12. Ciclo celular y crecimiento de poblaciones microbianasCrecimiento a nivel individual. Crecimiento de poblaciones: medida de masa y n de clulas. Crecimiento balanceado. Cultivo continuo. Curva de crecimiento en sistema cerrado

Introduccin al crecimiento microbiano (I)Crecimiento: incremento ordenado de todos los componentes del sistema biolgico aumento de la masa celular multiplicacin celularEn microorganismos que se dividen por fisin o por gemacin aumento del n de individuosEn microorganismos cenocticos aumento del tamao de la colonia cenoctica

Introduccin al crecimiento microbiano (II)Puntos de vista de estudio:Individual: ciclo celularReplicacin y segregacin de cromosomasSntesis de nuevos materiales de las envueltas (ver tema 5)Coordinacin de la replicacin y la divisin celularPoblacionalCintica del crecimientoFactores que afectan al tiempo de generacin (g)Factores ambientales que afectan al crecimientoFsicos (tema 13)Qumicos (tema 14)

Ciclo celularSecuencia de acontecimientos identificables que ocurren desde que surge una nueva clula hasta que sta se divide en dos hijasEn el ciclo procaritico existen perodosC: replicacin del ADN cromosmicoD: formacin del septo y divisin celularFase innominada, equivalente a la G1 eucariticaC y D son relativamente constantes cuando disminuye g lo hace a expensas de G1

Ciclo celular en funcin del tiempo de generacing>C+D: existe G1 (intervalo antes de la replicacin). C y D estn perfectamente diferenciadosg=C+D: no existe G1. Cada ronda de replicacin empieza al terminar una divisin celularg

Control del ciclo celular en Escherichia coli (I)Dos secuencias paralelas de acontecimientos controlan el ciclo:Un control es sensible a una masa celular umbral, y est implicado en desencadenar la replicacin cromosmicaOtro control es sensible a una longitud celular umbral, y tiene que ver con el reparto de los cromosomas y la formacin del tabique

Fase CFase D

Control del ciclo celular en Escherichia coli (II)Inicio de la replicacin (sensible a masa umbral):Unidades de DnaA (+ATP) se unen a oriC. El oriC tras la replicacin queda hemimetilado, y queda secuestrado en la membrana (para evitar la accin de la metilasa Dam)Inicio de tabicacin (sensible a longitud umbral y a la separacin de los cromosomas):Formacin en el centro celular de un crculo de FtsZ, que se va contrayendoEnsamblaje en ese plano del divisoma, incluyendo la PBP3 sntesis de PG del tabique

Medida del crecimiento por masa celular (I)Mtodos directos:Determinacin del peso hmedoDeterminacin del peso secoDeterminacin del N totalDeterminacin de algn componente caracterstico:PGADN, ARNProtenasATPClorofilas (en fotosintticos)

Medida del crecimiento por masa celular (II)Mtodos indirectos:Consumo de nutrientes QO2 (consumo de oxgeno)QCO2 (consumo de dixido de carbono)Produccin de ciertos metabolitosProduccin de cidos orgnicosMtodos turbidimtricos (pticos):Espectrofotmetro (mide luz transmitida)Nefelmetro (mide luz dispersada)

Espectrofotmetro en medida del crecimiento

Medida del nmero de individuos (I)Mtodos directos:Cmara de Petroff-Hauser (para bacterias)Cmara de Thoma (para levaduras y clulas mayores que las bacterianas)Contadores electrnicos de partculas (contador Coulter)

Cmara de Petroff-Hauser

Medida del nmero de individuos (II)Mtodos indirectos:Recuento de viables por siembra de muestras de diluciones en placas de PetriRecuento de viables a partir de grandes volmenes de suspensiones diluidas: se hacen pasar por filtros de nitrocelulosa o equivalentes (ej.: sistema Millipore), y se incuban sobre medio slido

Dispersin sobre la superficie de placas PetriMedio en sobrefusin se aade a una muestra

Alcuotas 0.1 ml 10 x106Recuento de viables por siembra en placas Petri

Sistema de filtracin en membrana de Millipore

Filtracin por membrana de Millipore de una muestra

Crecimiento balanceado (=equilibrado) (I) El incremento por unidad de tiempo constituyentes de la poblacin es un valor constante y similar en cada caso: velocidad de aumento del componente = K [cantidad de ese componente] (cintica orden 1)Es decir: el n de clulas, la masa u otros componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo tiempo de generacin (g)

Crecimiento balanceado (=equilibrado) (II) Otra manera: todos los constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo coeficiente exponencial de crecimiento Se deduce fcilmente la relacin entre y el tiempo de generacin (g): = 0.693/g (en h-1)

Cultivo continuo(sistema abierto) cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema abierto de flujo compuesto por:Una cmara de cultivo de volumen constanteA la que llega un suministro de nutrientes desde una cmara reservorioDesde la cmara de cultivo se elimina parte del cultivo y de sustancias txicas por un dispositivo de rebosadero

Medio fresco desde reservorioVlvula para controlar el flujof (en ml/h)f (en ml/h)

vxPrdida neta cls: -dx/dt = xDCrecimiento bruto: dx/dt = x Crecimiento neto: dx/dt = x - xD = = x (-D)En equilibrio = D; luego dx/dt = 0 y x se hace constante

D = f/v (en h-1)

SRD = f/vvReservorio de medio fresco, con un sustrato limitante (SR)Vlvula de control del flujoSuministro de aireFiltro de aireCmara de cultivoReceptor del efluente rebosado

gxDCDM

Crecimiento en sistemas cerrados lquidosEl ms habitual en laboratorioCultivo en frascos, tubos, etc.No hay aporte nuevo de nutrientes ni es posible eliminar los productos de desecho del cultivoSe desarrolla a travs de una curva caracterstica de crecimiento7

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*En este tema veremos: Crecimiento a nivel individual. Crecimiento de poblaciones: medida de masa y n de clulas. Crecimiento balanceado. Cultivo continuo. Curva de crecimiento en sistema cerrado lquido. Crecimiento en sistema cerrado slido.*Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biolgico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicacin celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicacin se traduce en un aumento del tamao del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisin o por gemacin, lo que ocurre es un aumento de la poblacin. En los microorganismos cenocticos (en los que la duplicacin del genoma no se acompaa de divisn celular) el crecimiento se traduce en aumento de tamao de la colonia cenoctica.*El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista: A escala individualA escala poblacionalLos eventos de crecimiento en el mbito individual hacen referencia al ciclo celular, y dentro de ste podemos abordar los siguientes temas:inicio y transcurso de la replicacin cromosmica y de plsmidos (vase tema 7);segregacin de cromosoma y plsmidos a las clulas hijas;sntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared celular (tema 5); seales que coordinan la replicacin genmica con la divisin celular.El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tpicos:cintica del crecimiento;factores que afectan al tiempo de generacin (g);factores ambientales que limitan el crecimiento.

*Un ciclo celular es una secuencia de acontecimientos interconectados que comienza con la formacin de una nueva clula y termina cuando dicha clula se divide en otras dos hijas. Los ciclos celulares se describen generalmente atendiendo a una serie de eventos identificables que se van produciendo en una secuencia fija, de modo que para que se produzca cada uno de ellos hace falta que se complete el anterior. Los periodos del ciclo celular procaritico son:fase C (equivalente a la S eucaritica): replicacin del ADN cromosmico;fase D (equivalente a G2 + M): se distingue porque su terminacin coincide con el final de divisin celular;fase innominada, equivalente a la G1 eucaritica.Lo caracterstico del ciclo es que las fases C y D son relativamente constantes, y por lo tanto, cuando disminuye el tiempo de generacin (g), lo hace a expensas de la fase G1. Por ejemplo, en Escherichia coli, C = unos 40 min, y D = unos 20 min.Una caracterstica del ciclo es que, cuanto ms rico es un medio, y por lo tanto menor es el tiempo de generacin (g), mayor es el tamao medio de las clulas. Es decir, los individuos de una cepa bacteriana que est en un medio rico son ms grandes que los individuos de esa misma cepa creciendo en un medio pobre.

*Vamos a estudiar con el ejemplo de E. coli qu ocurre con el ciclo celular a distintos tiempos de generacin.Cuando g>C+D: Existe fase "G1" (intervalo que precede a la replicacin). En estas condiciones podemos observar ntidamente periodos diferenciados entre s (de sntesis de ADN y de divisin celular).Cuando g=C+D: Ya no existe G1, y cada ronda de replicacin comienza inmediatamente tras la precedente divisin celular (es decir, cada clula hija recin nacida se embarca inmediatamente en replicar el cromosoma, y una vez que ha terminado de replicarlo, la clula inicia la divisin celular).Cuando g