18064-

014 de 500 unidades . 150 reacciones Cada 50 reacciones incluyen stand buffer 5x y DTT 0.1M, 3 kits en total � Marcadores de ADN , para electroforesis marca Invitrogen 1 frasco Peso 1 kb

de rango 0,5-12kb para 200 aplicaciones � DNTPs 10 mM, 1x1ml mezcla, 2 en total

� Random hexamers 1.5 mM, 2 en total

� Primers ò cebadores en número de 6, para gen Abelson, proteína P-190 y Proteína P-210

� RNasa OUT inhibina código 100777-019, 2 en total

� Isopropanolol , 500 ml, marca sigma 1 frasco

� Agarosa en polvo, frasco de de 2 kg. En total 5

� Agua Ultra Pura , grado pura molecular 2 litros

� Solución madre(BUFFER) tampon de 1x, para agarosa, (electroforesis) buffer TBE 10X, 5 litros

� solución Ficoll, frasco con 500 ml (número 10)

� Solución cloroformo Isoamílico Frasco 1 PT, 24:1, marca sigma

� Fenolácido refrigerado (menor 4 grados), 0.1 M citrato buffer ph 4.3. 500 ml

� � Solución Acetato de sodio PH4, 500 ml. Marca sigma

� Tiocitrato de Guanidio , marca sigma 500g

� Laurilsarcosina 200 mg marca sigma

� Etanol al 100%, marca sigma, 1 frasco de 500 ml

� Mercaptoetanol 1 frasco de 100 ml

� Tinte para colorear productos de PCR

� Buffer Loading 25 ml (colorante electroforesis) unidad 5ml 5x

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1.4.7.2 Descartables

Los materiales descartables requeridos para la investigación � Tubos cónicos 15 ML falcon , en número de1,000

� Probetas estériles, paquete de 1,000 tubos de 0.5 ml

� Probetas estériles, paquete de 1,000 tubos de 0.2 ml

� Criotubos 2ml, 500 unidades � Micropipetas descartables tipo pasteur, plástico , 500 unidades

� Puntas de pipetas, estériles con filtro de 20ul , en # 960

� Puntas de pipetas, estériles sin filtro de 20 µl, en # de 960 (10 cajas)

� Puntas de pipetas, estériles con filtro de 200 µl, en # de 960 � puntas de pipetas, estériles sin filtro de 1000ul, en # de 1000

� Caja de guantes descartables mediano, en # 10ajas, 100 C/una sin talco

� 3 micropipetas de volumen variable de 2-20 ul, 20-200 ul y 100-1000 ul

1.4.7.3 Aparatos y equipos utilizados en el laboratorio

� Refrigeradora para 4 °C mediana

� Congelador con capacidad de congelar a menos 20 °C � Vortex para mezclar muestras de laboratorio , eléctrico

� Espectofotómetro para ácidos nucleicos

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I.5 PLAN DE INVESTIGACIÒN

I.5.1 Etapa I selección de participantes I.5.1.1 Clasificación de los casos Todos los casos de los niños menores de 17 años con diagnóstico clínico de LLA y LPMA, los cuales se les investigó la translocaciones 15;17 y 12;21 respectivamente; así como a todos los niños menores de 1 año con LLA a los cuales se les investigó translocación 4;11. Todos los niños deberán estar previo a cualquier tratamiento. El diagnóstico clínico lo efectuarán en la Unidad Nacional de Oncología Pediátrica. Ver figura 1. Figura 1. Clasificación de los pacientes según diagnóstico y translocación a investigar

Fuente: Fodecyt 90-2006

Figura 1 Clasificación de los casos y translocaciones cromosómicas a investigar. Se clasifican en 3 grupos a

estudiar según diagnóstico clínico y en algunos casos por edad. Los 3 grupos son: 1) Niños con diagnóstico de

LPMA, todos los niños menores de 17 años de edad se les efectuará la determinación de translocaciòn 15;17 2) Niños con diagnóstico de LLA entre 1 a 17 años de edad se les efectuará la determinación de translocaciòn

12;21 y 3) Niños con diagnóstico de LLA menores de un año de edad se les efectuará translocaciòn 4;11.

I.5.1.2.- Solicitud del consentimiento para participar A cada padre ò tutor y niño se le explicará con palabras claras el motivo del estudio, en que consiste su participación y los beneficios del estudio para el niño. Todo niño con diagnóstico de LLA y LPMA, al inicio de sus estudios se le extrae muestra de Sangre venosa para otros estudios, se puede aprovechar este momento para obtener la muestra para el presente estudio. Previo a firmar ò colocar una huella en el consentimiento informado. El proceso del consentimiento informado consistirá básicamente en: 1. Explicación del estudio e importancia de la investigación a nivel social. 2. Beneficios potenciales para el participante. 3. Riesgos mínimos para el paciente. 4. Firma del documento de Consentimiento Informado ver anexo 3 , página 50 5. Explicar que el estudio es voluntario y si niega su participación no altera el tratamiento

en UNOP.

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I.5.1.3.- Boleta de recolección de datos del paciente Debe ser llenada una boleta previo a extraer la muestra y de ser enviada al laboratorio, Ver boleta , anexo 4 en página 51. I.5.2 Etapa II Recolección y procesamiento de muestras I.5.2.1.- Extracción de muestras De cada niño se obtendrá, una sola vez, muestra en sangre venosa, aproximadamente 10 ml., con anticoagulante EDTA. La extracción fue realzada por personal calificado médico ó enfermera de UNOP. La muestra fue transportada debidamente rotulada con el nombre del paciente y un formulario ò solicitud con los datos del paciente. A partir de la confirmación en participar en el presente estudio. Se inició a :

a) Registrar datos de los niños en boletas de ”recolección de datos” (ver página 47 ) b) Se obtuvo de 7 a 10 CC. de sangre venosa, obtenida en antebrazo, mediante técnica

de asepsia, con jeringa descartable y con aguja Coutanier. Por personal de laboratorio ò médico de la unidad. Antes de las 10 de la mañana para poderla procesarla en el laboratorio de la Facultad de Medicina , el cual está a dos cuadras de distancia de UNOP.

c) Transporte de sangre en tubos de ensayo, debidamente rotulada, en 1 cc. de EDTA a temperatura ambiente. (fue transportada al laboratorio multidisciplinario del CUM, facultad de Medicina por el investigador ó técnico/a de laboratorio).

d) Al ingresar la muestra se anotaron los datos en libro de registro (nombre, No de carné, edad, sexo, y diagnóstico clínico del tipo de leucemia) y en los programas de Excel (ver páginas 59).

e) La muestra se dejó a temperatura de 4 grados °C en refrigerador, mientras se prepara la primera etapa de procesamiento que debió ser ese mismo día. La cual denominamos etapa de separación de mononucleares con ficoll. Al separar los mononucleares estos se mezcla con guanidio a menos 20 °C; los cuales pueden preservarse por años. Ver anexos 5 al 8 páginas 52 a la 56.

f) El resultado de la prueba fue informado en forma escrita a los médicos de UNOP. Los resultados finales fueron escritos en el libro de procedimientos del laboratorio.

I.5.2.2.- Ingreso de las muestras al laboratorio Debidamente rotuladas se anotan los pacientes en “libro de Registro de ingreso”, se anotaron los siguientes datos : Fecha, nombre del paciente, número de historia clínica edad , sexo , lugar de procedencia, diagnóstico clínico. Así mismo se anotaron en una base de datos tipo Excel. VER ANEXO 10página 59 I.5.2.3.- Procesamiento de las muestras en el laboratorio

a) Separación de células mononucleadas, gradiente de Ficoll, de lunes a viernes. La muestras se procesaron el mismo día que ingresen al Laboratorio, ya que la calidad de los mononucleares es mejor antes de pasar 24 horas. Se identificaron debidamente en una bandeja específica en el congelador a menos 20°C.

b) Extracción de RNA / todas las muestras que fueron separadas los mononucleares y mezcladas en guanidio previamente; les fueron extraído el RNA en la campana de flujo laminar . Al extraer el RNA de las muestras se guardaron en el congelador a

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menos 80°C. ó suspenderla en Isopropanolol en congelador a menos 20°C por 24 a 72 horas. Las muestras fueron identificadas en una bandeja y etiqueta específica.

c) Síntesis de ADNc (transcripción inversa) al 3er día d) PCR gen constitutivo Abelson con electroforesis y toma de foto con cámara digital

a través de cámara de rayos UV/al cuarto día, comprobando la calidad del ADNc y RNA extraído

e) PCR de muestras de pacientes T 4;11 menores de 1 año y T 12;21 para todos los

menores de 17 años con LLA ò T 15;17 para pacientes con LPMA, posteriormente electroforesis y toma de foto digital con cámara UV/ al 5to día.

f) Elaboración del informe y envío a UNOP. Se escriben los resultados en el libro de registro del laboratorio.

Cada etapa del procesamiento de las muestras en el laboratorio tiene un folio, donde se especifican las instrucciones, en la siguiente figura se presentan lo relevante del proceso desde el diagnóstico en UNOP de los tipos de leucemia y el consentimiento informado aprobado hasta las etapas del procesamiento de la muestra. Ver Anexos folios de procedimientos del 5 al 8, páginas de la 52 a la 56. Todos aquellos casos en que exista duda fueron consultados vía Internet a un grupo de biólogos moleculares del laboratorio del Hospital San Gerardo, Monza, Milán, Italia. I.6. Etapa III Análisis e interpretación de resultados Al obtener los resultados I.6.1 PREVALENCIA según tipo de translocación : La prevalencia se obtendrá según tipo de leucemia LLA ó LPMA, son 3 fórmulas N t 4 ;11 X 100= % N t 12;21 X 100= % T LLA 1 año T LLA

N t 15;17 X 100 = % TLPMA

N t 4;11 número de casos positivos de translocación t 4;11 en leucemia tipo LLA, menores de 1 año de edad.

TLLA 1 año número de casos sometidos a estudio con diagnóstico clínico de LLA menores de 1 año de edad

N t 12;21 número de casos positivos de translocación t 12;21 en leucemia tipo LLA.

TLLA número de casos sometidos a estudio con diagnóstico clínico de LLA.

N t 15;17 número de casos positivos de translocación T 15;17 en leucemia tipo LPMA. TLPMA número de casos sometidos a estudio con diagnóstico clínico de LPMA.

I.6.2 Prevalencia de translocación positiva según tipo de translocación y sexo N fem LLA X 100 = % , N fem LLA X 100 = % T t 4;11 T t 12;21 N fem LPMA X 100= % T t 15;17

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Donde: N fem.LLA número de casos de sexo femenino con translocación positiva en LLA N fem LPMA número de casos de sexo femenino con translocación positiva en LPMA T t 4;11 número de casos sometidos a estudio con translocación 4;11 T t 12;21 número de casos sometidos a estudio con Translocación 12;21 T t 15;17 número de casos sometidos a estudio con translocación 15;17

N masc LLA X 100 = % , N masc LPMA X 100 = % T 4;11 T 12;21

N masc LPMA X 100= % T t 15;17

Figura 2. Cronograma de Actividades específicas según diagnóstico clínico del paciente Fuente: Fodecyt 90-2006

Figura 2 Cronograma de actividades según diagnóstico Clínico del paciente. El plan de investigación inicia

desde la selección de los pacientes con diagnóstico de LLA ó LPMA. Si los padres y/ó niños están de acuerdo

firmando el consentimiento informado, se toma la muestra llevándola a procesar al laboratorio. Al final del

proceso se concluye con RT- PCR, se efectuará primero PCR para un gen constitutivo como es Abl, si es

positivo significa que es de buena calidad el procesamiento de las muestras y se prosigue a PCR específicos T

4;11 y 12;21 para LLA ó T 15;17 para LPMA, los cuales evidenciarán si hay ó no las respectivas

translocaciónes . los casos en que halla contaminación de la muestra , se repetirá el proceso a partir de síntesis

de ADNc.

Diagnóstico

Clínico de

LLA ò LPMA

Consentimiento

informado

Procesamiento de muestra en laboratorio:

1. Separación de mononucleares con Ficoll

2. RNA en Guanidio

Consentimiento informado rechazado

PCR de gen

constitutivo

ABL Se evidencia expresión del gen constitutivo ABL

Los casos de LLA

Efectuar

PCR T 4;11 y

No se evidencia expresión del gen

ABL Ó muestra contaminada

Queda excluido del

estudio

Se repetirá el procesamiento de la muestra, a partir de RNA en Guanidio

Los casos de LPMC

Efectuar

PCR T 15;17

15

Donde: N masc LLA. número de casos de sexo masculino con translocación positiva en LLA N masc LPMA número de casos de sexo masculino con translocación positiva en LPMA

T 4;11 número de casos sometidos a estudio con translocación 4;11 T 12;21 número de casos sometidos a estudio con translocación 12;21 T 15;17 número de casos sometidos a estudio con translocación 15;17

1.6.3 Promedio de Edad de pacientes según tipo de leucemia.

A) N / TLLA

Donde N suma de las edades de todos los pacientes con LLA TLLA número de casos sometidos a estudio con diagnóstico de LLA B) N / TLPMA

Donde N suma de las edades de todos los pacientes con LPMA TLPMA número de casos sometidos a estudio con diagnóstico de LPMA

1.6.4 Frecuencia de lugares de procedencia de los pacientes según tipo de leucemia Procedencia cada lugar se calculará el porcentaje que le corresponde respecto de la totalidad de la muestra.

1.7 Técnicas a utilizar en el proceso de la investigación: La presente investigación analizará en una muestra única de sangre venosa la translocaciones 4;11, 12;21 y 15;17 en niños hospitalizados en UNOP. Los pasos a seguir en el proceso desde la extracción de la muestra se indican en la sección de recolección de Datos. Así también el procesamiento de las muestras se indican en esta sección (procesamiento de muestras en el laboratorio). 1.8 Tratamiento de deshechos: El laboratorio de la facultad de Medicina cuenta con los servicios de deshechos ECOTERMO.

1 El material descartable punzo-cortante (jeringas en estos casos), pipetas plásticas, tubos de toma de muestra sangre, puntas de micropipetas. Se descartarán en depósitos rígidos color rojo.

2 Material descartable No punzo cortante, papel higiénico, gel de agarosa, probetas En bolsas respectivas designadas por ecotermo.

El procesamiento de las muestras, sus productos y deshechos no contaminan el medio ambiente al tomar las medidas de precaución respectivas. El estudio de la aberraciones en cromosomas ó sea ADN es libre de contaminantes infecciosos. El uso de guantes en algunas etapas del procesamiento de muestra es para evitar contaminación del ADN y/ó RNA de las manos del investigador con las muestras a estudio. También se hizo hincapié en utilizar guantes para manipular el bromuro de etidio ya que el contacto constante y prolongado con la piel podría producir cáncer.

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I. 9 Resultados y su impacto: Se detectó en los casos con leucemia linfoblástica Aguda la translocación 4;11 en 80 % en niños menores de 1 año y 12;21 en 31.1 % en niños menores de 17 años; y en los pacientes con diagnóstico clínico de Leucemia Promielocítica Aguda la translocaciòn 15;17 en 100 % de los casos , este método provee información valiosa para los médicos pediatras oncólogos, planificando el tratamiento adecuado. Debido a que los pacientes con leucemia linfoblástica aguda con translocaciòn 4;11 es de peor pronóstico a ciertos protocolos de quimioterapia, por lo cual se tomaron las decisiones de iniciar con quimioterapia y posteriormente referirlos para un tratamiento paliativo . En el caso de la presencia de translocación 12;21 el pronóstico es favorable siendo necesario menos medicamentos, por lo que se evitarán costos innecesarios y menor riesgo de toxicidad al paciente ante la quimioterapia. Los pacientes con diagnóstico de leucemia Promielocítica Aguda con translocaciòn 15;17 tienen mejor pronóstico con tratamiento all-trans-retinoic acid (ATRA). El presente estudio podrá ser útil para el seguimiento posterior al tratamiento, en la fase de remisión, ya que tiene sensibilidad para detectar la enfermedad residual en etapas tempranas. La presente investigación complementa el estudio de translocaciones cromosómicas en leucemias que se realiza actualmente con el apoyo de CONCYT línea FODECYT, “Determinación de la translocaciòn 9;22 en niños con Leucemia Linfoblástica aguda y Mieloide crónica”, proyecto No Fodecyt 19/2006. Por lo anterior se prevee un impacto en beneficio a las medidas terapéuticas a iniciar en los pacientes ahorro en el costo de algunos tratamientos y descartar los tratamientos innecesarios. La aplicación de PCR en el diagnóstico de enfermedades no infecciosas está siendo fomentada en la facultad de Medicina y la Universidad de San Carlos de Guatemala con este tipo de investigaciones sobre otras enfermedades de tipo genético.

17

PARTE II MARCO TEÓRICO II 1 Generalidades del cáncer a nivel celular El cáncer es el resultado de defectos a nivel celular, generados por defectos genéticos y por modificaciones del medio ambiente. El cáncer puede ser heredado ó esporádico, es necesario que las células acumulen diferentes tipos de mutaciones en distintos genes de tal manera que la hacen inestable. Las manifestaciones de la inestabilidad genética son diferentes, siendo a nivel cromosómico: aneuploidía, translocación, deleción, recombinación, lugares frágiles; y a nivel molecular: mutación puntual, deleción, inserción, amplificación, inestabilidad de microsatélites y alteraciones de reparación. Los genes al estar alterados por cualquiera de las alteraciones de inestabilidad genética descritas anteriormente se pueden clasificar dentro de alguna de las siguientes categorías:

a) Oncogenes: genes codificadores de proteínas que promueven la pérdida del control de crecimiento y la conversión de una célula a un estado maligno. Estos genes tienen la capacidad de transformar a las células.( Karp . G. 2005),

b) Genes de supresión Tumoral: gens que codifican proteínas que limitan el crecimiento celular e impiden que las células se tornen malignas. Estos genes son recesivos.

c) Genes reparadores: genes que codifican proteínas cuya función es reparar los errores a la replicación del ADN. Al estar alterados estos genes acumulan mutaciones en las nuevas células.

II. 2 Translocaciones cromosómicas y cáncer Actualmente se sabe que los procesos neoplásicos presentan anomalías a nivel de cromosomas tales como aberraciones en translocaciones de genes, los cuales alteran el crecimiento y multiplicación aberrante de las células cancerígenas ver figura 3. (Bishop JM, 1987) El estudio de estas translocaciones tiene no solamente un propósito de detección sino observar el comportamiento de las células después de tratamientos tales como quimioterapia, pudiendo clasificar a los pacientes dentro grupos de alto y bajo riesgo, dependiendo de la persistencia de las translocaciones cromosómicas. Así como establecer pautas de tratamientos según la translocación así como el tipo de Leucemia.( Pui CH, et al., 2000) Figura 3. Esquema general de los

cambios a nivel celular en la mayo-

ría de translocaciones cromosómicas

Los cambios más importantes son:

Proliferación, falta de adherencia y

Transformación celular. Las altera-

ciones afectan al ADN, señales intrace-

lulares.

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II. 3 Leucemia Linfoblástica Aguda y translocaciones cromosómicas La leucemia Linfoblástica Aguda LLA es la más frecuente en niños y constituye el 70% de las leucemias; la máxima incidencia de LLA por edad se encuentra entre los 2 y 5 años. La incidencia es mayor en niños que en niñas hasta la pubertad. (Mc Nally, R. J.; Rowland, D., y Roman, E., et. Al. 1997) En las leucemias linfoblástica aguda y mieloide aguda es importante el diagnóstico de estas aberraciones cromosómicas. En Centros especializados Europeos y Americanos La PCR ha sido indispensable en el protocolo del manejo en niños con Leucemias. En Centro América inician desde 1,996 estudios de este tipo en Costa Rica.(Jiménez A, et al. , 2008). Las translocaciones cromosómicas de importancia en LLA son : 9;22, 4;11 y 12;21. Las cuales son detectadas con T 9;22 BCR-ABL en 4 % , t 4;11 MLL-AF4 70 % en niños menores de 1 año y 4% en niños mayores de un año y t 12;21 TEL-AML1 en 25 % (ver figura 4) Para LPMA es importante detectar la translocación 15;17 .(Arico Maurizio et. Al. 2000) La LLA en niños menores de 2 años se le denomina LLA del lactante, constituye el 2.5 al 5 % de las LLA. La LLA del lactante es muy agresiva; el recuento de leucocitos, la menor edad (< 2 años), la presencia de enfermedad extramedular y enfermedad en el Sistema Nervioso Central está asociada a un pronóstico pobre. ( Chris, W.; Pullen, J., y Boyett, J., et. Al, 1986) Dentro de las translocaciones cromosómicas detectadas en la LLA del lactante se encuentra la translocación 4;11 entre los genes MLL y A4. El hallazgo de la Translocación 4;11 en niños menores de 2 años se relaciona con recurrencias y mal pronóstico; los pacientes sin esta translocación que representa entre el 20 al 30 % tienen una supervivencia libre de enfermedad. Dentro de los pacientes con LLA y translocación 4;11 positiva la edad es un factor pronóstico ya que los niños mayores de 2 años con translocación 4;11 positiva tienen un 73.2% de supervivencia mientras que en los menores de 2 años tienen un 32.2 % de supervivencia. ( Pui, C. H.; Gaynon, P. S., y Boyett, J. M., et. al. 2002) En los niños mayores de 2 años es importante determinar dos tipos de translocaciones cromosómicas dentro de las cuales están las Translocaciones 9;22 de los genes BCR-ABL y 12;21 de los genes TEL-AML1. La translocación 9;22 se asocia con un riesgo elevado de fracaso temprano de tratamiento mientras que la Translocación 12;21 tiene buen pronóstico. La t 9;22 se detecta entre el 3 a 5% de los niños con LLA, estos niños son seleccionados para el transplante de médula ósea en la primera remisión hematológica. La respuesta inicial al tratamiento con prednisona ha sido también tomada en consideración como factor de pronóstico asociado a edad, recuento de glóbulos blancos. Generalmente el mal pronóstico está asociada con la adolescencia y recuento mayor de 50,000 de glóbulos blancos por campo. ( Heerema, N. A.; Harbott, J., y Galimberti, S., et al.2004) La translocación 12;21, en niños mayores de 2 años, es la más común en la LLA infantil de linaje B que ocurre el 25%. La expresión de los genes translocados TEL-AML1 se ha asociado a un excelente pronóstico con una sobrevida libre de enfermedad del 90%. (McLean, T. W.; Ringold, S., y Neuberg, D., et al.1996 )

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II.3.1. Translocación 4;11 con fusión de genes MLL-AF4 en Leucemia Linfoblástica Aguda

Los estudios biomoleculares han determinado en la translocación T(4;11) (q21;q23) los genes involucrados son MLL y AF4. Esta translocación ha sido observada en el 70% de los casos en los niños menores de 1 año con LLA, siendo de mal pronóstico. En el resto de los niños y adultos se detecta en el 5%.( Pui CH et al., 1991) Figura No 4 Frecuencia de translocaciones en Leucemia Linfoblástica Aguda en niños

Fuente: Pui CH. Blood 1991;77:440-7

Figura 4 Demuestra las translocaciones diferentes ,halladas en niños con LLA, mostrando el porcentaje y

los genes involucrados en cada translocación.

La presencia de t(4;11)(q21;q23) ha sido asociada con niños con fenotipo pro-B-LLA, esta translocación fusiona la porción 5´ del gen MLL con la 3´ del gen AF4 (figura 6). El gen MLL está compuesto de 37 exones que abarca una región de mayor de 1 megabase, ha sido detectado en aproximadamente 30 diferentes translocaciones , encontradas en leucemias LLA, Leucemia mieloide aguda LMA y en síndrome mielodisplásico (SMD). El gen AF4 está compuesto por 20 exones que codifica una proteína rica en serina- prolina. La función de esta proteína no está aún bien determinada. La fusión de genes MLL-AF4 no fueron detectadas por métodos convencionales con citogenética.( Pui CH, 1995) II.3.1.1. Diseño de los primers ò nucleótidos iniciadores para detectar translocación

4;11 La tabla 1 muestra la posición y secuencias de cada primer ò iniciador, del exon 8 del MLL-A y el exon 7 del gen AF4-B. La sensibilidad del PCR es de 10-3. Se observan los sitios de translocaciòn en MLL-A y AF4-B, se indican los puntos donde se rompen a nivel de diferentes exones. Ver (figura 6.a).(Dongen JJ, 1999).

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Tabla 1 Primers ò iniciadores para RT-PCR análisis de t(4;11)(q21; q23) con fusión de genes .MLL- AF4

Primer ò iniciador 5`posición secuencia (5`- 3`) Código (medida)

MLL-A 3916 (17) CCG CCT CAG CCA CCT AC AF4-B 1714 (20) TGT CAC TGA GCT GAA GGT CG MLL-C 3936 (18) AGG ACC GCC AAG AAA AGA AF4-D 1677 (20) CGT TCC TTG CTG AGA ATT TG MLL-E5 3793 (18) AAG CCC GTC GAG GAA AAG

Fuente . Fodecyt No 90-2006

Complemento a la figura 3, observe las descripciones de los diferentes primer ó cebadores, su posición y

medida, las secuencias de los nucleótidos.

En todas las reacciones positivas se visualizan, los productos amplificados por PCR, en gel de agarosa suspendidos en Bromuro de Etidio. La medida es de 468 bp , este segmento de ADN translocado se denomina MLL-A ↔ AF4-B. Debido a que abarca la mayoría de las posibilidades de translocaciones posibles entre ambos protooncogenes. (ver figura 6, B).12 La detección de la translocaciòn se efectúa al someter la muestra a electroforesis en gel de agarosa al 1 % con bromuro de etidio. Los pacientes con translocaciòn positiva muestra una franja ò línea simple a nivel de 468 bp. Debe haber un control positivo el cual siempre se evidencia a los rayos Ultravioleta, en este caso es de la línea celular MV4-11. Así mismo se utiliza un control negativo el cual no evidencia franja alguna, registra la calidad de las muestras debido a que no debe haber contaminantes. Ver figura 5

Figura 5. foto con luz ultravioleta Producto de PCR para translocación 4;11en gel agarosa al 1% con bromuro de etidio.. fusiones entre los genes MLL – AF4 con peso molecular 468 bp. Primers utilizados MLL-E5´ y AF4-D. Se utilizó línea celular MV4-11 .No se observa presencia de translocaciòn en paciente negativo ni en H20.

II.3.2 Translocación cromosómica 12; 21 TEL-AML 1 en LLA Estudios previos en la determinación de la translocación 12;21 en citogenética no pudieron determinar la presencia de esta translocación. Actualmente se conoce de la presencia de esta translocación en 25 % de los casos de niños con LLA, siendo de buen pronóstico, la mayoría del rango de los niños positivos están entre 1 a 12 años, con un ligero pico entre 2 y 5 año. El gen TEL localizado en el

21

cromosoma 12 se fusiona con el gen AML1 del cromosoma 21.( Cazzaniga G et al, 2003) Ver figura 7. Figura 6 Translocación cromosómica 4;11 MLL-AF4 en Leucemia linfoblástica aguda

Fuente . Fodecyt No 90-2006

Figura 6 (a) Diagrama esquemático de los exones e intrones de los genes MLL y AF4, involucrados en

t(4;11)(q21;q23) con la región de ruptura . Con la orientación de cada gen hacia centrómero y telòmero..(b) diagrama

esquemático de varios tipos de fusiones entre los genes MLL – AF4 , la fusión de los genes más frecuente es e1-e11-e4(mayor del 55%), esporádicos casos e1-a3, las flechas indican las posiciones de los primers. El primer más utilizado es MLL-A ↔ AF4-B, las secuencias de dichos primers se ven en la tabla 1

Infantes

MLL(11q23

2 3 4 5 6 7 8 9 ,10, 11 12-15 17 18-21 22-27 28 29-31 32 - 36 1

centrómero telómero Región de Ruptura

6.5 Kb

AF4 (4Q21)

Región de ruptura

8 7 8 9

e8-e7

tipo

frecuencia

<10 %

raro e8-e4

4012 1628 1683

1ª 1b 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12-15 16-19 20

a

b

1738

1459 1504 1591

4 5 6 8

8 9

8

8

8

8

8

8 9 10 11

9 10 11

9 10 11

9 10

9 10

9 10

8 9 4 5 6 7 8

4 5 6 7 8

4 5 6 7 8

5 6 7 8

6 7 8

6 7 8

5 6 7 8

MLL-A (3916) (1714) AF4-B

<10 %

<10 %

raro

raro

raro

18 %

<10 %

55 %

e9-e5

e9-e4

e10-e6

e10-e5

e10-e4

e11-e6

e11-e5

e11-e4

MLL-C (3936) (1677) AF4-D

22

II.3.2.1 Diseño de los primers ò nucleótidos iniciadores para detectar translocación 12;21.

Los primers ó cebadores utilizados para la detección de este tipo de translocación se pueden ver en tabla 2 . Tabla 2 Primers ò iniciadores para análisis de RT-PCR de t(12;21)(p13;q12) con fusión de genes TEL-AML 1.

Código del primer 5’ posición Secuencia (5`- 3`) (tamaño)

TEL-A 845 (20) TGC ACC CTC TGA TCC TGA AC AML 1-B 611 (19) AAC GCC TCG CTC ATC TTG C TEL -C 928 (22) AAG CCC ATC AAC CTC TCT CAT C AML 1-D 577 (18) TGG AAG GCG GCG TGA AGC Fuente . Fodecyt No 90-2006

Tabla 2 complemento a la figura 5, observe las descripciones de los diferentes primer ó cebadores, su posición

y medida, las secuencias de los nucleótidos.

Figura 7 Translocación cromosómica 12; 21 TEL-AML 1 en LLA

Fuente . Fodecyt No 90-2006

Figura 7 (a) Diagrama esquemático de los exones e intrones de los genes TEL y AML-1, incluyen en

t(12;21)(p13;q22). Orientación de las flecha hacia el telòmero y centròmero, numeración de los exones, se indica con linea azul el lugar de las regiones donde ocurren las rupturas. (b) diagrama esquemático del TEL/AML-1 unidos, existen 2 posibles uniones, oberve que en la barra inferior está ausente el exon 2 . los números debajo de la fusión de los genes refieren a los transcritos más frecuentes ; las flechas indican las posiciones relativas de los primers .

TEL (12p 13)

2 3 4 5 6 7 8 1

centròmero telòmero Región de ruptura

AML 1 (21q22)

Región de Ruptura

4 5 2 3 4 5 6 tipo

488 1033 503 542 796

b

a

TEL -A AML-1-B

TEL-C AML-D

1 2 3 4 5 6 7ª 7b 8

953 1058 4 5 3 4 5 6

23

Todos los casos con precursos –B inmunofenotipo son más frecuentes que Pro-B. los pacientes tienen entre sus laboratorios de recuento de glóbulos blancos < 50,000/l, DNA index = 1, el 80% presentan delección del alelo TEL. No es hallada en casos T-ALL ó Leucemia Mieloide aguda ni en niños menores de 1 año.( Cayado G. et al., 2000). La fusión de los genes TEL-AML1 es debido a la fusión del extremo 5´del gen TEL un miembro de la familia ETS de los factores de transcripción y casi todo la región del gen AML1, el cual codifica la alfa subunidad del “Core binding factor” por sus siglas en inglés CBFα, un regulador master de la formación definitivo hematopoyético de células madre. El quimerismo TEL-AML1 factor de transcripción retiene una proteína-proteína interactuando con el dominio de TEL y el DNA puente y la secuencia reguladora transcripcional del AML1 (llamada CBF alfa) . Al efectuar la prueba de PCR se detecta la translocaciòn al someter la muestra a electroforesis en gel de agarosa al 1 % con bromuro de etidio. Los pacientes con translocaciòn positiva muestra una franja ò línea, en este tipo de translocación puede observarse 2 diferentes niveles con peso de 298 ó 259 bp. Debe haber un control positivo el cual siempre se evidencia a los rayos Ultravioleta, en este caso es de la línea celular REH. Así mismo se utiliza un control negativo el cual no evidencia franja alguna, registra la calidad de las muestras debido a que no debe haber contaminantes.( (Dongen JJM et al, 1999) El marcador de ADN es el VIII , utilizado frecuentemente debido a la variedad de los pesos moleculares que pueden ser comparados con las muestras; a los rayos ultravioleta se observa variedad de franjas que van de peso molecular alto a bajo (ver figura 9 ).

Figura 8. foto con rayos ultravioleta en gel Productos de PCR t 12;21 de agarosa al 1 % con bromuro de etidio.; 2 pacientes positivos, comparar con el control lìnea celular REH, ambos con peso molecular 298 paciente 1 y 259bp II.4 Leucemia Promielocítica Aguda (LPMA) Es un tipo de leucemia que constituye el 5 al 10% de las leucemias en niños. Se ha observado que los grupos étnicos latinos, asiáticos, hispanos en EE.UU. y en regiones de Italia tienen mayor incidencia. ( Douer, D.; Preston Martin, 1996) II.4.1 Leucemia Promielocítica Aguda (LPMA) y Translocación cromosómica 15;17 la translocación 15;17 está asociada con la LPMA por sus siglas Leucemia Promielocítica Aguda , tipo de leucemia dentro del grupo de las Mielocíticas agudas y por citomorfología M3. Las regiones de ruptura cromosómica han sido variablemente mapeada en cromosoma 15q22-q24 y en el cromosoma 17 q11-q21. Los dos genes involucrados son PML, factor de transcripción del cromosoma 15 y el gen RARA por sus siglas en ingles receptor alfa del ácido retinoico del cromosoma 17.( Iland H, et al. , 2005) Este tipo de leucemia constituye el 5 al 10% de las leucemias en niños. Se ha observado que los grupos étnicos latinos, asiáticos, hispanos en EE.UU. y en regiones de Italia tienen mayor incidencia. Douer, D. Preston Martin, S., Chang, E.(1996)

24

La translocación cromosómica detectada es la 15;17 de los genes α-receptor del ácido retinoico en la región del cromosoma 17 y del gen PML del cromosoma 15. Otras translocaciones encontradas están la 11;17, 5;17 y 11;17. La LPA puede ser tratado con àcido transretinoico (ATRA) al ser detectada la t 15;17.( Huang, M. E.; Ye, Y. C.1988) La detección de la t 15;17 previamente al tratamiento de ATRA es importante ya que después del mismo se debe realizar la detección de la t 15;17 por medio de la Transcriptasa Reversa de la Reacción de Cadena de la Polimerasa (RT-PCR). La detección persistente de la t 15;17 pos tratamiento predice la recaída posterior.( Lo, C. F.; Diverio, D.1999) Se han encontrado algunos problemas para el diagnóstico molecular de la t 15;17 por medio de la RT-PCR : 1) Poco rendimiento en la extracción del RNA, 2) degradación del RNA y 3) Inestabilidad del ADNc obtenidos después de la transcripción Reversa (Biondi A, Rambaldi A, Pandolfi PP, Rossi V. 1992) Las rupturas del cromosoma 17 están localizadas dentro 15 Kb, fragmento de ADN del intron RARA ver figura 10. II.4.1.1 Diseños de los primers para detectar translocación 15;17. Los primers ó cebadores utilizados para la detección de este tipo de translocación se pueden ver en tabla 3. Se preparan dos mezclas de primers ó cebadores en 2 distintos PCR para cada muestra asociando el cebador denominado PML-A1 con RARA-B y PML-A2 con RARA-B

Para la detección de la translocación con el método de PCR se debe elaborar 2 tipos de PCR para bcr1 y bcr3 los cuales abarcan el 96 % de los tipos de T 15;17. para fines de documentación se presentan los tres tipos de bcr efectuados en la translocación para los genes PML- RARA .( Biondi A. Rambaldi A. Pandolfi PP, 1992)

Tabla 3 Primers para detección de la translocación 15;17 PRIMER 5 posición Secuencia (5´- 3´) (tamaño)

PML-A1 1438(21) CAG TGT ACG CCT TCT CCA TCA PML-A2 969(18) CTG CTG GAG GCT GTG GAC RARA-B 485(20) GCT TGT AGA TGC GGG GTA GA PML-C1 1546(21) TCA AGA TGG AGT CTG AGG AGG PML-C2 997(19) AGC GCG ACT ACG AGG AGA T RARA-D 426(20) CTG CTG CTC TGG GTC TCA AT RARA-E3´ 682(20) GCC CAC TTC AAA GCA CTT CT Fuente . Fodecyt No 90-2006

Tabla 3 complemento a la figura 10, observe las descripciones de los diferentes primer ó cebadores, su

posición y medida, las secuencias de los nucleótidos.

Al efectuar las pruebas de PCR se detectan las translocaciones al someter las muestras a electroforesis en gel de agarosa al 1 % con bromuro de etidio. Los pacientes con translocaciòn positiva muestra una franja ò línea, dependiendo del tipo de bcr/ translocación puede observarse 3 diferentes niveles con de 381bp para bcr 1, 345 bp para bcr2 y 376 bp

25

para bcr 3. Debe haber un control positivo el cual siempre se evidencia a los rayos Ultravioleta, en este caso es de la línea celular NB4. Así mismo se utiliza un control negativo el cual no evidencia franja alguna, registra la calidad de las muestras debido a que no debe haber contaminantes. (Dongen JJM et al, 1999) El marcador es el VIII utilizado a los rayos ultravioleta se observó variedad de franjas que van de peso molecular alto 1,000 pares de bases bp a bajo 100 pb (ver figura 11 ).

II. 5 Técnicas para el análisis genético de los tumores pediátricos Dentro de las técnicas que hay para evaluar las anomalías a nivel cromosómico y molecular están: Cariotipo, Fish - por sus siglas en ingles Fluorescence In Situ Hybridization, Hibridación genómica, Reaccción de la Cadena de la Polimerasa por sus siglas en inglés PCR, RT-PCR por sus siglas Transcripción Reversa previo a PCR, Microarreglos de ADN con chips y proteómica.( Rowland, J. 2002) II.5. 1 La Trascripción Reversa - PCR La enzima que es utilizada en este método se denomina Transcriptasa Inversa ó reversa ya que tiene la función de realizar y polimerizar una doble cadena de ADN a partir de RNAm. Los virus RNA tienen enzimas transcriptasas reversas cuya función es polimerizar ADN a partir de un molde de ARN como por ejemplo el virus HIV. En la figura 11 se puede observar la actividad de la polimerasa transcriptasa Inversa la cual se une al RNA blanco iniciando la polimerización de hebra de ADN en dirección 5´a 3´. El RNA se obtiene por medio de diferentes métodos, el más utilizado es por medio de fenol y cloroformo según Chomczynski, P. & Sacchi, N. Al extraer la molécula de RNA esta deberá ser utilizada con los reactivos de transcripción Reversa para sintetizar el ADNc . La extracción del ARN ó RNA utiliza según el protocolo de Chomczynski, P. & Sacchi. El fenol a un PH de 4 produce un interfaz separando el RNA del resto de biomoléculas celulares además se utiliza cloroformo estabilizando la molécula de RNA. Además se utiliza Isopropanolol para precipitar el RNA y después ser lavado con etanol al 70%. Ver figura 13

anexo 6 página 53 (Chomczynski P and Sacchi N 1987) El RNA se obtiene a partir de células sanguíneas por medio de la separación de gradiente con ficoll, este método separa los glóbulos rojos y plasma de las células mononucleares donde se encuentra el RNA. Ver figura 12 II.5.2 Transcripción Reversa con Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR) en

translocaciones cromosómicas. La trascripción de la fusión MLL-AF4 (translocación 4;11), TEL-AML1 (translocación 12;21) y PML-RARA (translocación 15;17) se expresan en RNAm, el cual es traducido formando proteínas diversas. Existe la técnica de detectar estas translocaciones por medio de PCR. La aplicación de RT-PCR (reacción en cadena de la polimerasa en transcripción inversa) ha sido una herramienta diagnóstica sensible para la detección de dicha translocaciòn. La Sensibilidad de la prueba diagnóstica es de una célula, con dicha translocación, en una población de hasta 10,000 células normales. (tipo de célula sanguínea estudiada son mononucleares). (Da silva A, 2003)

26

Figura 9 Translocación cromosómica 15; 17 PML/ RARA en Leucemia Promielocítica Aguda

Fuente . Fodecyt No 90-2006

Figura 9 a) esquema de las estructuras de los exones e intrones de los genes PML (color verde) y los de

RARA (color amarillo), involucrados en la translocación 15;17(q22;q21). La orientación del centrómero (cen)

y telómero (tel) , la numeración de los exones y las regiones de rupturas. El bcr1 y bcr2 estan yuxtapuestas en

el intron y en exon respectivamente No 6 gen PML.b) diagrama esquemático de los tres tipos de transcriptos de

PML-RARA , relacionado los diferenes PML regiones de rupturas. El tamaño del bcr 2 depende de la region de

ruptura en el exon 6 PML. Las siete flechas indican las posiciones relativas de los primers; los números

referidos al extremo 5´ nucleótido de cada primer .

PML( 15q22)

1 2 3 4 5 6 7 8 9

bcr 3 bcr2 bcr1 cen tel

-1.5 kb -0.3kb -2 kb

Región de ruptura – 15 kb

RARA (17q21)

1 2 3 4 5 6

tel cen

b

a

tipo frecuencia

55 %

5%

40%

3 4 5 6

3 4 5 6

3

3

3 3

bcr 1

bcr 2

bcr 3

PML-A2 PML-A2 RARA-B 968 1438 485

PML-C2 PML-C1 RARA-D 997 1546 426

RARA-E3 682

27

Figura 10 Foto de electroforesis de productos de PCR para detectar translocaciones

cromosómicas 15;17 (BCR 1 ,2 y 3).

Fuente: Dongen JJM et al.: Revista Leukemia, 1999 sep; 13 (1): 1901-1928.

Figura 10 foto con rayos ultravioleta en gel de agarosa al 1 % con bromuro de etidio. Prueba de PCR

PML/RARA; 3 diferentes pacientes positivos según tipo de bcr investigada (bcr 1,2 y 3), comparar con el

control línea celular NB4, con peso moleculares diferentes 381 bp para bcr 1 , 345 bp para bcr 2 y 376 bp

para bcr 3. Se utiliza marcador de ADN de 100 pares de bases . Control negativo (H20).

Figura 11 Transcripción Reversa

Fuente: http://www.ma.uni-heidelberg.de/inst/ikc/molekularbiologie/rt-pcr.jpg Figura 11 Transcripción Reversa RT. A partir de una cadena de RNA en la cual se observa una secuencia de

exones con sus 4 diferentes bases nitrogenadas A (adenina), U (uracilo), G (Guanina) y C (Citocina). Es única

hebra con exones únicamente. La transcriptasa Reversa en inglés Reverse Transcriptase es la enzima que

polimeriza la hebra complementaria de ADN ó DNA copia uniéndose al RNA, La polimerización sintetiza de

tal manera que las bases nitrogenadas son complementarias ejemplo A (Adenina) con T (timina) y C (Citocina)

con G (Guanina). Al finalizar el proceso de transcripción reversa este se somete a la Cadena de Reacción de la

Polimerasa para replicar in vitro la secuencia de interés.

28

Figura 12 Separación de células Mononucleares en sangre

Fuente: Fodecyt No 90/2006

Figura 12 Separación de Células Mononucleares (células sanguíneas) por medio de

gradiente utilizando Ficoll. a) En un tubo cónico de 15 ml se introduce primero el Ficoll,

Aproximadamente 5 ml y sangre completa aproximadamente 3 ml. Este tubo es llevado a

la centrífuga. b) Se observa la separación de diferentes elementos de la sangre en la fase

superior está el plasma, debajo de la misma están las células mononucleares las cuales

deben ser aspiradas.

Figura 13 Extracción de RNA de células mononucleares

Fuente: Fodecyt No 90 2006

Figura 13 Extracción de RNA con fenol y cloroformo. A) Se representa la separación de RNA en

forma acuosa al mezclarse con fenol ácido y cloroformo después de ser centrifugado; se separan dos

fases, la superior se localiza el RNA en forma acuosa. La cual deberá ser aspirado y colocado en un

segundo tubo con isopropanolo b) Después de la centrifugación de la mezcla de la fase superior del

tubo a) con isopropanolol se precipita al fondo del tubo el RNA denominado pellet. Técnica de

Chomczynski P and Sacchi.

II.6 Factores de riesgo y pronóstico en LLA y LPMA En UNOP los pacientes con LLA se clasifican en dos grupos de buen o mal pronóstico, dependiendo de la presencia de factores de riesgo, tales como: Edad, Recuento de glóbulos blancos, Inmunofenotipo, Index DNA (ver tabla _). Según la clasificación, reciben el tratamiento respectivo. Algunos de estos casos se han podido detectar translocaciones cromosómicas 9:22 ABL/BCR, Translocación 4;11 MLL-AF4 y Translocación 12;21 TEL-AML1. La

Sangre entera ò

Médula ósea

Ficoll

plasma

mononucleares

ficoll

polimorfonucleares Glóbulos

Rojos

A la

centrifugación

a)

RNA en fase

acuosa

Isopropanolol a la

centrifugación se

obtiene un pellet de

RNA

b)

29

determinación de las translocaciones 9;22 y 4;11 se relaciona a mal pronóstico; la translocación 12;21 esta presente en pacientes con buen pronóstico.(Artigas Carmen, 2006) Tabla 4 Factores de riesgo que determinan Bueno ó mal pronóstico en pacientes con LLA

Factor de riesgo

Buen pronóstico Mal pronostico

Edad 1 a 10 años <de 1 año ó > de 10 años Recuento de glóbulos blancos

< de 50,000 /mm3 > de 50,000 /mm3

DNA Index >1 < de 1. Inmunofenotipo B T Invasión a Sistema nervioso central

Sin presencia de blastos en líquido cefalorraquídeo

Presencia de blastos en líquido cefalorraquídeo

Tabla 4 Factores de riesgo de buen pronóstico y mal pronóstico según edad, recuento de glóbulos blancos, DNA index, inmunofenotipo e invasisión al sistema Nervioso Central

En las leucemias linfoblástica aguda es importante el diagnóstico de estas aberraciones cromosómicas. En Centros especializados Europeos y Americanos La RT-PCR ha sido indispensable en el protocolo del manejo en niños con Leucemias. La determinación de la presencia ó no de cada translocación en este tipo de Leucemia da una importante información para tomar decisiones en el tratamiento específico de cada caso. En Centro América inician estudios de este tipo en Costa Rica desde 1996. (Jiménez A, et al. , 2008).

En las Leucemias Mieloides tal como la Promielocítica Aguda ha sido investigada la presencia de la translocación 15;17, debido a que la detección de esta translocación permite seleccionar la quimioterapia ideal, ahorrando costos y mejorando el pronóstico de sobrevida de los pacientes. En centros de investigación de Estados Unidos y Europa indican la detección de esta translocación en un 90-95 % de los casos de LPMA.( Iland H, 2005)

la investigación de translocaciones en enfermedades como Leucemia es ideal identificarlas a partir de RNAm. Las muestras de sangre periférica ò médula ósea se someten a una serie de etapas ò procesos, a partir de extracción de células mononucleares se obtiene RNAm (ácido ribonucleótido mensajero); posteriormente se efectúa trascripción inversa para sintetizar ADNc. Finalmente se somete el ADNc al termociclador para realizar PCR . (ver en Anexos) ((Dongen JJM et al, 1999).

La PCR para MLL-AF4 se detecta en pacientes con diagnóstico clínico de Leucemia linfoblástica aguda (LLA) menores de 1 año y PCR para TEL-AML1 para todos los niños menores de 17 años con LLA. Finalmente la PCR para PML-RARA para todos los niños con diagnóstico clínico de Leucemia Promielicítica Aguda (LPMA) El protocolo general de PCR para las aberraciones cromosómicas en leucemias se observa en la tabla 5( Borrow J, 1990)

II.7 PCR del gen Abelson ABL (gen constitucional) el cual debe evidenciarse en todos los pacientes , tengan ò no la translocaciòn. El gen abelson codifica una enzima denominada Tirosincinasa cuya función es agregar grupos fosfatos a residuos de tirosina.

30

En la foto de figura 12 evidencia la existencia del gen ABL nos indica que la muestra es fidedigna ò de buena calidad para someterla a los diferentes PCR según el tipo de Leucemia. Se procesan 3 muestras denominadas Muestra de paciente, muestra control positiva (de la línea celular HL60) y la tercera muestra de control negativo (agua) Por ejemplo: Figura 14 Foto PCR ABL Esta foto se obtuvo posterior a electro-

Foresis, donde se Corrieron 2

muestras de pacientes a la vez (1 y

2), muestra de control positivo (C

+) y control negativo (C -) . ABL

es el gen Constitutivo. M es el

Marcador 8, para establecer El

peso molecular de los nucleótidos. Las muestras de los pacientes 1 y 2 son de buena calidad, ya que tienen el gen constitutivo ABL, los cuales se comparan con el control positivo. El control negativo es agua la cual debe estar sin evidencia de nucleótidos

FOTO 2: de PCR RT , evidencia si existe ò no la translocación, el proceso de PCR correrá a la vez 3 muestras denominadas Muestra del paciente, muestra control positivo (de la línea celular dependiendo de la translocación y diagnóstico clínico de leucemia ) y la tercera muestra es de control negativo (agua). II.8. Protocolo BIOMED-1 El protocolo estandarizado para la detección de las translocaciones cromosómicas en las diferentes tipos de leucemias se presente a continuación. Tabla 5 Dicha tabla presenta los procesos de Transcripción reversa ó síntesis de ADNc a partir de la extracción del RNA en células mononucleares con guanidio (punto 1 de la tabla). Posteriormente el PCR primario el cual se utiliza para detectar tanto el gen Abelson (constitutivo) como las diferentes translocaciones, lo que varía es el uso de los primers ó cebadores, los cuales son específicos según la translocación( 2 y 3 de la tabla 5). El protocolo así mismo refiere el PCR segundo ó en inglés Nested (anidado traducido al español) el cuál a partir del producto del PRC primario se aplican otro tipo de primers ó cebadores, los cuales deben ser internos C-D referidos en cada tabla de primers descritos anteriormente y según la translocación a detectar. Para el presente estudio no se aplicó este segundo PCR ya que es utilizado en casos de detección de enfermedad residual posteriormente a los tratamientos aplicado a pacientes con leucemia

31

Tabla 5 Protocolo estandarizado de RT-PCR ______________________________________________________________________ 1.- RT-reacción con random hexamers (transcriptasa inversa, se obtiene ADNc)

• 1 µg de RNA (ò 0.1 µg de RNAm) en 9.5 µl de H20

• Incubaciòn a 70 º C por 10 minutos

• colocar en hielo y agregar los siguiente reagentes , obteniendo un volumen de 20 µl:

RT buffer: 20 mM tris HCL, 50 mM KCL, ph 8.3

Mg Cl2 : 5 mM

Random Hexamers: 5 µM

RNAasa: 20 unidades

RT enzima: 200 unidades Superscript (200 unidades por µl)

dNTP: 1 mM

• tiempos y temperaturas de incubaciòn

temperatura ambiente por 10 minutos

42ºC por 45 minutos

99ºC por 3 minutos.

4ºC hasta el final

2.- PCR primario

• volume final con reagents 25 µl

• 2-3 µl de ADNc

• Primers: 400 nM , concentración final. Se utilizan los externos A ↔ B

• dNTP: 200 µM , concentraciòn final

• PCR buffer: 20mM tris HCL, 50 mM KCL, ph 8.3

• MgCl2 : 2.5 mM (utilizarlo según cada laboratorio)

• Enzima polimerasa Taq 1 unidad por 50 µl de volumen

3.- Programación temperaturas y tiempos en los ciclos

• Desnaturalización inicial : 95ºC por 2 minutos

• CICLOS de PCR

94ºC por 30 segundos (desnaturalización)

65ºC por 30 segundos (alineación)

72ºC por 45 segundos (elongación)

• El número de ciclos: 35

• Detener la PCR: 16ºC (ò temperatura ambiente)

4.- Segundo PCR ò nested (anidado)

• 1 µl del PCR primario

• Los mismos reagentes y cantidades utilizadas en el PCR primario, a excepción de los primer que

deben ser los internos C ↔ D.

Fuente: Dongen 1999 sep; Leukemia 13 (1): 1901-1928.

Este protocolo se aplica en la detección de diferentes aberraciones cromosómicas; difieren los primers, ya que

cada uno de ellos tiene una secuencia específica de nucleótidos. El producto del PCR podrá ser sometido a

electroforesis en gel de agarosa al 1 ò 2 % y posteriormente llevado al transiluminador de rayos ultravioleta

para tomar la foto digital. Según protocolo BIOMED-1.

32

PARTE III. III.1. RESULTADOS III.1.1 Frecuencia de Leucemias Linfoblástica Aguda (LLA) y Promielocítica Aguda

(LPMA) Los niños atendidos en Unidad Nacional de Oncología Pediátrica-UNOP- con diagnóstico de LLA fueron 90 casos, los cuales cumplieron con los criterios de inclusión, ver página 7 Los niños con diagnóstico de LPMA fueron 5, cumpliendo así mismo con los criterios de inclusión referidos anteriormente. Los otros tipos de Leucemias diagnosticadas fueron Leucemia Mieloide Crónica y Mieloide Aguda, los cuales no fueron incluidos en nuestro estudio. A continuación se presenta el cuadro no 2 donde especifica los diagnósticos de Leucemias atendidas en UNOP durante los 20 meses.

Cuadro No 2 Frecuencia de tipos de Leucemias referidas Por UNOP durante 20 meses

Tipos de Leucemias No Casos

Dx LLA 90

Dx LPMA 5

Dx LMC 3

Dx LMA 9

107

Fuente: Información obtenida en la base de datos de los pacientes de UNOP

Cuadro No 2 Representa la frecuencia de los tipos de Leucemias atendidos en UNOP,

donde Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) tiene el 84.1 % de todos los casos,

le sigue en frecuencia Leucemia Mieloide Aguda (LMA) con el 8.4%, Leucemia

Promielocítica Aguda (PMLA) con el 4.7% y Leucemia Mieloide Crónica (LMC)

Con el 2.8 %

III.1.2 Detección de translocación cromosómica 4;11 El procesamiento de las muestras por medio de la Reacción en Cadena de la Polimerasa con retrotranscriptasa , por sus siglas en inglés PCR-RT en los 5 niños menores de 1 año, fue detectada en 4 y siendo 1 negativa para dicha translocación. Ver gráfica No 1 III.1. 3 Detección de translocación cromosómica 12;21 Fueron procesadas 90 muestras de los niños con diagnóstico de LLA menores de 17 años de edad. De los cuales a 28 se les detectó la translocación cromosómica 12;21 y los 62 restantes fueron negativos para dicha translocación cromosómica. Ver gráfica 2.

33

Fuente Fodecyt Libro de registro del Laboratorio de Biología Molecular, Facultad de Ciencias Médicas,

USAC, CUM.

Gráfica No 1. Representa los casos de niños con diagnóstico de LLA menores de 1 año, diagnosticados

en UNOP durante 20 meses. De los 5 niños con LLA, a 4 se les detectó la Translocación 4;11 por

medio de RT-PCR en el laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Médicas

de la Universidad de San Carlos de Guatemala

Fuente Fodecyt Libro de registro del Laboratorio de Biología Molecular, Facultad de Ciencias Médicas,

USAC, CUM.

Gráfica No 2 Representa los casos de niños con diagnóstico de LLA (Leucemia Linfoblástica Aguda)

menores de 17 años, diagnosticados en UNOP durante 20 meses. De los 90 niños con LLA, a 28 se les detectó

la Translocación 12;21 por medio de RT-PCR en el laboratorio de Biología Molecular de la Facultad de

Ciencias Médicas de la Universidad de San Carlos de Guatemala

III.1. 4 Detección de translocación cromosómica 15;17 Fueron procesadas 5 muestras de los niños con diagnóstico de LPMA menores de 17 años de edad. De los cuales a todos se les detectó la translocación cromosómica 15;17. Ver gráfica 3.

Frecuencia

Frecuencia

34

Fuente Fodecyt Libro de registro del Laboratorio de Biología Molecular, Facultad de Ciencias Médicas,

USAC, CUM.

Gráfica No 3 Representa los casos de niños con diagnóstico de LPMA (Leucemia Promielocítica Aguda)

menores de 17 años, diagnosticados en UNOP durante 20 meses. De los 5 niños con LPMA, a los 5 se les

detectó la Translocación 15;17 por medio de RT-PCR en el laboratorio de Biología Molecular de la Facultad

de Ciencias Médicas de la Universidad de San Carlos de Guatemala

Así mismo se establece los dos subtipos más frecuentes de translocación 15;17 denominada BCR 1 y BCR 3 . Detectando de los 5 casos, 2 con subtipo BCR 1 y 3 con subtipo BCR 3. Ver gráfica 4.

Fuente Fodecyt Libro de registro del Laboratorio de Biología Molecular, Facultad de Ciencias Médicas,

USAC, CUM.

Gráfica No 4 Representa los casos de niños con diagnóstico de LPMA (Leucemia Promielocítica Aguda),

menores de 17 años, diagnosticados en UNOP durante 20 meses. De los 5 niños con LPMA a 2 se les detectó

la Translocación 15;17 subtipo BCR 1 y a 3 el subtipo BCR 3 por medio de RT-PCR en el laboratorio de

Biología Molecular de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad de San Carlos de Guatemala

Frecuencia

Frecuencia

35

III. 1. 5 Características generales de los pacientes estudiados en UNOP según el tipo de Leucemia

III.1.5.1 Pacientes con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) y

Leucemia Promielocítica Aguda (LPMA) según sexo.

De los 90 pacientes con diagnóstico de LLA 58 casos fueron de sexo Masculino y 32 de sexo femenino. De los 5 pacientes con diagnóstico de LPMA 3 casos fueron de sexo masculino y 2 de sexo femenino. Ver gráfica 5.

Fuente Fodecyt Libro de registro del Laboratorio de Biología Molecular, Facultad de Ciencias Médicas,USAC,

CUM.

Gráfica No 5 Representa la distribución de niños Según sexo y diagnóstico de LLA (Leucemia Linfoblástica

Aguda) y LPMA (Leucemia Promielocítica Aguda), menores de 17 años, diagnosticados en UNOP durante 20

meses.

III.1. 5.2 Procedencia de los pacientes con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) y Leucemia Promielocítica Aguda (LPMA).

Según las muestras de pacientes referidas de La Unidad Nacional de Oncología Pediátrica – UNOP- fueron 90 pacientes con diagnóstico de Leucemia Linfoblástia Aguda LLA y 5 con diagnóstico de Leucemia Promielocítica Aguda LPMA. de los 90 casos en total con LLA fueron originarios del departamento de Guatemala 31, le sigue San Marcos con 9 , Chimaltenango, Quetzaltenango con 7 cada uno; de los departamentos de Huhuetenango, Retalhuleu, Sololá y Suchitepequez fueron 4 cada uno De los departamentos de Escuintla, Jalapa con 3 casos cada uno; de los departamentos de Izabal, Santa Rosa, Totonicapán y El Progreso fueron 2 casos cada uno y finalmente para los departamentos de Chiquimula, Baja Verapaz, Mazatenango, Petén, Zacapa y El Quiché fueron originarios 1 para cada uno.

36

En los 5 casos con diagnóstico de LPMA, fueron originarios del departamento de Guatemala 3 y de Santa Rosa y El Quiché 1 para cada uno. Ver cuadro 3 CUADRO 3 Procedencia de pacientes con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica

Aguda (LLA) y Leucemia Promielocítica Aguda (LPMA), referidos de UNOP durante 20 meses.

Procedencia de los

pacientes

Pacientes

con LLA

Pacientes

con LPMA TOTAL

Guatemala 31 3 34

San Marcos 9 9

Chimaltenango 7 7

Quetzaltenango 7 7

Huehuetenango 4 4

Retalhuleu 4 4

Sololá 4 4

Suchitepéquez 4 4

Escuintla 3 3

Jalapa 3 3

Chiquimula 1 1

Izabal 2 2

Santa Rosa 2 1 3

Totonicapán 2 2

Baja Verapaz 1 1

El Progreso 2 2

Mazatenango 1 1

Petén 1 1

Zacapa 1 1

El Quiché 1 1 2

TOTAL 90 5 95

Fuente: Fodecyt Datos obtenidos en base de datos de los pacientes de UNOP

Cuadro No 3 Representa la frecuencia de los lugares de procedencia según los tipos de Leucemias

atendidos en UNOP, donde Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) y Leucemia Promielocítica

Aguda (PMLA) se observa que en orden de frecuencia Guatemala Ciudad Capital ocupa el primer

lugar.

III.1.5.3 Distribución de pacientes con diagnóstico de LLA y LPMA según edad. El presente estudio reporta la frecuencia de los pacientes con Leucemia Linfoblástica Aguda LLA y Leucemia Promielocítica Aguda LPMA según rango de edad. La población estudiada fueron niños menores de 17 años. En la gráfica 6 se reporta la distribución de los 90 niños con LLA y 5 con LPMA según las edades. Según el diagnóstico de LLA en el rango de 2 a 3 años fueron 11 casos, de 8 a 9

37

años fueron 10; en el rango de 6 a 7 años fueron 9 casos; en el rango de 5 a 6 años fueron 8 casos; en los rangos de 3 a 4 años, 4 a 5 años, 9 a 10 años fueron 6 casos cada uno. Los casos menores de 1 año fueron 5 casos, Dentro del resto de rangos de edad oscilan 4, 3 y 2 casos. Para los casos de LPMA los pacientes oscilan entre los 7 a 8 años y de 8 a 9 años 2 casos cada uno y solamente en el rango de 9 a 10 años 1 caso. Ver gráfica 6.

Fuente Fodecyt libro de registro del Laboratorio de Biología Molecular, Facultad de Ciencias Médicas, USAC,

CUM.

Gráfica No 6 Representa los casos de 90 niños con diagnóstico de LLA (Leucemia Linfoblástica Aguda) y 5

con LPMA (Leucemia Promielocítica Aguda), menores de 17 años, diagnosticados en UNOP durante 20

meses. En la gráfica la línea azul representa los ninños con diagnóstico de LLA y en rojo los de LPMA: La

gráfica presenta la frecuencia de los niños con estos diagnósticos según edad, note que el ragno es por año de

vida.

EDAD

38

III. 2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS

1. El presente estudio incluyó dos de los tipos de Leucemias que se diagnostican en niños menores de 17 años en la Unidad de Oncología Pediátrica –UNOP- de Guatemala; estas son la Leucemia Linfoblástica Aguda LLA y Leucemia Promielocítica Aguda LPMA. De los tipos de Leucemias reportados por UNOP, la LLA se detectó en el 84.1 % y LPMA en el 4.7 %. Ver cuadro 2

2. La translocación 4;11 en niños menores de 1 año con LLA fue detectada en el 80% de los 5 pacientes. Ver gráfica 1

3. La translocación 12;21 en los niños menores de 17 años con LLA fue detectada en

el 31.1 % de los 90 pacientes. Ver gráfica 2

4. La translocación 15;17 en los niños menores de 17 años con LPMA fue detectada en el 100% de los 5 pacientes. En este tipo de translocación se detectó así mismo 2 subtipos denominadas BCR 1 y BCR3 siendo el 40 % y 60% respectivamente. Ver gráfica 4.

5. De algunas características generales en los niños con diagnóstico de LLA y

LPMA se observa que: a) según el género ó sexo los niños con LLA se presenta en el 64.5% y en las niñas 35.5 % , para los pacientes con LPMA se presenta el 60% en niños y 40% en niñas. Ver gráfica 17 b) Según el lugar de procedencia de los niños con LLA y LPMA el departamento de Guatemala ocupa el primer lugar siendo el 34.4% y 60% respectivamente. Ver cuadro 3 c) Según la edad de los pacientes con diagnóstico de LLA se observa que los tres rangos con mayor frecuencia son: 2-3 años (12.2%), 8-9 años(11.1%) y 6-7 años (10%) ; así mismo ser observa que de los 5 casos con LPMA se encuentran en los rangos 7-8 años (40%) 8-9 años (40%) y de 9-10 años (20%) ver gráfica 6.

39

PARTE IV. IV. 1 CONCLUSIONES

1. Se determinó la prevalencia de las translocaciones 4;11 y 12;21 ,en 80% y 31.1% respectivamente, en niños con Leucemia Linfoblástica Aguda LLA y Translocación 15;17 en 100% de los casos con Leucemia Promielocítica Aguda PMLA, mediante la técnica de Retro transcripción y Reacción en cadena de la Polimerasa por sus siglas en inglés RT-PCR. Los niños fueron diagnosticados en la Unidad Nacional de Oncología Pediátrica UNOP.

2. Se determinó la translocación 4;11 en el 80% de los casos, considerada de mal pronóstico en los niños menores de 1 año con LLA. Entre los factores de mal pronóstico se encuentra la edad menor de un año ver tabla 4 página 29. La bibliografía consultada refiere que la detección de dicha translocación es del 70 al 80 % de los casos con LLA en menores de 1 año por lo que no hay diferencia significativa con dichas estadísticas.

3. Se determinó la translocación 12;21 en el 31.1% de los casos, considerada de buen pronóstico en los niños menores de 17 años con LLA. Según la bibliografía consultada dicha translocación está reportada entre el 25 al 30%. No hay diferencia significativa con dichas estadísticas.

4. Se determinó la translocación 15;17 detectada en el 100% de los casos, es de importancia en los casos con diagnóstico de Leucemia Promielocítica Aguda, LPMA, ya que son candidatos para el tratamiento de quimioterapia con el medicamento ATRA. Las estadísticas en estudios previos reporta la presencia entre el 95 al 100%.. Los subtipos de translocación BCR 1 y BCR3 no hay diferencia significativa con dichas estadísticas.

5. Según las características generales en los niños con LLA se observa una tendencia de que el sexo masculino es el más afectado 64.5% y para LPMA en un 60% respectivamente y para el sexo femenino con LLA el 35.5% y para LPMA 40% respectivamente; siendo los resultados similares en otros estudios realizados en EEUU. Según el lugar de procedencia hubo más casos en el departamento de Guatemala, es probable por factibilidad de diagnóstico y accesibilidad al ser referidos a UNOP. Según la edad de los niños con diagnósticos de LLA y LPMA las edades más afectadas fueron entre 6 a 10 años. En los casos de LLA hay mal pronóstico en niños menores de 1 año ó mayores de 10 años. La Leucemia Linfoblástica Aguda LLA ocupa el primer lugar de las leucemias diagnosticadas en UNOP en niños menores de 17 años. Presente en el 84.1% de todos los casos reportados.

40

IV. 2 RECOMENDACIONES

1. Dada la importancia de la determinación de las respectivas translocaciones según Leucemia Linfoblástica Aguda LLA y Leucemia Promielocítica Aguda LPMA Se recomienda incluir en los protocolos de manejo clínico de pacientes con dichas Leucemias las pruebas de detección de translocaciones cromosómicas 4;11, 12;21 y 15;17 por medio de RT-PCR.

2. En los casos de Leucemia Linfoblástica Aguda se recomienda realizar la prueba de

detección de translocación cromosómica 4;11 a niños menores de 1 año para documentar los casos con posibles recaídas posterior al tratamiento inicial.

3. A los niños menores de 17 años con LLA realizar la prueba de detección 12;21, para documentar los casos con mejor pronóstico inclusive con recaídas posterior al tratamiento inicial.

4. En los casos de Leucemia Promielocítica Aguda se recomienda realizar prueba de detección de translocación cromosómica 15;17 para decidir el tratamiento con Ácido Retinoico el cual actúa cuando existe dicha translocación mejorando la respuesta clínica

5. Realizar futuras investigaciones que podrán ser complementadas por medio de estos métodos de diagnóstico moleculares como lo es RT-PCR, ya que se pueden realizar un PCR anidado para la detección de translocación cromosómica residual especialmente en los casos de translocación 4;11 y 15;17.

41

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRAFÌCAS

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45

IV 4 ANEXOS

46

INDICE DE ANEXOS

1. Información de aspectos bioéticos página 47 2. Boleta de información a los padres y niños página 48 3. Boleta de consentimiento informado página 50 4. Boleta de datos del paciente página 51 5. Protocolo de Separación de mononucleares con gradiente de ficol página 52 6. Extracción de RNA página 53 7. Síntesis de ADNc página 55 8. PCR – Biomed 1 página 56 9. Electroforesis y toma de foto UV página 57 10. Registros en hoja Excel página 59

47

ANEXO 1 INFORMACIÓN DE ASPECTOS BIOÉTICOS

Se explicará al paciente (o a padres o tutores), con lenguaje claro y sencillo, la naturaleza del estudio, sus objetivos, la importancia del diagnóstico, los beneficios directos que obtendrá el paciente (mayor precisión en su diagnóstico, conocimiento temprano de pronóstico, decisión temprana de Tratamiento), los beneficios que tendrá el grupo de pacientes con LLA o LPMA.

Se les explicará la necesidad extraer una muestra de sangre venosa del paciente para detectar la presencia o ausencia de una alteración genética llamada translocación. Se explicará el procedimiento de extracción de sangre, la técnica antiséptica, la cantidad de 7 a 10 ml. , y que esto no conlleva mayor riesgo para el paciente que el de las extracciones habituales que se le realizan en el hospital. Procedimientos para garantizar aspectos éticos de la investigación: 1. Se explicará al encargado del paciente (padres o tutores) el propósito, la naturaleza y las

implicaciones de la investigación. 2. Se explicará los riesgos de la extracción de sangre. 3. Luego de asegurarse de que la información ha sido comprendida por el paciente y los

padres o encargados, se solicitará el consentimiento del paciente o de la persona encargada, si este fuese menor de 10 años. Ver página 53 (boleta de consentimiento informado).

4. Se garantizará la confidencialidad de la información proporcionada y de los exámenes clínicos y de laboratorio.

5. Se garantizará el uso de la información únicamente para los fines originales del estudio. 6. Se explicará que el paciente podrá decidir su retiro del estudio en cualquier momento, sin

que esto signifique que no recibirá atención médica. Siempre dentro del marco de los principios éticos de la investigación la relación riesgo-beneficio es positiva en el sentido de favorecer la salud de los participantes frente a riesgos menores. Se reivindicará a través de las acciones del estudio el procurar hacer el bien, en cuanto se apoya la obtención de un diagnóstico temprano que ayuda al inicio de una terapia apropiada.

Los padres y los niños mayores de 10 años tomarán la decisión de aceptar o no su participación en el estudio, debiendo firmar o colocar la huella digital en el documento de consentimiento informado, en caso de que desean participar en el estudio. La información a padres y niños y la boleta del consentimiento informado ver Boleta de información a padre y niños y consentimiento informado.

48

ANEXO 2 BOLETA DE INFORMACIÒN A LOS PADRES Y NIÑOS Marco teórico Durante los últimos 20 años, la Medicina ha mejorado el tratamiento de las leucemias, especialmente en niños. Debido a que se han realizado pruebas especiales

Estas pruebas en sangre, detectan si hay un problema a nivel de genes de las células. Dentro de los casos de leucemias hay pacientes con defectos en los genes llamados “translocaciones” , si el médico tratante sabe que existe este defecto puede programar el tratamiento más adecuado desde el principio.

El estudio está aprobado por La Facultad de Medicina de la Universidad de San Carlos de Guatemala. Propósito Encontrar el defecto en los genes llamado translocación en niños con leucemia específicamente con “Linfoblástica aguda ò Promielocítica Aguda ” . En este estudio:

El análisis en los genes será utilizado únicamente para la investigación llamada

“Determinación de translocaciones cromosómicas 4;11 y 12;21 en niños con diagnóstico de Leucemia linfoblástica aguda y 15;17 en Leucemia Promielocítica aguda

por medio de RT-PCR.”

1. El investigador dará los resultados al ó los médicos a cargo del paciente y si usted lo solicita será notificado a través de ellos.

2. No serán entregadas los resultados a terceras personas, incluyendo a su compañía de seguro médico, si usted no lo autoriza en forma escrita.

3. La muestra de sangre y las etapas de su proceso podrán conservarse hasta que sea de utilidad en el estudio. La investigación concluye hasta el año 2007.

4. Los científicos investigadores no entregarán las muestras a ninguna tercera parte, cumpliendo con esto privacidad y confidencialidad.

5. La muestra de sangre no estará disponible para ningún otro tipo de estudio no relacionado con esta investigación.

Procedimiento La investigación estudiará el defecto de translocación de genes en sangre, de los pacientes con leucemia linfoblástica aguda ó Promielocítica Aguda. Es necesario una muestra de sangre equivalente a 2 cucharaditas. La muestra de sangre se obtendrá de una vena del antebrazo por un médico ó personal de enfermería calificado. Esta muestra será enviada al laboratorio del Centro Universitario Metropolitano, Facultad de Medicina, Universidad de San Carlos de Guatemala, zona 11 Ciudad Capital. El procesamiento de la muestra dura 5 días hábiles y el resultado por escrito se enviará en 1 semana. Idealmente se aprovechará obtener la muestra para la presente investigación cuando se le extraiga sangre por otros estudios de rutina. Riesgos e incomodidades Los riesgos de la extracción de sangre en vena son mínimos. El único riesgo que puede anticiparse es la molestia asociada con la extracción sanguínea que incluye dolor en el sitio

49

de la misma. Poco frecuentes son hematoma e infección, los cuales pueden ser tratados apropiadamente por su médico responsable de la Unidad Nacional Oncológica Pediátrica. Beneficios potenciales

Los beneficios por participar en este estudio pueden ser: • Un mejor conocimiento de la enfermedad • Aportar información para el médico tratante en la Unidad Nacional Oncológica

Pediátrica. • Recibir información del estudio si así lo desean

Alternativas La única alternativa es no participar en el estudio. Al negarse a colaborar con el estudio no afecta la atención médica en Unidad Nacional Oncológica Pediátrica. Costos financieros No hay gastos para usted por participar en este estudio. Dudas pueden realizarla con los doctores investigadores Dr. Alberto García González y/ó Dr. César Vásquez Galván al tel. 53 12 78 74. Si está interesado en participar favor leer y llenar la boleta que se le presenta a

continuación.

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ANEXO 3

BOLETA DE CONSENTIMIENTO INFORMADO

al firmar el consentimiento informado se deberá llenar la boleta de Datos del paciente que a continuación se presentan, dichos datos se obtendrán de los registros médicos, bajo en consentimiento y aval de dirección médica UNOP. Ver siguiente página

Nombre del niño/a____________________________________________ Fecha ___________No registro hospitalario___________ (información llenada por personal del hospital) Con la firma de este documento, dejo constancia, yo____________________ _____________________, que he sido informado acerca de la técnica de extracción de sangre, de las muestras y riesgos menores. He recibido además una copia de la información al paciente, sobre la investigación. El médico investigador ha resuelto personalmente las dudas que he planteado con respecto a la investigación. Además he sido informado del derecho que tengo de retirarme de este estudio, sin que afecte la atención médica dada por la institución. Autorizo al médico y equipo de investigación a recabar la información que requiere la ficha del estudio, manteniendo la confidencialidad de los datos. Acepto voluntaria y libremente participar en esta investigación. __________________ ____________________ Firma o huella padre, firma ò huella del niño Madre ò tutor mayor de 10 años de edad __________________ Testigo/ enfermera(o) ò médico

51

Fecha:____________ Registro del paciente(del hospital)_______ Nombre del paciente____________________ Edad:__________ Sexo ____________procedencia__________________________ Nombre del padre ò tutor ______________________________________ Diagnóstico Clínico(histopatológico) _____________________________ Muestra enviada de sangre periférica______ CC. Estudios realizados previamente en UNOP en niños con LLA

Recuento de glóbulos blancos___________/mm3

Index DNA valor _________ Inmunofenotipo _________ Presencia de Blastos en Líquido cefalorraquídeo __________ Firma y nombre del médico que extrajo la muestra:

(firma) _______________________ Nombre: Nota: la muestra de sangre de 7 a 10 ml. debe colocarse en solución anticoagulante EDTA. Todos los pacientes que no hayan recibido

quimioterapia.

ANEXO 4

Boleta de Datos del Paciente de UNOP

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ANEXO 5

PROTOCOLO DE SEPARACIÒN DE CÈLULAS MONONUCLEARES CON GRADIENTE DE FICOLL

Dr Alberto Garcìa Gonzàlez

Elementos necesarios • Ficoll Paque (Pharmacia) • Probeta estéril de fondo cónico de 15 ml • Guantes descartables sin talco • Pipetas Pasteur descartables • Solución fisiológica • Centrífuga

La muestra debe procesarse antes de 24 horas de haberse extraido El gradiente de Ficoll permite separación de mononucleares (linfocitos, monolitos y blastos) de los polimorfonucleares y glóbulos rojos Muestras

• Sangre periférica con anticoagulante (EDTA ò Citrato de Sodio ) entera 10-20 ml, no en heparina.

• Médula ósea 3 ml Tiempo Se puede lograr en breve tiempo ( aproximadamente 90 minutos), el siguiente protocolo se puede utilizar para llevarlo a extracción de ADN ò ARN. Procedimiento I Diluir en solución fisiológica si sangre entera 1:2 ejemplo 10 ml de

sangre en 20 ml sol fisiológica. Si es Médula ósea no es necesario II Agregar Ficoll 5ml en probeta estéril de fondo cónico. III Verter Sangre diluida 5ml, cuidado de no mezclarlo con ficoll Si es médula ósea 3 ml. Notará que ficoll transparente quedará abajo

y la Sangre ò medula encima. IV Centrifugación programar a 1300-1400 rpm por 30 minutos, a 18-20

grados Centígrados. Observará la separación de varias zonas de la siguiente manera

V Con pipeta de Pasteur extraer el plasma (eliminarlo), al quedar la zona

de Mononucleares usar otra pipeta para extraerla con cuidado de no mezclar ó tocar Ficoll. Lo obtenido separarlo en otra probeta.

VI Diluir este anillo de mononucleares con sol. fisiológica ( 1:5 veces) solución fría (máximo 15 ml de solución fisiológica)

VII Centrifugar a 1500 rpm por 10 minutos a 4 grados centígrados. VIII eliminar el surnactante, resuspender las células en solución fisiológica

fría nuevamente. IX Centrifugar a 800 – 900 rpm por 10 minutos a 4 grados centígrados

para eliminar la plastrina NO en Médula ósea X Eliminar el surnactante, resuspenderla en solución fría fisiológica XI centrifugar a 1500 rpm por 10 minutos a 4 grados centígrados.

EN ESTA ETAPA SE DECIDE SI ESTOS MONUNUCLEARES SERÀN TRATADOS PARA EXTRACCIÒN DE ADN Ò RNA (PELLET Ò GUANIDIO)

RNAm en Guanidio

GUANIDIO las células mononucleares sanguíneas a las cuales serán extraído RNAm serán guardado en guanidio. El guanidio es un compuesto que lisa las células degradando e inactivando la proteína pero conservando a la vez los ácidos nucleicos en particular el RNA, el cual es fácilmente degradable. La preparación de guanidio: el guanidio deberá ser manipulado con un par de guantes, para evitar la contaminación del RNAasas, enzimas que degradan el RNA que está presente en las manos. _____________________________________________________ ISOTIOCIANATO DE GUANIDIO 4M Componente cantidad concentración

Final ISOTIOCIANATO DI GUANIDIO 25 gramos 4 M N- Laurylsarcosina 250 mg 0.5 % Citrato de Sodio tribàsico dihidrato 1Mph7 1.25 ml 25 mM 2-mercaptoetanol (2-ME) 14.3 M 350 µ 10.1 M H2O 50 ml _____________________________________________________

• Antes de nada pesar el guanidio directamente e una probeta estéril de 50ml.

• Pesar el sarcosyl y agregarlo en la probeta • Agregar citrato de sodio • Llevar a 40 – 45 ml con agua estéril apirógena (cerca de 20

ml) • Agitar y calentar la probeta por algunos minutos • Agregar el 2-ME (trabajando bajo capa química) • Llevar a volumen de 50 ml con agua estéril apirógena • Completada la preparación filtrarla en filtro de 0.45 µm • Conservar a 4 grados centígrados y protegido de la luz ,

usar papel aluminio. EJECUCIÒN 1) Centrifugar las células a 1500 rpm (500g) por 10 minutos, en caso de

un número de célula < 20 millones y/ò volumen < 1 ml, transferirlas en probeta de eppendorf para RNA (etiqueta roja) y centrifugar 3 minutos a 13.000 rpm. El pellet obtenido debe ser bien secado del sobrenadante.

2) Agregar el guanidio al pellet de células en un volumen apropiado

según el siguiente esquema: � De 20 a 80 millones de células = 1ml de guanidio � De 100 a 200 millones de células= 2ml de guandio � 200 millones de célula ò más = 4ml de Guanidio

Cantidad menor de 20 milliones � 10 millones = 500µ l de guanidio en probeta eppendorf estéril � 5 millones = 250 µ l “ “ “ “ � ≤2 millones = 200 µ l “ “ “ “ � Para cantidad inferior de 500 mil células agregar 200µ l de

guanidio 3) resuspender bien el pellet ayudándose con la pipeta y punta estéril

revolviendo bien todo sin espuma. 4) Colocar en congelador a – 20 grados centígrados , cuidando de

colocar el nombre , fecha, número de células totales y el tipo de muestra. Apuntar y clasificarlo en libro y en computadora su posición en el porta muestra

Sangre entera ò

Médula ósea

Ficoll

plasma

mononucleares

ficoll

polimorfonucleares Glóbulos

Rojos

A la

centrifugación

53

ANEXO 6 EXTRACCIÒN DE RNA

Materiales necesarios

• Mononucleares en guanidio • Acetato de Sodio Ph 4 • fenolácido a 4 ºC • cloroformo isoamílico • isopropanolol • Etanol al 70% a -20 ºC • Agua destilada • Centrífuga refrigerada • Pipetas 20 a 200 µl y de 200 µl a 1000 µl con puntas estériles y no

estériles. • 2 Probetas estériles de 1.5 ml, y una de 0.5 ml • 2 jeringas con aguja estériles de 3 ml • 1 vortex • Liofolizador ó termoblock • 1 bandeja con hielo • Guantes descartables sin talco • Campana de Flujo Laminar

Procedimiento A continuación se deberá seguir la secuencia de los pasos, marque con X en el espacio en blanco de cada secuencia. Recordar que es necesario el uso de guantes para la manipulación de la muestra, ya que es posible la contaminación de la misma. El procesamiento elaborarlo en la campana de flujo laminar. 1.- En una probeta estéril de 1.5ml agregar una mezcla de lo siguiente:

a. MonoNucleares/guanidio 250 µl _________ b. Acetato de Sodio 25 µl _________ c. Fenol ácido Ph 5 250 µl _________ d. Cloroformo isoamílico 100 µl _________

49;1

2.- Mezclar en Vortex por 2 minutos, debe tomar una coloración blanca como la Leche, si no es así agregar 25 µl de cloroformo isoamílico. Portarlo en la

Bandeja con hielo por 10 minutos ______ 3.- Llevar la muestra a la centrífuga y programar la misma 13,000 rpm (revolu- Ciones por minuto) 10 minutos a menos 4 ºC _______

54

4.- Recuperar ò extraer la fase superior , dejar el anillo blanco viscoso, lo recu- Perado ponerlo en otra probeta estéril de 1.5 ml. ________ Fase superior, extraerla con pipeta estéril Zona viscosa, deberá evitar extraerla 5.- agregar Isopropanolol 250 a 300 µl dejarlo en temperatura ambiente por 10 minutos. _________________ 6.- Centrifugar a 13,000 rpm, 15 minutos a 4 º C 7.- eliminar surnactante con jeringa estéril , dejar el pellet (en el fondo se observa una capa delgada blanca). Procurar hacerlo a tras Luz __________ 8.- Agregar etanol frío al 70 %, 500 µl , mezclando suavemente con pipeta y Su punta respectiva. _________ 9.- Centrifugar a 1,300 rpm, 3 minutos a 4 º C. ____________ 10.- Eliminar de nuevo el surnactante con jeringa dejando el pellet ya descrito 11.- Agregar etanol a 70% 500 µl , ________________ 12.- Centrifugar a 13,000 rpm, 3 minutos a 4 º C _______ 13.- Eliminar surnactante con jeringa estéril, dejar el pellet ________ 14.- transportarlo en hielo y liofolizarlo a 25 ºC por 5 minutos, con tapadera Abierta de la probeta. ________ 15.- Agregar a la probeta agua estéril, 15 µl, mezclarlo suavemente, pasarlo a Probeta pequeña de 0.5 ml , etiquetarla con nombre y fecha, guardarla a Menos 20 º C ______________

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ANEXO 7 SINTESIS DEL ADNc

Elementos necesarios

• Kit refrigerado de transcriptasa inversa a menos 4 º C • 2 probetas de 0.5 ml • Termociclator, programado 70 º C en 10 minutos y 2do programa de 42 ºC por 45 minutos 99 ºC por 5 minutos 4 º C por 5 minutos • Micropipetas con puntas estériles 0 a 20 µl • Bandeja con hielo • Centrifuga • Refrigerador a menos 20 º C • Guantes descartables

Procedimiento

Este procedimiento consta de 2 etapas de mezcla, las medidas del uso de Guantes son igual ò más estrictas que los pasos anteriores. MEZCLA 1 en una probeta 0.5 ml estéril, uso de micropipeta con filtro estéril con cada reactivo. Random hexamers (5µlM) 1 µl H20 (agua estéril) 8 µl RNA (extraído) 2 µl ______ TOTAL 11 µl Llevarlo al termociclador, con el programa ADNc1 ( 70 º C en 3 minutos) Colocarlo en hielo por 3 minutos MEZCLA 2 agregar a la probeta anterior, uso de micro pipeta con filtro estéril con cada reactivo.

Buffer 5 x 4 µl dNtp 10mM (0.5mM) 1 µl DTT 0.1 M (10 mM) 2 µl RNase inhibina 1 µl Reverse transcriptase (200U/µl) 1 µl ( Superscript II) ______ volumen TOTAL 9 µl Dejarlo 5 minutos a temperatura ambiente Llevarlo a termociclador, con el programa ADNc 2 42 º C por 45 minutos 99 º C por 5 minutos 4 º C por 5 minutos Colocar la muestra en congelador a menos 20 º C

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ANEXO 8 PCR –BIOMED 1

PCR Primario Preparar Kit para PCR Biomed 1, refrigerado a menos 4 º C, usar guantes descartables diferentes al manipular la muestra del paciente , de control positivo y negativo, pipetas de 0-20 µl y de 20µl a 200µl ,con puntas descartables sin filtro y con filtro (para las muestras de ADNc, control positivo y control negativo) SUSTANCIAS A UTILIZAR EN LA MEZCLA Utilizar probeta de 0.5 ml, estéril. Agregar lo siguiente, se calcula para 4 (1 medida de más) H20 16.4 µl X 4 =_____ BUFFER 10x 2.5 µl x " =_____ MgCl2 25mM (1,5 mM) 1.5 µl x " =_____ dNTP 10mM (200µM) 0.5 µl x " =_____ *Oligo A (10pm/µl) 1 µl x " =_____ *Oligo B (10pm/µl) 1 µl x " =_____ Taq Polimerasa (5U/µl) 0.1 µl x " =_____ total 23 µl TOTAL Colocar en 3 probetas distintas de 0.2 ml la cantidad de 23 µl de la mezcla anterior, a continuación se le añade lo siguiente

Colocar en una probeta 2 µl ADNc, en otra 2 µl control positivo ** y en la otra 2 µl control negativo (H20 estéril) identificarlas con marcador. Total del volumen de cada Probeta 25 µl Colocar la muestra en termociclador, con el programa para BIOMED, Platinium a 35 ciclos.

• 94 º C 2 minutos • 94 º C 30 segundos • 65 º C 30 segundos • 72 º C 30 segundos

El proceso dura 1 hora con 30 minutos. Puede iniciar a preparar la gel de agarosa al 1 % según el próximo folio para realizar la electroforesis. * Los oligonucleótidos A y B son los llamados también primer`s específicos para las pruebas en este caso son para ABL (gen constitutivo) ò Translocación 4;11 , 12;21 ó 15;17 ** El control positivo del ABL (que es de línea celular ) y para la Translocación 4;11 se utiliza control positivo de línea celular RS4;11 MV4-11 Translocación 12;21 se utiliza control positivo de línea celular REH Translocación 15;15 se utiliza control positivo de línea celular NB4

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ANEXO 9 ELECTROFORESIS Y TOMA DE FOTO UV

Elementos necesarios

• Agarosa en polvo • Solución Tampón 1x • Bromuro de etidio • Micropipetas de 0 a 20 µl y 20 a 200 µl • Puntas para sus respectivas pipetas (sin filtro) • Molde para electroforesis con peine • Fuente de poder ( 100 voltios) y sus cables • Pesa para microgramos • Horno de microonda con plato rotatorio • Beaker de capacidad 100 ml. • Transiluminador de rayos ultravioleta • Cámara con rollo para foto ultravioleta

PROCEDIMIENTO DE ELECTROFORESIS: 1.- Preparación de solución agarosa al 1 % , pesar 100 gm de agarosa en gel y Agregarlo en 100 ml de solución tampón en recipiente beaker. Llevarlo al microonda , colocar dentro y calentar la

solución a 4 a 5 minutos. Dejarlo enfriar por 5 minutos y agregar bromuro de etidio 2 µl (cuidado al manipular, hacerlo con guantes, es cancerígeno) 2.- Preparación de gel de agarosa al 1 % Colocar en el molde con su peine de electroforesis y dejarlo a temperatura Ambiente por 35 minutos aproximadamente, al final se observa opaca la Preparación y al tocarla es de consistencia gel. 3.- Preparación de las muestras previo a corrimiento Al finalizar el proceso de PCR, las muestras deben prepararse para el co- rrimiento de electroforesis. Extraer a cada muestra 10 µl y colocarlas en probeta 0.5 ml agregarle 2 µl de Buffer de carga, adicional a estas muestras se coloca Marcador escalera de ADN 2 µl con H20 8 µl y Loading Buffer 2 µl. 4.- Corrimiento de electroforesis Se retira el peine dejando las pozetas visibles, se lleva el gel a la cámara de Electroforesis, agregar sol tampón de 1 x aproximadamente 50 ml, a mane- ra de cubrir la gel, el contenido de las muestras preparadas se colocan en las pozetas en el siguiente orden de izquierda a derecha Muestra de paciente, control positivo , control negativo y Marcador de ADN escalera Se inicia la electroforesis a 100 voltios, aproximadamente 35 minutos.

58

5.- Toma de la Foto UV Al concluir la electroforesis, llevar la gel, usando guantes descartables, Se coloca la gel sobre el transiluminador de rayos ultravioleta, se ajusta La lente de la cámara de foto y se toma la misma.

La gel se debe descartar, colocarla en bolsa de plástico, debidamente cerrada Y ser reportado a la compañía ECOTERMO.

Imprimir foto digital acá: GEN control de calidad ABL Translocación ____________

INTERPRETACIÒN DE LA FOTO Y OBSERVACIONES _________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

__________

DIAGNÒSTICO Marque con una X si son positivas ò negativas las pruebas

PRUEBA DE ABL Positivo_________ Negativo _________

Recordar que si es positivo significa que el procesamiento de la muestra es adecuada y la

prueba de translocación es fidedigna. Si es negativo evaluar su repetición desde extracción

de ARN ( Folio 2) y la prueba de translocación estudiada no es fidedigna.

PRUEBA TRANSLOCACIÓN __________( 4;11 , 12;21 ó 15;17) Positivo ________ Negativo __________

59

ANEXO 10 HOJA DE DATOS EXCEL

Hoja 1. Datos generales del paciente

Fecha Registro mèdico Nombre/apellido edad sexo procedencia tipo de leucemia

Hoja 2. laboratorios en niños con LLA realizados en UNOP

Fecharegistro Mèdico Nombre/apellido

Recuento Glòbulos Blàncos inmunofenotipo Index ADN

Presencia de Blastos LCR

Hoja 3. Resultados de PCR

Fecha Registro

médico

Nombre Tipo de

leucemia

Tipo de

translocación

investigada

Resultado

(positivo/negativo)

60

IV. 5 REGISTRO FOTOGRÁFICO

Separación de Células Mononucleares. Recepción de muestras de sangre de pacientes de

UNOP- Unidad Nacional de Oncología Pediátrica

Mezcla de muestra sanguínea con Ficoll Hystopaque para separar las células Mononucleares

61

Equipo, Reactivos y descartables

descartables

62

63

64

Preparación Geles Producto de PCR y

elecroforesis- foto de la gel con luz

UV

PCR ABELSON

PCR Tx 15y 17 BCR 1 y BCR 3

65

V . INFORME FINANCIERO

AD-R-0013

DOCEAVA CONVOCATORIA

LINEA FODECYT

Nombre del Proyecto: Determinación de translocaciones comosómicas 4;11 y 12;21 en niños con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica aguda

y 15;17 en Leucemia Promielocitica Aguda por medio de RT-PCR

Numero del Proyecto: 90-2006 Investigador Principal: Dr. Alberto García Monto Autorizado: Q332.139,50 20 meses

Fecha de Inicio y

Finalización: 01/04/2007 AL 30/11/2008

Grupo Renglón Nombre del Gasto Asignación

Presupuestaria

TRANSFERENCIA En Ejecución

Menos (-) Mas (+)

Ejecutado Pendiente

de Ejecutar

1 Servicios No Personales

181 Estudios,investigaciones y proyectos de factibilidad Q 141.000,00 Q 141.000,00 Q -

181

Estudios, investigaciones y proyectos de factibilidad (Evaluación Externa de Impacto) Q 8.000,00 Q 8.000,00

122 Impresión, encuadernación y reproducción Q 2.500,00 Q 2.000,00 Q 500,00

2 Materiales y Suministros

241 Papel de escritorio Q 500,00 Q 194,50 Q 305,50

243 Productos de papel o cartón Q 500,00 Q 269,20 Q 230,80

261 Elementos y Compuestos químicos Q 87.470,00 Q 6.000,00 Q 81.394,92 Q 75,08

268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc Q 17.575,00 Q 13.725,00 Q 3.850,00 Q -

269 Otros Productos químicos y conexos Q 400,00 Q 400,00 Q -

291 Útiles de oficina Q 500,00 Q 479,80 Q 20,20

295 Útiles menores, médico-quirúrgicos y de laboratorio Q 5.425,00 Q 5.275,58 Q 149,42

3 PROPIEDAD, PLANTA,

EQUIPO E INTANGIBLES

323 Equipo médico sanitario y de laboratorio Q 45.000,00 Q 13.200,00 Q 58.191,05 Q 8,95

(-) Gastos Administrativos (10%) Q 30.194,50 Q 30.194,50 Q -

TOTAL Q 332.139,50 Q 20.125,00 Q 20.125,00 Q 322.849,55 Q 9.289,95

Monto Autorizado Q 332.139,50

Disponibilidad: Q 9.289,95

( -) Ejecutado Q 322.849,55

Sub-total Q 9.289,95

( -) Apertura de Caja Chica

Total por Ejecutar Q 9.289,95